KR20150063316A - 세포배양부재와 세포배양방법 - Google Patents

세포배양부재와 세포배양방법 Download PDF

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나오코 오비
지카코 스미요시
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니폰샤신인사츠가부시키가이샤
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Abstract

(과제)배양세포 집합체의 구조를 3차원 방향으로 제어 가능한 세포배양부재를 얻는 것을 과제로 한다.
(해결수단)기판(11)의 위에, 패턴모양이고 또한 층모양의 하이드로겔 부위(12)를 형성하고, 하이드로겔 부위(12)를 덮어서 층모양의 배양부위(12)를 형성한 세포배양부재(1)이다. 배양부위의 표면이 제1세포종 파종면(14)이다. 하이드로겔 부위(12)는 세포성장인자가 침윤되어 있고, 하이드로겔 부위의 두께는 하이드로겔 부위(12)로부터 배양부위(13)로 세포성장인자를 배양기간에 걸쳐서 서방 가능한 두께이다.

Description

세포배양부재와 세포배양방법{CELL CULTURING MEMBER, AND CELL CULTURING METHOD}
본 발명은 사람이나 동물 등의 세포의 배양을 생체(生體) 밖에서 하기 위한 세포배양부재(細胞培養部材)에 관한 것이다. 또한 본 발명은 세포의 배양을 생체 밖에서 하는 세포배양방법에 관한 것이다.
생체내에서 세포는 어떤 규칙을 가지고 3차원적으로 배열 및 배치되어 있다. 그러나 현상(現狀)의 세포배양에서는, 이 세포의 배열·배치에 관한 기술은 매우 한정되어 있다.
지금까지 2차원(次元)의 세포배열에 관해서는 보고가 있다. 예를 들면 세포접착성(細胞接着性) 표면과 비접착성(非接着性) 표면이라고 하는 패턴을 형성하고, 그것에 의하여 세포의 2차원 접착, 그것에 이어지는 증식패턴을 제어하는 것이 이루어지고 있다. 일례를 들면, 종래에 기재(基材)상에 온도응답성 고분자를 미세한 선폭(線幅)으로 패터닝한 세포배양 지지체와, 당해 세포배양 지지체로 세포를 배양하는 세포배양방법이 알려져 있다(예를 들면 특허문헌1 참조). 상기의 세포배양 지지체는, 세포배양부위를 모세혈관의 선폭으로 패터닝 할 수 있기 때문에 배양세포의 구조를 2차원적(막(膜)의 면(面) 방향)으로 제어할 수 있다.
이에 대하여 3차원에서의 세포배열에 대한 기술방법론은 거의 없다. 세포시트를 포개서 세포의 3차원 배열을 실현시키는 기술이 보고되어 있다(예를 들면 특허문헌2 참조). 그러나 세포가 중층화(重層化)된 내부의 구조는 반드시 인위적으로 제어되고 있다고는 말할 수 없다. 또 종래에 세포를 3차원적·입체적으로 증식시켜 덩어리 형상의 세포 덩어리를 만드는 세포배양법이 제안되어 있다. 그러나 이 방법론에 있어서도, 3차원에서의 세포배열은 인위적으로 제어할 수는 없다.
세포의 3차원·입체배양(덩어리 형상 배양)에서는, 종종 입체형상 내부에 위치하는 세포에 대한 산소나 영양의 공급이 나빠져서 내부세포의 기능저하 혹은 세포의 사멸(死滅)이 발생한다. 이에 대하여 생체는 세포의 3차원적 집합체로 이루어져 있는데에도 불구하고, 이러한 문제는 발생하지 않는다. 그 이유는, 3차원 세포 집합체중에 혈관이 존재하여 입체형상 내부의 세포에 산소와 영양을 잘 공급하고 있기 때문이다.
이와 같이 3차원에서 세포를 생존시키거나 기능시키기 위해서는 혈관망(血管網)의 형성이 중요 요소(필수사항)이다. 혈관망의 형성은 바로 3차원의 혈관세포의 배열이다. 이러한 체내의 조직구조에 가까운 세포배열의 제어기술의 개발이, 금후의 세포생물학의 발전에 필요불가결한 과제가 되어 있다.
일본국 공개특허 특개2010-98973호 공보 일본국 공개특허 특개2005-342112호 공보
따라서 본 발명은, 배양세포(집합체)의 구조를 3차원 방향으로 제어 가능한 세포배양부재를 얻는 것을 과제로 한다.
본 발명의 다른 과제는, 배양세포(집합체)의 구조를 3차원 방향으로 제어 가능한 세포배양방법을 제공하는 것에 있다. 또한 본 발명은 제1세포종(細胞種)의 배양세포(집합체)의 구조를 3차원 방향으로 제어 가능하게 하고 또한 제2세포종을 공배양(共培養)하는 세포배양방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명에서는, 세포가 세포성장인자(細胞成長因子)의 농도 구배(濃度勾配)에 응답하는 성질을 이용하여 세포의 3차원 배열을 제어한다. 우선 기재의 위에, 세포성장인자를 서방(徐放)(서서히 방출; sustained release)하는 하이드로겔층을 2차원 패턴으로 형성한다. 다음에 당해 패턴을 형성한 기재상에 세포이동을 가능하게 하는 배양부위(예를 들면 매트리겔층(Matrigel層))를 놓고, 그 배양부위상에 세포를 파종(播種)한다.
세포성장인자의 방출에 따라 배양부위내에 세포성장인자의 3차원 농도 구배 패턴이 형성된다. 이 3차원 패턴을 따라 세포가 이동한다. 그 결과 배양부위내에 세포성장인자의 3차원 농도 구배 패턴에 따른 세포배열이 형성된다.
본 발명은, 하이드로겔로부터의 세포성장인자의 서방성(徐放性)과 하이드로겔의 2차원 패턴을 조합시켜, 배양부위내에서 3차원에서의 세포배열을 가능하게 하였다.
본 발명의 하나의 태양에 관한 세포배양부재는, 기판의 위에 패턴모양이고 또한 층모양의 하이드로겔 부위를 형성하고, 상기 하이드로겔 부위를 덮어서 층모양의 배양부위를 형성한 세포배양부재에 있어서, 상기 배양부위의 표면이 제1세포종 파종면이며, 상기 하이드로겔 부위는 세포성장인자가 침윤되어 있어서, 상기 하이드로겔 부위로부터 상기 배양부위로 세포성장인자를 서방하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 관한 세포배양부재의 바람직한 실시태양으로서, 상기 하이드로겔 부위의 두께가, 상기 하이드로겔 부위로부터 상기 배양부위로 세포성장인자를 2일 이상, 21일 이하 서방하는 두께이더라도 좋고, 또한 상기 하이드로겔 부위의 두께가 1μｍ이상, 30mm이하이더라도 좋다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에 관한 세포배양부재는, 상기 하이드로겔 부위가 열가교 젤라틴(熱架橋 gelatine)으로 이루어지는 것이더라도 좋고, 또한 상기 하이드로겔 부위를 형성하는 하이드로겔의 함수율이 70% 이상, 99% 이하이더라도 좋다.
본 발명에 관한 세포배양방법은 이하의 공정으로 이루어진다.
A. 기판의 위에 패턴모양이고 또한 층모양의 하이드로겔 부위를 형성하는 공정
B. 상기 하이드로겔 부위에 세포성장인자를 침윤시키는 공정
C. 상기 하이드로겔 부위를 덮어서 층모양의 배양부위를 형성하여, 세포배양부재를 완성하는 공정
D. 상기 배양부위의 표면에 제1세포종을 파종하는 제1세포종 파종공정
E. 제1세포종 파종공정을 끝낸 세포배양부재를 배양조건하에 두는 제1세포종 배양공정
본 발명에 관한 세포배양방법의 바람직한 실시태양에 있어서는, D의 공정인 제1세포종 파종공정에 사용하는 제1세포종은, 파종전에 기아처리를 한 세포이더라도 좋고, 또한 상기 하이드로겔 부위를 형성하는 하이드로겔의 함수율을 70% 이상, 99% 이하의 범위로 하고 하이드로겔의 함수율을 상기 범위내에서 변경함으로써 상기 하이드로겔 부위로부터 상기 배양부위로 세포성장인자를 서방하는 기간을 조정하는 것이더라도 좋다.
본 발명에 관한 세포배양방법의, 그 이외의 바람직한 실시태양에 있어서는, E의 공정인 제1세포종 배양공정에 계속하여 이하의 공정을 하는 것이더라도 좋다.
F. 상기 배양부위에 제2세포종을 파종하는 제2세포종 파종공정
G. 제2세포종 파종공정을 끝낸 세포배양부재를 배양조건하에 두는 제2세포종 배양공정
이상에서 설명한 본 발명, 본 발명의 바람직한 실시태양, 이들에 포함되는 구성요소는 가능한 한 조합시켜서 실시할 수 있다.
본 발명에 관한 세포배양부재는, 세포성장인자를 침윤시킨 일정한 두께를 구비하는 하이드로겔 부위를 구비하고, 하이드로겔 부위로부터 세포성장인자가 서방되므로, 그 이외의 발명의 특정사항과 어울려, 배양중의 제1세포종이 배양부위의 표면으로부터 하이드로겔 부위를 향하여 이동과 증식을 한다. 그 결과, 하이드로겔 부위의 패턴형성에 기인하는, 제1세포종에 관한 배양세포(집합체)의 2차원 구조(기재의 표면방향)를 제어할 수 있을 뿐만 아니라, 배양부위의 층 두께방향으로의 구조를 제어할 수 있다. 즉 배양세포(집합체)의 3차원 구조를 제어할 수 있다.
본 발명에 관한 세포배양방법에 있어서도, 상기 세포배양부재와 마찬가지로 배양세포(집합체)의 3차원 구조를 제어할 수 있다.
도1은 세포배양부재의 단면 설명도이다.
도2는 배양부위를 제거한 세포배양부재의 설명도로서, 도2(a)는 단면설명도, 도2(b)는 평면 설명도이다.
도3은 제1세포종에 관한 세포배양방법의 개념설명도로서, 도3(a)는 제1세포종 파종직후, 도3(b)는 제1세포종 배양 초기, 도3(c)는 제1세포종 배양 후기의 각각의 개념 설명도이다.
도4는 실시예의 평가결과를 나타내는 그래프이다.
이하, 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 관한 세포배양부재와 세포배양방법을 더 설명한다. 본 명세서에 있어서 참조하는 각 도면은, 본 발명의 이해를 쉽게 하기 위해서 일부의 구성요소를 과장하여 나타내는 등, 도식적으로 나타내고 있는 것이 있다. 이 때문에 구성요소간의 치수나 비율 등은 실물과 다르게 되어 있는 경우가 있다. 또한 본 발명의 실시예에 기재한 부재나 부분의 치수, 재질, 형상, 그 상대위치 등은, 특히 특정적인 기재가 없는 한, 본 발명의 범위를 그것에만 한정하는 취지가 아니라 단순한 설명예에 불과하다.
<세포배양부재>
도1은 세포배양부재(1)의 단면 설명도, 도2는 배양부위(13)를 제거한 세포배양부재(1)의 설명도로서, 도2(a)는 단면설명도, 도2(b)는 평면 설명도이다.
세포배양부재(1)는 기판(11)의 위에 하이드로겔 부위(12)를 형성하고, 하이드로겔 부위(12)를 덮어서 배양부위(13)를 형성한 것이다. 하이드로겔 부위(12)는 세포성장인자의 서방용 담체(徐放用 擔體)이다. 또한 하이드로겔 부위(12)는 제1세포종에 관한 증식세포의 접착부위이기도 하다.
기판(11)의 형상은 보통, 평판이나 얇은 평판 또는 필름모양이다. 기판(11)의 위에 패턴모양으로 하이드로겔 부위(12)가 형성되어 있고, 하이드로겔 부위(12)가 없는 부분은 세포 비접착 부분(15)이 노출되어 있다. 기판(11)을 구성하는 기재(11-1)가 세포 비접착 재료(예를 들면 폴리디메틸실록산(이하, ＰＤＭＳ라고 부른다))로 이루어지는 것이라면, 기판(11)은 기재(11-1)만으로 구성된다.
기재(11-1)가 세포접착재료(예를 들면 폴리에틸렌 테레프탈레이트(이하, ＰＥＴ라고 부른다))로 이루어지는 것이라면, 기재(11-1)의 상면의 전체면에 세포 비접착 재료를 층모양(層狀)으로 도포함으로써 세포 비접착층(11-2)을 형성한다. 본 발명에 있어서 세포 비접착층(11-2)은, 기재(11-1)의 재료, 표면성질 등에 따라 그 존재가 필요하거나 불필요하거나 한다.
기재(11-1)의 재료는 ＰＤＭＳ, ＰＥＴ, 글라스, 실리콘, 금속(알루미늄, ＳＵＳ304 등의 스테인리스스틸(Stainless steel), 금, 은 등), 금속산화물(알루미나, 산화티탄, ＩＴＯ, 산화주석) 등이다. 세포 비접착층(11-2)의 재료는 아가로스(agarose), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), ＰＤＭＳ 등이다.
하이드로겔 부위(12)는, 패턴모양이고 또한 층모양으로 형성된다. 패턴모양으로 형성하는 이유는, 제1세포종에 관한 배양세포 집합체의 2차원(기판(11)의 평면방향) 형상을 제어하기 위해서이다. 도2(b)를 참조하면, 본 실시예에서는 하이드로겔 부위(12)는 직선모양이며, 5개의 직선이 평행하게 배열된 패턴으로 이루어져 있다. 패턴모양으로 형성하는 하이드로겔 부위의 선폭(화살표(22))은 특히 제한은 없지만, 10μm∼500μm로 하는 것이 바람직하다. 패턴모양으로 형성하는 하이드로겔 부위 상호간의 간격(화살표(23))은 특히 제한은 없지만, 50μm∼1000μm로 하는 것이 바람직하다.
하이드로겔 부위(12)는 층모양으로 형성함으로써 높이를 부여하였다. 높이를 부여함으로써 하이드로겔 부위(12)에 부피가 부여되므로, 하이드로겔 부위(12)에 세포성장인자 용액을 침윤시킴으로써 세포성장인자 서방을 위한 저장이 가능해진다.
세포성장인자를 저장하고 또한 서방하기 위해서, 하이드로겔 부위(12)는 하이드로겔(hydrogel)로 형성된다.
또한 층모양으로 형성되는 하이드로겔 부위(12)의 두께(화살표(21))는 특별하게 한정되는 것은 아니다. 파종한 세포가 하이드로겔 부위(12)를 향하는 방향으로 이동, 증식하는 데에 충분한 시간과 양의 세포성장인자를 서방할 수 있는 저장량이 있으면 좋다.
하이드로겔의 가교도(架橋度)를 조정하면, 세포성장인자의 서방기간은 조정가능하다. 하이드로겔의 가교도에 대응하는 지표로서 함수율(含水率)이 있다. 하이드로겔의 가교도는 보통 70% 이상, 99% 이하이며, 바람직하게는 90% 이상 99% 이하이다. 함수율을 이 범위로 하면, 제1세포종에 관한 세포배양기간 동안의 모든 기간에 걸쳐서, 제1세포종에 관한 증식세포의 증식방향을 정하는 데에 충분한 세포성장인자가 계속하여 서방되기 때문이다.
하이드로겔 부위(12)에 요구되는 세포성장인자의 서방기간은 바람직하게는 2일 이상, 21일 이하이다. 또한 하이드로겔 부위(12)의 바람직한 두께는 1μｍ이상, 3000μｍ이하이며, 더 바람직하게는 20μｍ이상, 70μｍ이하이다. 제1세포종에 관한 세포배양기간 동안의 모든 기간에 걸쳐서, 제1세포종에 관한 증식세포의 증식방향을 정하는 데에 충분한 세포성장인자가 계속하여 서방되기 때문이다.
하이드로겔 부위(12)의 재료는, 젤라틴, 콜라겐, 히아루론산, 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin), 피브린(fibrin) 등이며, 젤라틴이 특히 바람직하다. 젤라틴은 비교적 저온으로의 가열에 의하여 열가교 할 수 있기 때문이다.
하이드로겔 부위(12)의 형성방법은, (1)유리판 등의 위에 소정 두께의 박층물(薄層物)을 형성하고 이것을 잘라내서 기판(11)상에 재치하는 방법, (2)디스펜서를 사용하여 겔모양 재료를 재치하는 방법, (3)스크린 인쇄로 거듭 인쇄를 하는 방법 등, 임의의 방법으로 할 수 있다.
배양부위(13)는, 하이드로겔 부위(12)를 덮어서 층모양으로 형성한다. 기판의 평면방향을 생각하면, 배양부위(13)는 당해 평면방향으로 면모양으로 형성한다. 하이드로겔 부위(12)는 기판(11)상의 세포 비접착 부분(15)에 둘러싸여져 있고, 배양부위(13)는 면모양으로 형성되어 있기 때문에, 배양부위(13)는 하이드로겔 부위(12)와 세포 비접착 부분(15)을 덮고 있다.
배양부위(13)의 상면은 제1세포종 파종면(14)이다. 세포배양부재(1)에 있어서, 배양대상이 되는 제1세포종은 제1세포종 파종면(14)에 놓여진다. 배양부위(13)의 상면은, 층모양으로 형성된 배양부위(13)의 2개의 면 중에서 기판(11)으로부터 먼 쪽의 면이다.
배양부위(13)는 제1세포종이 증식하는 부위이다. 또 배양부위(13)는 하이드로겔 부위(12)로부터 세포성장인자가 서방되는 부위이다. 또한 배양부위(13)는 제2세포종이 증식하는 부위이기도 하다.
배양부위(13)의 층 두께 즉 하이드로겔 부위(12)의 표면으로부터 제1세포종 파종면(14)까지의 거리(화살표(26)로 나타낸다)는 10μm∼30mm, 바람직하게는 100μm∼5mm이다. 층 두께가 이 범위이면, 제1세포종에 관한 증식세포에 있어서 세포성장인자 방출방향으로 방향이 정해지는 효과가 얻어지고 또한 3차원 방향(층 두께방향)으로의 구조가 확인될 수 있기 때문이다.
배양부위(13)의 재료는 매트리겔, 콜라겐 등이다. 콜라겐은 콜라겐 겔이어도 좋고, 콜라겐 스펀지여도 좋다.
<세포배양방법>
계속하여 제1세포종에 관한 세포배양방법을 설명한다. 세포의 배양에 앞서서 세포배양부재를 준비한다.
세포배양부재는, 우선 (1)기판(11)의 위에, 패턴모양이고 또한 층모양의 하이드로겔 부위(12)를 형성하는 공정, 다음에 (2)하이드로겔 부위(12)에 세포성장인자를 침윤시키는 공정, 계속하여 (3)하이드로겔 부위(12)를 덮어서 층모양의 배양부위(13)를 형성하는 공정에 의하여 완성된다.
도3은 제1세포종에 관한 세포배양방법의 개념 설명도로서, 도3(a)는 제1세포종 파종직후의 상태를 나타내고, 도3(b)는 제1세포종 배양 초기의 상태를 나타내고, 도3(c)는 제1세포종 배양 후기의 상태를 나타내고 있다.
도3(a)를 참조하면, 배양부위의 표면인 제1세포종 파종면(14)에 배양세포를 파종한다. 파종한 제1세포종에 관한 세포의 이미지를 부호 31로 나타내고 있다. 본 발명의 세포배양방법을 적합하게 실시할 수 있는 제1세포종의 예로서, 정상 인간 제대정맥 내피세포(臍帶靜脈 內皮細胞)(이하, ＨＵＶＥＣ라고 부른다), 섬유아세포(纖維芽細胞), 내피세포, 상피세포(上皮細胞), 혈관 내피세포, 혈관 평활근세포(血管平滑筋細胞), 림프관 내피세포, 담관 상피세포, 표피세포 등을 들 수 있다.
본 발명의 세포배양방법과 세포배양부재에 사용하는 세포성장인자는, 제1세포종에 관한 세포의 증식과 이동을 촉진하는 속성을 가지는 세포성장인자이면 특별하게 한정되는 것은 아니다. 예를 들면 ＨＵＶＥＣ세포를 배양하는 경우에는 세포성장인자 VEGF를 선택하고, 림프관 상피세포를 배양하는 경우에는 세포성장인자 VEGF를 선택하고, 표피세포를 배양하는 경우에는 케라티노사이트 세포인자(ＫＧＦ)를 선택하여 사용한다.
제1세포종에 관한 파종세포(31)는 파종전에 기아처리(Starvation처리)를 하는 것이 바람직하다. 세포성장인자 방향으로의 이동과 당해 방향으로의 증식이 더한층 이루어지기 때문이다.
도3(b)를 참조하면, 하이드로겔 부위(12)로부터 배양부위(13)를 향하여 세포성장인자가 서방되고 있다. 방출된 세포성장인자의 이미지를 화살표(34)로 나타내고 있다. 파종한 세포(31)는 세포성장인자(34)의 방향으로 이동하여 당해 방향으로 증식한다. 도3(ｂ)중에 배양 초기의 배양세포 집합체의 이미지를 부호 32로 나타내고 있다.
배양기간 동안에 제1세포종은 방출되는 세포성장인자 방향으로의 이동과 당해 방향으로의 증식을 반복한다. 배양 후기에 이르면 제1세포종에 관한 배양세포 집합체는, 세포파종면(14)과 하이드로겔 부위(12)를 연락(連絡)하는 상태가 된다. 도3(ｃ)에서 배양 후기의 배양세포 집합체의 이미지를 부호 33으로 나타내고 있다. 이렇게 하여 배양세포 집합체의 3차원(배양부위(13)의 층 두께방향) 구조의 제어가 이루어진다.
기판(11)상에 하이드로겔 부위(12)를 둘러싸는 부분은 세포 비접착 부분(15)으로, 배양세포는 세포 비접착 부분(15)에 이르는 경우는 없다. 이렇게 하여 배양세포 집합체의 2차원(배양부위(13)의 면방향) 구조의 제어가 이루어진다.
ＨＵＶＥＣ세포를 배양하면, 배양세포 집합체(33)는 관상구조(管狀構造)가 된다.
계속하여 본 발명에 관한 세포배양방법의 바람직한 실시예를 설명한다. 상술한 바와 같이 하여 얻은 배양세포 집합체를 포함하는 세포배양부재에 제2세포종을 파종한다. 제2세포종은 배양부위에 파종한다. 그 후에 세포배양부재를 배양조건하에 놓고, 제2세포종을 증식시킨다. 배양조건에 대해서는 사용하는 세포에 따라서도 다르지만, 공지의 배양방법을 사용한다.
이와 같이 하여, 생체내의 환경과 유사한 환경에서 2종류의 세포의 공배양(共培養)을 할 수 있다.
제2세포종의 예는, 간실질세포, 이토세포(Ito cell), 췌장실질세포, 심근세포, ##신경세포, 간엽계 세포, ##종양세포 등이다. 제1세포종과 제2세포종의 조합에 대해서는 특별한 제한은 없다.
[실시예1]
<세포배양부재(배양부위 형성전)의 작성>
핫플레이트(50도) 상에서, 역접착처리(逆接着處理)가 되어 있는 ＰＥＴ필름(테이진테트론 필름 G274) 위에 아가로스 수용액(80도, 5%)을 바코팅(bar-coating)하였다. 오븐중에서 40도, 30분간 가열건조를 하였다.
유리판을 핫플레이트(50도) 상에서 가온(加溫)하면서 30% 젤라틴 수용액을 코팅하였다. 냉각후에 젤라틴을 잘라내어 상기 아가로스 코팅 완료 필름 위에 놓았다. 그 후에 당해 필름을 잘라 나누어 젤라틴 패턴 기재를 얻었다.
작성한 젤라틴 패턴 기재를 140도, 48시간 진공가열건조 함으로써 젤라틴의 가교 및 멸균을 실시하였다. 하이드로겔 부위인 젤라틴의 층 두께는 50μm, 젤라틴의 패턴은 1개의 직선, 선폭은 70μm이었다.
세포성장인자는 HumanVEGF165를 사용하였다. HumanVEGF165 40ng/ml 수용액에 가교가 끝난 젤라틴 기재를 담그고 기재상의 젤라틴에 VEGF수용액을 스며들게 하였다. 또한 컨트롤로서, 순수(純水)에 가교가 끝난 젤라틴 기재를 담그고 기재상의 젤라틴에 순수를 스며들게 하였다.
<제1세포종의 준비>
파종(배양)세포는 HUVEC를 사용하였다. HUVEC를 소정의 배양액으로 배양한 후에, 1일전에 배양액(medium)을 medium199 + 0.5% FCS(송아지 혈청) + 1% P/S(페니실린 스트렙토마이신)로 교환하여 배양하였다. 당해 배양은 기아처리(starvation처리)이다. 세포배양실험 직전에 콜라게나제(collagenase) 처리에 의하여 HUVEC를 떼어냈다. 얻어진 HUVEC를 PKH26에 의하여 형광표지 하였다.
<파종과 배양>
24웰 플레이트(24well plate) 하부에 VEGF 함침 젤라틴 패터닝 기재를 정치(靜置)하고, 24웰 셀 컬처 인서트(24well cell culture insert) 상부에 배양부위인 매트리겔(matrigel)층을 제작하였다. 매트리겔의 농도는 10mg/ml이었다. 당해 매트리겔 용액을 20μl 사용한 것과, 50μl 사용한 것의 2종류의 세포배양부재를 사용하였다. 매트리겔 용액 20μl의 경우에 매트리겔층의 두께는 약 0.7mm이며, 매트리겔 용액 50μl의 경우에 매트리겔층의 두께는 약 1.7mm이었다. 컨트롤은, 24웰 플레이트 하부에 순수 함침 젤라틴 패터닝 기재를 정치하고, 24웰 셀 컬처 인서트 상부에 배양부위인 매트리겔층을 동일하게 제작하였다.
세포파종면인 매트리겔층 표면에 기아처리 완료된 PKH26 형광표지 HUVEC를 파종하였다. CO2 인큐베이터내에서 21시간 배양하였다.
<배양세포의 평가>
배양종료후에 플레이트 리더(plate reader)로 셀 컬처 인서트(cell culture insert) 하부의 형광강도를 측정함으로써, 배양부위(매트리겔층) 하부로 이동한 HUVEC 세포수를 평가하였다.
평가결과를 도4에 나타냈다. VEGF 미첨가군(컨트롤군)과 비교하여 VEGF 함침 젤라틴 기재군에서는 셀 컬처 인서트 하부의 형광강도가 증가하였다. 이에 따라, VEGF 함침 젤라틴 패터닝 기재로부터 방출된 VEGF에 의하여 HUVEC가 배양부위(매트리겔층)중을 VEGF의 방향(하부)으로 이동하였음을 알 수 있다.
1 세포배양부재
11 기판
11-1 기재
11-2 세포 비접착층
12 하이드로겔 부위
13 배양부위
14 제1세포종 파종면
15 세포 비접착 부분
31 제1세포종에 관한 파종한 세포(이미지)
32 제1세포종에 관한 배양세포 집합체 배양 초기(이미지)
33 제1세포종에 관한 배양세포 집합체 배양 후기(이미지)
34 방출된 세포성장인자(이미지)

Claims (9)

  1. 기판(基板)의 위에,
    패턴모양이고 또한 층모양(層狀)의 하이드로겔 부위(hydrogel部位)를 형성하고,
    상기 하이드로겔 부위를 덮어서 층모양의 배양부위(培養部位)를 형성한 세포배양부재(細胞培養部材)에 있어서,
    상기 배양부위의 표면이 제1세포종 파종면(細胞種 播種面)이며,
    상기 하이드로겔 부위는 세포성장인자(細胞成長因子)가 침윤(浸潤)되어 있고,
    상기 하이드로겔 부위로부터 상기 배양부위로 세포성장인자를 서방(徐放)하는 것을 특징으로 하는 세포배양부재.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 하이드로겔 부위의 두께는, 상기 하이드로겔 부위로부터 상기 배양부위로 세포성장인자를 2일 이상, 21일 이하 서방하는 두께인 것을 특징으로 하는 세포배양부재.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 하이드로겔 부위의 두께는 1μｍ이상, 30mm이하인 것을 특징으로 하는 세포배양부재.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 하이드로겔 부위는 열가교 젤라틴(熱架橋gelatine)으로 이루어지는 것인 세포배양부재.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 하이드로겔 부위를 형성하는 하이드로겔의 함수율(含水率)이 70% 이상, 99% 이하인 것을 특징으로 하는 세포배양부재.
  6. 이하의 공정으로 이루어지는 세포배양방법.
    A. 기판의 위에 패턴모양이고 또한 층모양의 하이드로겔 부위를 형성하는 공정
    B. 상기 하이드로겔 부위에 세포성장인자를 침윤시키는 공정
    C. 상기 하이드로겔 부위를 덮어서 층모양의 배양부위를 형성하여 세포배양부재를 완성하는 공정
    D. 상기 배양부위의 표면에 제1세포종을 파종하는 제1세포종 파종공정
    E. 제1세포종 파종공정을 끝낸 세포배양부재를 배양조건하에 두는 제1세포종 배양공정
  7. 제6항에 있어서,
    D의 공정인 제1세포종 파종공정에 사용하는 제1세포종은, 파종전에 기아처리(飢餓處理)를 한 세포인 것을 특징으로 하는 세포배양방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 하이드로겔 부위를 형성하는 하이드로겔의 함수율을 70% 이상, 99% 이하의 범위로 하고, 하이드로겔의 함수율을 상기 범위내에서 변경함으로써 상기 하이드로겔 부위로부터 상기 배양부위로 세포성장인자를 서방하는 기간을 조정하는 것을 특징으로 하는 세포배양방법.
  9. 제6항에 있어서,
    E의 공정인 제1세포종 배양공정에 계속하여 이하의 공정을 하는 것을 특징으로 하는 세포배양방법.
    F. 상기 배양부위에 제2세포종을 파종하는 제2세포종 파종공정
    G. 제2세포종 파종공정을 끝낸 세포배양부재를 배양조건하에 두는 제2세포종 배양공정
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220073873A (ko) * 2020-11-26 2022-06-03 성균관대학교산학협력단 2차원 세포 및 3차원 세포 이식용 패치

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102078602B1 (ko) 2015-07-23 2020-02-19 한국화학연구원 지방세포와 마크로파지의 3차원 공동 배양 방법
US10000732B2 (en) * 2015-11-20 2018-06-19 National Health Research Institutes Microfluidic dual-well device for highthroughput single-cell capture and culture
JP6678520B2 (ja) * 2016-06-01 2020-04-08 大日本印刷株式会社 細胞集合体の製造方法
WO2019161048A1 (en) * 2018-02-14 2019-08-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Hierarchic neural microphysiological system for brain function and disorders
CN109628390A (zh) * 2018-12-30 2019-04-16 深圳光彩生命工程技术有限公司 一种水凝胶状的细胞培养配方
WO2022028150A1 (zh) * 2020-08-04 2022-02-10 南京凌芯生物科技有限公司 筛选靶细胞或细胞的方法及生物培养芯片

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2414990B (en) * 2003-02-21 2007-05-23 Uab Research Foundation Biologically active native biomatrix composition
US20070110962A1 (en) * 2003-09-23 2007-05-17 Joe Tien Three-dimensional gels that have microscale features
JP4699361B2 (ja) * 2004-04-26 2011-06-08 大日本印刷株式会社 細胞培養用パターニング基板およびその製造方法
JP4303643B2 (ja) 2004-06-01 2009-07-29 育男 森田 人工組織体およびその製造方法
US20060153894A1 (en) * 2004-06-30 2006-07-13 Ragae Ghabrial Multi-compartment delivery system
CN101920046A (zh) * 2005-02-23 2010-12-22 Hi-Lex株式会社 医用材料、人工牙根及医疗材料的制造方法
US8129188B2 (en) * 2005-09-29 2012-03-06 Industrial Technology Research Institute Cell culture apparatus and method of fabricating the apparatus
DE102007028423A1 (de) * 2007-06-20 2008-12-24 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Verfahren und Vorrichtung zur Bildung von Aggregaten biologischer Zellen
JP5656158B2 (ja) * 2008-03-05 2015-01-21 国立大学法人金沢大学 再生組織用細胞内カルシウムイオンモニタリング装置
JP2010098973A (ja) 2008-10-22 2010-05-06 Konica Minolta Holdings Inc 細胞培養支持体並びに細胞培養方法
WO2012092542A2 (en) * 2010-12-30 2012-07-05 University Of Massachusetts Lowell Responsive cell culture hydrogel
CN102188759A (zh) * 2011-03-11 2011-09-21 西安交通大学 一种用于细胞复合培养的肝组织工程支架及其制备方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220073873A (ko) * 2020-11-26 2022-06-03 성균관대학교산학협력단 2차원 세포 및 3차원 세포 이식용 패치

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