CN102188759A - 一种用于细胞复合培养的肝组织工程支架及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种用于细胞复合培养的肝组织工程支架及其制备方法，肝组织工程支架由具有流道结构的薄膜支架与具有细胞培养结构的微米级多孔支架重叠后卷裹构成，其制备方法先设计数字模型，制备出薄膜支架软模具负型和多孔支架软模具负型，再分别制备薄膜支架和多孔支架，最后重叠、卷裹制成肝组织工程支架，肝组织工程支架内部具有细胞培养结构的微米级多孔支架以及流道结构的薄膜支架，细胞培养结构适宜肝细胞生长，并且具有优化设计的流道结构，使培养液在整个支架内部的充分渗透和物质交换，从而促进血管网构建和肝细胞团聚生长，最终实现肝组织的工程化制造，具有制造精度高，周期短，成本低，操作简单的优点。

Description

一种用于细胞复合培养的肝组织工程支架及其制备方法

技术领域

本发明属于医疗行业的生物制造领域，具体涉及一种用于细胞复合培养的肝组织工程支架及其制备方法。

背景技术

肝移植是治疗肝病重症患者的有效治愈手段，多年来一直受到供体匮乏的严重制约，肝组织工程希望能通过人工的方法再造具有正常肝功能的肝组织，替代供体移植，而肝脏需要丰富的血管网络维持肝细胞旺盛的新陈代谢，因此血管化与肝细胞组织化培养一直是肝组织工程的主要研究对象。血管内皮细胞需要附着表面粗糙度低，从而相互连接形成表皮组织；肝细胞则需要团聚生长才能实现其功能。

目前针对肝组织工程的常用的支架制造工艺为冷冻干燥法，能够制造出均匀的多孔支架。该种支架只有单一的多孔结构，难以满足不同种类细胞的复合培养要求，不利于培养液在支架内部渗透；另外传统细胞培养只是在平面支架的表面上种植细胞，仅凭细胞的自我增殖迁移难以达到三维组织化培养的结果。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于细胞复合培养的肝组织工程支架及其制备方法，能够制造出适宜血管内皮生长环境的薄膜型支架和适宜肝细胞培养的三维多孔支架，实现两种细胞在整个支架内的有序分布，并且具有可控的内部管道促进细胞培养中的物质交换，促进血管网构建和肝细胞团聚生长，最终实现肝组织的工程化制造，具有制造精度高，周期短，成本低，操作简单的优点。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于细胞复合培养的肝组织工程支架，由具有流道结构3的薄膜支架1与具有细胞培养结构4的微米级多孔支架2重叠后卷裹构成。

所述的薄膜支架1上加入促血管生长因子，而多孔支架2上加入肝细胞生长因子。

所述的流道结构3利用快速成型技术进行直接成型。

所述的薄膜支架1表面涂覆一层100～300μm的胶原蛋白或明胶。

所述的薄膜支架1材料采用丝素蛋白、壳聚糖或PLGA。

所述的多孔支架2材料采用胶原蛋白、明胶或海藻酸钠。

肝组织工程支架的工作原理为：

肝组织工程支架内部具有细胞培养结构4的微米级多孔支架2以及流道结构3的薄膜支架1，细胞培养结构4适宜肝细胞生长，并且具有优化设计的流道结构3，使培养液在整个支架内部的充分渗透和物质交换，从而促进血管网构建和肝细胞团聚生长，最终实现肝组织的工程化制造。

一种用于细胞复合培养的肝组织工程支架的制备方法，包括下列步骤：

1)、通过计算机设计矩形的3D数字模型，矩形厚度为1～2mm，矩形的一侧表面上设有宽度为200μm～1mm、深度为300～700μm的凹槽结构，将数字模型通过快速成型技术制造出快速原型，再用硅橡胶(PDMS)翻模，制备出薄膜支架软模具负型和多孔支架软模具负型；

2)、采用丝素蛋白、壳聚糖或PLGA作为制造薄膜支架的材料，控制其动力粘度在60～80Pa·s，并用磁力搅拌器搅拌6h以上，备用；

3)、采用胶原蛋白、明胶或海藻酸钠作为制造多孔支架的材料，溶液中所有溶质的质量分数为5％-10％，并用磁力搅拌器充分搅拌6h以上，备用；

4)、将薄膜支架材料溶液灌注于薄膜支架软模具负型上，在真空度＜50Pa的环境下保持3～10min，抽出底层气泡，然后取出静置于室温常压环境下自然晾干，脱模，即得薄膜支架；

5)、将多孔支架材料溶液灌注入多孔支架软模具负型上，-20℃以下预冻3h后进行冷冻干燥24～48h，真空度维持在20Pa以下，完全干燥后取出脱模即得多孔支架，微孔直径在50～120μm范围内；

6)、分别在薄膜支架上种植血管内皮细胞，在多空支架上种植肝细胞，然后重叠卷起，端部用医用生物胶固定，得到圆柱外形的肝组织工程支架，然后进行体外培养或体内植入。

本发明与现有支架制造技术相比有如下优点：

1.采用常见的生物材料进行批量化的支架制造，且制造精度高，周期短，成本低，操作简单；

2.薄膜结构和多孔结构的复合支架能够分别适应血管内皮细胞和肝细胞的生长要求；

3.流道结构根据细胞培养的物质交换需求优化设计并通过快速成型工艺准确实现，有效改善支架内部细胞培养环境；

4.双层卷裹方式实现细胞在整个支架内部的均匀三维分布，有利于细胞进一步的组织化生长。

附图说明

图1为本发明肝组织工程支架的结构示意图。

图2为本发明薄膜支架1的结构示意图。

图3为本发明多孔支架2的结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的肝组织工程支架作进一步的详细描述。

参见图1、2和3，一种用于细胞复合培养的肝组织工程支架，由具有流道结构3的薄膜支架1与具有细胞培养结构4的微米级多孔支架2重叠后卷裹构成，能够实现血管内皮细胞和肝细胞的复合培养。

所述的薄膜支架1上加入促血管生长因子，而多孔支架2上加入肝细胞生长因子。

所述的流道结构3根据流体动力学原理优化设计，选择最适宜培养液在支架内部流动的形状参数，利用快速成型技术进行复杂结构的直接成型。

所述的薄膜支架1表面涂覆一层100～300μm的胶原蛋白或明胶。

所述的薄膜支架1材料采用丝素蛋白、壳聚糖或PLGA，具有较高机械强度和韧性，用于培养血管内皮细胞。

所述的多孔支架2材料采用胶原蛋白、明胶或海藻酸钠。

肝组织工程支架的工作原理为：

肝组织工程支架内部具有细胞培养结构4的微米级多孔支架2以及流道结构3的薄膜支架1，细胞培养结构4适宜肝细胞生长，并且具有优化设计的流道结构3，使培养液在整个支架内部的充分渗透和物质交换，从而促进血管网构建和肝细胞团聚生长，最终实现肝组织的工程化制造。

附图中：1为薄膜支架；2为多孔支架；3为流道结构；4为细胞培养结构。

下面结合具体实施例对本发明肝组织工程支架的制备方法进行详细描述。

实施例1

一种用于细胞复合培养的肝组织工程支架的制备方法，包括下列步骤：

1)、通过计算机设计矩形的3D数字模型，矩形的厚度为1mm，矩形的一侧表面上设有宽度为200μm、深度为300的凹槽结构，将数字模型通过快速成型技术制造出快速原型，再用硅橡胶(PDMS)翻模，制备出薄膜支架软模具负型和多孔支架软模具负型；

2)、采用丝素蛋白作为制造薄膜支架的材料，控制其动力粘度在60Pa·s，并用磁力搅拌器搅拌6h，备用；

3)、采用胶原蛋白作为制造多孔支架的材料，溶液中所有溶质的质量分数为6％，并用磁力搅拌器充分搅拌6h，备用；

4)、将薄膜支架材料溶液灌注于薄膜支架软模具负型上，在真空度＜50Pa的环境下保持3min，抽出底层气泡，然后取出静置于室温常压环境下自然晾干，脱模，即得薄膜支架；

5)、将多孔支架材料溶液灌注入多孔支架软模具负型上，-20℃以下预冻3h后进行冷冻干燥24h，真空度维持在20Pa以下，完全干燥后取出脱模即得多孔支架，微孔直径在100-120μm范围内；

6)、分别在薄膜支架上种植血管内皮细胞，在多空支架上种植肝细胞，然后重叠卷起，端部用医用生物胶固定，得到圆柱外形的肝组织工程支架，然后进行体外培养或体内植入。

实施例2

一种用于细胞复合培养的肝组织工程支架的制备方法，包括下列步骤：

1)、通过计算机设计矩形的3D数字模型，矩形的厚度为1.5mm，矩形的一侧表面上设有宽度为500μm、深度为500μm的凹槽结构，将数字模型通过快速成型技术制造出快速原型，再用硅橡胶(PDMS)翻模，制备出薄膜支架软模具负型和多孔支架软模具负型；

2)、采用壳聚糖作为制造薄膜支架的材料，控制其动力粘度在70Pa·s，并用磁力搅拌器搅拌8h，备用；

3)、采用明胶作为制造多孔支架的材料，溶液中所有溶质的质量分数为8％，并用磁力搅拌器充分搅拌8h，备用；

4)、将薄膜支架材料溶液灌注于薄膜支架软模具负型上，在真空度＜50Pa的环境下保持5min，抽出底层气泡，然后取出静置于室温常压环境下自然晾干，脱模，即得薄膜支架；

5)、将多孔支架材料溶液灌注入多孔支架软模具负型上，-20℃以下预冻3h后进行冷冻干燥36h，真空度维持在20Pa以下，完全干燥后取出脱模即得多孔支架，微孔直径在90-110μm范围内；

6)、分别在薄膜支架上种植血管内皮细胞，在多空支架上种植肝细胞，然后重叠卷起，端部用医用生物胶固定，得到圆柱外形的肝组织工程支架，然后进行体外培养或体内植入。

实施例3

一种用于细胞复合培养的肝组织工程支架的制备方法，包括下列步骤：

1)、通过计算机设计矩形的3D数字模型，矩形的厚度为2mm，矩形的一侧表面上设有宽度为1mm、深度为700μm的凹槽结构，将数字模型通过快速成型技术制造出快速原型，再用硅橡胶(PDMS)翻模，制备出薄膜支架软模具负型和多孔支架软模具负型；

2)、采用PLGA作为制造薄膜支架的材料，控制其动力粘度在80Pa·s，并用磁力搅拌器搅拌10h，备用；

3)、采用海藻酸钠作为制造多孔支架的材料，溶液中所有溶质的质量分数为10％，并用磁力搅拌器充分搅拌10h，备用；

4)、将薄膜支架材料溶液灌注于薄膜支架软模具负型上，在真空度＜50Pa的环境下保持10min，抽出底层气泡，然后取出静置于室温常压环境下自然晾干，脱模，即得薄膜支架；

5)、将多孔支架材料溶液灌注入多孔支架软模具负型上，-20℃以下预冻3h后进行冷冻干燥48h，真空度维持在20Pa以下，完全干燥后取出脱模即得多孔支架，微孔直径在70-90μm范围内；

6)、分别在薄膜支架上种植血管内皮细胞，在多空支架上种植肝细胞，然后重叠卷起，端部用医用生物胶固定，得到圆柱外形的肝组织工程支架，然后进行体外培养或体内植入。

Claims (7)

1.一种用于细胞复合培养的肝组织工程支架，其特征在于：由具有流道结构(3)的薄膜支架(1)与具有细胞培养结构(4)的微米级多孔支架(2)重叠后卷裹构成。

2.根据权利要求1所述的一种用于细胞复合培养的肝组织工程支架，其特征在于：所述的薄膜支架(1)上加入促血管生长因子，而多孔支架(2)上加入肝细胞生长因子。

3.根据权利要求1所述的一种用于细胞复合培养的肝组织工程支架，其特征在于：所述的流道结构(3)利用快速成型技术进行直接成型。

4.根据权利要求1所述的一种用于细胞复合培养的肝组织工程支架，其特征在于：所述的薄膜支架(1)表面涂覆一层100～300μm的胶原蛋白或明胶。

5.根据权利要求1所述的一种用于细胞复合培养的肝组织工程支架，其特征在于：所述的薄膜支架(1)材料采用丝素蛋白、壳聚糖或PLGA。

6.根据权利要求1所述的一种用于细胞复合培养的肝组织工程支架，其特征在于：所述的多孔支架(2)材料采用胶原蛋白、明胶或海藻酸钠。

7.一种用于细胞复合培养的肝组织工程支架的制备方法，其特征在于：包括下列步骤：

1)、通过计算机设计矩形的3D数字模型，矩形厚度为1～2mm，矩形的一侧表面上设有宽度为200μm～1mm、深度为300～700μm的凹槽结构，将数字模型通过快速成型技术制造出快速原型，再用硅橡胶(PDMS)翻模，制备出薄膜支架软模具负型和多孔支架软模具负型；

2)、采用丝素蛋白、壳聚糖或PLGA作为制造薄膜支架的材料，控制其动力粘度在60～80Pa·s，并用磁力搅拌器搅拌6h以上，备用；

3)、采用胶原蛋白、明胶或海藻酸钠作为制造多孔支架的材料，溶液中所有溶质的质量分数为5％-10％，并用磁力搅拌器充分搅拌6h以上，备用；

4)、将薄膜支架材料溶液灌注于薄膜支架软模具负型上，在真空度＜50Pa的环境下保持3～10min，抽出底层气泡，然后取出静置于室温常压环境下自然晾干，脱模，即得薄膜支架；

5)、将多孔支架材料溶液灌注入多孔支架软模具负型上，-20℃以下预冻3h后进行冷冻干燥24～48h，真空度维持在20Pa以下，完全干燥后取出脱模即得多孔支架，微孔直径在50～120μm范围内；

6)、分别在薄膜支架上种植血管内皮细胞，在多空支架上种植肝细胞，然后重叠卷起，端部用医用生物胶固定，得到圆柱外形的肝组织工程支架，然后进行体外培养或体内植入。

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