CN1652757A

CN1652757A - Edg受体结合剂在癌症中的应用

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Publication number: CN1652757A
Application number: CNA038111942A
Authority: CN
Inventors: T·鲍姆鲁克尔; V·布林克曼; K·R·拉蒙塔涅; P·T·拉索塔; D·梅希特谢里安科娃; J·M·伍德
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2002-05-16
Filing date: 2003-05-15
Publication date: 2005-08-10
Anticipated expiration: 2023-05-15
Also published as: EP1505959B1; AU2003240655B2; HK1126127A1; MXPA04011384A; CA2483594A1; JP5227492B2; NZ536513A; IL164838A; DE60324416D1; PL372103A1; SI1505959T1; AU2003240655A1; EP1955696B1; JP2010100637A; CN1652757B; EP1944026A3; IL229550A0; WO2003097028A1; KR20120125398A; ZA200408575B

Abstract

本发明提供了使用1－磷酸鞘氨醇受体激动剂，并可任选地联合应用化疗剂来治疗实体瘤，例如肿瘤侵入、特别是抑制或控制失控的血管生成的方法。本发明还包括1－磷酸鞘氨醇受体激动剂和化疗剂的组合。

Description

EDG受体结合剂在癌症中的应用

本发明涉及1-磷酸鞘氨醇(S1P)受体激动剂的新用途，特别是在治疗癌症中的新用途。

S1P受体激动剂是加速淋巴细胞归巢(LH)的物质，其可引起淋巴细胞减少，原因是淋巴细胞从循环系统向次级淋巴组织进行再分布、优选可逆性再分布，但不引起全身性免疫抑制。稚细胞被隔绝；来自血液的CD4和CD8 T-细胞和B-细胞被刺激迁移至淋巴结(LN)和派尔斑(PP)，并因此例如抑制细胞向移植器官的浸润。

S1P受体激动剂通常是鞘氨醇类似物，如2-取代的2-氨基-丙烷-1，3-二醇或2-氨基-丙醇衍生物，例如包含式X基团的化合物：

其中：

Z为H；C_1-6烷基；C_2-6链烯基；C_2-6炔基；苯基；被OH取代的苯基；被1至3个选自卤素、C_3-8环烷基、苯基以及OH取代的苯基的取代基取代的C_1-6烷基；或CH₂-R_4z，其中R_4z为OH、酰氧基或式(a)的残基

其中Z₁为直连键或O，优选O；R_5z和R_6z相互独立地为H，或任选被1、2或3个卤素原子取代的C_1-4烷基；

R_1z为OH、酰氧基或式(a)的残基；且R_2z和R_3z相互独立地为H、C_1-4烷基或酰基。

式X的基团是作为端基连接于亲水或亲脂部分的官能团，并包含一个或多个脂族、脂环族、芳族和/或杂环残基，达到的结果是所形成的其中的Z和R_1z至少有一个是或包含式(a)的残基的分子可在多个1-磷酸鞘氨醇受体之一上作为激动剂进行信号转导。

S1P受体激动剂是在一种或多种1-磷酸鞘氨醇受体、例如S1P1至S1P8上作为激动剂进行信号转导的化合物。与1-磷酸鞘氨醇受体结合的激动剂可以例如导致细胞内的杂三聚体G-蛋白解离为Gα-GTP和Gβγ-GTP，和/或被激动剂占领的受体磷酸化作用增加，以及下游信号转导途径/激酶活化。S1P受体激动剂的结合亲和力可以如以下段落I所述进行测定。

合适的S1P受体激动剂的实例有例如：

-EP627406A1中所公开的化合物，例如式I的化合物

其中R₁为直链或支链(C_12-22)碳链

-其可在碳链中含有选自以下的键或杂原子：双键、三键、O、S、NR₆和羰基，其中R₆为H、烷基、芳烷基、酰基或烷氧基羰基，

和/或

-其可含有作为取代基的烷氧基、链烯氧基、炔氧基、芳烷基氧基、酰基、烷基氨基、烷硫基、酰氨基、烷氧基羰基、烷氧基羰基氨基、酰氧基、烷基氨基甲酰基、硝基、卤素、氨基、羟基亚氨基、羟基或羧基；或

R₁为

-苯基烷基，其中烷基为直链或支链(C_6-20)碳链；或

-苯基烷基，其中烷基为直链或支链(C_1-30)碳链，其中所述的苯基烷基被以下基团取代：

-任选被卤素取代的直链或支链(C_6-20)碳链，

-任选被卤素取代的直链或支链(C_6-20)烷氧基链，

-直链或支链(C_6-20)链烯氧基，

-苯基烷氧基、卤代苯基烷氧基、苯基烷氧基烷基、苯氧基烷氧基或苯氧基烷基，

-被C_6-20烷基取代的环烷基烷基，

-被C_6-20烷基取代的杂芳基烷基，

-杂环C_6-20烷基或

-被C_2-20烷基取代的杂环烷基，

并且其中：

烷基部分可以含有：

-在碳链中，含有选自以下的键或杂原子：双键、三键、O、S、亚磺酰基、磺酰基或NR₆，其中R₆如上所定义，且

-作为取代基的烷氧基、链烯氧基、炔氧基、芳烷基氧基、酰基、烷基氨基、烷硫基、酰氨基、烷氧基羰基、烷氧基羰基氨基、酰氧基、烷基氨基甲酰基、硝基、卤素、氨基、羟基或羧基，且

R₂、R₃、R₄和R₅相互独立地为H、C_1-4烷基或酰基，

或其可药用其盐；

-EP 1002792A1中所公开的化合物，例如式II的化合物

其中m为1至9，且R’₂、R’₃、R’₄和R’₅相互独立地为H、烷基或酰基，或其可药用其盐；

-EP 0778263A1中所公开的化合物，例如式III的化合物

其中W为H；C_1-6烷基、C_2-6链烯基或C_2-6炔基；未取代的或被OH取代的苯基；R”₄O(CH₂)_n；或被1至3个选自卤素、C_3-8环烷基、苯基以及被OH取代的苯基的取代基取代的C_1-6烷基；

X为H或含有的碳原子数为p的未取代的或取代的直链烷基或含有的碳原子数为p-1的未取代或取代的直链烷氧基，例如被选自以下的1至3个取代基取代：C_1-6烷基、OH、C_1-6烷氧基、酰氧基、氨基、C_1-6烷基氨基、酰氨基、氧代、卤代C_1-6烷基、卤素、未取代的苯基、被1至3个选自C_1-6烷基、OH、C_1-6烷氧基、酰基、酰氧基、氨基、C_1-6烷基氨基、酰氨基、卤代C_1-6烷基和卤素的取代基取代的苯基；Y为H、C_1-6烷基、OH、C_1-6烷氧基、酰基、酰氧基、氨基、C_1-6烷基氨基、酰氨基、卤代C_1-6烷基或卤素，Z₂为单键或含有的碳原子数为q的直链亚烷基，

p和q相互独立地为1至20中的整数之一，条件是6≤p+q≤23，m’为1、2或3，n为2或3，

R”₁、R”₂、R”₃和R”₄相互独立地为H、C_1-4烷基或酰基，

或其可药用其盐，

-WO02/18395中所公开的化合物，例如式IVa或Ivb的化合物

或

其中X_a为O、S、NR_1s或基团-(CH₂)_na-，该基团是未取代的或被1至4个卤素取代；n_a为1或2，R_1s为H或(C_1-4)烷基，该烷基为未取代的或被卤素取代；R_1a为H、OH、(C_1-4)烷基或O(C_1-4)烷基，其中烷基是未取代的或被1至3个卤素取代；R_1b为H、OH或(C_1-4)烷基，其中烷基是未取代的或被卤素取代；每个R_2a相互独立地选自H或(C_1-4)烷基，该烷基是未取代的或被卤素取代；R_3a为H、OH、卤素或O(C_1-4)烷基，其中烷基是未取代的或被卤素取代；且R_3b为H、OH、卤素、(C_1-4)烷基，其中烷基是未取代的或被羟基取代、或O(C_1-4)烷基，其中烷基是未取代的或被卤素取代；

Y_a为-CH₂-、-C(O)-、-CH(OH)-、-C(＝NOH)-、O或S，且R_4a为(C_4-14)烷基或(C_4-14)链烯基；

或其可药用其盐；

-WO 02/076995中所公开的化合物，例如式V的化合物：

其中

m_c为1、2或3；

X_c为O或直连键；

R_1c为H；任选被OH、酰基、卤素、C_3-10环烷基、苯基或羟基亚苯基取代的C_1-6烷基；C_2-6链烯基；C_2-6炔基；或任选被OH取代的苯基；

R_2c为

其中R_5c为H或任选被1、2或3个卤素原子取代的C_1-4烷基，且R_6c为H或任选被卤素取代的C_1-4烷基；

R_3c和R_4c相互独立地为H、任选被卤素取代的C_1-4烷基或酰基，

且

R_c为C_13-20烷基，其可任选地在链中含有氧原子，且其可任选地被硝基、卤素、氨基、羟基或羧基取代；或为式(a)的残基

其中R_7c为H、C_1-4烷基或C_1-4烷氧基，且R_8c为取代的C_1-20烷酰基、苯基C_1-14烷基，其中C_1-14烷基任选地被卤素或OH取代、环烷基C_1-14烷氧基或苯基C_1-14烷氧基，其中环烷基或苯环任选被卤素、C_1-4烷基和/或C_1-4烷氧基取代、苯基C_1-14烷氧基C_1-14烷基、苯氧基C_1-14烷氧基或苯氧基C_1-14烷基，

当R_1c为C_1-4烷基、C_2-6链烯基或C_2-6炔基时，R_c也可以是式(a)的残基，其中R_8c为C_1-14烷氧基，

或式VI的化合物

其中

n_x为2、3或4

R_1x为H；任选被OH、酰基、卤素、环烷基、苯基或羟基亚苯基取代的C_1-6烷基；C_2-6链烯基；C_2-6炔基；或任选被OH取代的苯基；

R_2x为H、C_1-4烷基或酰基

R_3x和R_4x相互独立地为H、任选被卤素或酰基取代的C_1-4烷基，

R_5x为H、C_1-4烷基或C_1-4烷氧基，且

R_6x为被环烷基取代的C_1-20烷酰基；环烷基C_1-14烷氧基，其中环烷基环任选被卤素、C_1-4烷基和/或C_1-4烷氧基取代；苯基C_1-14烷氧基，其中苯环任选被卤素、C_1-4烷基和/或C_1-4烷氧基取代，

当R_1x为被OH取代的C_2-4烷基时，R_6x也可以为C_4-14烷氧基，或当R_1x为C_1-4烷基时，R_6x为戊氧基或己氧基，

条件是：当R_5x为H或R_1x为甲基时，R_6x不是苯基-丁烯氧基，

或其可药用盐；

-WO 02/06268A1中所公开的化合物，例如式VII的化合物

其中R_1d和R_2d相互独立地为H或氨基保护基；

R_3d为氢或羟基保护基；

R_4d为低级烷基；

n_d为1至6的整数之一；

X_d为亚乙基、亚乙烯基、亚乙炔基、式-D-CH₂-的基团(其中D为羰基、-CH(OH)-、O、S或N)、芳基或被不超过三个选自下文所定义的基团的取代基取代的芳基；

Y_d为单键、C_1-10亚烷基、被不超过三个选自基团a和b的取代基取代的C_1-10亚烷基、在碳链中间或末端含有O或S的C_1-10亚烷基、或在碳链中间或末端含有O或S、被不超过三个选自基团a和b的取代基取代的C_1-10亚烷基；

R_5d为氢、环烷基、芳基、杂环、被不超过三个选自基团a和b的取代基取代的环烷基、被不超过三个选自基团a和b的取代基取代的芳基、或者被不超过三个选自基团a和b的取代基取代的杂环；且

R_6d和R_7d相互独立地为H或选自基团a的取代基；

<基团a>为卤素、低级烷基、卤代低级烷基、低级烷氧基、低级烷硫基、羧基、低级烷氧基羰基、羟基、低级脂族酰基、氨基、单低级烷基氨基、二低级烷基氨基、低级脂族酰氨基、氰基或硝基；

<基团b>为环烷基、酰基、杂环，其分别可任选被不超过三个选自基团a的取代基取代；

条件是：当R_5d为氢时，Y_d为单键或直链C_1-10亚烷基，

或其可药用的盐或酯。

-JP-14316985(JP2002316985)中所公开的化合物，例如式VIII的化合物：

其中R_1e、R_2e、R_3e、R_4e、R_5e、R_6e、R_7e、n_e、X_e和Y_e如JP-14316985中所述；

或其可药用的盐或酯。

-WO 03/29184和WO 03/29205中所公开的化合物，例如式IX的化合物：

其中X_f为O或S，且R_1f、R_2f、R_3f和n_f如WO 03/29184和O3/29205中所述，例如，2-氨基-2-[4-(3-苄氧苯氧基)-2-氯苯基]丙基-1，3-丙二醇或2-氨基-2-[4-(苄氧基苯硫基)-2-氯苯基]丙基-1，3-丙二醇。

当进行专利申请引用时，将与所述化合物相关的主题引入本申请作为参考。

酰基可为R_y-CO-残基，其中R_y为C_1-6烷基、C_3-6环烷基、苯基或苯基-C_1-4烷基。除非另外说明，否则烷基、烷氧基、链烯基或炔基均可以为直链或支链的。

当式I化合物中的R1的碳链被取代时，其优选被卤素、硝基、氨基、羟基或羧基取代。当碳链被任选取代的亚苯基中断时，碳链优选为未取代的。当亚苯基部分被取代时，其优选被卤素、硝基、氨基、甲氧基、羟基或羧基取代。

式I的优选化合物是那些其中R₁为任选被硝基、卤素、氨基、羟基或羧基取代的C_13-20烷基的化合物；并且，更优选那些其中R₁为被C_6-14烷基链(烷基链任选被卤素取代且烷基部分任选被羟基取代)取代的苯基烷基的化合物。更优选地，R₁为在苯环上被直链或支链、优选直链的C_6-14烷基链取代的苯基-C_1-6烷基。C_6-14烷基链可以在邻位、间位或对位，优选在对位。

优选R₂至R₅各自为H。

优选的式I化合物为2-氨基-2-十四烷基-1，3-丙二醇。特别优选的式I的S1P受体激动剂为FTY720，即游离形式或可药用盐形式的2-氨基-2-[2-(4-辛基苯基)乙基]丙烷-1，3-二醇(下文称为化合物A)，例如如下所示的盐酸盐：

式II的优选化合物为其中R’₂至R’₅各自为H且m为4的化合物，即游离形式或可药用盐形式的2-氨基-2-{2-[4-(1-氧代-5-苯基戊基)苯基]乙基}丙烷-1，3-二醇(下文称为化合物B)，例如盐酸盐。

式III的优选化合物为其中W为CH₃、R”₁至R”₃各自为H、Z₂为亚乙基、X为庚氧基且Y为H的化合物，即游离形式或可药用盐形式的2-氨基-4-(4-庚氧基苯基)-2-甲基-丁醇(下文称为化合物C)，例如盐酸盐。特别优选R-对映体。

式IVa的优选化合物为FTY720-磷酸盐(R_2a为H、R_3a为OH、X_a为O、R_1a和R_1b为OH)。式IV_b的优选化合物为化合物C-磷酸盐(R_2a为H、R_3b为OH、X_a为O、R_1a和R_1b为OH、Y_a为O且R_4a为庚基)。式V的优选化合物为化合物B-磷酸盐。

式V的优选化合物为磷酸单-[(R)-2-氨基-2-甲基-4-(4-戊氧基-苯基)-丁基]酯。

式VIII的优选化合物为(2R)-2-氨基-4-[3-(4-环己基氧基丁基)苯并[b]噻吩-6-基]-2-甲基丁-1-醇。

当式I至IX的化合物在分子中具有一个或多个不对称中心时，本发明应理解为包括各种旋光异构体以及外消旋物、非对映立体异构体及其混合物。当带有氨基的碳原子为不对称碳原子时，式III或IVb的化合物在该碳原子上优选具有R-构型。

式I至IX的化合物的可药用盐的例子包括与无机酸的盐，如盐酸盐、氢溴酸盐和硫酸盐、与有机酸的盐，如醋酸盐、富马酸盐、马来酸盐、苯甲酸盐、柠檬酸盐、苹果酸盐、甲磺酸盐和苯磺酸盐，或者适宜时，与金属如钠、钾、钙和铝的盐、与胺如三乙胺的盐以及与氨基二酸如赖氨酸的盐。本发明的方法的化合物和盐包括水合物和溶剂合物形式。

根据所观察的活性例如EP627406A1或USP 6,004,565所述的淋巴细胞归巢活性，已发现S1P受体激动剂可例如在治疗急性同种异体移植物排异中例如用作免疫抑制剂。现已发现：S1P受体激动剂具有令人关注的特性，所述特性使其可用于癌症化疗，特别是实体瘤，尤其是晚期实体瘤。仍需要扩展实体瘤癌症治疗的装备，尤其是在抗癌化合物治疗不能使疾病消退或稳定的情况下。

根据本发明的特别发现，本发明提供了：

1.1一种在有需要的个体中治疗实体瘤的方法，包括给予所述个体治疗有效量的S1P受体激动剂或其可药用盐，其中所述激动剂含有式X的基团。

1.2一种在有需要的个体中抑制实体瘤生长的方法，包括给予所述个体治疗有效量的S1P受体激动剂或其可药用盐，其中所述激动剂含有式X的基团。

1.3一种在有需要的个体中诱导肿瘤消退、例如肿瘤质量减轻的方法，包括给予所述个体治疗有效量的S1P受体激动剂或其可药用盐，其中所述激动剂含有式X的基团。

1.4一种在有需要的个体中治疗实体瘤侵入或与此肿瘤生长相关的症状的方法，包括给予所述个体治疗有效量的S1P受体激动剂或其可药用盐，其中所述激动剂含有式X的基团。

1.5一种在有需要的个体中预防肿瘤转移扩散或预防或抑制微转移灶生长的方法，包括给予所述个体治疗有效量的S1P受体激动剂或其可药用盐，其中所述激动剂含有式X的基团。

1.6一种在有需要的个体中抑制或控制失控的血管生成(例如1-磷酸鞘氨醇(S1P)介导的血管生成)的方法，包括给予所述个体治疗有效量的S1P受体激动剂或其可药用盐，其中所述激动剂含有式X的基团。

1.7一种在有需要的个体中预防或治疗新血管生成过程所介导的疾病或与失控的血管生成相关的疾病的方法，包括给予所述个体治疗有效量的S1P受体激动剂或其可药用盐，其中所述激动剂含有式X的基团。

“实体瘤”指除淋巴癌之外的肿瘤和/或转移灶(无论在何处)，例如脑或其它中枢神经系统肿瘤(如脑膜瘤、脑瘤、脊髓瘤、颅神经瘤和中枢神经系统其它部分的肿瘤，如恶性胶质瘤或髓胚细胞瘤)；头和/或颈部癌；乳房肿瘤；循环系统肿瘤(例如心脏、纵隔和胸膜、以及胸廓内其它器官的肿瘤、血管瘤和与血管组织有关的肿瘤)；分泌系统肿瘤(例如肾、肾孟、输尿管、膀胱、其它和未特别指出的泌尿器官)；胃肠道肿瘤(例如食道、胃、小肠、结肠、结肠直肠、直肠乙状结肠结合点、直肠、肛门、肛管)，涉及肝及肝内输胆管、胆囊、胆道的其它和未特别指出部分、胰腺及其它消化器官的肿瘤；头和颈；口腔(嘴唇、舌头、牙龈、口腔底部、腭和口腔的其它部分、腮腺和唾液腺其它部分、扁桃体、口咽、鼻咽、梨形窦、咽下部和嘴唇、口腔及咽的其它部位)；生殖系统肿瘤(例如外阴、阴道、子宫颈、子宫体、子宫、卵巢和女性生殖器官的其它部位、胎盘、阴茎、前列腺、睾丸和男性生殖器官的其它部位)；呼吸道肿瘤(例如鼻腔和中耳、副鼻窦、喉、气管、支气管和肺，例如小细胞肺癌或非小细胞肺癌)；骨骼系统肿瘤(例如四肢的骨和关节软骨、骨关节软骨和其它部位)；皮肤肿瘤(例如皮肤恶性黑色素瘤、非黑色素瘤皮肤癌、皮肤基底细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、间皮瘤、Kaposi’s肉瘤)；和涉及其它组织、包括外周神经和植物神经系统、结缔组织和软组织、腹膜后腔和腹膜、眼及附件、甲状腺、肾上腺和其它内分泌腺及有关结构的肿瘤、继发性和未特别指出的恶性淋巴结瘤、呼吸和消化系统的继发性恶性肿瘤和其它部位的继发性恶性肿瘤。

在以上和以下提到肿瘤、肿瘤疾病、癌或恶性肿瘤时，还单独或同时暗指原发器官或组织和/或其它任一部位的转移瘤，不管肿瘤和/或转移瘤是在何处。

当S1P受体激动剂为式I化合物(例如化合物A)或式IVa或IVb的化合物时，在一项实施方案中，其被用于除乳腺、前列腺、膀胱、肾脏或肺肿瘤以外的实体瘤治疗方法1.1、1.2、1.3或1.4中。

在一系列其它具体的或可供选择的实施方案中，本发明还提供了：

1.8一种在有需要的个体中增强化疗剂的活性或克服化疗剂耐药性的方法，其包括与所述化疗剂一起，同时或依次给予所述个体治疗有效量的S1P受体激动剂，例如含有式X的基团的S1P受体激动剂，或其可药用盐。

1.9根据1.8所述的方法，其中化疗剂为信号传导路径抑制剂，该信号传导路径针对宿主细胞或肿瘤形成和/或转移灶形成所涉及的过程，或可被肿瘤细胞利用以进行增殖、存活、分化或产生耐药性。

1.10如上所述的方法，其中S1P受体激动剂间断给药。

2.1用于上述1.1至1.4所定义的任何方法的包含式X的基团的S1P受体激动剂或其可药用盐，当S1P受体激动剂为式I的化合物(如化合物A)或式IVa或IVb的化合物时，其优选用于乳腺、前列腺、膀胱、肾脏或肺以外的实体瘤。

2.2用于以上1.5至1.10或下文7中所定义的任何方法中的S1P受体激动剂，例如含有式X的基团的S1P受体激动剂，或其可药用盐。

3.1用于制备用在上述1.1至1.4所定义的任何方法中的药物组合物的包含式X的基团的S1P受体激动剂或其可药用盐，当S1P受体激动剂为式I的化合物(如化合物A)或式IVa或IVb的化合物时，其优选用于乳腺、前列腺、膀胱、肾脏或肺以外的实体瘤。

3.2用于制备用在以上1.5至1.10或下文7中所定义的任何方法中的S1P受体激动剂，例如含有式X的基团的S1P受体激动剂，或其可药用盐。

4.1用于上述1.1至1.4所定义的任何方法的药物组合物，其含有包含式X的基团的S1P受体激动剂或其可药用盐，以及一种或多种可药用的稀释剂或载体，当S1P受体激动剂为式I的化合物(如化合物A)或式IVa或IVb的化合物时，其优选用于乳腺、前列腺、膀胱、肾脏或肺以外的实体瘤。

4.2用于以上1.5至1.10或下文7中所定义的任何方法的药物组合物，其含有S1P受体激动剂，例如含有式X的基团的S1P受体激动剂，或其可药用盐，以及一种或多种可药用的稀释剂或载体。

5.1一种药物组合，其含有a)为S1P受体激动剂的第一药物，例如含有式X的基团的S1P受体激动剂或其可药用盐，以及b)为化疗剂的辅药，例如下文所详细说明的化疗剂。

5.2一种药物组合，其含有一定量的a)为S1P受体激动剂的第一药物，例如含有式X的基团的S1P受体激动剂或其可药用盐，以及b)为化疗剂的辅药，其选自下文xi)部分所定义的化合物，以产生协同治疗效果。

6.一种如上所定义的方法，包括将治疗有效量的S1P受体激动剂，例如包含式X的基团的S1P受体激动剂或其可药用盐和第二种药物共同给药，例如同时或相继给药，所述的第二种药物为下文所述的化疗剂。

7.一种在有需要的个体中治疗淋巴增殖或骨髓增殖异常，例如治疗肿瘤侵入或与此肿瘤生长相关的症状的方法，其包括向所述个体共同给药，例如同时或相继给药S1P受体激动剂，例如包含式X的基团的S1P受体激动剂或其可药用盐和第二种药物，所述的第二种药物为例如下文所述的化疗剂。

“淋巴癌”是指例如血液和淋巴系统肿瘤(例如霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、与AIDS有关的淋巴瘤、恶性免疫增生病、多发性骨髓瘤和恶性浆细胞瘤、淋巴白血病、骨髓白血病、急性或慢性淋巴细胞白血病、单核细胞白血病、其它指定细胞类型的白血病、未特别指出细胞类型的白血病、其它和未特别指出的淋巴、造血及有关组织的恶性肿瘤例如弥散性大细胞淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤或皮肤T-细胞淋巴瘤)。骨髓癌包括如急性或慢性髓性白血病。

名词“化疗剂”尤其所指的是除S1P受体激动剂外的任何化疗剂。其包括但不只限于：

i.芳香酶抑制药，

ii.抗雌激素药、抗雄激素药(特别是患前列腺癌时)或戈那瑞林激动剂，

iii.拓扑异构酶I抑制剂或拓扑异构酶II抑制剂，

iv.微管活化剂、烷化剂、抗肿瘤抗代谢药物或铂配合物，

v.靶向/降低蛋白或脂类激酶活性或者蛋白或脂类磷酸酶活性的化合物，其它抗血管生成化合物或可诱导细胞分化过程的化合物，

vi.缓激肽1受体或血管紧张素II拮抗剂，

vii.环加氧酶抑制剂、二膦酸类化合物、组蛋白脱酰酶抑制剂、肝素酶(heparinase)抑制剂(防止硫酸乙酰肝素降解)如PI-88、生物学应答修饰剂，优选淋巴因子或干扰素，例如干扰素γ、遍在蛋白化抑制剂或能阻断抗细胞凋亡途径的抑制剂。

Viii.Ras致癌同种型抑制剂，例如H-Ras、K-Ras或N-Ras，或法尼基转移酶抑制剂，例如L-744,832或DK8G557，

ix.端粒末端转移酶抑制剂，例如telomestatin，

x.蛋白酶抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、蛋氨酸氨基肽酶抑制剂，例如bengamide或其衍生物，或蛋白体抑制剂，例如PS-341。

xi.mTOR抑制剂。

这里使用的术语“芳香酶抑制剂”涉及能抑制雌激素生成，即将雄甾烯二酮和睾酮底物分别转化为雌酮和雌二醇的化合物。该术语包括但不局限于甾类，尤其是阿他美坦、依西美坦和福美坦，和特别是非甾类，尤其是氨鲁米特、罗谷亚胺、吡啶基苯乙哌啶酮、曲洛司坦、睾内酯、酮康唑、伏氯唑、法倔唑、阿那曲唑和来曲唑。依西美坦可以如市售形式如商标为AROMASIN^TM的形式给药。福美坦可以如市售形式如商标为LENTARON^TM的形式给药。法倔唑可以如市售形式如商标为AFEMA^TM的形式给药。阿那曲唑可以如市售形式如商标为ARIMIDEX^TM的形式给药。来曲唑可以如市售形式如商标为FEMARA^TM或FEMAR^TM的形式给药。氨鲁米特可以如市售形式如商标为ORIMETEN^TM的形式给药。本发明中含芳香酶抑制药化疗剂的联合给药对治疗激素受体阳性肿瘤如乳瘤特别有效。

这里使用的术语“抗雌激素药”涉及能在雌激素受体水平拮抗雌激素效应的化合物。该术语包括但不局限于他莫昔芬、氟维司群、雷洛昔芬和盐酸雷洛昔芬。他莫昔芬可以如市售形式如商标NOLVADEX^TM的形式给药。盐酸雷洛昔芬可以如市售形式如商标为EVISTA^TM的形式给药。氟维司群可按US 4,659,516中公开的内容制得或以如市售形式如商标为FASLODEX^TM的形式给药。本发明中含有抗雌激素药化疗剂的联合给药对治疗雌激素受体阳性肿瘤如乳瘤特别有效。

这里使用的术语“抗雄激素药”涉及能抑制雄性激素生物学效应的任一物质，包括但不局限于比卡鲁胺(CASODEX^TM)，其可按照US 4,636,505中公开的内容配制。

这里使用的术语“戈那瑞林激动剂”包括但不局限于阿巴瑞克、戈舍瑞林和醋酸戈舍瑞林。戈舍瑞林在US 4,100,274中公开，可以如市售形式如商标为ZOLADEX^TM的形式给药。阿巴瑞克可按照US 5,843,901中公开的内容配制。

这里使用的术语“拓扑异构酶I抑制剂”包括但不局限于托泊替康、伊立替康、9-硝基喜树碱和大分子喜树碱轭合物PNU-166148(WO99/17804中的化合物A1)。伊立替康可以例如市售形式如商标为CAMPTOSAR^TM的形式给药。托泊替康可以如市售形式如商标为HYCAMTIN^TM的形式给药。

这里使用的术语“拓扑异构酶II抑制剂”包括但不局限于蒽环霉素类如阿霉素(包括脂质体剂型，例如CAELYX^TM)、柔红霉素、表柔比星、伊达比星和奈莫柔比星(nemorubicin)、蒽醌米托蒽醌和洛索蒽醌，和鬼臼脂素(podophyllotoxines)依托泊苷和替尼泊苷。依托泊苷可以例如市售形式如商标为ETOPOPHOS^TM的形式给药。替尼泊苷以如市售形式如商标为VM26-BRISTOL^TM的形式给药。阿霉素以如市售形式如商标为ADRIBLASTIN^TM的形式给药。表柔比星以如市售形式如商标为FARMORUBICIN^TM的形式给药。伊达比星以如市售形式如商标为ZAVEDOS^TM的形式给药。米托蒽醌以如市售形式如商标为NOVANTRON^TM的形式给药。

这里使用的术语“微管活化药”涉及微管稳定药和微管去稳定药，包括但不局限于紫杉烷类如紫杉醇和多西他赛，长春生物碱如长春花碱，特别是硫酸长春花碱、长春新碱，特别是硫酸长春新碱、和长春瑞滨、海绵内酯(discodermolide)和埃博霉素及其衍生物，如埃博霉素B或其衍生物。紫杉醇以如市售形式如商标为TAXOL^TM的形式给药。多西他赛以如市售形式如商标为TAXOTERE^TM的形式给药。硫酸长春花碱以例如市售形式如商标为VINBLASTIN R.P.^TM的形式给药。硫酸长春新碱以例如市售形式如商标为FARMISTIN^TM的形式给药。海绵内酯可如US 5,010,099公开的内容中得到。

这里使用的术语“烷化剂”包括但不局限于环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥或亚硝基脲(BCNU或Gliadel^TM)。环磷酰胺以例如市售形式如商标为CYCLOSTIN^TM的形式给药。异环磷酰胺以例如市售形式如商标为HOLOXAN^TM的形式给药。

术语“抗肿瘤抗代谢药物”包括但不局限于5-氟尿嘧啶、卡培他滨、吉西他滨、甲氨蝶呤和依达曲沙。卡培他滨以例如市售形式如商标为XELODA^TM的形式给药。吉西他滨以例如市售形式如商标为GEMZAR^TM的形式给药。

这里使用的术语“铂配合物”包括但不局限于卡铂、顺铂和奥沙利铂。卡铂以例如市售形式如商标为CARBOPLA^TM的形式给药。奥沙利铂以例如市售形式如商标为ELOXATIN^TM的形式给药。

靶向、减小或抑制VEGFR活性的化合物尤其是能抑制VEGF酪氨酸激酶受体、抑制VEGF受体或与VEGF结合的化合物、蛋白质或抗体，和特别是那些WO 98/35958中、或如WO 00/09495、WO 00/27820、WO00/59509、WO 98/11223、WO 00/27819和EP 0 769947中一般和具体公开的化合物、蛋白质或单克隆抗体，例如1-(4-氯苯氨基)-4-(4-吡啶基甲基)酞嗪或可药用盐，如琥珀酸盐；那些如M.Prewett等人在Cancer Research 59(1999)5209-5218中、F.Yuan等人在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.93，pp.14765-14770，Dec.1996中、Z.Zhu等人在Cancer Res.58，1998，3209-3214中和J.Mordenti等人在Toxicologic Pathology，Vol.27，no.1，pp 14-21，1999中描述的化合物；WO 00/37502和WO 94/10202中的化合物；M.S.O’Reilly等人在Cell 79，1994，315-328中描述的Angiostatin^TM； M.S.O’Reilly等人在Cell 88，1997，277-285中描述的Endostatin^TM；邻氨基苯甲酸酰胺；ZD4190；ZD6474；SU5416；SU6668；或抗VEGF抗体或抗-VEGF受体抗体，例如RhuMab。

抗体指完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多种类抗体、和抗体碎片，只要该抗体碎片能表现出希望的生物学活性。

靶向、减小或抑制表皮生长因子受体家族活性的化合物尤其是能抑制EGF酪氨酸激酶受体家族成员如EGF受体、ErbB2、ErbB3和ErbB4或结合EGF或EGF有关配体的化合物、蛋白质或抗体，和特别是那些WO97/02266中一般和具体公开的化合物、蛋白质或单克隆抗体，如实施例39的化合物，或者在EP 0 564 409、WO 99/03854、EP 0520722、EP 0 566 226、EP 0 787 722、EP 0 837 063、US 5,747,498、WO 98/10767、WO 97/30034、WO 97/49688、WO 97/38983中和尤其在WO 96/30347(如已知化合物CP358774)、WO 96/33980(如已知化合物ZD 1839)和WO 95/03283(如化合物ZM105180)中公开的化合物、蛋白质或单克隆抗体；例如曲妥单抗(Herpetin^R)、西妥昔单抗、Iressa、OSI-774、CI-1033、EKB-569、GW-2016、E1.1、E2.4、E2.5、E6.2、E6.4、E2.11、E6.3或E7.6.3。

靶向、减小或抑制PDGFR活性的化合物尤其是能抑制PDGF受体的化合物，例如N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物，如伊马替尼。

靶向、减小或抑制c-AbI家族成员及其基因融合产物活性的化合物例如是N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物，如伊马替尼；PD180970；AG957或NSC680410。

靶向、减小或抑制蛋白激酶C、Raf、MEK、SRC、JAK、FAK和PDK家族成员或PI(3)激酶或与PI(3)激酶有关家族成员和/或细胞周期蛋白依赖性激酶家族(CDK)成员活性的化合物，尤其是那些EP 0 296 110中公开的星孢素衍生物如米哚妥林；其它化合物的实施例包括例如UCN-01、沙芬戈、BAY 43-9006、苔藓抑素1、哌立福辛；伊莫福新；RO 318220和RO 320432；GO 6976；Isis 3521；或LY333531/LY379196。

其它抗血管生成化合物例如是萨力多胺(THALOMID)和TNP-470。

靶向、减小或抑制蛋白或脂质磷酸酶活性的化合物例如是磷酸酶1、磷酸酶2A、PTEN或CDC25如冈田酸或其衍生物的抑制剂。

能诱导细胞变异过程的化合物例如是视黄酸、α-、γ-或δ-生育酚或α-、γ-或δ-生育三烯酚。

这里使用的术语环加氧酶抑制剂包括但不局限于例如塞来考昔(Celebrex^R)、罗非考昔(Vioxx^R)、etoricoxib、伐地考昔或5-烷基-2-氨基氨基苯基乙酸如5-甲基-2-(2’-氯-6’-氟苯氨基)苯基乙酸。

这里使用的术语“组蛋白脱酰酶抑制剂”包括但不局限于MS-27-275、SAHA、pyroxamide、FR-901228或丙戊酸。

这里使用的术语“二膦酸类化合物”包括但不局限于依替膦酸、氯膦酸、替鲁膦酸、帕米膦酸、阿仑膦酸、伊班膦酸、利塞膦酸和唑来膦酸。“依替膦酸”以例如市售形式如商标为DIDRONEL^TM的形式给药。“氯膦酸”以例如市售形式如商标为BONEFOS^TM的形式给药。“替鲁膦酸”以例如市售形式如商标为SKELID^TM的形式给药。“帕米膦酸”以例如市售形式如商标为AREDIA^TM的形式给药。“阿仑膦酸”以例如市售形式如商标为FOSAMAX^TM的形式给药。“伊班膦酸”以例如市售形式如商标为BONDRANA^TM的形式给药。“利塞膦酸”以例如市售形式如商标为ACTONEL^TM的形式给药。“唑来膦酸”以例如市售形式如商标为ZOMETA^TM的形式给药。

这里使用的术语“基质金属蛋白酶抑制剂”包括但不局限于胶原模拟肽和非模拟肽抑制剂、四环素衍生物例如异羟肟酸模拟肽抑制剂巴马司他及其口服生物可接受类似物马立马司他、普啉司他、BMS-279251、BAY12-9566、TAA211或AAJ996。

这里使用的术语“mTOR抑制剂”包括但不仅限于雷帕霉素或其衍生物。雷帕霉素是由吸水链霉菌产生的已知的大环内酯类抗菌素。适宜的雷帕霉素衍生物包括例如式A的化合物

其中

R_1aa为CH₃或C_3-6炔基，

R_2aa为H或-CH₂-CH₂-OH、3-羟基-2-(羟甲基)-2-甲基-丙酰基或四唑基，并且

X_aa为＝O、(H，H)或(H，OH)

其条件是，当X_aa为＝O且R_1aa为CH₃时，R_2aa不为H，

或者当R_2aa为-CH₂-CH₂-OH时，其前体药物，例如其生理学可水解的酯。

式I化合物在例如WO 94/09010、WO 95/16691、WO 96/41807、USP5,362,718或WO 99/15530中已经公开，这些文献在此引入作为参考。可按照这些文献中公开的或与之相似的方法制备这些化合物。

优选的雷帕霉素衍生物是32-脱氧雷帕霉素、16-戊-2-炔基氧基-32-脱氧雷帕霉素、16-戊-2-炔基氧基-32(S)-二氢-雷帕霉素、16-戊-2-炔基氧基-32(S)-二氢-40-O-(2-羟乙基)-雷帕霉素，和更优选的40-O-(2-羟乙基)-雷帕霉素。雷帕霉素衍生物的其他例子包括如USP 5,362,718中公开的CCI779或40-[3-羟基-2-(羟甲基)-2-甲基丙酸酯]-雷帕霉素或其可药用盐、如WO99/15530中所公开的ABT578或40-(四唑基)-雷帕霉素，特别是40-表-(四唑基)-雷帕霉素，或者如WO 98/02441和WO 01/14387中所公开的雷帕霉素类似物，例如AP23573。

在给出了专利申请或科学刊物引文的情况中，与化合物有关的内容引入本申请作为参考。这些化合物也可以是其可药用盐、相应的消旋物、非对映异构体、对映体、互变异构体以及，如果存在的话，上述化合物的相应的结晶变体，例如溶剂化物、水合物和多晶型。在本发明的组合中用作活性成份的化合物可如所引用文献中所述进行制备和给药。同时，本发明的范围还包括多于两种的上述各种活性成份的组合，即本发明范围内的药学组合可包括三种或三种以上活性成份。此外，第一药物和辅药均不为同种成份。

在治疗如上所详细说明的实体瘤中，S1P激动剂(如包含式X的基团的S1P激动剂)的效用可在动物试验或临床试验方法中进行证实，例如依照下文所述的试验方法证实。

A.体外试验

A.1抗肿瘤活性

试验使用了最初分离自乳腺癌的小鼠乳腺癌细胞系，例如JygMC(A)。在试验操作开始前，将细胞数目调整至5×10⁵以在新鲜培养液中铺板。将细胞与含有2.5mM胸腺嘧啶脱氧核苷的不含FCS的新鲜培养液一起孵育12小时，然后用PBS清洗两次，随后再加入含10％FCS的新鲜培养液，并再次孵育12小时。然后再与含有2.5mM胸腺嘧啶脱氧核苷的不含FCS的新鲜培养液一起孵育12小时。为将细胞从所粘连成的细胞团块中释放，可将细胞以PBS清洗两次，并重新铺于含有10％FCS的新鲜培养液中。在同步化后，将细胞与不同浓度的式I化合物一起或者单独孵育3、6、9、12、18或24小时。在以0.2％EDTA处理后，收获细胞，并以冰冷的70％酒精溶液固定，然后于37℃以250μg/ml的RnaseA(1-A型：Sigma Chem.Co.)水解30分钟，并以10mg/ml的碘化丙啶染色20分钟。在孵育期后，同时通过Coulter计数器计数细胞以及SRB比色测定来测定细胞数目。在这些试验条件下，S1P激动剂(例如盐酸盐形式的化合物B)可在10^-12-10^-6M浓度范围内抑制肿瘤细胞的增殖。

A.2 S1P介导的HUVEC管柱形成试验

使用传代2-8代的HUVEC用于管柱形成试验，同时在收获前细胞融合度切勿超过70％。使用Herpes平衡盐溶液(HBSS来自Clonetics)清洗细胞然后以胰蛋白酶/EDTA(0.25mg/ml，来自Clonetics)对之进行酶解消化来预处理细胞以进行实验。在约90％的细胞脱离平板后，加入等体积的胰蛋白酶中和液(TNS来自Clonetics)并将细胞收集至至少含有10ml EBM-2(Clonetics)+0.1％BSA(Sigma)培养液的圆锥管中。于1000rpm离心细胞5分钟，移除上清液并补充以5ml的新鲜EBM-2+0.1％BSA。使用血球计数器计数细胞并将细胞混悬液调整达到500,000细胞/ml的浓度。使用100nM的检测化合物以及每只管中10ng/ml的百日咳菌外毒素(PTx)对圆锥管进行预处理，然后向每只管中加入1ml的细胞混悬液。然后于37℃、5％CO₂中孵育圆锥管半小时。使用涂以纤连蛋白的Fluoro-Blok 24-Mulitwell嵌入板(8μm管径大小，Falcon#351147)代替在24孔板中的单个嵌入板进行细胞移行试验。如上所述准备细胞和检测化合物并进行预孵育，然后向嵌入板每一合适的孔中加入100μl。将300μl EBM-2+2％经活性炭吸附的不含S1P的培养液加入标记为无刺激物(-)孔的底部，同时将300μl含有S1P(500nM)的培养液加入标记为刺激物(+)孔的底部。然后将平板置于37℃、5％CO₂中孵育4小时。

先向小瓶中加入20μl DMSO来准备钙黄绿素AM，50μg/小瓶(Molecular Probes #C3100)。然后加热12.5ml的HBSS(每平板)至37℃，同时每小瓶中加入150μl。然后将小瓶内容物转移回剩余的HBSS中以使钙黄绿素AM最终浓度为4μg/ml。

将Fluoro-Blok平板移出保温箱，分开顶部嵌入板并“轻弹”除去粘在嵌入板上多余的培养液。然后将嵌入板转移至含有500μl/孔的4μg/ml的钙黄绿素AM的新的24孔板上。再将板于37℃、5％CO₂中孵育1.5小时。

孵育后，将板置于Cytofluor II上以485nm的激发波长和530nm的发射波长进行读数。嵌入板中的Fluoro-Blok涂层只允许移行至底部的细胞被计数。数据传输至Excel进行计算，并使用SigmaPlot生成图表，同时使用SigmaStat进行显著性检验(t-检验)。(图7)。

在4倍放大倍率下，通过计数3个独立视野中分支点(两独立带的连接点)的数目来定量管柱形成。结果报道如下：

处理	分支点
处理	分支点	PBS	8±5
S1P	42±13	PBS	8±5
S1P	42±13	FTY720-磷酸盐	48±15
FTY720-磷酸盐+S1P	14±7	FTY720-磷酸盐	48±15
FTY720-磷酸盐+S1P	14±7	化合物C-磷酸盐	44±16
化合物C-磷酸盐+S1P	18±6	化合物C-磷酸盐	44±16

这些结果证实了FTY720-磷酸盐或化合物C-磷酸盐本身作为血管生成激动剂的独特能力，但又令人惊奇的可作为S1P所介导血管生成的拮抗剂。化合物C磷酸盐优选为消旋物或R-对映体。PTx被用作抑制Giα(EDG-1)所介导活性的对照。

B.体内试验

B.1抗肿瘤活性

抗肿瘤活性以T/C％表示(经处理动物平均肿瘤体积的增加除以对照动物平均肿瘤体积的增加再乘以100)。

将等分试样的癌症细胞(1×10⁷)(例如人类A375黑色素瘤细胞)移植至BALB/c-nu/nu小鼠。在肿瘤长至10×10mm大小时，将动物随机分配至四个亚组，并用式I化合物处理。经过2周处理后，处死动物，同时收获肿瘤和组织并进行形态学和分子分析处理。使用卡尺测定肿瘤大小。在本试验中，在以0.5至5mg/kg的剂量给药时，与对照盐水相比，S1P激动剂(例如化合物B或C(以盐酸盐形式))可减慢肿瘤生长；例如，化合物C盐酸盐在以2.5mg/kg 5次/周的剂量给药时，可产生最终T/C值为30％的结果。

B.2与VEGF-R蛋白酪氨酸激酶抑制剂联合

将移植人类MDA-MB-435乳腺肿瘤的裸鼠以100mg/kg 5次/周口服剂量的VEGF-R蛋白酪氨酸激酶抑制剂(例如1-(4-氯苯胺基)-4-(4-吡啶基甲基)酞嗪琥珀酸盐)、2.5mg/kg 5次/周静脉剂量的S1P受体激动剂(例如化合物C(盐酸盐))或两者联合用药处理两周。如上所述，以T/C％表示抗肿瘤活性。与单独使用任何一种药剂相比，化合物C盐酸盐和1-(4-氯苯胺基)-4-(4-吡啶基甲基)酞嗪琥珀酸盐的联合用药可产生更显著的抗肿瘤效果(T/C％27)(化合物C盐酸盐T/C66％；1-(4-氯苯胺基)-4-(4-吡啶基甲基)酞嗪琥珀酸盐T/C91％)。在移植人类A375黑色素瘤细胞并以相似方法进行处理的裸鼠中，相同的联合用药也同样获得了良好的抗肿瘤反应：联合用药所产生的T/C％为15，而单独使用每一种药剂所产生的T/C％分别为35和44。

B.3抗血管生成活性

将在0.5ml 0.8％w/v琼脂(含有肝素，20U/ml)中含有(i)1-磷酸鞘氨醇(5μM/腔)或(ii)人体VEGF(1μg/腔)的多孔腔植入裸鼠胁腹皮下。S1P或VEGF可诱导腔周围的血管化组织的生长。此反应为剂量依赖性的并可通过测定组织重量和血容量来定量。从移植前4-6小时开始，以化合物A(0.3、3、30或50mg/kg)口服(i)或化合物C的R-对映体(2.5mg/kg)静脉(ii)或化合物C的S对映体(2.5mg/kg)静脉(iii)或载体(5％葡萄糖，10ml/kg)口服或静脉(iv)处理裸鼠，每天一次，持续4天。在给予最后一次剂量24小时后，处死动物以进行血管化组织的测定。测定腔周围血管化组织的重量和血容量。

与仅用载体处理的动物相比，经化合物A或化合物C的R或S对映体处理过的动物显示其血管化组织的重量和/或血容量减低。

C.临床试验

C.1 S1P受体激动剂(例如式I、II或III的化合物，如化合物A、B或C)的临床获益调查

20名对标准治疗方法耐药或难控的进展期晚期肿瘤患者，以通过剂量递增试验所确定的剂量接受了所述的化合物治疗。每周对患者进行体检和实验室检查以调查其全身临床状况。每两个月通过放射检查评定其肿瘤变化和所负荷的转移。患者最初接受2个月的治疗。此后，只要其疾病没有进展并且药物耐受满意，患者可以持续本治疗。

评估的主要变量：安全性(不良事件)、标准血清生物化学和血液学、计算机断层扫描(CT)或核磁共振成像(MRI)所确定的肿瘤大小。

C.2联合治疗

合适的临床试验为，例如晚期实体瘤患者的开放标记非随机化剂量递增试验。这样的试验特别证明了本发明的组合的活性成份的协同作用。通过这些试验结果或通过为所属技术领域中的技术人员所已知的试验设计中的变化，可直接确定其对增殖性疾病的有益效果。这样的试验特别适合对比使用活性成份单药疗法和本发明之联合疗法的疗效。优选第一药物(a)的剂量逐渐递增直至达到最大耐受剂量，同时辅药(b)以固定剂量给药。或者也可选择，第一药物(a)以固定剂量给药，同时辅药(b)剂量递增。每一患者均每天或间断接受药剂(a)治疗。在这些试验中可确定治疗疗效，例如12、18或24周后每6周进行放射学评估。

或者也可选择，使用安慰剂对照的双盲试验来证实此处所述发明的联合治疗益处。

在单独使用S1P受体激动剂时，本发明方法实施中所需的每日剂量将依据如下因素而变化，例如所使用的化合物、宿主、给药方式以及所治疗病情的严重程度。优选的每日剂量范围为约从0.1至100mg，单次给药或分次给药。患者合适的每日剂量为例如0.1至50mg口服。S1P受体激动剂可通过任何常规途径给药，特别是肠道(例如口服，如以片剂、胶囊、口服液的形式)、鼻腔、肺(通过吸入)或胃肠外给药(例如以注射液或注射混悬液的形式)。合适的口服给药单位剂量形式包含约0.1至30mg(通常0.25至30mg)的S1P受体激动剂以及一种或多种可药用的稀释剂或其载体。为抑制血管生成，选择一足够高剂量的S1P受体激动剂很重要，因为低浓度的S1P受体激动剂可促进血管生成。在给予患者S1P激动剂时，可通过如上A、B和C所述的浓度和剂量递增试验来选择提供抗血管生成作用的合适剂量。

本发明的组合也可与手术治疗、轻微长时间升高整个体温和/或照射治疗联合。

施用本发明的药物组合物不仅产生了例如协同治疗效果(例如就减慢、停止或逆转肿瘤的形成或延长肿瘤的响应期或抑制血管生成而言)这样的有益效果，而且还产生了其它令人惊讶的有益效果，例如与仅使用本发明的组合中所使用的药物活性成分之一的单独治疗相比，特别是在治疗用其它用作抗癌药的化疗剂无效的肿瘤时，副作用减少、生活质量提高或者死亡率和发病率降低。

另一方面的有益效果是可使用较低剂量的本发明的组合中的活性成分，例如剂量不仅可以更小而且使用频率可以更低，或者当控制肿瘤形成的生长时可用于减小副作用的发生率。这与被治疗患者的希望和需要是一致的。

根据本发明的一个实施方案，一种优选的药物组合含有

a)式I、II、III、IVa、IVb、V或VI的化合物，例如化合物A、B或C，以及

b)作为辅药的一种或多种上述段落(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vii)或(xi)中所述的化合物，例如卡铂，顺铂，紫杉醇，多西他赛，吉西他滨，阿霉素，靶向、降低或抑制血管内皮生长因子受体(VEGFR)家族酪氨酸激酶或血小板衍生生长因子受体(PDGFR)的活性的化合物，二膦酸类或mTOR抑制剂。

本发明的另一实施方案涉及S1P受体激动剂(a)与化疗剂(b)联合在治疗淋巴或骨髓癌中(例如如上所示)的用途。该组合还可包含一种其他的辅药(b)，例如白消安、阿糖胞苷、6-硫基鸟嘌呤、氟达拉滨、羟基脲、丙卡巴肼、博来霉素或氨甲蝶呤。拓扑异构酶II抑制剂(例如柔红霉素)，或者特别是靶向、降低或抑制PDGFR或c-Abl家族成员及其基因融合产物的活性的化合物(例如伊马替尼)作为辅药(b)更佳，例如用于治疗淋巴癌。

这里使用的术语“共同给药”或“联合给药”或相似术语包括将选择的治疗剂向单个患者给药，包括其中的药物不一定以同样的给药途径给药或同时给药的治疗方案。

本发明的目的之一是提供一种含有联合治疗增殖性恶性疾病有效量的本发明的组合的药物组合物。在该组合物中，第一药物a)和辅药b)可以以一个联合的单位剂量形式或两个单独的单位剂量形式同时给药、依次给药或分别给药。单位剂量形式也可以是固定的组合物。

本发明的药物组合物可以以本身已知的方式制备，并且是那些适合于肠内(如口服或直肠)和胃肠外对哺乳动物(温血动物)、包括人给药的组合物，其含有治疗有效量的至少一种如上所指出的药理学活性的联用组分本身，或同时含有一种或多种可药用的载体或稀释剂，特别是适合于肠内或胃肠外使用的载体或稀释剂。

适合的药物组合物含有，例如约0.1％至约99.9％、优选约1％至60％的活性成分。用于通过肠内或胃肠外给药进行联合治疗的药物制剂是例如单位剂量形式的制剂，如糖包衣片、片剂、胶囊或栓剂，或安瓿。如果没有另外说明，这些剂型以本身已知的方式制备，例如常规混合、制粒、糖包衣、溶解或冷冻干燥法。应当理解的是，既然可以通过给药多个剂量单位来达到所需的有效量，每个剂型的单个剂量中所含的联用组分的单位含量本身并不需要构成有效量。

具体地讲，本发明组合物的每个联用组分的治疗有效量可同时或以任何顺序依次给药，并且各组分可以分别或以固定的组合给药。例如，根据本发明，延迟增殖性恶性疾病的发展或对其进行治疗的方法包括：以联合治疗有效量、优选协同有效量(例如与文中描述的量一致的每日剂量或间断剂量)，同时或以任何顺序依次施用(i)游离或可药用盐形式的第一药物a)和(ii)游离或可药用盐形式的辅药b)。本发明的组合的各个联用组分可在治疗过程中的不同时间分别给药，或者以分开或单一组合物的形式同时给药。此外，术语给药也包括使用在体内可转化为这些联用组分的前药。因此，本发明应理解为包括所有这些同时或交替治疗的方案，术语“给药”也应作相应的解释。

本发明的组合中使用的各个联用组分的有效量随使用的特定化合物或药物组合物、给药方式、所治疗的病情、治疗病情的严重程度而变化。因此，根据多种因素、包括给药途径和患者的肾肝功能来选择本发明的组合的剂量方案。具有普通技能的主治医师、临床医师或兽医能迅速地决定和指定预防、阻止或控制病情发展所需要的单个活性成分的有效量。使活性成分的浓度最精确地达到可产生效果而没有毒性的范围内需要以活性成分在靶点的利用度动力学为基础的给药方案。

当然，第一药物a)的每日剂量随多种因素，例如选择的化合物、治疗的特定病情和所需的效果而变化。然而，以约0.1至100mg作为单次剂量或分次剂量处方的每日剂量给以S1P受体激动剂，例如化合物A、B或C，通常即可获得满意效果。S1P受体激动剂可通过任何常规途径给药，特别是肠内给药，例如以片剂、胶囊、口服液的形式口服给药，或以例如注射液或注射混悬液的形式胃肠外给药。适于口服给药的单位剂量形式包含约0.1至30mg的成份(a)(例如0.1至25mg)和一种或多种可药用的稀释剂或载体。

法倔唑对于人的口服剂量范围为约0.5至10mg/天，优选约1至约2.5mg/天。依西美坦对于人的口服剂量范围为约5至200mg/天，优选约10至约25mg/天，或者胃肠外给药的剂量范围为约50至500mg/天，优选约100至约250mg/天。如果药物以单独的药物组合物给药，可按照GB2,177,700中公开的方式给药。福美坦对于人的胃肠外给药剂量范围为约100至500mg/天，优选约250至约300mg/天。阿那曲唑对于人的口服剂量范围为约0.25至20mg/天，优选约0.5至约2.5mg/天。氨鲁米特对人给药的剂量范围为约200至500mg/天。

柠檬酸他莫昔芬对人给药的剂量范围为约10至40mg/天。

长春花碱对人给药的剂量范围为约1.5至10mg/m²天。硫酸长春新碱对人胃肠外给药的剂量范围为约0.025至0.05mg/kg体重*每星期。长春瑞滨对人给药的剂量范围为约10至50mg/m²天。

磷酸依托泊苷对人给药的剂量范围为约25至115mg/m²天，如56.8或113.6mg/m²天。

替尼泊苷对人给药的剂量范围为每两个星期约75至150mg。阿霉素对人给药的剂量范围为约10至100mg/m²天，如25或50mg/m²天。表柔比星对人给药的剂量范围为约10至200mg/m²天。伊达比星对人给药的剂量范围为约0.5至50mg/m²天。米托蒽醌对人给药的剂量范围为约2.5至25mg/m²天。

紫杉醇对人给药的剂量范围为约50至300mg/m²天。多西他赛对人给药的剂量范围为约25至100mg/m²天。

环磷酰胺对人给药的剂量范围为约20至1500mg/m²天。苯丙氨酸氮芥对人给药的剂量范围为约0.5至10mg/m²天。

5-氟尿嘧啶对人给药的剂量范围为约50至1000mg/m²天，如500mg/m²天。卡培他滨对人给药的剂量范围为约10至1000mg/m²天。盐酸吉西他滨对人给药的剂量范围为约1000mg/m²/星期。

甲氨蝶呤对人给药的剂量范围为约5至500mg/m²天。

托泊替康对人给药的剂量范围为约1至5mg/m²天。伊立替康对人给药的剂量范围为约50至350mg/m²天。

卡铂对人给药的剂量范围为每四个星期约200至400mg/m²。顺铂对人给药的剂量范围为每三个星期约25至75mg/m²。奥沙利铂对人给药的剂量范围为每两个星期约50至85mg/m²。

伊马替尼对人给药的剂量范围为约2.5至850mg/天，更优选5至600mg/天，最优选20至300mg/天。

阿仑膦酸对人给药的剂量范围为约5至10mg/m²天。氯膦酸对人给药的剂量范围为约750至1500mg/天。依替膦酸对人给药的剂量范围为约200至400mg/天。伊班膦酸对人给药的剂量范围为每三至四星期1-4mg。利塞膦酸对人给药的剂量范围为约20至30mg/天。帕米膦酸对人给药的剂量范围为每三至四个星期约15至90mg。替鲁膦酸对人给药的剂量范围为约200至400mg/天。

曲妥单抗对人给药的剂量范围为约1至4mg/m²/星期。

比卡鲁胺对人给药的剂量范围为约25至50mg/m²/天。

1-(4-氯苯胺基)-4-(4-吡啶基甲基)酞嗪或其盐如琥珀酸盐对人给药的剂量范围为约50至1500mg/天、优选100至750mg/天、最优选250至500mg/天。

雷帕霉素或其衍生物(例如40-O-(2-羟乙基)-雷帕霉素)可以约0.1至25mg的剂量范围给药。

配方举例：软胶囊

式I化合物

例如化合物A盐酸盐 30mg

聚乙二醇300 300mg

聚山梨酯80 20mg

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总量 350mg

S1P受体激动剂(例如包含式X的基团的S1P受体激动剂)在本发明的应用所需的剂量下耐受性良好。例如，在大鼠和猴子中，化合物A的急性口服LD₅₀为＞10mg/kg。

另一方面，本发明涉及S1P激动剂作为促血管生成药物的用途。近来，诱导新生血管生成已被认可为治疗许多疾病(例如心肌血管生成、伤口愈合或糖尿病性血管功能障碍/血管病变)的极佳的靶位。

如上所述，高浓度的S1P受体激动剂(2μM或更高，例如2-5μM或约5μM)显示抗血管生成作用，同时S1P受体激动剂可抑制VEGF-诱导的血管生成。相反，低浓度(0.1-1μM，例如0.1-0.5μM或0.5-1μM)的S1P受体激动剂具有增进血管生成的效果，同时能够增强VEGF-诱导的血管生成。因此，S1P激动剂在血管生成中可有双相作用。

据此，本发明进一步提供：

8.S1P激动剂，例如含有式X的基团的S1P激动剂，如化合物A或化合物A磷酸盐，在诱导新血管生成过程中的用途，例如作为促血管生成剂，例如在需要促进血管生成的适应症中；

9.用于治疗或预防由抑制新血管生成过程所介导的(例如经抗血管生成因子所介导的)疾病、例如需要促进血管生成的适应症、例如伤口愈合或治疗心肌梗塞或糖尿病性血管功能障碍/血管病变的药物的制备方法，其包括使用S1P受体激动剂，例如含有式X的基团的S1P激动剂，如化合物A或化合物A磷酸盐作为性成份。

10.治疗或预防由抑制新血管生成过程所介导的(例如经抗血管生成因子所介导的)疾病、例如需要促进血管生成的适应症、例如伤口愈合或治疗心肌梗塞或糖尿病性血管功能障碍/血管病变的方法，其包括给以需要这种治疗的个体有效量的S1P受体激动剂，例如含有式X的基团的S1P激动剂，如化合物A或化合物A磷酸盐。

适合促进血管生成的S1P激动剂包括如上关于癌症治疗所定义的那些化合物，例如含有式X的基团的S1P激动剂或式I至IX的化合物，或其可药用盐或酯。优选的S1P激动剂为化合物A磷酸盐。S1P激动剂可单独使用，或者与一种或多种促进血管生成的其他药剂例如VEGF联合使用。

为促进血管生成，选择足够低剂量的S1P受体激动剂很重要，因为高浓度的S1P受体激动剂可抑制血管生成。在将S1P激动剂给药于患者时，用于提供促血管生成作用的合适的S1P激动剂剂量可通过如上A、B以及C所述的浓度和剂量递增试验进行选择。

附图说明

图1显示，化合物A磷酸盐可以以钟形剂量依赖形式强烈地促进毛细血管样网状结构形成，同时显示最大活性在0.5μM左右。

图2显示，在0.5-1μM时，化合物A磷酸盐和化合物A均不削弱VEGF所介导的重建，而是与多肽生长因子协同起作用。

图3显示，化合物A磷酸盐以及S1P所刺激的管柱形成实际上可被百日咳菌外毒素(PTX，50ng/ml)(一种α_i/o型杂三聚体G蛋白的抑制剂)完全抑制。这可解释为，在化合物A磷酸盐所刺激的生物反应中，可能涉及到EDG-1(S1P₁)受体所介导的信号传导活动。

图4显示，在1μM时，本身看起来比S1P低效的鞘氨醇可削弱S1P和化合物A磷酸盐诱导毛细血管样结构的能力，同时对VEGF所诱导的管柱形成没有抑制作用。在这一方面，鞘氨醇的作用表现异于化合物A。数据表明，鞘氨醇与S1P之间的平衡看起来对于最可能经由EDG受体家族的内皮细胞激活/血管生成极其重要。同样重要的是，高浓度的鞘氨醇和化合物A(2-5μM)可抑制VEGF触发的管柱形成。

图5显示，用0.5μM的化合物A磷酸盐处理HUVEC可导致ERK1/2的短暂激活，并在第10分钟时出现磷酸化/激活峰，20分钟后回复至基线水平。

图6检测了是否化合物A、化合物A磷酸盐、鞘氨醇或S1P也可在HUVEC上诱导组织因子。所发现的数据表明，在这些化合物中，无一可单独或与其他化合物联合提高组织因子活性，具体如图6所示。化合物A与化合物A磷酸盐可轻微增强VEGF而非TNFα所诱导的组织因子活性。

图7显示了化合物C在S1P所介导的HUVEC管柱形成试验中的作用。所用缩写如下：

BSA：牛血清白蛋白

ECGS：内皮细胞生长因子组 ECL：增强化学发光

S：鞘氨醇 PBS：磷酸盐缓冲盐水

JNK1/2：c-jun-N-末端激酶1/2 RT：室温

TF当量：组织因子当量

EGR-1/NFAT：早期生长反应蛋白1/活化T细胞核因子

F1P：化合物A磷酸盐(FTY720-磷酸盐)

S1P激动剂(如含有式X的基团的S1P激动剂)在促进血管生成中的效用可在例如依照下文所述的试验方法中进行证实。

D.细胞培养和材料

在37℃、5％CO₂，于补充20％SCS(HyClone，Logan，UT)、1U/ml肝素、50μg/ml ECGS、2mM谷酰胺、100U/ml青霉素以及0.1mg/ml链霉素的M199培养液中培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。在传代最多5代后将细胞用于试验。用含有1％SCS的M199饿细胞5小时以获得短暂受饿的HUVEC细胞。重组人体VEGF₁₆₅获自PromoCell(Heideberg，德国)。磷酸特异性ERK1/2、p38激酶多克隆抗体、无磷酸ERK1/2抗体以及LumiGLO化学发光剂来自New England BioLabs(Beverly，MA)，多克隆IκB抗体来自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，Calif)。过氧化物酶-标记的驴抗兔免疫球蛋白G(Ig G)和绵羊抗小鼠IgG购自AmershamLIFE SCIENCE(Amersham Place，英国)。Immobilon-P转移膜为Millipore的产品(Bedford，MA)。S获自Sigma Chemical Co.；S1P来自Biomol。化合物A磷酸盐储备液通过如下方案制备。先将化合物A磷酸盐溶于含有痕量浓HCl的甲醇中(0.5mg化合物A磷酸盐于500μl加入2μl HCl的甲醇中)。于真空中蒸发所形成溶液中的溶剂，并于0.1％的脱脂BSA在无菌去离子水(500μl)中的溶液(变体1)或于0.5％Triton X-100在去离子水中的溶液(变体2)中重新溶解所得到的残余物。将所产生的储备液(2.5mM)超声处理并于4℃保存。

凝集试验

在80-90％融合度时将细胞种于6孔板中并生长过夜。依照Clauss，M.，J.Biol.Chem.271，17629-17634(1996)，Mechtcheriakova，D.，Blood 93，3811-3823(1999)中所述的方法将细胞自平板剥脱，并分析组织因子活性。简要的说，在与VEGF(1.5nM)、TNF-α(100U/ml)、S(0.5-2μM)、S1P(0.5-2μM)、化合物A(0.5-2μM)以及化合物A磷酸盐(0.5-2μM)一起孵育4小时后，将细胞清洗两次，并然后剥脱移至1ml凝集缓冲液中(12mM醋酸钠、7mM巴比妥酸二乙酯以及130mM氯化钠；pH7.4)。将50μl重新混悬的细胞与50μl柠檬酸化的血浆混和，并在用50μl 20mM CaCl₂溶液于37℃重新钙化后，测定其凝集时间。使用获白兔脑促凝血酶原激酶的标准曲线测定TF当量。

E.蛋白质印迹分析

在各种处理后，将细胞用冷的PBS清洗两次，然后于100μl Laemmli缓冲液中裂解消化，最后剥脱并于95℃加热5分钟。使用SDS-PAGE分离总的细胞裂解液并转移至Immobilon-P膜上。将膜用含0.1％Tween-20和3％脱脂奶的PBS封闭30分钟，并于RT下，与稀释于封闭缓冲液中的一抗一起孵育1小时。所得到的膜再用含有0.1％Tween-20的PBS清洗三次，每次5分钟，然后再于室温下与过氧化物酶标记的二抗一起孵育1小时。在清洗后，再将膜与ECL试剂一起孵育1分钟，并如所要求的暴露至胶片。如欲使用其他的抗体重新探测，需再将膜以PBS清洗两次，然后于55℃使用剥脱缓冲液(62.5mM Tris-HCl，pH6.8，2％SDS，100mM 2-巯基乙醇)剥脱30分钟，并再于室温下使用PBS清洗3次，每次5分钟。在每次免疫检测后，将膜于4℃、SaranWrap中湿覆盖保存。

体外Matrigel上的血管生成试验

依照制造工序，在减低了生长因子的Matrigel基质(BD Bioscience)上进行内皮细胞至毛细血管样结构的形态发生试验。简要的说，先将HUVEC进行胰蛋白酶酶解，然后于含大豆胰蛋白酶抑制剂(1mg/ml，Sigma)的无血清的M199中重新混悬。离心后，再将细胞于无血清的培养液中以0.5×10⁵细胞/ml的密度重新混悬，并再将细胞混悬液种于96孔培养板中(Costar，Corning Incorporated)，培养板事先涂以含有或不含有如下各种刺激物的50μl Matrigel：1.5nM的VEGF、0.1-2μM的S1P、0.1-2μM的S、0.1-2μM的化合物A、以及0.1-2μM的化合物A磷酸盐。8小时后，以含3％甲醛的PBS固定Matrigel上的细胞，并于4℃保存。最后使用带有冷CCD相机(Kappa GmbH，Gleichen，德国)的Nikon Diaphot显微镜拍摄影像，并通过直接计数每一试验重复孔中两显微镜视野中分支点的数目来于影像定量结果。

F.体外Matrigel管柱形成试验中化合物A磷酸盐所诱导的内皮细胞形态发生以及可能涉及的G_i-介导的信号传导路径

使用体外Matrigel血管生成试验来测定化合物A和化合物A磷酸盐对内皮细胞形态学分化的影响。内皮细胞形态发生是一复杂的过程，其要求细胞-细胞外基质的相互作用、以及随之而来的基质重建、刺激移行、细胞-细胞相互作用以及血管周围蛋白水解。如图1中所示，化合物A磷酸盐可以以钟形剂量依赖形式强烈地促进毛细血管样网状结构的形成，并显示其最大活性位于0.5μM左右。可反应刺激物诱导效力的每个显微镜视野中分支点的数目对于化合物A磷酸盐和S1P也是相当的，并显著超过VEGF所触发的效果。与化合物A磷酸盐相比，0.5-1μM的化合物A本身具有微弱的、但持续增强的作用。0.5-1μM的化合物A磷酸盐以及化合物A均不削弱VEGF所诱导的重建，而是与多肽生长因子协同起作用(参见图2)。此外，化合物A磷酸盐以及S1P所刺激的管柱形成可被百日咳菌外毒素(PTX，50ng/ml)(一种α_i/o型杂三聚体G蛋白的抑制剂)完全抑制。这可解释为，在化合物A磷酸盐所刺激的生物反应中，可能涉及到EDG-1(S1P₁)受体所介导的信号传导活动(参见如图3)。在1μM时，本身看起来比S1P低效的鞘氨醇可削弱S1P和化合物A磷酸盐诱导毛细血管样结构的能力，同时对VEGF所诱导的管柱形成没有抑制作用(参见图4)。在这一方面，鞘氨醇的作用表现异于化合物A。数据表明，鞘氨醇与S1P之间的平衡看起来对于最可能经由EDG受体家族的内皮细胞激活/血管生成极其重要。同样重要的是，高浓度的S和化合物A(2-5μM)可抑制VEGF触发的管柱形成。该数据提示，化合物A和化合物A磷酸盐在体外对血管生成可有双相的剂量依赖性作用。

G.化合物A磷酸盐对ERK1/2 MAP激酶的激活

经由MAP激酶的信号传导在多种细胞功能中发挥着重要作用。用0.5μM的化合物A磷酸盐处理HUVEC可导致ERK1/2的短暂激活，并在第10分钟时出现磷酸化/激活峰，20分钟后回复至基线水平(参见图5)。在HUVEC中没有检测到p38激酶和JNK1/2被化合物A磷酸盐激活。此外，化合物A磷酸盐可以剂量依赖的方式触发ERK1/2的激活，并在2μM显示较强活性。这与管柱形成试验的结果形成对比，在管柱形成试验中，化合物A磷酸盐在2μM时的效力比0.5μM时低。在处理5分钟至60分钟的动力学范围内，化合物A和S均不能在内皮细胞中诱导MAP激酶激活。欲评估炎症性/NFκB-依赖性程序在内皮细胞的化合物A磷酸盐所刺激的生物反应中的可能作用，可将膜以抗IκB抗体重新进行检测。IκB水平不受化合物A磷酸盐处理的影响。此外，以化合物A磷酸盐处理内皮细胞可能无法如NFκB依赖性次反应基因那样，诱导E-选择素表达。因此，数据有力表明，化合物A磷酸盐信号传输不涉及NFκB的激活(这是内皮细胞急性炎症反应中的主要级联反应)。

H.化合物A和化合物A磷酸盐不诱导内皮细胞组织因子表达。

经典的炎症激发物TNF-α和主要的血管源性生长因子VEGF两者对内皮细胞的一个重要的特征性属性为其上调组织因子的潜能。化合物A、化合物A磷酸盐、S或S1P均检测了其是否也可在HUVEC上诱导组织因子。所发现的数据表明，在这些化合物中，无一可单独或与其他化合物联合提高组织因子活性(参见图6)。化合物A与化合物A磷酸盐可轻微增强VEGF而非TNFα所诱导的组织因子活性。所获得的数据同时还表明，化合物A、化合物A磷酸盐、S或S1P与血管源性的VEGF和炎性TNF-α以不同的机理起作用。

I.可通过如下试验测定S1P受体激动剂与人体S1P受体的结合亲和力。人体S1P受体至HEK293细胞中的瞬时转染

克隆EDG受体和G_i蛋白，然后混和相等量的EDG受体G_i-α、G_i-β和G_i-γ的cDNA并使用磷酸钙沉淀法(M.Wigler等人，Cell.1977；11；223和DS.Im等人，Mol.Pharmacol.2000；57；753)将之用于转染单层HEK293细胞。简要的说，将含有25μg DNA和0.25M CaCl₂的DNA混合物加至HEPES缓冲的2mM Na₂HPO₄中。使用25mM氯喹毒化亚融合的单层HEK293细胞，然后将DNA沉淀物加至细胞。4小时后，以PBS和refed培养液(90％1∶1 Dulbecco’s改进的基础培养液(DMEM)：F-12+10％胎牛血清)清洗单层细胞。在加入DNA 48-72小时后，在冰上于含有10％蔗糖的HME缓冲液(单位mM：20 HEPES，5 MgCl₂，1 EDTA，pH 7.4)中剥脱并收获细胞，并使用Dounce匀浆器裂解细胞。在以800xg离心后，使用不含蔗糖的HME稀释上清液，并再以100,000xg离心1小时。将所得到沉淀物重新匀浆，并再次以100,000xg离心1小时。将此粗制的膜状沉淀物再于含蔗糖的HME中重新混悬、等分标本，并浸入液氮中速冻。将膜于-70℃储存。通过Bradford蛋白检测光谱测定蛋白浓度。

使用S1P受体/HEK293膜制备物的GTPγS结合检测

如DS.Im等人Mol.Pharmacol.2000；57；753所述进行GTPγS结合实验。使用25μg来自瞬时转染的HEK293细胞的膜制备物在GTP结合缓冲液(单位mM：50 HEPES，100 NaCl，10 MgCl₂，pH7.5)中测定配体介导的GTPγS至G-蛋白的结合。在10μM GDP和0.1nM [³⁵S]GTPγS(1200Ci/mmol)的存在下将配体加至膜中并于30℃孵育30分钟。使用Brandel采集机(Gaithersburg，MD)将已结合的GTPγS与未结合的分离，并使用液体闪烁计数器计数。

Claims

1.一种在有需要的个体中治疗实体瘤或抑制实体瘤生长的方法，包括给予所述个体治疗有效量的S1P受体激动剂，条件是，当S1P受体激动剂为FTY720或FTY720-磷酸盐时，所述肿瘤不是乳腺、前列腺、膀胱、肾脏或肺的肿瘤。

2.一种在有需要的个体中治疗实体瘤侵入或与此肿瘤生长相关的症状、预防肿瘤转移扩散或预防或抑制微转移灶生长的方法，其包括给予所述个体治疗有效量的S1P受体激动剂。

3.一种在有需要的个体中抑制或控制失控的血管生成，例如1-磷酸鞘氨醇(S1P)介导的血管生成的方法，其包括给予所述个体治疗有效量的S1P受体激动剂。

4.一种在有需要的个体中预防或治疗由新血管生成过程所介导的疾病或与失控的血管生成相关的疾病的方法，其包括给予所述个体治疗有效量的S1P受体激动剂。

5.一种在有需要的个体中增强化疗剂的活性或克服化疗剂的耐药性的方法，其包括与所述化疗剂一起，同时或依次给予所述个体治疗有效量的S1P受体激动剂。

6.根据任何上述权利要求的方法，其中将S1P受体激动剂间断给药。

7.根据任何上述权利要求的方法，其包括将治疗有效量的S1P受体激动剂和第二种药物同时或依次共同给药，所述第二种药物为化疗剂。

8.一种治疗淋巴增殖或骨髓增殖异常的方法，其包括向所述个体同时或依次共同给药S1P受体激动剂和第二种药物，所述第二种药物为化疗剂。

9.根据任何上述权利要求的方法，其中S1P受体激动剂含有式X的基团：

其中：

10.一种药物组合，其包含a)为S1P受体激动剂的第一药物，以及b)为化疗剂的辅药。

11.根据权利要求10所述的组合，其中的辅药选自：

i.芳香酶抑制药，

ii.抗雌激素药、抗雄激素药或戈那瑞林激动剂，

iii.拓扑异构酶I抑制剂或拓扑异构酶II抑制剂，

iv.微管活化剂、烷化剂、抗肿瘤抗代谢药物或铂配合物，

vi.缓激肽1受体或血管紧张素II拮抗剂，

vii.环加氧酶抑制剂、二膦酸类化合物、组蛋白脱酰酶抑制剂、肝素酶抑制剂、生物学应答修饰剂、遍在蛋白化抑制剂或能阻断抗细胞凋亡途径的抑制剂，

viii.Ras致癌同种型抑制剂，

ix.端粒末端转移酶抑制剂，

x.蛋白酶抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、蛋氨酸氨基肽酶抑制剂或蛋白体抑制剂，和/或

xi.mTOR抑制剂。

12.一种治疗或预防由抑制新血管生成过程所介导疾病的方法，其包括向需要所述治疗的个体给予有效量的S1P受体激动剂。

13.根据权利要求12所述的方法，其中S1P受体激动剂含有如权利要求9中所定义的式X的基团。