EP1280888A1 - Procedes de culture de cellules, amas cellulaires obtenus par ces procedes et utilisation de ceux-ci - Google Patents

Abstract

L'invention porte sur des procédés d'obtention de cellules ancrage-dépendantes (CAD), par culture desdites cellules sur des microsupports bidimensionnels cryosensibles (2D-MS2). Les feuillets, sphéroïdes, organoïdes ou agrégats cellulaires, susceptibles d'être obtenus par ces procédés font également partie de l'invention, ainsi que leurs applications, notamment pour l'élaboration de tissus ou organes artificiels.

Description

Procédés de culture de cellules, amas cellulaires obtenus par ces procédés et utilisation de ceux-ci

La présente invention porte sur de nouveaux procédés de culture de cellules ancrage-dépendantes sur des microsupports à géométrie bidimensionnelle cryosensibles. Plus précisément, l'invention porte sur des procédés d'obtention de cellules animales ancrage-dépendantes, individualisées ou formant des associations cellulaires de types feuillets, agrégats, sphéroïdes ou organoïdes plus organisés, présentant des propriétés particulières telles qu'une grande viabilité des cellules et une homogénéité de taille des amas cellulaires.

L'industrie biotechnologique repose en grande partie sur la culture des cellules in vitro afin de générer et isoler certains composants biochimiques. Les cellules cultivées sont souvent modifiées génétiquement afin de produire de nouvelles molécules ou des molécules qu'il est extrêmement difficile d'isoler à partir d'organes ou de liquides physiologiques. Les techniques de culture de cellules procaryotes et de cellules eucaryotes ancrage-indépendantes sont bien maîtrisées par l'industrie. Or de nombreuses lignées cellulaires et de nombreux types de cellules normales ancrage-dépendantes sont utilisés dans l'industrie pour la production de substances biologiques, pharmaceutiques ou médicales. Les cellules ancrage-dépendantes (CAD) doivent impérativement interagir physiquement avec un support pour être viables, fonctionnelles et proliférer. Cette dépendance constitue un facteur limitant de la culture de ces cellules comparativement aux cellules ancrage-indépendantes qui, elles, peuvent proliférer en suspension.

Plus récemment donc, des techniques de culture en masse de cellules eucaryotes ancrage-dépendantes ont été exploitées. Pour ce faire, plusieurs types de microsupports sont utilisés industriellement pour la production de produits biologiques et pharmaceutiques, dont les plus connus sont les microbilles tridimensionnelles Cytodex® (3D) de Pharmacia (UPPSALA, Suède).

Une nouvelle génération de microsupports, à géométrie bi-dimensionnelle, a été développée et décrite dans EP 579 596.

Par géométrie bidimensionnelle, il faut entendre que l'épaisseur de ces microsupports tend à devenir infime et négligeable par rapport aux dimensions des cellules cultivées. Cette réduction d'épaisseur est telle qu'il n'y a aucune possibilité de croissance des cellules, ni au sein du support, ni sur sa tranche mais uniquement sur ses deux faces d'ancrage. Ces microsupports 2D (2D-MS) ont une surface volumique élevée (environ 950 cm²/cm³), et offrent donc le principal avantage d'une surface d'ancrage par unité de volume plus élevée que l'ensemble des compétiteurs 3D, telles les microbilles du type CYTODEX® mentionnées ci-dessus.

Ils permettent donc, pour une occupation de volume de culture donnée dans un bioréacteur, de cultiver et d'obtenir plus de cellules par unité de volume. En effet, la surface d'ancrage externe d'une sphère (4πR²) est égale à la surface totale de deux disques (2 x 2πR²) infiniment minces situés à l'équateur et s'inscrivant dans cette sphère. Cependant, les volumes combinés de ces deux disques "équatoriaux" deviennent d'autant plus faibles que l'épaisseur du film, utilisé pour les produire, est faible, ne représentant qu'une infime fraction du volume de la sphère qui les circonscrit. Adoptant une épaisseur de 10μm pour l'ensemble des disques générés dans une sphère, la surface totale apte à l'ancrage des cellules ainsi fournie par les disques est environ 3.3 fois supérieure à la surface extérieure de la sphère, tenant compte des mouvements aléatoires de ceux-ci, en suspension.

La grande surface d'ancrage disponible pour les CAD par unité de volume des 2D-MS permet donc d'envisager la culture de cellules à hautes concentrations à l'échelle industrielle.

Une autre limitation des supports pour culture cellulaire ancrage- dépendante est celle du mode de récupération des cellules attachées à leur support, tout en préservant les propriétés biologiques ou physiologiques de ces dernières. En effet, le détachement des cellules de leur support passe par un traitement enzymatique (tel la trypsine) ou un agent chélateur (tel l'EDTA), qui peut endommager non seulement les fonctions cellulaires, mais également leur ré-attachement ultérieur à des supports dans le cadre de cultures en continu. Cette limitation est particulièrement préjudiciable lorsque les fonctions biologiques des cellules sont utilisées ensuite sur le plan industriel. Cette situation est fréquemment rencontrée dans le cas de production de macromolécules d'intérêt par lesdites cellules, ou encore quand l'intégralité des récepteurs ou molécules membranaires est recherchée pour leur capacité à lier des ligands ou internaliser des molécules ou des substances. Les méthodes décrites ci-dessus ne sont donc pas adaptées, qualitativement ni quantitativement, à la culture de cellules à l'échelle industrielle en vue de produire de grandes quantités de molécules à haute valeur ajoutée telles que des glycoprotéines sensibles à la trypsinisation des cellules.

En outre, la culture à confluence des cellules ancrage-dépendantes conduit à la formation de liens intercellulaires ou de jonctions intercellulaires. Ces jonctions intercellulaires contribuent également à la fonctionnalité des cellules et leur destruction à la perte de ces fonctionnalités.

Ces limites dans la culture en masse des cellules ancrage-dépendantes conduisent également à une limite à la production industrielle de macromolécules biologiques produites par cesdites cellules, qu'il s'agisse des molécules synthétisées normalement par les cellules en question ou plus généralement produites par insertion par des techniques de recombinaison génétique de gènes codant pour une protéine hétérologue. Cette limitation liée aux capacités de production de cellules ancrage- dépendantes fonctionnelles peut conduire à des prix de revient industriels des protéines que l'on souhaite exprimer et purifier, incompatibles avec un prix de vente ultérieur d'un médicament contenant ladite protéine comme principe actif.

Des tentatives pour surmonter un certain nombre d'inconvénients décrits ci- dessus, notamment la nécessité d'utiliser des enzymes ou des agents chélateurs pour décrocher les cellules de leur support, ont été décrites dans EP 387 975 et dans EP 382 214. Ces deux brevets proposent de recouvrir les supports classiques de culture cellulaire par le produit de la copolymérisation de monomères hydrophiles choisis parmi les dérivés de poly-N-alkyl-(meth)acrylamide, leurs copolymères respectifs, le poly-N- acryloyl-piperidine ou le poly-N-acryloyl-pyrrolidine dont la fonctionnalité recherchée est la cryosensibilité. Le terme « cryosensible » indique que l'abaissement de la température d'une culture de cellules attachées sur ces microsupports 2D, en-deçà d'une température donnée, conduit au détachement de ces cellules.

Dans cette utilisation, le polymère est choisi en fonction de la température inférieure critique (lower critical solution température, ou LCST), qui est une température de transition pour l'hydratation et la déshydratation du composé polymérique. Quand la LCST est inférieure à la température de culture des cellules, les cellules restent fixées sur le support du polymère pendant la phase de culture cellulaire. Elles peuvent en être décrochées consécutivement à un abaissement de la température de la culture tel que cette dernière est substantiellement inférieure à la LCST. Les méthodes d'obtention d'un polymère ou d'un copolymère avec une température LCST donnée sont décrites dans EP 382 214 B1. De manière générale, on peut dire que l'inclusion de monomères hydrophiles dans le processus de polymérisation tend à augmenter la LCST, alors que la présence de polymères hydrophobes tend à diminuer la LCST. Des exemples de monomères hydrophiles sont : N-vinyl-pyrrolidone, vinylpyridine, acrylamide, methacrylamide, N-methyl-acrylamide, hydroxyethyl- methacrylate, hydroxyethyl-acrylate, hydroxymethyl-metha-crylate, hydroxymethyl-acrylate, acide acrylique et acide methacrylique ayant des groupes acides et leurs sels, acide vinyisuifonique, acide styrylsulfonique et N,N'-dimethylamino-ethyl-methacrylate, N,N'-diethylamino-ethyl- methacrylate, et N,N'-dimethylamino-propyl-acrylamide ayant des groupes basiques et leurs sels.

Des exemples de monomères hydrophobes sont : les dérivés acrylates et dérivés methacrylates tels que l'éthyl-acrylate, le methyl- methacrylate et le glycidyl-methacrylate etc., les dérivés N-substitués-aikyl-(meth)- acrylamides tels que le N-nbutyl-(meth)-acrylamide et le N-isopropyl- acrylamide etc. ainsi que le chlorure de vinyl, l'acrylonitrile, le styrène, et l'acétate de vinyl etc.

Néanmoins, les moyens décrits dans ces demandes pour coupler ces polymères ou copolymères cryosensibles sur les supports de culture cellulaire ne permettent :

" ni le contrôle de la quantité et donc de l'épaisseur des polymères greffés, paramètre particulièrement important lorsque l'on veut contrôler la densité des cellules en culture ;

" ni d'assurer un couplage covalent du polymère ou copolymère sur le support de culture ; ceci est un inconvénient majeur dans la mesure où il ne permet pas la conservation à long terme de ces supports ni leur réutilisation.

Dans une récente demande de brevet européen (N° 99402710.0), A. Miller et al. ont décrit des nouveaux microsupports cryosensibles à géométrie bidimensionnelle (2D-MS2), sur lesquels sont greffées des molécules conférant au microsupport des propriétés particulières telles que la cryosensibilité ou l'adhésion spécifique. L'originalité de cette demande N° 99402710.0 réside notamment dans le procédé de production desdits 2D- MS2, qui permet un greffage covalent des molécules dont la fonctionnalité est recherchée. Ce procédé comprend notamment la succession d'étapes suivantes :

• une production en continu de bobines de film polymère d'une épaisseur inférieure ou égale à 35 μ à partir de granules d'un polymère donné ;

• une activation dudit film polymère par tout moyen permettant de générer des groupements réactifs, notamment des radicaux ou des fonctions peroxydes, hydroperoxydes ou aminés ;

• un greffage covalent entre le film polymère activé et un polymère, un copolymère ou une macromolécule d'intérêt dont la fonctionnalité est recherchée, ledit greffage étant obtenu par immersion du film dans une solution de monomère, la copolymérisation étant amorcée par les radicaux libres créés par l'activation sous rayonnement β, le temps d'immersion étant directement corrélé à l'épaisseur recherchée du polymère greffé sur le film ; • le cas échéant un lavage pour éliminer les monomères non consommés et non fixés sur le film ;

• une découpe du film polymère par un procédé choisi en fonction de la géométrie et de la taille des microsupports 2D recherchées ; ^« le cas échéant, une étape de stérilisation, soit par autoclavage, soit par rayonnement, la méthode de stérilisation étant bien entendu choisie en fonction du matériau à stériliser.

Lorsque la nature du polymère mis en œuvre pour la production du film polymère est de type polyester aliphatique, le film est par essence biorésorbable / biodégradable et, dans ce cas, il peut être utilisé en tant qu'implant dans l'organisme vivant si le polymère mis en œuvre est de grade biomédical, de préférence reconnu par la FDA.

Pour des raisons essentiellement économiques, les industriels tendent à transformer le processus discontinu de culture des cellules ancrage- dépendantes en un processus semi-continu tel que la culture sérielle, procédé au cours duquel ce sont toujours les mêmes microsupports qui sont réutilisés, l'inoculum provenant d'une partie des cellules du cycle précédent.

L'un des buts de la présente invention est de répondre au besoin exprimé par les industriels d'obtenir de grandes quantités de cellules individualisées intactes, notamment en utilisant des microsupports 2D cryosensibles du même type que ceux décrits dans la demande citée ci-dessus.

L'invention revendiquée porte donc sur des procédés d'obtention de cellules ancrage-dépendantes (CAD), comportant les étapes suivantes : a) ensemencement de microsupports cryosensibles à géométrie bidimensionnelle (2D-MS2) par des CAD, b) culture à une température supérieure à la température inférieure critique (LCST) du polymère responsable de la cryosensibilité du microsupport, c) décrochage des cellules des microsupports, par abaissement de la température de la culture à une température substantiellement inférieure à ladite LCST, d) le cas échéant, reproduction des étapes b) et c) jusqu'à l'obtention de la quantité souhaitée de cellules. De manière préférée, les microsupports ensemencés à l'étape a) sont constitués d'un film polymère sur lequel sont greffées de manière covalente les molécules assurant la cryosensibilité desdits microsupports. De manière encore préférée, les 2D-MS2 utilisés sont ceux décrits dans la demande de brevet européen N° 99402710.0.

Dans une première réalisation de l'invention, les cellules ancrage- dépendantes sont obtenues individualisées ou non, intactes, à grande échelle, comme il est illustré dans l'exemple 1. Des microsupports cryosensibles à géométrie bidimensionnelle (notés ci-après 2D-MS2) sont ensemencés par des cellules ancrage-dépendantes et la culture poursuivie à une température compatible avec la culture cellulaire et supérieure à la LCST des polymères greffés sur les microsupports, de préférence à 37°C. La culture est poursuivie jusqu'à un stade précédant celui de la confluence, durant lequel des jonctions soudent les cellules les unes aux autres. De manière préférée, pour obtenir le meilleur rendement possible, la culture est poursuivie jusqu'au stade précédant immédiatement celui de la confluence. A ce moment, sans arrêter l'agitation, la température de la culture est abaissée et maintenue à une température substantiellement inférieure à la LCST, jusqu'à ce que toutes les cellules se soient décrochées et flottent dans la suspension sous forme individualisée ou d'agrégats. Une température est considérée comme « substantiellement inférieure à la LCST » dès lors que celle-ci est inférieure d'au moins 25°C à la LCST. De manière préférée, la température est maintenue à 4-10°C pour assurer le décrochement des cellules. La sédimentation des microsupports 2D cryosensibles, consécutive à l'arrêt de l'agitation, permet d'écrémer les cellules intactes présentes dans le surnageant. Le cas échéant, une partie ou la totalité de ces cellules peut être utilisée pour ré-ensemencer des 2D- MS2 et accomplir un nouveau cycle d'amplification cellulaire.

Dans cette réalisation de l'invention, les cellules utilisées sont préférentiellement des cellules qui ne forment pas de jonctions intercellulaires très fortes comme les fibroblastes dermiques humains, les CHO (Chinese Hamster Ovary), les fibroblastes murins L929, les fibroblastes murins 3T3. Néanmoins, la culture de cellules épithéliales telles que les kératinocytes peut aussi être envisagée dans du milieu sans sérum et à faible concentration calcique (<0,1 mM). Ainsi, les cellules récoltées, qu'elles soient individualisées ou non, gardent intactes leurs protéines membranaires et en particulier le segment extracellulaire de celles-ci. Ces cellules intéressent particulièrement les scientifiques dont les recherches nécessitent de pouvoir disposer de protéines membranaires intactes, les industriels qui mettent au point des tests de diagnostic, de toxicologie, de criblage et autres à partir de telles protéines, ainsi que l'industrie pharmaceutique qui utilise de telles protéines pour la conception de vaccins par exemple.

Une deuxième réalisation de l'invention permet de réutiliser les 2D-MS2 après en avoir décroché les cellules, et d'opérer automatiquement leur réensemencement de manière à réaliser ce qu'il est convenu d'appeler la culture sérielle, ou culture continue. Dans un tel procédé de culture, des cellules individualisées intactes sont produites à chaque cycle, comme illustré dans l'exemple 2. Une première façon de réaliser une culture en continu est de ne récolter qu'une partie des cellules décrochées (en général, plus de 90%, mais cela peut varier suivant les cellules cultivées), avant d'effectuer un nouveau cycle de culture à 37°C sous agitation. Une approche préférée pour réaliser une culture sérielle consiste à ne pas décrocher toutes les cellules des microsupports. Il suffit pour ce faire d'utiliser dans le procédé des 2D-MS2 dont un certain pourcentage (par exemple, 2-10%) de la surface de chaque microsupport n'est pas cryosensible, conférant ainsi une cryosensibilité partielle (détachement partiel). Dans ce cas, l'étape d) du procédé décrit ci-dessus est réalisée par remise en suspension et à température de culture des 2D-MS, après détachement partiel conformément à l'étape c). Ainsi, en procédant de la manière décrite dans l'exemple 1 et consécutivement à l'abaissement de la température de 37°C à 4-10°C, 2 à 10% des cellules ne se détachent pas du microsupport. Ce sont ces cellules qui servent d'inoculum pour le cycle suivant. Les pourcentages donnés ici sont illustratifs et non limitatifs. Tout pourcentage compris entre 2 et 80 % peut être opérationnel dans le procédé de culture sérielle. Un décrochement partiel des cellules du microsupport dans l'étape c) est également réalisable en diminuant l'épaisseur du dépôt de polymère cryosensible. Par exemple, pour un détachement de 90% de cellules CHO, l'épaisseur du polymère peut être réduite de 10 à 2 nanomètres. Les cellules utilisées dans ces procédés de culture sont de préférence des cellules dont les jonctions intercellulaires sont faibles ou inexistantes, en tout cas dans le type de milieu de culture utilisé pour les cultiver. Tout comme pour la première réalisation de l'invention, les cellules produites ici en continu de par leur facilité d'obtention, intéressent les laboratoires académiques, pharmaceutiques et biotechnologiques pour le rendement de production, associé à la qualité supérieure des protéines membranaires obtenues.

Par opposition aux cellules individualisées obtenues par les procédés décrits ci-avant, l'obtention des structures tridimensionnelles de taille homogène, appelées, suivant le nombre de types cellulaires qui les composent, sphéroïdes (cellules appartenant toutes à un même type cellulaire), organoïdes (ou pseudo-organes constitués de cellules provenant de types cellulaires différents) ou agrégats (amas cellulaires caractérisés par une hétérodispersité de taille, composés ou non de plusieurs types cellulaires), présente de nombreux avantages, et le procédé selon l'invention permet la production contrôlée de ces différents types d'amas cellulaires.

L'investigation fondamentale, le criblage à grande échelle de molécules d'intérêt thérapeutique (high throughput screening), la toxicologie, la médecine réparatrice, et la thérapie génique notamment, constituent autant de domaines où les amas cellulaires (organoïdes, sphéroïdes, agrégats) trouvent leur pleine utilisation. Ceci n'est pas le cas, ou à un degré moindre, de ces mêmes cellules individualisées qui ne sont pas ou peu adaptées à la fonction recherchée.

Les cellules des organoïdes (et sphéroïdes et agrégats) sont agencées entre elles de telle manière par l'échafaudage que constituent les molécules de la matrice extracellulaire que tant leur viabilité que leurs fonctions physiologiques s'en trouvent améliorées, voire même restaurées au point d'égaler les performances de l'organe intact (Koide et al., 1989 ; Matsushita et al., 1991 ; Matsushita et al., 1992). Les fonctions physiologiques des cellules différenciées organisées en organoïdes sont maintenues à un haut niveau pendant de plus longues périodes que lors de leur culture en monocouche (Tong et al., 1990 ; Tong et al., 1992).

L'intérêt que représentent les structures cellulaires tridimensionnelles (agrégats, sphéroïdes, organoïdes) a stimulé le développement de plusieurs méthodes pour leur fabrication. La plupart de ces méthodes consistent à cultiver des cellules individualisées en culture stationnaire ou agitée afin que les cellules bien individualisées au départ finissent par s'agréger et former des agrégats cellulaires. Certaines méthodes utilisent des substrats non-adhérents comme les protéoglycanes, la polylysine, le

PVLA (poly-/V-p-vinylbenzyl-D-lactonamide) et la mousse de polyuréthane (Ijima et al., 1997). Mais avec toutes ces méthodes, il est impossible de contrôler la taille des amas cellulaires formés et la distribution de taille des sphéroïdes, organoïdes ou agrégats obtenus est alors très large.

La viabilité et la fonctionnalité des cellules composant les structures cellulaires tridimensionnelles sont dépendantes notamment de la taille atteinte par celles-ci. Par ailleurs, d'une lignée cellulaire à l'autre, la taille des amas cellulaires peut varier (Carvalhal et al., 1997). Par exemple, des sphéroïdes de fibroblastes pourront atteindre de 150 à 500 μm de diamètre. De manière préférée, la taille des microsupports 2D utilisés dans les procédés d'obtention de CAD de l'invention est choisie en fonction du type cellulaire des cellules cultivées, de façon à obtenir des amas de cellules viables, sans risque d'anoxie de certaines d'entre elles.

D'autres méthodes ont été développées afin de pouvoir produire des amas cellulaires. Il s'agit de méthodes utilisant un mélange de polymère cryosensible, le poly-N-isopropyl acrylamide (PNIPAAm), et de collagène comme support de culture des cellules. En effet, le PNIPAAm est un polymère insoluble au-dessus de 32°C et se solubilise en dessous de cette température. Des surfaces de culture recouvertes par ce polymère acquièrent donc la propriété de cryosensibilité (US patent n° 5.284.766). Pour ce faire, ce mélange est déposé au fond de boites de culture classique et laissé polymériser et sécher. Les cellules sont ensuite ensemencées sur ce support et cultivées jusqu'à confluence et formation de jonctions intercellulaires. A 37°C, les molécules de PNIPAAm présentent un certain caractère hydrophobe et les cellules restent parfaitement ancrées sur leur support. En abaissant la température de la culture, les cellules peuvent être détachées du support sous forme de feuillet mono ou pluricellulaire. En effet, en dessous de 32°C, le PNIPAAm acquiert un certain caractère hydrophile et les cellules se détachent du support sous forme de cellules isolées et/ou de feuillets (Takezawa et al., 1990 ; Takezawa et al., 1992 ; Takezawa ét al., 1993). Cependant, cette technique présente des limitations intrinsèques importantes. Elle ne permet pas de fabriquer de grandes quantités de flocons ni de fabriquer des flocons de taille prédéterminée et uniforme.

On constate donc qu'il y a besoin de surmonter ces problèmes de production d'amas cellulaires de taille micrométrique et homogène. L'un des buts de la présente invention est de répondre à ce besoin. Plus précisément, une troisième réalisation de l'invention porte sur de nouveaux procédés de culture de cellules ancrage-dépendantes sur microsupports à géométrie bidimensionnelle (2D-MS), cryosensibles (2D-MS2), afin de générer des structures bidimensionnelles ou tridimensionnelles cohérentes, de taille homogène, constituées de cellules appartenant à la même lignée cellulaire ou non, réalisant ainsi la culture de cellules ancrage-dépendantes sous forme de feuillets cellulaires, de sphéroïdes ou d'organoïdes en suspension. Ainsi, dans ce mode de réalisation du procédé de l'invention, l'étape b) de culture est poursuivie jusqu'au stade de la confluence, et les CAD sont obtenues après l'étape c) sous forme de feuillets cellulaires. Dans une mise en œuvre préférée de ce procédé de l'invention, la taille des feuillets cellulaires obtenus après l'étape c) est contrôlée. Cette taille dépend essentiellement de la taille des microsupports.

La remise en culture, sous agitation convenable, de ces feuillets cellulaires, précédée ou suivie de l'élimination des 2D-MS du milieu de culture, permet l'obtention de sphéroïdes (si les feuillets sont constitués d'un seul type cellulaire), ou d'organoïdes (si les feuillets comportent plusieurs types cellulaires). Si l'étape b) de culture est poursuivie au-delà du stade de la confluence, les CAD sont obtenues après l'étape c) sous forme d'agrégats cellulaires.

Des microsupports cryosensibles à géométrie bidimensionnelle (2D-MS2) sont ensemencés par des cellules ancrage-dépendantes provenant d'une même lignée cellulaire ou non, et la culture poursuivie à une température supérieure à la LCST, de préférence à 37°C, jusqu'à la confluence. Le stade de la confluence est caractérisé par le fait que la monocouche cellulaire est formée de cellules soudées entre elles par des jonctions fortes (desmosomes, tight junctions, etc.). A ce moment, sans arrêter l'agitation, la température de la culture est abaissée et maintenue à une température substantiellement inférieure à la LCST, de préférence à 4-10°C, jusqu'à ce que tous les feuillets se décrochent. La sédimentation des 2D-MS2 consécutive à l'arrêt de l'agitation permet de récupérer les feuillets cellulaires présents dans le surnageant. Ces feuillets, remis en suspension dans du milieu de culture à 37°C, forment spontanément des sphéroïdes ou des organoïdes en quelques heures, voire quelques jours. Alternativement, consécutivement au décrochage thermique des feuillets, la température de la culture peut être ramenée à 37°C et les sphéroïdes ou organoïdes ensuite séparés des 2D-MS2.

Les procédés d'obtention de feuillets cellulaires et de sphéroïdes conformément à l'invention sont schématisés à la figure 1.

Contrairement aux cellules utilisées dans les deux premières réalisations de l'invention, les cellules utilisées dans cette troisième réalisation de l'invention possèdent de préférence une forte aptitude à l'établissement de jonctions intercellulaires fortes (desmosomes, jonctions adhérentes, etc.). Les cellules épithéliales comme les cellules pancréatiques d'îlot de Langerhans sécrétrices d'insuline, les cellules hépatiques porcines, de rat ou humaines et les kératinocytes humains sont utilisées dans une réalisation préférée de l'invention. Ces sphéroïdes ou organoïdes peuvent être utilisés comme modèles lors d'études pharmaco-toxicologiques, pour le screening de molécules pharmaceutiques, ou encore pour le diagnostic. Ils peuvent également servir à la production de molécules d'intérêt pharmaceutique et cosmétique, comme cela est illustré dans les exemples 5a et b. Cette invention permet également avec ces cellules de réaliser en masse des organoïdes fonctionnels et de taille homogène qui peuvent ainsi servir de matière première à la réalisation d'organes pour la transplantation chez des diabétiques, comme cela est décrit dans l'exemple 5c.

L'invention porte donc sur un procédé d'obtention de CAD sous forme de feuillets cellulaires, comportant les étapes suivantes : a) ensemencement de microsupports cryosensibles à géométrie bidimensionnelle (2D-MS) par des CAD, b) culture à une température supérieure à la température inférieure critique (LCST) du polymère responsable de la cryosensibilité du microsupport, jusqu'au stade de la confluence, c) décrochement des cellules des microsupports, par abaissement de la température de la culture à une température substantiellement inférieure à ladite LCST.

Dans une variante de ce procédé, les microsupports ensemencés en a) par des CAD sont préalablement recouverts d'une « sous-couche » de cellules, préférentiellement d'un type différent de celui desdites CAD. Cette « sous- couche », ou couche primaire, est, le cas échéant, traitée à confluence par un procédé physique tel l'irradiation γ, ou chimique tel la mitomycine c, de façon à arrêter leur prolifération sans altérer les fonctionnalités membranaires. Un exemple de cette variante est décrit dans l'exemple 4.

L'invention porte également sur des procédés d'obtention de sphéroïdes ou d'organoïdes, comportant les étapes suivantes : a) récupération de feuillets cellulaires obtenus selon un procédé tel que décrit ci-dessus, b) remise en suspension de ces feuillets dans du milieu de culture à 37°C, c) élimination des 2D-MS du milieu de culture.

Le cas échéant, l'étape b) ci-dessus peut être réalisée avant l'étape c) lors de la production des sphéroïdes ou organoïdes.

Dans ce procédé, les feuillets cellulaires récupérés à l'étape a) sont préférentiellement homodisperses en taille, et la taille des sphéroïdes ou organoïdes obtenus est contrôlée. Cette taille dépend essentiellement de la taille des microsupports, et de la morphologie des cellules cultivées. Dans une autre réalisation de l'invention, des organoïdes peuvent être produits par un procédé comportant les étapes suivantes : a) obtention de sphéroïdes ou organoïdes par un procédé tel que décrit ci-dessus, b) ensemencement de ces sphéroïdes ou organoïdes par d'autres

CAD, du même type cellulaire, ou, de manière préférée, d'un type cellulaire différent, c) la culture est ensuite poursuivie jusqu'à ce que la surface des sphéroïdes ou organoïdes de départ soit recouverte par les cellules ensemencées en b), d) le cas échéant, les étapes b) et c) peuvent être répétées pour obtenir des organoïdes présentant une structure organisée en « couches multiples », ou jusqu'à ce que les organoïdes aient la taille et la composition attendues.

Un exemple de production d'organoïdes par ce procédé est présenté dans l'exemple 5b.

Bien entendu, les feuillets cellulaires, sphéroïdes, ou organoïdes susceptibles d'être obtenus par l'un quelconque des procédés décrits dans cette demande, entrent en tant que tels dans le cadre de la présente invention.

Ces feuillets, sphéroïdes, ou organoïdes cellulaires présentent les caractéristiques suivantes : ils sont de taille homogène, liée à la taille des microsupports, et sont constitués de cellules en grande majorité viables et ayant une membrane intacte. En effet, les procédés de production de feuillets, sphéroïdes, ou organoïdes cellulaires décrits ci-dessus permettent une bonne oxygénation et alimentation des cellules, qui sont toutes en contact direct avec le milieu de culture pendant la plus grande partie de leur croissance, c'est-à-dire jusqu'à leur décrochement des microsupports. Les procédés d'obtention de feuillets, sphéroïdes, ou organoïdes cellulaires décrits ci-dessus permettent en outre de contrôler la taille de ces structures. L'utilisation de microsupport d'un diamètre donné permettra d'obtenir des feuillets cellulaires de même diamètre, et des sphéroïdes ou organoïdes de diamètre inférieur. Partant d'un diamètre moyen de cellules animales compris entre 5 et 15 microns, le diamètre des 2D-MS2 sera de préférence compris entre 100 et 300 microns, par exemple 150 μm. La taille des feuillets cellulaires selon l'invention sera avantageusement comprise entre 100 et 300 μm de diamètre, et la taille des organoïdes ou sphéroïdes de l'ordre de 50 à 500 μm de diamètre. Les feuillets peuvent être constitués d'un seul ou de plusieurs types cellulaires.

Dans une quatrième réalisation de l'invention, les cellules ancrage- dépendantes, que l'on a laissé croître sur les 2D-MS2 au-delà du stade de la confluence, forment des agrégats cellulaires contenant ou non le 2D- MS2 de départ ayant servi à leur formation. De tels agrégats formés naturellement sans utilisation de la cryosensibilité, se distinguent des sphéroïdes et organoïdes par leur hétérogénéité de taille, comme cela est illustré dans l'exemple 5. Il est à remarquer que dans cette réalisation de l'invention ; il n'est pas nécessairement fait usage de la cryosensibilité des microsupports. La cryosensibilité des microsupports peut néanmoins être utilisée pour décrocher tous les agrégats des microsupports. Il est aussi important de noter que, contrairement à ce que l'on pourrait imaginer, l'utilisation de microsupport à géométrie tridimensionnelle ne permet pas de détachement cellulaire menant à la formation d'agrégats, et encore moins, de sphéroïdes et d'organoïdes. Dans une réalisation préférée de l'invention, les microsupports utilisés dans les procédés d'obtention d'agrégats cellulaires sont fabriqués dans des matériaux biocompatibles et/ou biorésorbables, de grade biomédical de préférence reconnu par la FDA, afin de permettre l'implantation dans l'organisme vivant d'agrégats comportant encore le microsupport. La figure 2 représente sous forme schématique les différentes modalités de culture de cellules sur 2D-MS2 et les produits obtenus, conformément à la présente invention.

Les procédés décrits ci-dessus peuvent être mis en œuvre pour produire des cellules individualisées, des feuillets cellulaires, des sphéroïdes, des organoïdes, ou des agrégats cellulaires à partir de n'importe quel type de cellules ancrage-dépendantes. Il peut s'agir en particulier de fibroblastes, d'hépatocytes, de kératinocytes, de cellules pancréatiques, de cellules souches hématopoïétiques ou de cellules nerveuses. Dans de nombreux cas, les cellules ainsi cultivées seront modifiées génétiquement, par exemple pour leur conférer un phénotype particulier tel que la résistance à un agent chimique, la capacité à sécréter des substances potentiellement actives ou la capacité à produire des virus ou des anticorps.

Bien entendu, les agrégats cellulaires susceptibles d'être obtenus par l'un quelconque des procédés décrits dans cette demande, entrent également dans le cadre de l'invention telle que revendiquée.

Les cellules ancrage-dépendantes produites selon un procédé de l'invention peuvent être utilisées pour la production in vitro de substances d'intérêt biologique, cosmétique, prophylactique ou thérapeutique difficiles à isoler à partir d'organes ou de liquides physiologiques. L'intégrité biologique et physiologique des cellules produites selon un procédé de l'invention, ainsi que leur densité élevée, permet de produire en grandes quantités des molécules à haute valeur ajoutée telles que des glycoprotéines sensibles à la trypsinisation des cellules. A titre d'exemples de substances produites par de telles cellules, on peut citer des anticorps, des antigènes membranaires, des récepteurs membrariaires, ainsi que des protéines d'adhésion.

De même, les sphéroïdes, organoïdes ou agrégats cellulaires selon l'invention peuvent être utilisés pour la production in vitro de substances d'intérêt biologique, cosmétique, prophylactique ou thérapeutique difficiles à isoler à partir d'organes ou de liquides physiologiques. L'avantage de ces structures pluricellulaires sur les cellules isolées est que les fonctions physiologiques des cellules au sein de ces structures sont améliorées, voire même restaurées. Par ailleurs, les sphéroïdes, organoïdes ou agrégats cellulaires selon l'invention peuvent être implantés dans l'organisme d'un hôte, humain ou animal, et servir ainsi à la production in vivo de substances d'intérêt biologique, cosmétique, prophylactique ou thérapeutique. De manière préférée, des cellules d'un type donné seront implantées au niveau de l'organe ou du tissu correspondant au type des cellules préalablement cultivées.

Lorsque des feuillets, sphéroïdes, organoïdes ou agrégats cellulaires selon l'invention sont implantés dans l'organisme d'un hôte, humain ou animal, pour la production in vivo de substances d'intérêt prophylactique ou thérapeutique, ces substances peuvent agir de façon locale ou par diffusion systémique. Par exemple, des facteurs de croissance et des protéines de matrice extracellulaire sécrétés par des fibroblastes hétérologues, au niveau d'une lésion cutanée, peuvent stimuler la croissance des kératinocytes de l'hôte et favoriser ainsi la cicatrisation. Par ailleurs, des substances telles que l'érythropoïétine ou des facteurs de coagulation tels que le facteur VIII ou le facteur IX peuvent être synthétisées au niveau de la peau, au niveau d'un muscle, ou au niveau d'un organe tel que le foie ou le pancréas, et diffuser dans l'organisme pour exercer leur action.

Dans un autre aspect de l'invention, les feuillets, sphéroïdes, organoïdes ou agrégats cellulaires entrent dans la composition d'organes ou de tissus artificiels qui seront ensuite implantés chez un hôte, humain ou animal. Par « organe artificiel », on entend ici un ensemble relativement ordonné de cellules reproduisant des structures et surtout des fonctions d'un organe donné. Il peut s'agir, par exemple, de sphéroïdes formés de cellules pancréatiques reproduisant des structures proches des îlots de Langerhans. Il peut s'agir aussi de sphéroïdes, organoïdes ou agrégats de cellules hépatiques reproduisant des structures de nodules du foie. Ces organes artificiels peuvent comporter des cellules génétiquement modifiées. Ils sont ensuite implantés dans l'organe correspondant, à des fins de restauration lorsque cet organe a été lésé, ou à des fins de correction lorsque cet organe est déficient. Ainsi, dans des cas de diabète, des îlots de Langerhans artificiels peuvent être implantés dans le pancréas des malades, afin de corriger leur sécrétion d'insuline. L'implantation de micro-organes artificiels, comportant des cellules génétiquement modifiées, peut aussi avoir pour but de corriger une déficience qui ne serait pas liée à cet organe. Par exemple, des sphéroïdes d'hépatocytes produisant un taux élevé de facteur de coagulation (Facteur VIII ou Facteur IX), peuvent être greffés dans le foie de patients hémophiles présentant un déficit dudit facteur.

Un « tissu artificiel » est défini ici comme une composition comportant des feuillets, sphéroïdes, organoïdes ou agrégats cellulaires correspondant à un type de tissu donné, tel que la peau ou le muscle, par exemple. De même qu'en ce qui concerne les organes artificiels, les tissus artificiels sont destinés à être implantés chez l'hôte, humain ou animal, au niveau du tissu correspondant, dans le but de restaurer un tissu lésé, ou dans le but de greffer des cellules productrices d'une substance prophylactique ou potentiellement thérapeutique pour l'hôte. Des exemples particuliers de tissus artificiels selon l'invention sont présentés dans les exemples 3 et 4. Dans une autre application, les cellules constituant le tissu artificiel (kératinocytes et/ou fibroblastes, par exemple), peuvent être modifiées génétiquement pour produire une substance d'intérêt pour l'hôte. On citera notamment rérythropoïétine, le facteur VIII, le facteur IX.

De tels organes ou tissus artificiels font également partie de l'invention. Dans une réalisation particulière de l'invention, des micro-feuillets réalisés à partir de kératinocytes humains allogéniques et/ou autogéniques sur des 2D-MS2 sont utilisés tels quels ou incorporés au sein d'une formulation pour le traitement des plaies chroniques (ulcères, escarres) ou aiguës (brûlures) de la peau. Il est à noter à ce stade que les microsupports 2D-

MS2 peuvent être coatés ou liés de façon covalente (greffage) avec du collagène, de la fibronectine ou de la poly-L-Lysine pour améliorer l'adhésion des kératinocytes. Dans le cas de plaies chroniques ou aiguës, l'application sur la plaie de pansements bioactifs constitués de cellules allogéniques telles que les fibroblastes ou les kératinocytes permet une meilleure cicatrisation et la prépare à une éventuelle greffe de cellules autologues (cellules du patient) tout en limitant la déshydratation et les infections lorsque la préparation est appliquée sous un bandage étanche (film de silicone par exemple). La plupart des substituts cutanés développés jusqu'à présent sont constitués de matrice tridimensionnelle de collagène, de nylon, de vicryl, d'acide hyaluronique sur lesquelles sont cultivés des fibroblastes, des kératinocytes ou les deux (Yannas et al., 1982 ; Damour et al., 1994 ; Naughton, 1997 ; US patent 5,166,187 ; US patent 5,266,480). Le plus utilisé des substituts cutanés reste cependant le simple feuillet de kératinocytes autologues préparé à partir d'une biopsie prélevé sur le patient (O'Connor et al., 1981 ; Gallico et al., 1984 ; Cuono et al., 1986). Seule la société Boehringer Mannheim a développé un système de culture de cellules épithéliales sur microsupports 3D dans l'objectif de transplantations (WO 96/12510). Ce système, qui s'apparente le plus à celui décrit ici, présente cependant plusieurs imperfections par rapport à la présente invention. D'une part, les microsupports utilisés sont tridimensionnels et donc ne se plaquent pas parfaitement sur les plaies, ce qui implique un transfert de facteurs de croissance et de cellules très aléatoires. D'autre part, les microsupports n'étant pas biorésorbables, ils vont subsister sur les plaies et nécessitent un retrait avant que les cellules de la plaie ne les recouvrent et qu'ils ne soient ainsi irrémédiablement « incorporés » dans l'organisme. Dans une réalisation particulièrement préférée de notre invention, des kératinocytes allogéniques sont cultivés sur des 2D-MS2 jusqu'à confluence. Une fois les jonctions interkératinocytaires formées, les micro-feuillets sont décrochés par contraste thermique puis incorporés dans une formulation gélifiée

(contenant ou non des antibiotiques), puis appliqués sur la plaie. Un bandage (silicone par exemple) est réalisé permettant de limiter la déshydratation et les infections. Cette méthode est particulièrement adaptée au traitement des brûlures mais aussi des ulcères et escarres, comme décrit dans l'exemple 4. Dans le cas de brûlures profondes où peu de kératinocytes du patient sont susceptibles de reformer un épiderme, des cellules autologues (du patient) ou un mélange de cellules autologues et hétérologues peuvent être cultivées sur les microsupports 2D-MS2. Dans une autre réalisation préférée de l'invention, ce sont des micro-feuillets de fibroblastes qui sont générés à partir de microsupports 2D-MS2, comme illustré dans l'exemple 3. Ceux-ci sont plus particulièrement utilisés pour le traitement des ulcères et escarres mais aussi pour le recouvrement des brûlés en attente d'une greffe de kératinocytes autologues.

Des applications importantes des cellules, feuillets, sphéroïdes, organoïdes, ou agrégats cellulaires selon l'invention, sont les domaines de la pharmacologie et de la toxicologie. Les organoïdes présentent en particulier un grand intérêt pour ces applications. En effet, les propriétés particulières d'intégrité membranaire des cellules, et la structure organisée des organoïdes, en font des modèles intéressants pour réaliser des tests pharmacologiques et toxicologiques. Ils offrent notamment des outils de choix pour le screening de molécules pharmacologiquement actives, particulièrement lorsque celles-ci agissent sur des structures organisées comme le sont les récepteurs membranaires, ou encore les jonctions intracellulaires. L'exemple 5b présente la production d'organoïdes constitués d'un coeur de fibroblastes entouré d'une gangue externe de kératinocytes. Dans une réalisation préférée de l'invention, des mélanocytes humains normaux sont aussi incorporés dans la gangue externe de l'organoïde à raison de 1-5 mélanocytes pour 10 kératinocytes. On obtient alors des organoïdes pigmentés composés des trois principaux types cellulaires qui constituent la peau. Des cellules immunitaires de

Langerhans, ainsi que des cellules endothéliales dermiques peuvent aussi être incorporées pour reconstituer un système encore plus complet. De tels organoïdes reproduisent en quelque sorte la peau humaine, et constituent donc des modèles particulièrement intéressants pour réaliser des tests pharmacologiques et toxicologiques. Cette approche peut bien sûr être utilisée pour produire des modèles pour d'autres tissus et/ou organes.

Les cellules, feuillets, sphéroïdes, organoïdes, ou agrégats cellulaires selon l'invention peuvent aussi être utilisés pour l'élaboration de tests de diagnostic et la fabrication de vaccins. En particulier, les cellules individualisées obtenues par un procédé tel que décrit plus haut et illustré dans l'exemple 1 , ont des protéines membranaires intactes. Elles peuvent donc être avantageusement utilisées pour l'extraction et la purification notamment de récepteurs et autres antigènes membranaires utiles à l'élaboration de tests de diagnostic, et à la fabrication compositions immunogènes ou de vaccins.

Une autre domaine d'application possible d'un procédé de culture de CAD selon l'invention est la production de vecteurs viraux pour la thérapie génique. Une première application consiste par exemple à cultiver des cellules transcomplémentantes pour des adénovirus défectifs selon un procédé continu ou non, tel que décrit plus haut. Lorsque les cellules ont atteint la confluence optimale pour l'infection (qui peut dépendre des cellules concernées), elles sont mises en présence du virus à amplifier, à une multiplicité d'infection telle qu'une grande proportion des cellules soit infectées. La grande densité cellulaire obtenue par les procédés selon l'invention permet a priori d'infecter une grande proportion des cellules en utilisant un inoculum viral relativement réduit. Pour la même raison, le virus récupéré dans le surnageant, après la lyse des cellules à la fin du cycle viral, sera a priori plus concentré lorsqu'il est produit dans d'autres systèmes.

Une autre application envisageable des procédés de l'invention en thérapie génique est la production de sphéroïdes, organoïdes ou agrégats de cellules productrices de vecteurs rétroviraux ou lentiviraux. Ces sphéroïdes, organoïdes ou agrégats producteurs de vecteurs sont ensuite implantés dans l'hôte humain ou animal, au niveau du site à traiter. Il peut s'agir par exemple de cellules productrices de vecteurs codant pour un facteur neuroprotecteur, à implanter dans le cerveau de malades atteints de maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer ou la maladie de Parkinson. Il peut s'agir aussi de cellules productrices de vecteurs codant pour un gène ayant une activité anti-tumqrale potentielle (gène « suicide » tel que la thymidine kinase de HSV, gène de cytokine, gène de p53,...). Dans ce cas, les sphéroïdes, organoïdes ou agrégats producteurs desdits vecteurs sont implantés à proximité de la tumeur, éventuellement après sa ressection totale ou partielle. Dans cette application, les sphéroïdes, organoïdes ou agrégats selon l'invention présentent l'avantage d'être plus facilement implantables que des cellules isolées.

Les exemples ci-après, illustrent la mise en œuvre et l'intérêt de la présente invention, sans toutefois en limiter la portée. Légende des figures :

La figure 1 représente sous forme schématique les procédés d'obtention de feuillets cellulaires et de sphéroïdes selon l'invention.

La figure 2 représente sous forme schématique les différentes modalités de culture de cellules sur 2D-MS2 et les produits obtenus, conformément à l'invention décrite ci-dessus.

La figure 3 est une photographie d'un microsupport recouvert par des fibroblastes.

La figure 4 est une photographie d'un microsupport recouvert de fibroblastes humains γ-irradiés et ensemencé par des kératinocytes.

La figure 5 est une photographie d'agrégat cellulaire obtenu par culture sur 2D-MS2 de fibroblastes, au-delà du stade de la confluence, et entourant le microsupport.

La figure 6 est une photographie d'agrégat cellulaire obtenu par culture sur 2D-MS2 de fibroblastes, au-delà du stade de la confluence, dissocié du microsupport.

Exemple 1 : Culture de cellules ancrage-dépendantes sur microsupport cryosensible à géométrie bidimensionnelle (2D-MS2) en vue de la production de cellules individualisées intactes

0,55 g de 2D-MS2 (760 cm²/g) correspondant à une surface totale de 418 cm² sont mélangés à 8,36.10⁶ fibroblastes humains (20 000 cellules/cm²) dans un volume final de 50 ml de milieu de culture DMEM/F12 (1 :1 ) additionné de 10% de sérum de nouveau né (NCS) et le tout placé dans un flacon de culture à agitation pendulaire pour culture sur microsupport. La vitesse d'agitation est réglée à 25 rpm pendant 16-18 h afin que les cellules puissent adhérer aux microsupports, le flacon de culture étant gazé en continu avec un mélange d'air/C02 (95%-5% v/v). Après cette période, le volume de la culture est amené à 100 ml et la vitesse d'agitation portée à 40 rpm. La culture est maintenue dans ces conditions pendant une semaine avec changement quotidien de milieu. A ce moment, les cellules (qui n'ont pas encore atteint la confluence) sont décrochées par contraste thermique en abaissant la température du milieu de culture à 4-10°C. Après 15 minutes dans ces conditions (l'agitation n'est pas interrompue), toutes les cellules décrochées sont séparées par sédimentation des microsupports. Le pourcentage de viabilité déterminé par coloration au bleu trypan est de 95%. Cette technique peut être extrapolée à des volumes de culture plus en rapport avec une échelle industrielle. Les cellules ainsi obtenues, dont les protéines membranaires sont intactes, peuvent être utilisées pour l'extraction et la purification notamment de récepteurs membranaires pouvant servir à l'élaboration de tests de diagnostic, à la fabrication de vaccins et en recherche fondamentale. Exemple 2 : Culture sérielle de cellules ancrage-dépendantes sur microsupport cryosensible

La culture sérielle de cellules ancrage-dépendantes en bioréacteurs sur microsupports cryosensibles est rendue possible sans intervention d'enzyme protéolytique (trypsine, dispase, thermolysine), en alternant cycles de croissance des cellules, cycles de récolte partielle des cellules (par contraste thermique) et à nouveau cycles de croissance des cellules non récoltées qui servent à ré-inoculer les microsupports.

Des cellules fibroblastiques de souris L929 sont inoculées dans un bioréacteur de 3 I (11 de milieu) à raison de 20 000 cellules/cm² de microsupport bidimensionnel partiellement (95-98%) cryosensible, dans du milieu DMEM/F12 10% NCS. Le milieu est renouvelé à raison de 2l/j par perfusion. La croissance de ces cellules sur les microsupports est contrôlée chaque jour par observation microscopique et mesure par Aperture Impédance Puise Spectroscopy (Degouys et al., 1993). Avant la confluence, les cellules sont décrochées par contraste thermique en abaissant la température du milieu de culture à 4°C pendant 15 minutes en injectant de l'eau glacée dans la jaquette du bioréacteur. Après décantation des microsupports, les cellules individuelle en suspension sont recueillies et les microsupports soigneusement lavés avec du milieu de culture froid.

Les cellules restées fixées aux régions non cryosensibles des 2D-MS2 constituent l'inoculum destiné au cycle de croissance suivant. Ce cycle est entamé par l'ajout de milieu de culture à 37°C. Un cycle de croissance est alors à nouveau enclenché. Exemple 3 : Utilisation de microsupports bidimensionnels cryosensibles

(2D-MS2) pour la réalisation de micro-feuillets de fibroblastes humains pour la thérapie des plaies chronigues (ulcères, escarres) et aiguës (brûlures) de la peau (voir photo de la figure 3)

Des fibroblastes humains allogéniques sont inoculés sur des microsupports cryosensibles 2D-MS2 dans des flacons de cultures à agitation pendulaire (marque Techne ou Wheaton) à raison de 10-20 cellules par microsupport (5.10⁴-10⁵ cellules/ml) dans 75 ml de DMEM/F12 (1 :1 ) contenant 10% de Sérum de veau nouveau-né « NCS » (Newborn Calf Sérum). Les cellules et les microsupports sont agités à 25 rpm pendant une nuit, puis le lendemain, le volume de milieu est doublé et l'agitation portée à 40 rpm. Le milieu de culture est changé tous les jours. La culture des fibroblastes est arrêtée lorsque ceux-ci ont une densité de recouvrement des microsupports de 100% (voir photo de la figure 3). Par abaissement de la température du milieu de culture, des micro-feuillets de fibroblastes sont décrochés des microsupports, rincés puis appliqués tels quels sur les plaies ou inclus dans une formulation gélifiée (méthylcellulose, agarose, etc .). Les microfeuillets peuvent être aussi congelés et conservés à - 80°C ou - 196°C dans une solution contenant de préférence comme cryoconservateur du

DMSO, du glycérol ou du tréhalose.

Les micro-feuillets récoltés sont de préférence rincés dans du milieu sans sérum avant d'être appliqués directement sur la plaie tels quels ou inclus dans une formulation sous forme gélifiée (methyl cellulose, agarose, etc.). Un pansement est ensuite apposé sur la plaie pour empêcher la déshydratation et les infections. De la sorte, une fois les micro-feuillets appliqués sur la plaie, les facteurs de croissance et protéines de la matrice extracellulaire produits par ces cellules peuvent diffuser plus facilement et les cellules migrer du micro-feuillet vers la plaie en quelques heures. Une fois adhérées sur la plaie, elles continuent à synthétiser et diffuser leurs facteurs de croissance et des protéines de la matrice extracellulaire. Cette réalisation de l'invention est particulièrement adaptée au traitement des plaies chroniques (ulcères, escarres) mais peut aussi être utilisée pour le traitement des brûlures.

Exemple 4 : Utilisation de microsupports bidimensionnels cryosensibles

(2D-MS2) pour la réalisation de micro-feuillets de kératinocytes humains pour la thérapie des plaies chronigues

(ulcères, escarres) et aiguës (brûlures) de la peau (voir photo de la figure 4)

Dans une réalisation préférée de l'invention, les kératinocytes humains sont ensemencés sur une sous-couche de fibroblastes humains γ irradiés (ou mitomycinés) afin d'en arrêter la croissance sans en altérer les propriétés membranaires ni le métabolisme, cultivés sur des microsupports 2D-MS2, à raison de 10-20 KHN (Kératinocytes Humains Normaux) par microsupport dans un volume de milieu de culture aussi réduit que possible. Par exemple, 2.10⁶ KHN sont ensemencés sur 2.10⁵ 2D-MS2 (0,6 cm²) dans un volume de 10 ml de milieu DMEM/F12, 10% NCS, contenant de l'hydrocortisone 0,4 μg/ml, de l'EGF 10 ng/ml, de la transferrine 5 μg/ml, de la triiodothyronine (2 nM), de l'adénine 0,18 mM, de la toxine cholérique 0,1 μg/ml et de l'insuline 5 μg/ml dans une boite de pétri bactériologique (non traitée pour culture de cellule) ou dans un tube conique de 50 ml. La boite de pétri ou le tube sont placés dans un incubateur à CO₂ à 37°C et sont agités toutes les Vz heures pendant quelques secondes. Au bout de 16-18 h on peut considérer que tous les KHN qui n'ont pas adhéré n'adhéreront plus. Les microsupports sont alors transférés dans un spinner (25-50 ml) ou un flacon à agitation pendulaire (125 ml) et une agitation minimale des microsupports est assurée de façon à ce que ceux-ci ne décantent pas. Inversement, si l'agitation est trop forte, les cellules se décrochent. Le volume du milieu de culture est porté à 25-50 ml. On laisse pousser les KHN jusqu'à ce que ceux-ci recouvrent 100% de la surface des microsupports et notamment jusqu'à ce que les jonctions interkératinocytaires soient fortes (3-4 jours après la confluence en milieu hypercalcique). Par abaissement de la température du milieu de culture, des micro-feuillets de kératinocytes sont décrochés des microsupports, rincés puis appliqués tels quels sur les plaies ou inclus dans une formulation gélifiée (méthylcellulose, agarose, etc .). Les micro-feuillets peuvent être aussi congelés et conservés à - 80°C ou - 196°C dans une solution contenant de préférence comme cryoconservateur du DMSO

(10%), du glycérol (10%) ou du tréhalose (0,2-0,4M).

Exemple 5 : Utilisation de microsupport cryosensible à géométrie bidimensionnelle pour réaliser la culture de cellules ancrage- dépendantes sous forme de sphéroïdes

Cet exemple illustre comment l'utilisation des microsupports bidimensionnels cryosensibles peut servir à la formation de sphéroïdes (ou organoïdes).

5a. Sphéroïdes de fibroblastes humains.

Des fibroblastes humains normaux cultivés en flacons de culture dans du milieu DMEM/F12 (1 :1), 10% NCS sont individualisés par trypsinisation

(trypsine/EDTA 0,05% : 0,02% pH 7,4) puis ensemencés à raison de 10⁴- 10⁵ (préférentiellement 4,10⁴) cellules/cm² de microsupport dans un flacon de culture à agitation pendulaire (Techne, Cambridge UK) dans du milieu DMEM/F12 (1 :1 ), 10% NCS (75 ml au total). Le Techne est mis sous agitation (25 rpm) à 37°C et gazé par un flux d'air/CO^ (95%/5%) pendant

24 h pour l'ancrage des cellules. Le lendemain, l'agitation est portée à 40 rpm et du milieu de culture est ajouté (150 ml final). A la confluence (environ 1 semaine après l'ensemencement), les cellules sont décrochées par contraste thermique en refroidissant rapidement le milieu de culture jusqu'à une température de 4-10°C pendant environ 15 minutes sous agitation contrôlée. L'agitation est ensuite arrêtée puis on laisse décanter les microsupports quelques minutes. Le résultat obtenu consiste en des micro-feuillets (mono ou pluri-couches) ou flocons cellulaires de la taille des microsupports utilisés (dans ce cas 150μm de diamètre). Ces microfeuillets sont ensuite prélevés, puis remis en agitation sans microsupport jusqu'à obtention de sphéroïdes homodisperses constitués de fibroblastes.

5b. Organoïdes composés de fibroblastes et de kératinocytes humains

Des organoïdes à base de fibroblastes et de kératinocytes humains peuvent être réalisés selon un mode opératoire un peu plus complexe. Dans un premier temps, des sphéroïdes de fibroblastes sont réalisés comme ci-dessus. Lorsque ceux-ci se sont formés, le milieu de culture est remplacé par un autre ayant la composition suivante : DMEM/F12 (3:1 ) contenant 10% DE NCS, de l'hydrocortisone 0,4 μg/ml, de l'EGF 10 ng/ml, de la transferrine 5μg/ml, de la triiodothyronine (2 nM), de l'adénine 0,18 mM, de la toxine cholérique 0,1 μg/ml et de l'insuline 5μg/ml. Dans une réalisation préférée de l'invention, les fibroblastes utilisés lors de l'inoculation des microsupports sont des fibroblastes mitomycinés ou ayant subi une irradiation γ, ceux-ci ne pouvant plus alors se multiplier. Des kératinocytes humains sont alors ensemencés (50-100000 KHN/ml) sur ces sphéroïdes fibroblastiques. La culture est ainsi poursuivie encore une ou deux semaines, les kératinocytes recouvrent la surface des sphéroïdes, puis commencent à former plusieurs couches en se différenciant. L'organoïde ainsi obtenu est constitué d'un sphéroïde dont le cœur de fibroblastes est entouré par une gangue externe de kératinocytes. Chacun de ces organoïdes reproduit en quelque sorte la peau humaine et les milliers d'organoïdes obtenus peuvent constituer des modèles intéressants pour réaliser des tests pharmacologiques et toxicologiques pour les sociétés pharmaceutiques, cosmétiques et les laboratoires académiques. Eventuellement, des mélanocytes humains normaux sont aussi incorporés dans la gangue externe de l'organoïde à raison de 1-5 mélanocytes pour 10 kératinocytes. Du bFGF est alors incorporé au milieu de culture à raison de 1 ng/ml. On obtient alors des organoïdes pigmentés composés des trois principaux types cellulaires qui constituent la peau. Des cellules immunitaires de Langerhans, ainsi que des cellules endothéliales dermiques peuvent aussi être incorporées pour reconstituer un système encore plus complet.

5c. Sphéroïdes de cellules d'îlots de Langerhans de porc ou de rat

Des cellules pancréatiques d'îlots de Langerhans de porc ou de rat peuvent être cultivées comme dans l'exemple 3a et former des sphéroïdes fonctionnels capables de synthétiser de l'insuline. Ces sphéroïdes peuvent être utilisés encapsulés dans un système imperméable aux anticorps du patient, à des fins thérapeutiques (greffes) chez les diabétiques insulino- dépendants.

Exemple 6 : Utilisation de microsupports bidimensionnels pour réaliser la culture de cellules ancrage-dépendantes sous forme d'agrégats (structure tridimensionnelle et distribution de taille hétérodisperse) (voir photos des figures 5 et 6)

0,55 g de microsupports bidimensionnels (760 cm²/g), soit 418 cm² sont inoculés dans du milieu DMEM/F12 (1 :1 ) 50 ml avec 8,36.10^e fibroblastes (20 000 c/cm²) dans un flacon de culture pour culture sur microsupport (marque Wheaton ou Techne).

La vitesse d'agitation est réglée à 18 rpm pendant 16-18h afin que les cellules puissent adhérer aux microsupports et le flacon de culture est gazé en continu avec un mélange d'air/CO₂ (95/5%). Le lendemain, on apporte 50 ml de milieu supplémentaire et la vitesse d'agitation est portée à 40 rpm.

La culture est maintenue pendant 15 jours à 37°C sous atmosphère 5% CO₂ le milieu de culture étant changé tous les jours.

Au bout de 15 jours, les agrégats sont récoltés par tamisage sur un tamis de 125 μm de diamètre. On récolte ainsi des agrégats cellulaires formés autour d'un moule qui est constitué par le microsupport (figure 5), et des agrégats qui se sont dissociés du microsupport (figure 6).

Références citées :

Carvalhal, AN., Moreira, J.L., Miranda, P.M. and Carrondo, M.J.T. (1997) Hydrodynamic control of aggregate size in suspended cultures of différent animal cells. Animal Cell Technology (Kluwer Académie Publishers), 779-784.

Cuono, C, Langdon, R. and McGuire, J. (1986). Use of cultured epidermal autografts and dermal allografts as skin replacement after burn injury. Lancefv. 1123-1124.

Damour, O., Gueugniaud, P.Y., Berthin-Maghit, M. Rousselle, P., Berthod, F., Sahuc, F. and Collombel, C. (1994). A dermal substrate made of collagen-GAG-Chitosan for deep burn coverage: first clinical uses.

C//t7/^'ca/ Materials. 15 : 273-276.

Degouys, V., Cerckel, I., Garcia, A., Harfield, J., Dubois, D., Fabry, L. and Miller, AO. (1993) Dielectric spectroscopy of mammalian cells. Simultaneous in situ évaluation by aperture impédance puise spectroscopy and low frequency dielectric spectroscopy of the biomass of HTC cells on cytodex 3 Cytotechnology, 13. 195-202.

Gallico, G. G., O'Connor, Ν.E., Compton, C.C., Kehinde, O. and Green, O. (1984). Permanent coverage of large burn wounds with autologous cultured human epithelium. N Engl J Med. 31 1 : 448-451.

Ijima, H., Matsushita, T., Nakazawa, N., Koyama, S., Gion, T., Shirabe, K., Shimada, M., Takenaka, K., Sugimachi, K. and Funatsu, K. (1997) Spheroid formation of primary dog hepatocytes using polyurethane foam and its application to hybrid artificial liver. Animal Cell Technology (Kluwer Académie Publishers), 577-583. Koide, N., Shinji, T., Tanabe, T., Asano, K., Kawaguchi, M., Sakaguchi, K., Koide, Y., Mori, M., Tsuji, T. (1989) Continued high albumin production by multicellular spheroids of adult rat hepatocytes formed in the présence of liver-derived proteoglycans. Biochem. Biophys. Res. Comm. 161 ,385-391.

Matsushita, T., Ijima, H. and Funatsu, K. (1992) Development of a hybrid artificial liver utilizing three dimensional culture of adult hepatocytes.

Ppn. J. Artif. Organs. 21, 1050-1054.

Matsushita, T., Ijima, H., Koide, N. and Funatsu, K. (1991 ) High albumin production by multicellular spheroid of adult rat hepatocytes formed in the pores of polyurethane foam. Appl. Microbiol. Biotechnol. 36, 324- 326.

Naughton, G.K. (1997). Skin and epithelia. Principles of tissue engineering. Robert Lanza editors. Académie press Californie USA. pp 769- 782.

O'Connor, N., Mulliken, J.B., Banks-Schlegel, S., Kehinde, O. and Green, H. (1981). Grafting of burns with cultured epithelium prepared from autologous epidermal cells. Lancet i:75-78.

Takezawa, T., Mori, Y., Yonaha, T. and Yoshizato, K. (1993) Characterization of morphology and cellular metabolism during the spheroid formation by fibroblasts. Exp. Cell. Res. 208, 430-441.

Takezawa, T., Mori, Y., Yoshizato, K. 1990) Cell culture on a thermo- responsive polymer surface. Biotechnology. 8(9), 854-856.

Takezawa, T., Yamasaki, M., Mori, Y., Yonaha, T. and Yoshizato, K. (1992). Morphological and immuno-cytochemical characterization of a hetero-spheroid composed of fibroblasts and hepatocytes. J. Cell Sci. 101. 495-501. Tong, J.Z., Bernard, O. and Alvarez, F. (1990) Long-term culture of rat liver cell spheroids in hormonally defined média. Exp. Cell. Res. 189, 87-92.

Tong, J.Z., De Lagausie, P., Furian, V., Crésteil, T., Bernard, O. and Alvarez, F. (1992) Long-term culture of adult rat hepatocyte spheroids.

Exp. Cell. Res. 200, 326-332.

Yannas, IN., Burke, J.F., Orgill, D.P. and Skrabut, E.M. (1982). Wound tissue can utilize a polymeric template to synthesize a functional extension of skin. Science. 215: 174-176.

Brevet Européen EP 579 596. Support pour la culture de cellules et procédé de préparation d'un tel support.

Demande de brevet européen n° 99402710.0. Nouveaux supports de culture cellulaire porteurs de propriétés particulières. A.O.A. Miller, N. Ropson

US patent 5.284.766. Bed material for cell culture.

US patent 5,166,187. Biomateriais with a base of mixtures of coliagen, chitosan and glycosaminoglycans, process for preparing them and their application in human medicine.

US patent 5,266,480. Three dimensional skin culture System.

WO patent 96/12510. Biomaterial containing epithelial cells and use thereof as a transplant. 2 May 1996.

US patent 5,980,888. Kératinocytes attached to microcarriers for treatment of skin wounds. 9 Nov. 1999.

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé d'obtention de cellules ancrage-dépendantes (CAD), comportant les étapes suivantes : a) ensemencement de microsupports cryosensibles à géométrie bidimensionnelle (2D-MS) par des CAD, b) culture à une température supérieure à la température inférieure critique (LCST) du polymère responsable de la cryosensibilité du microsupport, c) décrochage des cellules des microsupports, par abaissement de la température de la culture à une température substantiellement inférieure à ladite LCST, d) le cas échéant, reproduction des étapes b) et c) jusqu'à l'obtention de la quantité souhaitée de cellules.

2. Procédé d'obtention de CAD selon la revendication 1 , caractérisé en ce que les microsupports ensemencés à l'étape a) sont constitués d'un film polymère sur lequel sont greffées de manière covalente les molécules assurant la cryosensibilité desdits microsupports.

3. Procédé d'obtention de CAD selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'intégralité de la surface des 2D-MS2 est cryosensible et la totalité des cellules sont décrochées des microsupports à l'étape c).

4. Procédé d'obtention de CAD selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que les microsupports sont partiellement cryosensibles, et que l'étape d) est réalisée par remise en suspension à température de culture des 2D-MS après décrochement des cellules selon l'étape c).

5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que 2 à 10% de la surface des 2D-MS ne sont pas cryosensibles.

6. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'épaisseur du dépôt de polymère est telle que 2 à 10% des cellules ne se détachent pas du microsupport lors de l'étape c).

7. Procédé d'obtention de CAD selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que les microsupports sont préalablement recouverts d'une sous-couche de cellules ancrage-dépendantes de nature différente de celle des cellules innoculées à l'étape a).

8. Procédé d'obtention de CAD selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et 7, dans lequel l'étape b) de culture est poursuivie jusqu'au stade de la confluence, et les CAD sont obtenues après l'étape c) sous forme de feuillets cellulaires.

9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel la taille des feuillets obtenus après l'étape c) est contrôlée.

10. Procédé d'obtention d'agrégats cellulaires comportant les étapes suivantes : a) ensemencement de 2D-MS2 le cas échéant biocompatibles et/ou biorésorbables par des CAD, b) culture à une température supérieure à la température inférieure critique (LCST) du polymère responsable de la cryosensibilité du microsupport, au-delà du stade de la confluence, c) le cas échéant, décrochage des cellules des microsupports, par abaissement de la température de la culture à une température substantiellement inférieure à ladite LCST.

11. Procédé d'obtention de sphéroïdes ou d'organoïdes, comportant les étapes suivantes : a) récupération de feuillets cellulaires obtenus par un procédé de la revendication 8 ou 9, b) remise en suspension de ces feuillets dans du milieu de culture à 37°C, c) élimination des 2D-MS du milieu de culture, cette étape étant réalisable avant ou après l'étape b).

12. Procédé selon la revendication 11 , dans lequel les feuillets cellulaires récupérés en a) sont homodisperses en taille, et la taille des sphéroïdes ou organoïdes obtenus est contrôlée.

13. Procédé d'obtention d'organoïdes complexes comportant les étapes suivantes : a) obtention de sphéroïdes ou organoïdes par un procédé selon la revendication 11 ou 12, b) ensemencement de ces sphéroïdes ou organoïdes par d'autres CAD, du même type cellulaire, ou d'un type cellulaire différent, c) poursuite de la culture jusqu'à ce que la surface des sphéroïdes ou organoïdes de l'étape a) soit recouverte par les cellules ensemencées en b), d) le cas échéant, les étapes b) et c) peuvent être répétées sur les organoïdes complexes obtenus en c) par ensemencement de ces derniers avec des cellules d'un type différent de celui de b).

14. Procédé d'obtention d'organoïdes complexes selon la revendication 13, dans lequel les sphéroïdes de l'étape a) sont constitués de fibroblastes ayant subi un traitement pour les rendre incapables de multiplication, et les CAD de l'étape b) sont majoritairement des kératinocytes.

15. Suspension de feuillets cellulaires susceptibles d'être obtenus par un procédé suivant la revendication 8 ou 9, caractérisée par l'homogénéité de taille des feuillets, l'intégrité membranaire des cellules composant ces feuillets et leur viabilité.

16. Suspension de feuillets cellulaires suivant la revendication 15, telle que la taille des feuillets est comprise entre 100 et 300 μm de diamètre.

17. Sphéroïdes ou organoïdes de cellules ancrage-dépendantes, susceptibles d'être obtenus par un procédé suivant la revendication 11 , 12 ou 13.

18. Suspension de sphéroïdes ou d'organoïdes de cellules ancrage- dépendantes suivant la revendication 17, telle que la taille des sphéroïdes ou organoïdes est comprise entre 50 et 500 μm de diamètre.

19. Organoïdes selon l'une quelconque des revendications 17 et 18, caractérisés en ce qu'ils comportent des cellules de type fibroblastes et kératinocytes.

20. Agrégats cellulaires susceptibles d'être obtenus par un procédé selon la revendication 10.

21. Feuillets cellulaires, sphéroïdes, organoïdes ou agrégats selon l'une quelconque des revendications 15 à 20, constitués au moins en partie de cellules génétiquement modifiées.

22. Feuillets, sphéroïdes, organoïdes ou agrégats cellulaires selon l'une quelconque des revendications 15 à 21 , constitués de fibroblastes, de kératinocytes, de mélanocytes, d'hépatocytes, de myoblastes, de cellules pancréatiques, nerveuses ou d'un mélange de ceux-ci.

23. Cellules ancrage-dépendantes, susceptibles d'être obtenues par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, ou feuillets cellulaires, sphéroïdes, organoïdes ou agrégats selon l'une quelconque des revendications 15 à 22, pour la production de substances d'intérêt biologique, cosmétique, prophylactique ou thérapeutique.

24. Cellules ancrage-dépendantes, feuillets cellulaires, sphéroïdes, organoïdes ou agrégats selon l'une quelconque des revendications 21 à 23, pour la production de vecteurs viraux pour la thérapie génique.

25. Organe ou tissu artificiel comprenant des feuillets, sphéroïdes, organoïdes ou agrégats cellulaires selon l'une quelconque des revendications 15 à 22, et des excipients pharmaceutiquement acceptables.

26. Organe ou tissu artificiel selon la revendication 25, pour la sécrétion de substances à visée thérapeutique ou prophylactique pour l'hôte.

27. Utilisation d'organe ou tissu artificiel selon la revendication 25 ou 26; dans la fabrication d'une composition thérapeutique pour la réparation de l'organe ou du tissu correspondant chez un hôte humain ou animal.

28. Utilisation de feuillets, sphéroïdes, agrégats ou organoïdes cellulaires selon l'une quelconque des revendications 15 à 22, ou de tissu artificiel selon l'une des revendications 25 ou 26, pour la préparation d'une composition thérapeutique destinée au traitement de brûlures et de plaies chroniques.

29. Utilisation de feuillets, sphéroïdes, organoïdes ou agrégats cellulaires selon l'une quelconque des revendications 15 à 22, pour réaliser des tests pharmacologiques ou toxicologiques in vitro.

30. Utilisation de CAD, feuillets, sphéroïdes, organoïdes ou agrégats cellulaires selon l'une quelconque des revendications 15 à 22, pour la fabrication de réactifs pour des tests de diagnostic ou la fabrication de compositions immunogènes.

31. Feuillets, sphéroïdes, organoïdes ou agrégats cellulaires selon l'une quelconque des revendications 15 à 22, comportant des cellules pancréatiques le cas échéant recombinées, pour leur implantation dans le pancréas, pour la sécrétion régulée d'insuline.