CN1353116A - 制备低过敏性天然橡胶胶乳和脱蛋白天然橡胶胶乳的方法及低过敏性天然橡胶和脱蛋白天然橡胶 - Google Patents

制备低过敏性天然橡胶胶乳和脱蛋白天然橡胶胶乳的方法及低过敏性天然橡胶和脱蛋白天然橡胶 Download PDF

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Abstract

一种制备低过敏性天然橡胶胶乳的方法,包括在天然橡胶胶乳中加入具有肽链端解酶活性的蛋白酶,将天然橡胶胶乳陈化,从而将胶乳中的蛋白质分解到检测不到数均分子量为4500或更高的蛋白质及其分解产物的程度;一种制备低过敏性脱蛋白天然橡胶胶乳的方法,包括在天然橡胶胶乳中加入碱性蛋白酶,分解胶乳中的蛋白质,加入具有肽链端解酶活性的蛋白酶,进一步分解胶乳中的蛋白质及其分解产物,并去除蛋白质及其分解产物;一种通过蛋白质分解处理得到的低过敏性天然橡胶,其中检测不到数均分子量为4500或更高的蛋白质及其分解产物;及一种通过蛋白质分解处理和去除处理得到的脱蛋白天然橡胶。

Description

制备低过敏性天然橡胶胶乳和脱蛋白天然橡胶胶乳的方法 及低过敏性天然橡胶和脱蛋白天然橡胶
技术领域
本发明涉及引起过敏性反应可能性较小的天然橡胶胶乳的制备方法和引起过敏性反应可能性较小的脱蛋白天然橡胶胶乳的制备方法，及涉及低过敏性天然橡胶和脱蛋白天然橡胶。
背景技术
因为如大拉伸、高弹性和强膜强度这样的特征，天然橡胶被广泛应用于各种领域，例如家用器具如手套，医用器具如外科手套及各种导管，哺乳器具，避孕设备等。最近报道当使用天然橡胶制造的医用器具如外科手套和各种导管时，引起直接(I型)过敏性反应，它显示如呼吸困难症状和过敏性反应症状(例如血管水肿、荨麻症、发绀等)，认为直接过敏性反应是由天然橡胶中作为一种抗原的蛋白质引起的。
因此，最近进行了高度去除天然橡胶胶乳中蛋白质的试验，及日本专利号2,905,005[日本出版的未经审查的专利(Kokai Tokkyo Koho Hei)号6-56902]叙述了一种在天然橡胶胶乳中加入蛋白水解酶如碱性蛋白酶和一种表面活性剂的方法进行脱蛋白处理，并通过离心处理充分洗涤胶乳。
根据上述专利发表的方法，天然橡胶中的蛋白质可被高度分解和去除。具体地，天然橡胶中所含蛋白质的数量用氮含量(N％)来表示，由Kjeldahl的方法测定，蛋白质可被控制到非常低的数值如0.02％或更少。一般认为天然橡胶是具有数均分子量<Mn>1,000,000～2,500,000的高分子组分和具有数均分子量100,000～200,000的低分子组分的混合物，低分子组分通过天然橡胶所含的肽分子相互结合而形成前者高分子组分。认为低分子组分是通过原始生物合成形成的，假设其分子量是100,000，及一个分子间结合一个肽分子，即以低分子组分的一个橡胶分子为基础结合一个氮原子(原子量：14)，则天然橡胶的氮含量是0.014％。因此认为，即使经过高度脱蛋白处理，它不可避免地剩余大约0.02％的氮。
在经过上述发表方法的脱蛋白处理的情况下，由处理过的天然橡胶胶乳形成的橡胶薄膜的红外吸收光谱中未观察到在328℃m-1的多肽特征峰。因此发现通过上述发表的方法达到了蛋白质的高度分解和去除。
然而，最新研究表明，即使通过包括上述发表方法的各种常规已知的脱蛋白处理来分解和去除蛋白质，仍然存在显示过敏性反应的可能性。
发明内容
根据本发明者：
(i)通过蛋白质分析系统完成分析，以确定经过常规方法脱蛋白处理的天然橡胶胶乳中剩余蛋白质及其分解产物的程度，蛋白分析系统包括一个飞行时间(TOF)型质谱仪和一个二维表面修饰芯片(decorativechip)的组合，和
(ii)基于抗原-抗体反应用人类患者血清完成体外测定，代替常规的肤斑试验体内测定，以确定经过常规方法脱蛋白处理的天然橡胶胶乳的过敏性反应。
结果发现：
(I)剩余具有数均分子量<Mn>为大约4500～4700的蛋白质或蛋白质分解产物，并且该蛋白质没有充分分解，及
(II)含有过敏性蛋白质，甚至在脱蛋白处理后其数量仍足以引起直接过敏性反应。
在本发明中术语“过敏性蛋白质”的定义如下：天然橡胶胶乳样品中任何蛋白质及其分解产物(下文中称作“全蛋白质”)包含“抗原蛋白质”，该“抗原蛋白质”能够在人血清中产生抗体。在人血清中产生的抗体被归类为IgE-抗体，IgE-抗体能够引起过敏性反应，而不同于IgE-抗体的抗体不能引起过敏性反应。在“抗原蛋白质”中，能够产生引起过敏性反应的IgE-抗体的抗原蛋白质被称作“过敏性蛋白质”，以区别其他于抗原蛋白质。
这样，本发明的一个目标是提供一种制备低过敏性天然橡胶胶乳的方法，该胶乳基本上不包含过敏性蛋白质，因此引起过敏性反应的可能性较小。
本发明的另一个目标是提供一种制备脱蛋白天然橡胶胶乳的方法，该胶乳基本上不包含过敏性蛋白质，因此引起过敏性反应的可能性较小。
本发明的再一个目标是提供一种天然橡胶胶乳，因为蛋白质高度分解，该胶乳引起过敏性反应的可能性较小。
本发明进一步的目标是提供一种脱蛋白橡胶胶乳，因为蛋白质高度分解和去除，该胶乳引起过敏性反应的可能性较小。发明概述
(I)本发明制备低过敏性天然橡胶胶乳的方法具有的特征是：该方法包括在天然橡胶胶乳中加入一种有肽链端解酶活性的蛋白酶并将该天然橡胶胶乳陈化，从而使胶乳中的蛋白质分解到检测不到数均分子量为4500或大于4500的蛋白质和蛋白质分解产物的程度。
(II)本发明制备脱蛋白天然橡胶胶乳的方法具有的特征是：该方法包括在天然橡胶胶乳中加入一种碱性蛋白酶，从而分解胶乳中的蛋白质；加入有肽链端解酶活性的蛋白酶，从而进一步分解胶乳中的蛋白质及其分解产物，并去除蛋白质及其分解产物。
(III)本发明的低过敏性天然橡胶具有的特征是：通过分解处理蛋白质得到的天然橡胶中检测不到数均分子量为4500或大于4500的蛋白质和蛋白质分解产物。
(IV)本发明脱蛋白天然橡胶具有的特征是：通过蛋白质的分解处理和去除处理得到的天然橡胶中，蛋白质的含量依据氮含量为0.02％或更少，红外吸收光谱上辨认不到在3280cm-1的吸收，及检测不到数均分子量为4500或大于4500的蛋白质和蛋白质分解产物。
用于常规脱蛋白处理的蛋白酶(蛋白水解酶)是主要由细菌产生的蛋白酶，该蛋白酶具有的最佳pH在碱性范围，并还具有肽链内切酶活性，但不显示肽链端解酶活性。碱性蛋白酶被主要用于常规的脱蛋白处理有下列原因：(a)田间胶乳作为天然橡胶是以所谓氨胶乳的形式供给的，氨胶乳是通过浓缩胶乳并加入氨来制备的，加氨的目的是防止胶乳的凝结和腐败，并且胶乳本身呈现碱性；(b)及因此，有必要使用最佳pH在碱性范围的所谓碱性蛋白酶以避免橡胶分子的凝结。表1显示了商业上有售的用于常规脱蛋白处理的碱性蛋白酶的特征。[表1]
产生酶的细菌              活性      pH  工作温度(℃)
酶的商业名称   内切   端解
枯草芽孢杆菌 ◎ - 8.1～12 50～70
Bioprase*4
枯草芽孢杆菌 ◎ - 8.6～12 53～67
Proleather FG-F
枯草芽孢杆孢 ◎ - 9.0～12 30～50
PW-102*1
枯草芽孢杆菌 ◎ - 6.6～8.2 48～62
N“Amano”*3
芽孢杆菌属 ◎ - 7.7～12 47～58
Savinase*2
地衣形芽孢杆菌 ◎ - 6.1～11 48～66
Alcalase*2
迟缓芽孢杆菌 ◎ - 7.2～10 52～65
Esperase*2
嗜热芽孢杆菌 ◎ - 6.6～9.5 62～77
S“Amano”*3
制造商：
1：Kao Corp，2：Novo-Nordisk Bioindustri A/S，3：AmanoEnzyme，Inc.，4：Nagase Biochemicals，Ltd.
活性：
◎：非常高；○：高；-：无活性
有关产生酶的细菌的商业名称，上栏表示属类，而下栏表示品种。
本发明者使用具有肽链端解酶活性的蛋白酶代替常规的碱性蛋白酶做了实施蛋白质分解处理的试验。作为结果，他们惊奇地发现一个新的事实，即蛋白质可被分解到基本上不存在数均分子量<Mn>为4500或4500以上的蛋白质和蛋白质分解产物的程度，从而有可能得到一种不大可能引起过敏性反应的天然橡胶胶乳。这样，就完成了上述本发明(I)的制备低过敏性天然橡胶胶乳的方法。
从另一个观点看，本发明者除了使用常规的碱性蛋白酶分解处理蛋白质外，还使用具有肽链端解酶活性的蛋白酶做了实施分解处理蛋白质和去除处理蛋白质及其蛋白质分解产物的试验。作为结果，他们惊奇地发现一个新的事实，即蛋白质可被分解和去除到基本上不存在数均分子量<Mn>为4500或4500以上的蛋白质和蛋白质分解产物的程度，从而有可能得到一种脱蛋白的橡胶胶乳，它不大可能引起过敏性反应。这样就完成了上述本发明(II)的制备低过敏性天然橡胶胶乳的方法。
在本发明中通常使用质谱检测蛋白质和蛋白质分解产物，优选使用蛋白质分析系统来测定，分析系统包括飞行时间(TOF)型质谱仪和二维表面修饰芯片的组合[例如，蛋白质结构分析仪“蛋白质芯片TM(ProteinChipTM)系统”，由Ciphergen Biosystems，Inc.制造]。根据蛋白质芯片TM系统，可以检测到痕量的蛋白质，如每1mL天然橡胶胶乳中大约0.1μg的量。
日本发表的未审查专利(Kokai Tokkyo Koho Hei)号9-71604中叙述了天然橡胶胶乳中加入表面活性剂，及在加入中和剂调整pH后加入蛋白水解酶，从而分解胶乳中的蛋白质。然而，该出版物仅仅叙述了使用酶对蛋白质的分解处理，而没有公开通过这样的处理蛋白质分子量被降低到何种程度。在该出版物中叙述的发明具有的特征是萃取处理，它包括使用酶使蛋白质分解，在胶乳中掺入硫化剂使胶乳成形和硫化，将硫化的胶乳浸入稀释的碱性溶液中并萃取分解的蛋白质。
在本发明(I)制备低过敏性天然橡胶胶乳的方法中，鉴于进一步降低过敏性反应，在蛋白质分解后优选分解胶乳中的蛋白质及其分解产物。鉴于去除效果和去除处理的效率，优选此去除处理通过离心处理来完成。
在本发明(II)制备脱蛋白天然橡胶胶乳方法中，鉴于去除效果和去除处理的效率，优选通过离心处理来去除蛋白质及其分解产物。
在本发明(I)和(II)的制备方法中，优选在使用含有肽链端解酶的蛋白酶处理之前将胶乳的pH调整到中性范围(特别是pH6～9)。原因如下：因为几乎任何具有肽链端解酶活性的蛋白酶所具有的最佳pH范围为6～9，及优选大约6.5～8.5，如果胶乳的pH在中性范围，可增强蛋白质分解处理的效果。
用于本发明(I)和(II)的具有肽链端解酶活性的蛋白酶优选属于曲霉属或根霉属的微生物产生的蛋白酶，这些微生物是一种丝状细菌。源自丝状细菌的肽酶适合于使蛋白质实现高度的分解。
更优选具有肽链端解酶活性的蛋白酶是由下列微生物产生的蛋白酶：属于米曲霉的微生物，属于蜂蜜曲霉的微生物，或属于米根霉的微生物产生的蛋白酶，及属于上述属类中微生物产生的那些酶。
在本发明(I)和(II)的制备方法中，从橡胶分子稳定地在胶乳中分散而改善蛋白质分解效果的观点出发，优选在表面活性剂的存在下实施蛋白质的分解处理。
关于本发明(III)的低过敏性天然橡胶，由数均分子量<Mn>在4500或4500以上的蛋白质和蛋白质分解产物检测不到的事实，显然与经过常规已知的方法脱蛋白处理的情况比较，蛋白质已被高度分解了。因此，认为几乎任何可起到抗原作用、相对于人类血清能够产生IgE-抗体的部分，已被分解处理排除或被变性，且不大可能引起过敏性反应。
关于本发明(III)的低过敏性天然橡胶，因为蛋白质被非常高度地分解，引起过敏性反应的可能性显著地降低了。因此，它适合作为原材料用于家用器具如手套、医用器具如外科导管、哺乳器具、避孕设备等。
关于本发明(IV)的脱蛋白天然橡胶，因为依据氮含量计算，蛋白质的含量是0.02％或更少，以及红外吸收光谱中辨认不到在3280cm-1的吸收，显然与常规的脱蛋白处理类似，天然橡胶中包含的蛋白质总量已被极大地降低。
此外，由于检测不到数均分子量<Mn>在4500或4500以上的蛋白质和蛋白质分解产物，与经过常规已知方法脱蛋白处理的天然橡胶比较，显然蛋白质被高度分解了。因此，认为几乎任何可起到抗原作用、相对于人类血清能够产生IgE-抗体的部分，已被分解处理排除或被变性，且不大可能引起过敏性反应。
关于本发明(IV)的脱蛋白天然橡胶，因为蛋白质被非常高度地分解，引起过敏性反应的可能性显著地降低了。因此，它适合作为原材料用于家用器具如手套、医用器具如外科导管、哺乳器具、避孕设备等
附图说明
图1表示有关低过敏性天然橡胶胶乳中剩余的蛋白质和蛋白质分解产物的数均分子量<Mn>测定结果的曲线图，该胶乳是实施例1和13仅经过蛋白质分解处理得到的。
图2表示有关低过敏性天然橡胶胶乳中剩余的蛋白质和蛋白质分解产物的数均分子量<Mn>测定结果的曲线图，该胶乳是实施例1和13经过蛋白质分解处理和蛋白质去除处理得到的。
图3表示有关脱蛋白天然橡胶胶乳中剩余的蛋白质和蛋白质分解产物的数均分子量<Mn>测定结果的曲线图，该胶乳是比较例1和3及比较例2和4经过蛋白质分解处理和蛋白质去除处理得到的。
图4表示有关高氨-处理的胶乳中剩余蛋白质的数均分子量<Mn>测定结果的曲线图。
图5表示有关实施例7和19得到的脱蛋白质天然橡胶胶乳中剩余的蛋白质和蛋白质分解产物的数均分子量<Mn>测定结果的曲线图。
图6表示有关实施例9和21得到的脱蛋白天然橡胶胶乳中剩余的蛋白质和蛋白质分解产物的数均分子量<Mn>测定结果的曲线图。
图7表示有关实施例8和22得到的脱蛋白天然橡胶胶乳中剩余的蛋白质和蛋白质分解产物的数均分子量<Mn>测定结果的曲线图。
图8表示有关实施例10和23得到的脱蛋白天然橡胶胶乳中剩余的蛋白质和蛋白质分解产物的数均分子量<Mn>测定结果的曲线图。
发明详述
A.将详细叙述本发明(I)制备低过敏性天然橡胶胶乳的方法。
如上所述，本发明(I)制备低过敏性天然橡胶胶乳的方法具有的特征
是：
(1)它包括往天然橡胶胶乳中加入具有肽链端解酶活性的蛋白酶及使天然橡胶胶乳陈化，从而将胶乳中的蛋白质分解到检测不到数均分子量在4500或4500以上的蛋白质和蛋白质分解产物的程度，本发明包括下列实施方案。
(2)第(1)项中叙述的制备低过敏性天然橡胶胶乳的方法，其中在蛋白质分解之后除去胶乳中的蛋白质及其分解产物。
(3)第(2)项中叙述的制备低过敏性天然橡胶胶乳的方法，其中通过离心处理除去蛋白质及其分解产物。
(4)第(1)项中叙述的制备低过敏性天然橡胶胶乳的方法，其中在使用具有肽链端解酶活性的蛋白酶处理之前将胶乳的pH调到中性范围。
(5)第(1)项中叙述的制备低过敏性天然橡胶胶乳的方法，其中具有肽链端解酶活性的蛋白酶是由属于曲霉属或根霉属的微生物产生的。
(6)第(5)项中叙述的制备低过敏性天然橡胶胶乳的方法，其中属于曲霉属的微生物是列入米曲霉的微生物。
(7)第(5)项中叙述的制备低过敏性天然橡胶胶乳的方法，其中属于曲霉属的微生物是列入蜂蜜曲霉的微生物。
(8)第(5)项中叙述的制备低过敏性天然橡胶胶乳的方法，其中属于根霉属的微生物是列入米根霉的微生物。
(9)第(1)项中叙述的制备低过敏性天然橡胶胶乳的方法，其中蛋白质的分解处理是在表面活性剂的存在下完成的。
现在将叙述本发明各组成部分的特征。[具有肽链端解酶活性的蛋白酶]
用于本发明分解蛋白质的酶是具有肽链端解酶活性的蛋白酶。
本发明中通过使用肽链内切酶分解和一起使用肽链端解酶分解，降低蛋白质分子量的效果和分解作用可进一步被增强。优选本发明制备方法中使用具有肽链端解酶活性和肽链内切酶活性二者的蛋白酶。
如果具有肽链端解酶活性的蛋白酶受其来源的限制，优选的蛋白酶是由属于曲霉属或根霉属的微生物产生的蛋白酶，它们是一种丝状细菌。
属于曲霉属的微生物的实例包括米曲霉、蜂蜜曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉、灰绿曲霉、黄曲霉、酱油曲霉等。
属于根霉属的微生物的实例包括米根霉、爪哇根霉、delemar根霉、nigricants根霉等。
用于本发明的具有肽链端解酶活性的蛋白酶优选由上述的那些中属于米曲霉的微生物产生的蛋白酶、属于蜂蜜曲霉的微生物产生的蛋白酶或属于米根霉的微生物产生的蛋白酶。
表2表明了商业有售的具有肽链端解酶活性的蛋白酶的特征。
[表2]
产生酶的丝状细菌              活性      pH  使用温度(℃)
酶的商业名称    内切    端解
米曲霉 ○ ○ 5.4～10 46～58
 A“Amano”G*3
米曲霉 ○ ◎ 3.0～6.2 35～62
 M“Amano”*3
米曲霉 ○ ◎ 6.2～8.2 30～60
Umamizyme*3
米曲霉 ○ ○ 4.5～7.7 38～58
Flavorzyme*2
米曲霉 ○ ○ 6.0～9.2 37～49
P“Amano”3G*3
米曲霉 ○ ◎ 6.2～7.4 30～50
Peptidase R*3
制造商：
1：Kao Corp.，2：Novo-Nordisk Bioindustri A/S，3：AmanoEnzyme，Inc.，4：Nagase Biochemicals，Ltd.
活性：
◎：非常高；○：高；-：无活性
有关产生酶的细菌的商业名称，上栏表示属类，而下栏表示品种。(生胶乳)
天然橡胶胶乳是得到本发明低过敏性天然橡胶胶乳的原料，它的意思是从橡胶树收集的胶乳和新鲜田间胶乳、及商业有售的氨-处理胶乳可用作此胶乳。[蛋白质分解处理的方法][蛋白质的分解处理]
本发明制备方法中，蛋白质被具有肽链端解酶活性的蛋白酶分解处理，分解处理是将蛋白酶或两种或两种以上蛋白酶的混合物加到天然橡胶胶乳中，及将胶乳陈化大约数小时到一个星期来完成的。
根据肽酶活性调整具有肽链端解酶活性的蛋白酶的量，该量不是特别限定的，但通常以田间胶乳或氨-处理胶乳的橡胶固含量计算，可设定在大约0.001～10重量％的范围内。当蛋白酶的量小于0.001重量％时，有可能得不到蛋白质充分分解的效果。另一方面，当该量超过10重量％时，因为过量的酶和酶的活性很可能被降低而使成本增加。
用于本发明的具有肽链端解酶活性的蛋白酶的肽酶活性不是特别限定的，但优选30u/g或高于30u/g(LGG方法)。
根据所使用蛋白酶的最佳pH来设定蛋白酶分解处理蛋白质时胶乳的pH。因为几乎所有具有肽链端解酶活性的蛋白酶是所谓的中性蛋白酶，具有最佳pH在中性范围，特别是在6～9的范围内，及优选6.5～8.5；被蛋白酶处理的胶乳的pH优选被调整到中性范围内，特别在6～9的范围内，及优选6.5～8.5。可往胶乳中加入磷酸二氢钠、甲醛水溶液、稀盐酸等，将胶乳的pH调整到中性范围。
根据所使用蛋白酶的最佳温度来设定蛋白酶分解处理蛋白质时胶乳的温度，且不是特别受限定的，但优选设定在5～90℃的范围内，更优选20～60℃。
表面活性剂作为稳定剂可在蛋白酶分解处理蛋白质之前预先加入，或者在蛋白酶处理过程中加入，加入的量在0.01～10重量％的范围内。(蛋白质的去除处理和蛋白质分解产物)
蛋白质的分解处理完成后，天然橡胶胶乳可进一步经历如离心、橡胶成分的凝结、超滤等处理。通过这些处理可将蛋白质及其分解产物从橡胶成分中分离并去除。经过此去除处理，可提供具有更低过敏性反应的天然橡胶胶乳。
假如通过离心来完成蛋白质及其分解产物的去除处理，仅通过一次离心处理就可充分地除去蛋白质及其分解产物，但离心处理可执行两次或多次，直到出现橡胶成分损失和产量降低的负面影响。[表面活性剂]
在实行蛋白质分解处理来制备本发明低过敏性天然橡胶的情况下，优选在经历具有肽链端解酶活性的蛋白质酶处理之前或处理过程中将表面活性剂作为稳定剂加入到胶乳中。在氨-处理胶乳的pH被调整到中性范围或进行蛋白质分解处理时，需要加入表面活性剂，以预防橡胶成分的凝结。
表面活性剂的实例包括、但不限于各种常规已知的阴离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂和阳离子型表面活性剂。由于几乎所有具有肽链端解酶活性的蛋白酶的最佳pH在中性范围，优选在中性范围显示稳定的表面活性的那些表面活性剂，并优选pH为6.5～8.5。
下文列出可在本发明中使用的表面活性剂。下列表面活性剂可单独使用或混合使用。(阴离子型表面活性剂)
阴离子型表面活性剂的实例包括羧酸盐、磺酸盐、硫酸盐和磷酸盐表面活性剂。
羧酸盐阴离子型表面活性剂的实例包括具有6～30个碳原子的脂肪酸盐、多元羧酸盐、松香酸盐、二聚酸盐、聚合酸盐和松浆油脂肪酸盐。其中，优选有10～20个碳原子的羧酸盐。当碳原子数小于6时，蛋白质和杂质的分散及乳化作用可能不充分。另一方面，当碳原子数超过30，它在水中分散可能是困难的。
磺酸盐阴离子型表面活性剂的实例包括烷基苯磺酸盐、烷基萘磺酸盐、萘磺酸盐和二苯基醚磺酸盐。
硫酸盐表面活性剂的实例包括烷基硫酸酯盐、聚氧化烯烷基硫酸酯盐、聚氧化烯烷基苯基醚硫酸盐、三苯乙烯酚硫酸酯盐和聚氧化烯二苯乙烯酚硫酸酯盐。
磷酸盐阴离子型表面活性剂的实例包括烷基磷酸酯盐和聚氧化烯磷酸酯盐。
这些化合物的盐的实例包括金属盐(例如，Na，K，Ca，Mg和Zn盐)、氨盐和胺盐(例如三乙醇胺盐)。(非离子型表面活性剂)
非离子型表面活性剂的实例包括聚氧化烯醚、聚氧化烯酯、多元醇脂肪酸酯、糖类脂肪酸酯和烷基多糖苷非离子型表面活性剂。
聚氧化烯醚非离子型表面活性剂的实例包括聚氧化烯烷基醚、聚氧化烯烷基苯基醚、聚氧化烯多元醇烷基醚、聚氧化烯苯乙烯酚醚、聚氧化烯二苯乙烯酚醚和聚氧化烯三苯乙烯酚醚。多元醇的实例包括有2～12个碳原子的多元醇，例如丙二醇、甘油、山梨醇，蔗糖，季戊四醇和脱水山梨醇。
聚氧化烯酯非离子型表面活性剂的实例包括聚氧化烯脂肪酸酯。
多元醇脂肪酸酯非离子型表面活性剂的实例包括有2～12个碳原子的多元醇的脂肪酸酯或聚氧化烯多元醇的脂肪酸酯。它们的具体实例包括山梨醇脂肪酸酯、脱水山梨醇脂肪酸酯、脂肪酸单酸甘油酯、脂肪酸甘油二酯和聚甘油脂肪酸酯。还可使用这些表面活性剂的聚环氧烷加合物(例如，聚氧化烯脱水山梨醇脂肪酸酯、聚氧化烯甘油脂肪酸酯等)。
糖类脂肪酸酯非离子型表面活性剂的实例包括蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖和多糖类的脂肪酸酯，及还可使用这些表面活性剂的聚环氧烷加合物。
烷基多糖苷非离子型表面活性剂的实例包括烷基糖苷、烷基多糖苷、聚氧化烯烷基糖苷和聚氧化烯烷基多糖苷，及脂肪酸酯。这些表面活性剂的聚环氧烷加合物也可使用。
这些非离子型表面活性剂中烷基基团的实例包括有4～30个碳原子的烷基基团。聚氧化烯基的实例包括那些具有C2～4亚烷基的基团，例如，其中环氧乙烷的加合摩尔数为大约1～50摩尔的那些基团。脂肪酸的实例包括有4～30个碳原子的直链或支链的饱和或不饱和脂肪酸。(阳离子型表面活性剂)
阳离子型表面活性剂的实例包括烷基胺盐、烷基胺衍生物和它们季铵化的化合物，及咪唑啉鎓盐阳离子型表面活性剂。
烷基胺盐阳离子型表面活性剂的实例包括伯胺、仲胺和叔胺的盐。
烷基胺衍生物阳离子型表面活性剂分子中具有至少一个酯基、醚基和酰胺基，其实例包括聚氧化烯(AO)烷基胺及其盐、烷基酯胺(包括AO加合物)及其盐、烷基醚胺(包括AO加合物)及其盐、烷基酰胺胺(包括AO加合物)及其盐、烷基酯酰胺胺(包括AO加合物)及其盐和烷基醚酰胺胺(包括AO加合物)及其盐。
盐的实施例包括盐酸盐、磷酸盐、醋酸盐、烷基磺酸酯、烷基苯磺酸、烷基萘磺酸、脂肪酸、有机酸、烷基磷酸酯、烷基醚羧酸、烷基酰胺醚羧酸、阴离子型低聚物和阴离子型聚合物。在烷基胺衍生物阳离子型表面活性剂中具体的醋酸盐的实例包括椰子胺醋酸盐和硬脂胺醋酸盐。烷基胺盐和烷基胺衍生物阳离子型表面活性剂中，烷基通常包括但不限于有8～22个碳原子的直链、支链或格尔伯特形烷基基团。
烷基胺盐和烷基胺衍生物阳离子型表面活性剂中季铵化的化合物的实例包括烷基胺盐和烷基胺衍生物被氯代甲烷、溴代甲烷、硫酸二甲基酯或硫酸二乙基酯季铵化制备的那些季铵化合物。它们中的具体实例包括卤化烷基三甲基铵盐如卤化十二烷基三甲基铵盐、卤化十六烷基三甲基铵盐或卤化硬脂基三甲基铵盐；卤化二烷基二甲基铵盐如卤化二硬脂基二甲基铵盐；卤化三烷基甲基铵盐；卤化二烷基苯基甲基铵盐；或卤化烷基苯基二甲基铵盐。
咪唑啉鎓盐阳离子型表面活性剂的实例包括2-十七碳烯基-羟乙基咪唑啉。
在上述表面活性剂中，pH6.5～8.5范围内显示稳定表面活性的表面活性剂的实例包括作为非离子型表面活性剂的聚氧乙烯壬基苯基醚，和作为阴离子型表面活性剂的聚氧乙烯烷基苯基醚硫酸钠盐。(其他添加剂)
本发明制备低过敏性天然橡胶胶乳的方法中，除了上述各成分外，可任选使用其他添加剂。
这些其他添加剂包括pH调节剂，例如，磷酸盐如磷酸单钾盐、磷酸二钾盐、或磷酸钠盐；醋酸盐如醋酸钾盐或醋酸钠盐；酸如硫酸、醋酸、盐酸、柠檬酸和琥珀酸、或其盐；及氨、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠和碳酸氢钠。其它实例包括酶如脂肪酶、酯酶、淀粉酶、漆酶和纤维素酶。其它实例包括分散剂如苯乙烯磺酸共聚物、甲醛萘磺酸盐缩合物、木质素磺酸、多环芳香族磺酸共聚物、丙烯酸和马来酐的均聚物/共聚物、异丁烯-丙烯酸和异丁烯-马来酐共聚物。[蛋白质分解处理的程度和过敏性反应]
根据本发明制备方法，经过具有肽链端解酶活性的蛋白酶分解处理蛋白质，得到的低过敏性天然橡胶胶乳中，以Kjeldahl方法通过氮含量(N％)比较，剩余的蛋白质的量与作为对照的天然橡胶胶乳中量是相同的。
然而，与经过常规的方法脱蛋白质处理的脱蛋白天然橡胶胶乳比较，本发明方法得到的低过敏性天然橡胶胶乳仅含有非常少量的分子量大的蛋白质和过敏性蛋白质。特别是，从本发明方法得到的低过敏性天然橡胶胶乳中，检测不到数均分子量<Mn>在4500或4500以上的蛋白质和蛋白质分解产物。
由下述比较例明显看到，从经历常规方法(一次酶处理和一次离心处理)脱蛋白处理的脱蛋白天然橡胶胶乳(橡胶固含量：大约30％)中，可检测到数均分子量<Mn>在4500或4500以上的蛋白质和蛋白质分解产物。另一方面，由下述实施例明显看到，从经历本发明方法(一次酶处理，及无离心处理)对蛋白质分解处理的天然橡胶胶乳中，检测不到数均分子量<Mn>在4500或4500以上的蛋白质和蛋白质分解产物。
如上所述，检测不到数均分子量<Mn>在4500或4500以上的蛋白质和蛋白质分解产物的程度，意味着蛋白质已被分解到基本不出现由蛋白质引起过敏性反应的程度。对于本发明低过敏性天然橡胶胶乳，虽然胶乳中剩余蛋白质的总量是大的，但由蛋白质引起直接过敏性反应的可能性明显地降低了。
在蛋白质如上所述经过本发明制备方法的分解处理后，检测不到数均分子量<Mn>在4500或4500以上的蛋白质和蛋白质分解产物。按照本发明更优选的条件，蛋白质可被分解到检测不到数均分子量<Mn>在2000或2000以上蛋白质和蛋白质分解产物的程度，更优选被分解到检测不到1500或1500以上蛋白质和蛋白质分解产物的程度。
在蛋白质经过本发明制备方法分解处理的情况下，由RAST-抑制法测定的过敏性蛋白质含量指数可降低到10μg或更少、优选5μg/g或更少、及更优选2μg/g或更少。
一般认为当过敏性蛋白质的含量指数小于10μg/g或更少时，基本不大可能出现蛋白质引起的过敏性反应。
在此使用的术语“过敏性蛋白质的含量指数”是一种指数，它以普通高氨胶乳(HA胶乳)为基础，指示能够对人血清产生IgE-抗体(能够起抗原的作用)的蛋白质含量程度，该指数是一个数值，能相对地指示过敏性反应的程度。
虽然天然橡胶胶乳中蛋白质总量和溶解蛋白质的总量可通过分析来测定，但过敏性蛋白质的量和非-过敏性蛋白质的量不可能分别测定。因此，天然橡胶胶乳的过敏性反应这里是以常规的天然橡胶胶乳，例如HA胶乳为基础，作为过敏性反应的相对值来评估的。
“过敏性蛋白质的含量指数”是通过竞争RAST-免疫抑制方法[参阅X.Baur等：Allergy，52，661-664(1997)]，使用Pharmacia Cap系统来计算的，并特别是按照下列程序来计算的。
首先，将作为标准样品的HA胶乳(上述文献中的非-氨天然橡胶胶乳)的萃取物和人血清中IgE-抗体混合而陈化，从而使得HA胶乳中的过敏性蛋白质和IgE-抗体之间的抗原-抗体反应能够进行。使用患胶乳过敏性反应疾病的人的血清，作为IgE-抗体的供给源。剩余的不引起抗原-抗体反应的IgE-抗体与固相Immuno-Cap胶乳抗原反应，使固定的IgE-抗体与酶标(β-D-半乳糖苷酶)抗体结合，及然后通过测量荧光强度来测定剩余的IgE-抗体的量。对HA胶乳的溶解蛋白质的过敏性反应的程度用此测量值来测定。使用数种具有不同稀释度的HA胶乳样品测定过敏性反应的程度，做成校准曲线。同样对于天然橡胶胶乳作测量样品，过敏性反应的程度是用上述相同的方式测定的。作为结果，如果被测样品产生的过敏性反应程度，与HA胶乳中每1g橡胶的溶解蛋白质总量为10μg时所得到的值相同，被测样品的过敏性蛋白质的含量指数就是10μg/g。
B.将叙述本发明制备脱蛋白天然橡胶胶乳的方法(II)。
如上所述，本发明制备脱蛋白天然橡胶胶乳的方法具有的特征是：
(10)它包括将碱性蛋白酶加到天然橡胶胶乳中，从而分解胶乳中的蛋白质；加入具有肽链端解酶活性的蛋白酶，从而进一步分解胶乳中的蛋白质及其分解产物，及去除蛋白质及其分解产物。本发明包括下列实施方案。
(11)第(10)项中叙述的制备脱蛋白天然橡胶胶乳的方法，其中通过离心处理去除蛋白质及其分解产物。
(12)第(10)项中叙述的制备脱蛋白天然橡胶胶乳的方法，其中在使用具有肽链端解酶活性的蛋白酶处理之前，将胶乳的pH调整到中性范围。
(13)第(10)项中叙述的制备脱蛋白天然橡胶胶乳的方法，其中具有肽链端解酶活性的蛋白酶是由属于曲霉属或根霉属的微生物产生的。
(14)第(13)项中叙述的制备脱蛋白天然橡胶胶乳的方法，其中属于曲霉属的微生物是列入米曲霉的微生物。
(15)第(13)项中叙述的制备脱蛋白天然橡胶胶乳的方法，其中属于曲霉属的微生物是列入蜂蜜曲霉的微生物。
(16)第(13)项中叙述的制备脱蛋白天然橡胶胶乳的方法，其中属于根霉属的微生物是列入米根霉的微生物。
(17)第(10)项中叙述的制备脱蛋白天然橡胶胶乳的方法，其中蛋白质的分解处理是在表面活性剂的存在下完成的。
现在将叙述本发明各组成部分的特征。[蛋白酶]
用于制备本发明脱蛋白天然橡胶的分解蛋白质的酶包括两种酶，如常规已知的蛋白酶(碱性蛋白酶)和具有肽链端解酶活性的蛋白酶。(常规已知的蛋白酶)
常规已知的蛋白酶不是特别地限定的，可以或是源自丝状细菌的蛋白酶，或是源自酵母的蛋白酶。这些蛋白酶中，优选使用源自细菌的蛋白酶。一般，源自细菌的蛋白酶是最佳pH在碱性范围且仅有蛋白内切酶活性的蛋白酶。
源自细菌的蛋白酶的具体实例包括表1中叙述的蛋白酶。(具有肽链端解酶活性的蛋白酶)
具有肽链端解酶活性的蛋白酶也可具有肽链内切酶活性。在这种情况下，可进一步改善降低蛋白质分子量的效果和分解的效率。
可使用本发明制备方法(I)中叙述的相同的酶作为具有肽链端解酶活性的蛋白酶。[生胶乳]
以天然橡胶胶乳作为得到本发明脱蛋白天然橡胶胶乳的原料，可使用与本发明制备方法(I)中叙述的相同的天然橡胶胶乳。[制备脱蛋白天然橡胶胶乳的方法]
如上所述，本发明制备脱蛋白天然橡胶胶乳的方法具有的特征是它包含以下步骤：
(1)使用常规已知的蛋白酶(碱性蛋白酶)实行蛋白质的分解处理，及
(2)任选地调整胶乳的pH，及使用具有肽链端解酶活性的蛋白酶实行蛋白质的分解处理，然后从如此得到的胶乳中去除蛋白质及其分解产物。(碱性蛋白酶分解处理蛋白质)
在本发明制备脱蛋白天然橡胶的方法中，如步骤(1)，由常规已知的碱性蛋白酶分解处理蛋白质是通过在天然橡胶胶乳中加入碱性蛋白酶或两种或多种蛋白酶的混合物来实施的，并将胶乳陈化大约数小时到一星期。
根据所使用蛋白酶的活性设定碱性蛋白酶的量，该量不是特别地限定的，但以田间胶乳或氨-处理胶乳为基础计算，通常可设定在大约0.001～10重量％的范围内。当碱性蛋白酶的量小于0.001重量％，有可能得不到蛋白质充分分解的效果。另一方面，当该量超过10重量％时，因为过量的酶和酶的活性很可能降低会使成本增加。
用于本发明的碱性蛋白酶的活性不是特别地限定的。
用碱性蛋白酶分解处理蛋白质时，胶乳的pH可适当地根据所使用蛋白酶的最佳pH来设定。
用碱性蛋白酶分解处理蛋白质时，胶乳的温度可根据所使用蛋白酶的最佳温度来设定，温度不是特别地限定的，但优选设定在5～90℃的范围内，及更优选20～60℃。
作为稳定剂的表面活性剂可在蛋白质被碱性蛋白酶分解处理之前或被蛋白酶处理过程中加入，加入的量在0.01～10重量％范围内。(肽链端解酶分解处理蛋白质)
如步骤(2)，在天然橡胶胶乳中加入具有肽链端解酶活性的蛋白酶或两种或多种蛋白酶的混合物，并将胶乳陈化大约数小时到一星期，来进行用具有肽链端解酶活性的蛋白酶分解处理蛋白质。该分解处理可使用与本发明制备方法(I)同样的方式来完成。(蛋白质和蛋白质分解产物的去除处理)
蛋白的分解处理完成后，天然橡胶胶乳可进一步进行如离心、橡胶成分的凝结、超滤等处理。蛋白质及其分解产物可从橡胶成分中分离出来，并通过这些处理去除。经过这些去除处理，可提供具有非常低过敏性反应的脱蛋白天然橡胶胶乳。
虽然去除处理可在蛋白质被碱性蛋白酶分解处理之后进行，如步骤(1)，及可在蛋白质被具有肽链端解酶活性的蛋白质酶分解处理之后进行，如步骤(2)，但鉴于脱蛋白质天然橡胶胶乳的产率和脱蛋白处理的操作效率，优选仅在蛋白质被具有肽链端解酶活性的蛋白酶分解处理之后进行，如步骤(2)。
假如通过离心来完成蛋白质及其分解产物的去除处理，仅通过一次离心处理就可充分地除去蛋白质及其分解产物，但离心处理可执行两次或多次，直到出现橡胶成分损失和产量降低的负面影响。[表面活性剂]
在制备本发明脱蛋白天然橡胶的方法中，优选在经过蛋白质分解处理之前或处理过程中，将表面活性剂作为稳定剂加入到胶乳中。在氨-处理胶乳的pH被调整到中性范围或进行蛋白质的分解处理时，需要加入表面活性剂，以预防橡胶成分的凝结。
表面活性剂的实例包括、但不限于各种常规已知的阴离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂和阳离子型表面活性剂。由于几乎所有具有肽链端解酶活性的蛋白酶的最佳pH在中性范围，优选在中性范围、特别是pH在6～9、优选pH在6.5～8.5显示稳定的表面活性的那些表面活性剂。
可用于本发明的表面活性剂的实例包括与本发明制备方法(I)中所述相同的阴离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂和阳离子型表面活性剂。这些表面活性剂可单独使用或混合使用。(其他添加剂)
在制备本发明脱蛋白天然橡胶胶乳的方法中，与本发明制备方法(I)类似，除了上述各成分，可任选掺入其他添加剂。[蛋白质分解处理程度和过敏性反应]
如上所述，在蛋白质经过本发明制备方法的分解处理后，检测不到数均分子量<Mn>在4500或4500以上的蛋白质和蛋白质分解产物。按照本发明更优选的条件，蛋白质可被分解到检测不到数均分子量在2000或2000以上蛋白质和蛋白质分解产物的程度，更优选被分解到检测不到数均分子量在1500或1500以上蛋白质和蛋白质分解产物的程度。
蛋白质经过本发明制备方法的分解处理后，RAST-抑制方法测定的过敏性蛋白质的含量指数可降低到10μg/g或更少，优选5μg/g或更少，及更优选2μg/g或更少。如同在A项所述，一般认为，当过敏性蛋白质的含量指数小于10μg/g或更少时，基本上不大可能出现蛋白质引起的过敏性反应。
C.将详细叙述本发明制备低过敏性天然橡胶胶乳的方法(III)。
如上所述，本发明低过敏性天然橡胶具有的特征是：
(18)它是通过蛋白质的分解处理得到的一种天然橡胶，其中检测不到数均分子量<Mn>在4500或4500以上的蛋白质和蛋白质分解产物。本发明包括下列实施方案。
(19)第(18)项中叙述的低过敏性天然橡胶，其中检测不到数均分子量在2000或2000以上、优选在1500或1500以上的蛋白质和蛋白质分解产物。
(20)第(18)项中叙述的低过敏性天然橡胶，其中能够在人血液血清中产生一种IgE-类抗体的过敏性蛋白质的含量指数为10μg/g或更少。
(21)第(20)项中叙述的低过敏性天然橡胶，其中过敏性蛋白质的含量指数为5μg/g或更少。
在本发明中，如上所述，如果蛋白质经过分解处理到检测不到数均分子量<Mn>在4500或4500以上的蛋白质和蛋白质分解产物的程度，就认为可起到抗原作用、相对于人类血清能够产生IgE-抗体的部分，已被充分分解或被变性了。且如上所述，认为当每lg原胶中过敏性蛋白质的含量为10μg或更少时，不大可能出现蛋白质引起的过敏性反应。
可以说明的是，本发明脱蛋白天然橡胶具有的过敏性蛋白质的含量指数非常小，基本上不包含由该蛋白质形成的过敏原。
使用具有肽链端解酶活性的蛋白酶代替常规使用的蛋白酶(蛋白水解酶)，对蛋白进行分解处理，得到了本发明的低过敏性天然橡胶。
本发明低过敏性天然橡胶具有的特征是：它是由具有肽链端解酶活性的蛋白酶对蛋白质进行分解处理而得到的。通过使用蛋白酶进行处理，可惊奇地使蛋白质分解到基本上不存在数均分子量<Mn>在4500或4500以上的蛋白质和蛋白质分解产物的程度。[制备低过敏性天然橡胶胶乳的方法]
天然橡胶胶乳中加入具有肽链端解酶活性的蛋白酶或两种或多种蛋白酶混合物、将该胶乳陈化数小时到大约一星期，分解胶乳中的蛋白质，便得到本发明的低过敏性天然橡胶胶乳。
更具体地说，以天然橡胶胶乳的橡胶固含量为基础计算，加入数量为大约0.001～10重量％的具有肽链端解酶活性的蛋白酶，然后将胶乳在5～90℃、优选20～60℃陈化数小时到大约一星期。如果需要，蛋白质的这种分解处理可进行两次或多次。
假如加入具有肽链端解酶活性的蛋白酶，考虑到几乎所有蛋白酶具有的最佳pH在中性范围(特别是pH6～9)，如在下文中叙述的，优选预先将胶乳的pH调到中性范围，特别是pH6～9，及更优选为pH6.5～8.5。可加入磷酸二氢钠、甲醛水溶液、稀盐酸等将胶乳的pH调到中性范围。
经过蛋白质分解处理的胶乳可任选通过离心、超滤等进行纯化处理(去除处理)。如果实施离心纯化处理(去除处理)，离心可在加入表面活性剂后，通过常规的方法来完成，所加表面活性剂的量在0.01～10重量％范围内。虽然仅通过一次离心处理就充分地完成了此去除处理，但离心处理可进行两次或多次，以提高去除蛋白质及其分解产物的效果。然后，橡胶成分用常规的方法如凝结、干燥等处理，得到脱蛋白的天然橡胶。
凝结方法包括通常使用的酸凝结，及进一步的盐凝结，醇加成凝结或冷冻干燥等。在这些方法中，对于大规模生产而言，酸凝结是更优选的，因为其效率最高，并且对所得橡胶的性能影响较小。[生胶乳]
以天然橡胶胶乳作为得到本发明脱蛋白天然橡胶胶乳的原料，可使用与本发明制备方法(I)中叙述的相同的天然橡胶胶乳。(具有肽链端解酶活性的蛋白酶)
具有肽链端解酶活性的蛋白酶也可具有肽链内切酶活性。在这种情况下，降低蛋白质分子量的效果和分解效率进一步改善了。因此，为了制备本发明低过敏性天然橡胶，优选使用具有外切蛋白酶活性和肽链内切酶活性二者的蛋白酶。
可使用本发明制备方法(I)中叙述的相同的酶，用作具有肽链端解酶活性的蛋白酶。
在得到本发明低过敏性天然橡胶的蛋白质分解处理中，用具有肽链端解酶活性的蛋白酶分解处理蛋白质可以与用其他蛋白酶分解处理蛋白质联合使用。
其他蛋白酶不是特别地限定的，其实例如表1所示，包括各种常规已知的肽酶如源自丝状细菌的蛋白酶(除了具有肽链端解酶活性的蛋白酶)和源自酵母的蛋白酶。[表面活性剂]
在进行蛋白质的分解处理来制备本发明脱蛋白天然橡胶时，优选在经历蛋白质分解处理之前或处理过程中，将表面活性剂作为稳定剂加入到胶乳中。在氨-处理胶乳的pH被调整到中性范围或进行蛋白质的分解处理的情况下，需要加入表面活性剂，以预防橡胶成分的凝结。
表面活性剂的实例包括、但不限于各种常规已知的阴离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂和阳离子型表面活性剂。由于几乎所有具有肽链端解酶活性的蛋白酶的最佳pH在中性范围，优选在中性、特别是pH在6～9、优选pH在6.5～8.5范围显示稳定表面活性的那些表面活性剂。
可用于本发明的表面活性剂的实例包括与本发明制备方法(I)中所述相同的阴离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂和阳离子型表面活性剂。这些表面活性剂可单独使用或混合使用。(其他添加剂)
在制备本发明脱蛋白天然橡胶胶乳的方法中，与本发明制备方法(I)类似，除了上述各成分外，可任选掺入其他添加剂。[天然橡胶的剩余蛋白质的量和过敏性反应]
在本发明低过敏性天然橡胶胶乳(III)中，以Kjeldahl方法通过氮含量(N％)比较，剩余蛋白质的量与作为对照的天然橡胶胶乳中的量是相同的。
然而，与经过常规方法脱蛋白处理的脱蛋白天然橡胶胶乳比较，本发明低过敏性天然橡胶胶乳仅含有非常少量的分子量大的蛋白质和过敏性蛋白质。特别是，从本发明方法得到的低过敏性天然橡胶胶乳中，检测不到数均分子量<Mn>在4500或4500以上的蛋白质和蛋白质分解产物。
由下述比较例明显看到，从经历常规方法(一次酶处理和一次离心处理)脱蛋白处理的脱蛋白天然橡胶胶乳中，可检测到数均分子量<Mn>在4500或4500以上的蛋白质和蛋白质分解产物。另一方面，如由下述实施例明显看到，从经历本发明方法(一次酶处理，及无离心处理)对蛋白质分解处理的天然橡胶胶乳中，检测不到数均分子量<Mn>在4500或4500以上的蛋白质和蛋白质分解产物。
如上所述，检测不到数均分子量<Mn>在4500或4500以上的蛋白质和蛋白质分解产物的程度，意味着蛋白质已被分解到基本不出现由蛋白质引起过敏性反应的程度。对于本发明低过敏性天然橡胶胶乳，虽然胶乳中剩余蛋白质的总量是大的，但由蛋白质引起直接过敏性反应的可能性明显地降低了。
D.将叙述本发明制备脱蛋白天然橡胶胶乳的方法(IV)。
如上所述，本发明脱蛋白天然橡胶(IV)具有的特征是：
(22)它是一种天然橡胶，是通过蛋白质的分解处理和去除处理得到的，其中蛋白质的含量依据氮含量是0.02％或更少，红外吸收光谱上辨认不到328℃m-1的吸收，及检测不到数均分子量<Mn>在4500或4500以上的蛋白质和蛋白质分解产物。本发明包括下列实施方案。
(23)第(22)项中叙述的脱蛋白天然橡胶，其中检测不到数均分子量在2000或2000以上的蛋白质和蛋白质分解产物、优选检测不到1500或1500以上的蛋白质和蛋白质分解产物。
(24)第(22)项中叙述的脱蛋白天然橡胶，其中能够在人血清中产生一种IgE-类抗体的过敏性蛋白质的含量指数为10μg/g或更少。
(25)第(22)项中叙述的脱蛋白天然橡胶，其中过敏性蛋白质的含量指数为5μg/g或更少。
如上所述，如果蛋白质经过分解处理到数均分子量<Mn>在4500或4500以上的蛋白质和蛋白质分解产物检测不到的程度，就认为可起到抗原作用、相对于人类血清能够产生IgE-抗体的部分，已被充分分解或被变性了。且如上所述，认为当每1g原胶中过敏性蛋白质的含量为10μg或更少时，不大可能出现蛋白质引起的过敏性反应。
可以说明的是，本发明脱蛋白天然橡胶具有的过敏性蛋白质的含量指数非常小，基本上不包含由该蛋白质形成的过敏原。
通过具有肽链端解酶活性蛋白酶与常规使用的蛋白酶(蛋白水解酶)分解处理蛋白质一起对蛋白质实行分解处理，及对蛋白质及其分解产物实行去除处理，得到本发明脱蛋白天然橡胶。
本发明脱蛋白天然橡胶具有的特征是：它是除了通过常规使用的蛋白酶(蛋白水解酶)分解处理蛋白质外，还通过具有肽链端解酶活性的蛋白酶对蛋白质进行分解处理，及对蛋白质及其分解产物实行去除处理而得到的。通过使用蛋白酶进行处理，可惊奇地使蛋白质分解到基本上不存在数均分子量<Mn>在4500或4500以上的蛋白质和蛋白质分解产物的程度。[制备脱蛋白天然橡胶胶乳的方法]
通过下列步骤得到本发明脱蛋白天然橡胶胶乳：
(1)使用常规已知的蛋白酶(碱性蛋白酶)对天然橡胶胶乳进行蛋白质的分解处理，
(2)任选地将胶乳的pH调到中性范围，使用具有肽链端解酶活性的蛋白酶对蛋白质进行分解处理，及
(3)从所得到的胶乳中去除蛋白质及其分解产物，并使橡胶成分凝结。
可用下列程序得到脱蛋白天然橡胶：首先加入常规已知的碱性蛋白酶，以天然橡胶胶乳的橡胶固含量为基础计算，加入碱性蛋白酶的量为大约0.001～10重量％，然后在5～90℃、优选20～60℃陈化数小时到大约一星期，进行蛋白质的分解处理。任选加入0.01～10重量％的表面活性剂后，加入具有肽链端解酶活性的蛋白酶，以胶乳的橡胶固含量为基础计算，加入这种酶的量为大约0.001～10重量％，然后在5～90℃、优选20～60℃陈化数小时到大约一星期，来完成蛋白质的分解处理。
如下文将叙述的，假如加入具有肽链端解酶活性的蛋白酶，考虑到几乎所有蛋白酶具有的最佳pH在中性范围(特别是pH6～9)，优选预先将胶乳的pH调到中性范围、特别是pH6～9、及更优选pH6.5～8.5。可加入磷酸二氢钠、甲醛水溶液、稀盐酸等调节胶乳的pH到中性范围。
在通过离心来完成去除处理的情况下，可在加入表面活性剂后用常规方法进行离心，所加表面活性剂的量在0.01～10重量％范围内。虽然仅通过一次离心处理就可充分地完成该去除处理，但离心处理可进行两次或多次，以提高去除蛋白质及其分解产物的效果。然后橡胶成分通过常规的方法如凝结、干燥等处理，得到脱蛋白天然橡胶。
凝结方法包括通常使用的酸凝结，及进一步的盐凝结，醇加成凝结或冷冻干燥等。在这些方法中，对于大规模生产而言，酸凝结是更优选的，因为其效率最高，并且对所得橡胶的性能影响较小。[生胶乳]
以天然橡胶胶乳作为得到本发明脱蛋白天然橡胶胶乳的原料，可使用与本发明制备方法(I)中叙述的相同的天然橡胶胶乳。[蛋白酶]
用于分解蛋白质来制备本发明脱蛋白天然橡胶的酶包括两种酶，如常规已知的蛋白酶(碱性蛋白酶)和具有肽链端解酶活性的蛋白酶。(常规已知的蛋白酶)
常规已知的蛋白酶不是特别地限定的，它可或是源自丝状细菌的蛋白酶，或是源自酵母的蛋白酶。这些蛋白酶中，优选使用源自细菌的蛋白酶。一般源自细菌的蛋白酶是最佳pH在碱性范围、仅具有蛋白内切酶活性的蛋白酶。
源自细菌的蛋白酶的具体实例包括表1中叙述的蛋白酶。(具有肽链端解酶活性的蛋白酶)
具有肽链端解酶活性的蛋白酶也可具有肽链内切酶活性。在这种情况下，降低蛋白质分子量的效果和分解效率可被进一步改善。
如上所述，当具有肽链端解酶活性的蛋白酶被其起源所限制时，优选一种丝状细菌微生物产生的蛋白酶，这些微生物属于曲霉属或根霉属。对于属于曲霉属的微生物，可使用与本发明制备方法(I)中所述相同的微生物。[表面活性剂]
在实施蛋白质的分解处理来制备本发明脱蛋白天然橡胶的情况下，优选在经历蛋白质分解处理之前或处理之中，往胶乳中加入作为稳定剂的表面活性剂。在氨-处理胶乳的pH被调到中性范围时或进行蛋白质分解处理时，需要加入表面活性剂，以预防橡胶成分的凝结。
表面活性剂的实例包括但不限于各种常规已知的阴离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂和阳离子型表面活性剂。由于几乎所有具有肽链端解酶活性的蛋白酶具有的最佳pH在中性范围(特别是pH6～9)，优选在中性、特别是pH6～9、优选pH6.5～8.5范围显示稳定表面活性的那些表面活性剂。
可用于本发明的表面活性剂的实例包括与本发明制备方法(I)中所述相同的阴离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂和阳离子型表面活性剂。这些表面活性剂可单独使用或混合使用。(其他添加剂)
在制备本发明脱蛋白天然橡胶胶乳的方法中，与本发明制备方法(I)类似，除了上述各成分外，可任选掺入其他添加剂。
具体实施方式
下列实施例和比较例进一步对本发明加以说明，但本发明不受下列实施例所限制。
在下列实施例和比较例中，使用马来西亚生产的田间胶乳和SoctexCo.(马来西亚)加工的高氨天然橡胶胶乳[橡胶固含量：60.2重量％；氨含量：0.7％]。
使用Toho Chemical Industry Co.，Ltd.生产的商品名称为“Triton X-100”的非离子型表面活性剂，作为表面活性剂。[低过敏性天然橡胶胶乳的制备]实施例1(仅蛋白质分解处理)
在100重量份橡胶含量的田间胶乳中，加入1.0重量份非离子型表面活性剂和0.12％的环烷酸钠，从而使胶乳稳定化，然后使用5％磷酸二氢钠水溶液将胶乳的pH调到7.0。在100重量份橡胶含量的胶乳中加入0.1重量份具有肽链端解酶活性的蛋白酶，然后将胶乳在30℃放置24小时让其陈化，得到经过蛋白质分解处理的低过敏性天然橡胶胶乳。
关于蛋白酶，使用也由米曲霉属微生物生产、最佳pH在中性范围的具有肽链端解酶活性和肽链内切酶活性二者的蛋白酶[Amano Enzyme，Inc.生产，商品名为“Umamizyme”](参阅表2)。这种蛋白酶具有的肽酶活性为70u/g或更高(pH7.0，LGG(L-亮氨酰基-甘氨酰基-甘氨酸)方法)。(蛋白质分解处理和蛋白质去除处理)
经历过蛋白质分解处理的低过敏性天然橡胶胶乳用1％非离子型表面活性剂的水溶液稀释，从而将胶乳的橡胶含量降低到10％，然后在13000转/分下进行离心处理30分钟。取出这样分离的上层乳浆成分，然后再一次在相同量的水中分散，得到已经经过蛋白质分解处理和蛋白质去除处理的低过敏性天然橡胶胶乳。实施例2(仅蛋白质分解处理)
稀释高氨胶乳(下文称作“HA胶乳”)，使橡胶含量降低到30重量％。在100重量份橡胶含量的胶乳中加入1.0重量份非离子型表面活性剂和0.12％的环烷酸钠(稳定剂)，从而使胶乳稳定化，然后使用5％磷酸二氢钠水溶液将胶乳的pH调到7.0。在100重量份橡胶含量的这种胶乳中加入0.1重量份的蛋白酶(上述“Umamizyme”)，然后将胶乳在30℃放置24小时让其陈化，得到经历过蛋白质分解处理的低过敏性天然橡胶胶乳。(蛋白质分解处理和蛋白质去除处理)
经过蛋白质分解处理的低过敏性天然橡胶胶乳用1％非离子型表面活性剂的水溶液稀释，从而将胶乳的橡胶含量降低到10％，及然后在13000转/分下进行离心处理30分钟。取出这样分离的上层乳浆成分，然后再一次在同样量的水中分散，得到经历过蛋白质分解处理和蛋白质去除处理的低过敏性天然橡胶胶乳。实施例3(仅蛋白质分解处理)
除了使用由蜂蜜曲霉属微生物产生的蛋白酶[Amano Enzyme，Inc.制备，商品名为P“Amano”3G]作为具有肽链端解酶活性的蛋白酶，来代替上述“Umamizyme”，且以100重量份胶乳橡胶含量为基础，其量改变为0.1重量份外，用与实施例1同样的方式(即，使用田间胶乳作原料)进行蛋白质的分解处理，得到低过敏性天然橡胶胶乳。
如表2所示，蛋白酶P“Amano”3G是一种具有肽链端解酶活性和肽链内切酶活性二者的蛋白酶，它具有的蛋白质消解效力为10000u/g或更高(pH7.0，Amano方法)，及其最佳pH在中性范围。(蛋白质分解处理和蛋白质去除处理)
用与实施例1同样的方式，对经历过蛋白质分解处理的低过敏性天然橡胶胶乳进行稀释处理、离心处理和再分散处理，得到经过蛋白质分解处理和蛋白质去除处理的低过敏性天然橡胶胶乳。实施例4(仅蛋白质分解处理)
除了使用上述P“Amano”3G作为具有肽链端解酶活性的蛋白酶，来代替上述“Umamizyme”，且以100重量份胶乳橡胶含量为基础，其量改变为0.1重量份外，用与实施例2同样的方式(即，使用HA胶乳作原料)进行蛋白质的分解处理，得到低过敏性天然橡胶胶乳。(蛋白质分解处理和蛋白质去除处理)
用与实施例2同样的方式，对经历过蛋白质分解处理的低过敏性天然橡胶胶乳进行稀释处理、离心处理和再分散处理，得到经过蛋白质分解处理和蛋白质去除处理的低过敏性天然橡胶胶乳。实施例5(仅蛋白质分解处理)
除了使用由米根霉属微生物产生的蛋白酶[Amano Enzyme，Inc.制备，商品名为“Peptidase R”]作为具有肽链端解酶活性的蛋白酶，来代替上述“Umamizyme”，且以100重量份胶乳橡胶含量为基础，其量改变为0.1重量份外，用与实施例1同样的方式(即，使用田间胶乳作原料)进行蛋白质的分解处理，得到低过敏性天然橡胶胶乳。
如表2所示，蛋白酶“Peptidase R”是一种具有肽链端解酶活性和肽链内切酶活性二者的蛋白酶，它具有的肽酶活性为420u/g或更高(pH7.0，LGG方法)，及其最佳pH在中性范围。(蛋白质分解处理和蛋白质去除处理)
用与实施例1同样的方式，对经历过蛋白质分解处理的低过敏性天然橡胶胶乳进行稀释处理、离心处理和再分散处理，得到经过蛋白质分解处理和蛋白质去除处理的低过敏性天然橡胶胶乳。实施例6(仅蛋白质分解处理)
除了使用上述“Peptidase R”作为具有肽链端解酶活性的蛋白酶，来代替上述“Umamizyme”，且以100重量份胶乳橡胶含量为基础，其量改变为0.1重量份外，用与实施例2同样的方式(即，使用HA胶乳作原料)进行蛋白质的分解处理，得到低过敏性天然橡胶胶乳。(蛋白质分解处理和蛋白质去除处理)
用与实施例2同样的方式，对经历过蛋白质分解处理的低过敏性天然橡胶胶乳进行稀释处理、离心处理和再分散处理，得到经过蛋白质分解处理和蛋白质去除处理的低过敏性天然橡胶胶乳。比较例1(仅蛋白质分解处理)
在100重量份橡胶含量的田间胶乳中，加入0.1重量份碱性蛋白酶、1.0重量份非离子型表面活性剂和0.12％的环烷酸钠，从而使胶乳稳定化。
关于碱性蛋白酶，使用源自细菌、及由地衣形芽孢杆菌属的微生物生产的蛋白酶[由Novo-Nordisk Bioindustri A/S制备，商品名为“Alcalase2.0M”]，该碱性蛋白酶具有的效力为2.0AU/g(pH8.3)，及其最佳pH在碱性范围，如表1所示，它具有肽链内切酶活性，但没有肽链端解酶活性。
在使用磷酸二氢钠将pH调到9.2以后，将胶乳在30℃放置24小时让其陈化，得到经过蛋白质分解处理的天然橡胶胶乳。(蛋白质分解处理和蛋白质去除处理)
经过蛋白质分解处理的低过敏性天然橡胶胶乳用1％非离子型表面活性剂的水溶液稀释，从而将胶乳的橡胶含量降低到10％，然后在13000转/分下进行离心处理30分钟。取出这样分离的上层乳浆成分，然后再一次在同样量的水中分散得到经历过蛋白质分解处理和蛋白质去除处理的天然橡胶胶乳。[蛋白质分解处理的评估](测定氮含量)
使用实施例1～6和比较例1离心后形成的乳浆成分再次在水中分散制成各自的胶乳，将胶乳涂布到玻璃板上得到流延薄膜。
这些流延薄膜被用作测量氮含量的样品。
关于实施例1和比较例1，使用仅经过蛋白质分解处理的胶乳制成如上述那些同样的流延薄膜，及这些薄膜用作测量氮含量的样品。
此外，直接由既未经历蛋白质分解处理、也未经历洗涤处理的田间胶乳和HA胶乳制成流延薄膜，及这些薄膜用作对照样品。
关于实施例1～6、比较例1和对照的各样品，通过RRIM测试方法(马来西亚橡胶研究所(1973)，‘SMR Bulletin No.7’)来测定氮含量(N％)。
氮含量(N％)测定结果列于表3。(测定过敏性蛋白质的含量指数)
根据RAST-抑制方法测定实施例1～6和比较例1得到的各天然橡胶胶乳所包含的过敏性蛋白质的含量指数。“过敏性蛋白质的含量指数”是通过竞争免疫抑制方法使用上述德国BGFA(BerufsgenossenschaftlichesForschungsinstitut für Arbeitsmedizin)的Pharmacia Cap系统测定的。
在实施例1和比较例1中，过敏性蛋白质的含量指数是以同样的方式计算的，对有关仅经历蛋白质分解处理的胶乳也是一样。
过敏性蛋白质含量指数的测定结果列于表3。[表3]
胶乳类别     蛋白酶 蛋白质去除处理 氮含量(N％)   过敏性蛋白质的含量指数
类别   数量*1(重量份)
实施例1 田间胶乳 Umamizyme 0.1     无有   0.6430.062   356μg/g4.3μg/g
实施例2  HA胶乳   Umamizyme     0.1     有   0.041   2.6μg/g
实施例3  田间胶乳   P“Amano”3G     0.1     有   0.061   3.9μg/g
实施例4  HA胶乳   P“Amano”3G     0.1     有   0.042   2.5μg/g
实施例5  田间胶乳   PeptidaseR     0.1     有   0.062   3.7μg/g
实施例6  HA胶乳   Peptidase R     0.1     有   0.042   2.3μg/g
比较例1 田间胶乳 Alcalase 2.0M 0.1     无有   0.6450.062   982μg/g21.1μg/g
对照1 田间胶乳 - - 有*2 0.654     ＞8000μg/g
对照2  HA胶乳     -     有*2   0.334   1060μg/g
*1：蛋白酶数量(重量份)是以100重量份胶乳橡胶含量为基础的数值。*2：仅通过离心去除蛋白质。
显然从表3看出，虽然实施例1的低过敏性天然橡胶胶乳的氮含量(N％)和比较例1使用酶常规处理得到的脱蛋白天然橡胶胶乳的相同，但过敏性蛋白质的含量指数明显降低了。
与对照2中出示的常规HA胶乳比较，即使仅经过酶处理，实施例1中过敏性蛋白质的含量指数明显降低，及与经过常规酶处理(比较例1的胶乳没有经过蛋白质去除处理)的比较也降低了。
因此发现由蛋白质引起过敏性反应的可能性明显地降低。(蛋白质分子量分析)
对于实施例1和比较例1得到的天然橡胶胶乳，使用蛋白质分析系统包括飞行时间(TOF)型质谱仪和二维表面修饰芯片的结合[例如，蛋白质结构分析仪“蛋白质芯片TM系统”，Ciphergen Biosystems，Inc.制造]，分析是否存在数均分子量<Mn>在4500～4700范围内的杂质。
用上述“蛋白质芯片TM系统”对蛋白质分子量的分析是通过下列程序来完成的：(1)首先，天然橡胶胶乳浆液样品被吸附到一个芯片上，(2)该芯片用洗涤缓冲液洗涤到只留下被吸附的蛋白质，(3)在被吸附的蛋白质上涂上能量吸收物质，(4)在芯片上的蛋白质被激光束照射而离子化，及(5)使用TOF型质谱测定分子量。
有关剩余蛋白质和蛋白质分解产物的数均分子量<Mn>的分析结果，分别地，图1出示了实施例1仅经过蛋白质分解处理得到的低过敏性天然橡胶胶乳样品的测定结果；图2出示了实施例1经过蛋白质分解处理和蛋白质去除处理得到的低过敏性天然橡胶胶乳样品的测定结果；及图3出示了比较例1由使用酶常规处理的脱蛋白天然橡胶胶乳得到的样品的测定结果。
分析了由HA胶乳得到的对照样品的分子量，该胶乳既未经过蛋白质分解处理也未经过蛋白质去除处理。测定结果在图4中表示。
显然，由分子量分析的测定结果看到，比较例1(图3)中峰存在的位置(位置与蛋白质的存在相对应)是数均分子量<Mn>大约4700的位置。相反，在实施例1仅实施蛋白质分解处理(图1)和进一步实施蛋白质及分解产物的去除处理(图2)两种情况下，在数均分子量<Mn>为大约4500或4500以上的范围没有观察到峰。在除了蛋白质分解处理外，还进一步实施了蛋白质及分解产物的去除处理的情况下(图2)，没有在数均分子量<Mn>为1500～4500的范围观察到峰。[制备脱蛋白天然橡胶胶乳]实施例7(碱性蛋白酶分解蛋白质)
在100重量份橡胶含量的田间胶乳中，加入1.0重量份非离子型表面活性剂和0.12％环烷酸钠，从而使胶乳稳定化。在100重量份橡胶含量的该胶乳中加入0.1重量份碱性蛋白酶，然后将胶乳在30℃放置24小时让其陈化。
关于碱性蛋白酶，是使用一种源自细菌的蛋白酶，它是由一种芽孢杆菌类的细菌地衣形芽孢杆菌属微生物产生的[Novo-Nordisk BioindustriA/S制备，商品名为“Alcalase 2.0M”]。这种碱性蛋白酶具有的效力为2.0AU/g(pH8.3)、具有最佳pH在碱性范围、如表1所示，并也只有肽链内切酶活性，而没有肽链端解酶活性。(具有肽链端解酶活性的蛋白酶分解蛋白质)
在陈化过的胶乳中加入5％磷酸二氢钠水溶液，从而将pH调到7.0。在100重量份橡胶含量的胶乳中加入0.1重量份具有肽链端解酶活性的蛋白酶。在加入蛋白酶以后，将胶乳在30℃放置24小时让其再一次陈化。
有关蛋白酶，是使用一种具有肽链端解酶活性和肽链内切酶活性二者的蛋白酶，它的最佳pH在中性范围，并是由米曲霉属微生物产生[AmanoEnzyme，Inc.制备，商品名为“Umamizyme”](参阅表2)。这种蛋白酶具有的肽酶活性为70u/g或更高(pH7.0，LGG(L-亮氨酰基-甘氨酰基-甘氨酸)方法)。(蛋白质及其分解产物的去除)
酶处理完成后，胶乳用1％非离子型表面活性剂的水溶液稀释，从而将胶乳的橡胶含量降低到10％，然后在13000转/分下进行离心处理30分钟。再一次稀释如此分离的上层乳浆成分，然后与上述同样的方式进行第二次离心处理。
所生成的乳浆成分再一次在水中分散，得到脱蛋白天然橡胶胶乳。实施例8(碱性蛋白酶分解蛋白质)
将一种高氨胶乳(下文称作“HA胶乳”)稀释，使橡胶含量降低到30重量％。在100重量份橡胶含量的田间胶乳中加入1.0重量份非离子型表面活性剂和0.12％环烷酸钠，从而使胶乳稳定化。在100重量份橡胶含量的该胶乳中加入0.1重量份的碱性蛋白酶(上述“Alcalase 2.0M”)，然后将胶乳在30℃放置24小时让其陈化。(具有肽链端解酶活性的蛋白酶分解蛋白质)
在陈化过的胶乳中加入5％磷酸二氢钠水溶液，从而将pH调到7.0。在100重量份橡胶含量的胶乳中加入0.1重量份具有肽链端解酶活性的蛋白酶(上述“Umamizyme”)。在加入蛋白酶以后，将胶乳在30℃放置24小时让其再一次陈化。(去除蛋白质及其分解产物)
酶处理完成后，胶乳用1％非离子型表面活性剂水溶液稀释，从而将胶乳的橡胶含量降低到10％，并在13000转/分下进行离心处理30分钟。
将如此分离的上层乳浆成分再一次稀释，然后如上述同样的方式进行第二次离心处理。
所生成乳浆成分再一次在水中分散，得到脱蛋白天然橡胶胶乳。实施例9(碱性蛋白酶分解蛋白质)
以实施例7中“碱性蛋白酶分解蛋白质”的情况同样的方式，用碱性蛋白酶(上述“Alcalase 2.0M”)分解田间胶乳中的蛋白质。(具有肽链端解酶活性的蛋白酶分解蛋白质)
除了使用由蜂蜜曲霉属微生物产生的蛋白酶[Amano Enzyme，Inc.制备，商品名为P“Amano”3G]代替上述“Umamizyme”，作为具有肽链端解酶活性的蛋白酶，并以100重量份胶乳橡胶含量为基础，将酶的量改变为0.1重量份外，以实施例7中“具有肽链端解酶活性的蛋白酶分解蛋白质”的情况同样的方式完成蛋白质的分解处理。
蛋白酶P“Amano”3G是一种蛋白质消解效力为10000u/g或更高(pH7.0，Amano方法)的蛋白酶，它具有肽链端解酶活性和肽链内切酶活性二者，还具有最佳pH在中性范围，如表2所示。(去除蛋白质及其分解产物)
除了使用由蛋白酶P“Amano”3G完成酶处理后的胶乳外，以实施例7中“去除蛋白质及其分解产物”的情况同样的方式完成离心处理，得到脱蛋白天然橡胶胶乳。实施例10(碱性蛋白酶分解蛋白质)
以实施例8“碱性蛋白酶分解蛋白质”的情况同样的方式，用碱性蛋白酶(上述“Alcalase 2.0M”)分解HA胶乳中的蛋白质。(具有肽链端解酶活性的蛋白酶分解蛋白质)
除了使用上述P“Amano”3G代替上述“Umamizyme”，作为具有肽链端解酶活性的蛋白酶，及以100重量份胶乳橡胶含量为基础，将酶的量改变为0.1重量份外，以实施例8中“具有肽链端解酶活性的蛋白酶分解蛋白质”的情况同样的方式完成蛋白质的分解处理。(去除蛋白质及其分解产物)
除了使用由蛋白酶P“Amano”3G完成酶处理后的胶乳外，以实施例8中“去除蛋白质及其分解产物”的情况同样的方式完成离心处理，得到脱蛋白天然橡胶胶乳。实施例11(碱性蛋白酶分解蛋白质)
以实施例8中“碱性蛋白酶分解蛋白质”的情况同样的方式，用碱性蛋白酶(上述“Alcalase 2.0M”)分解田间胶乳中的蛋白质。(具有肽链端解酶活性的蛋白酶分解蛋白质)
除了使用由米根霉属微生物产生的蛋白酶[Amano Enzyme，Inc.制备，商品名为“Peptidase R”]代替上述“Umamizyme”，作为具有肽链端解酶活性的蛋白酶，及以100重量份胶乳橡胶含量为基础，将酶的量改变为0.1重量份外，以实施例8中“具有肽链端解酶活性的蛋白酶分解蛋白质”的情况同样的方式完成蛋白质的分解处理。
蛋白酶“Peptidase R”是肽酶活性为420u/g或更高(pH7.0，LGG方法)的蛋白酶，它具有肽链端解酶活性和肽链内切酶活性二者，且最佳pH在中性范围，如表2所示。(去除蛋白质及其分解产物)
除了使用由蛋白酶“Peptidase R”完成酶处理后的胶乳外，以实施例8中“去除蛋白质及其分解产物”的情况同样的方式完成离心处理，得到脱蛋白天然橡胶胶乳。实施例12(碱性蛋白酶分解蛋白质)
以实施例8“碱性蛋白酶分解蛋白质”的情况同样的方式，用碱性蛋白酶(上述“Alcalase 2.0M”)分解田间胶乳中的蛋白质。(具有肽链端解酶活性的蛋白酶分解蛋白质)
除了使用上述“Peptidase R”代替上述“Umamizyme”，作为具有肽链端解酶活性的蛋白酶，及以100重量份胶乳橡胶含量为基础，将酶的量改变为0.1重量份外，以实施例8“具有肽链端解酶活性的蛋白酶分解蛋白质”的情况同样的方式完成蛋白质的分解处理。(去除蛋白质及其分解产物)
除了使用由蛋白酶“Peptidase R”完成酶处理后的胶乳外，以实施例8“去除蛋白质及其分解产物”的情况同样的方式完成离心处理，得到脱蛋白天然橡胶胶乳。比较例2
根据日本专利2,905,005所述的方法制备脱蛋白天然橡胶胶乳。
稀释HA胶乳，使其橡胶含量降低到30重量％。在100重量份橡胶含量的田间胶乳中加入0.1重量份碱性蛋白酶、1.0重量份非离子型表面活性剂和0.12％的环烷酸钠，从而使胶乳稳定化。
关于碱性蛋白酶，是使用一种源自细菌的蛋白酶，它是由一种芽孢杆菌类的细菌地衣形芽孢杆菌属微生物产生的[Novo-Nordisk BioindustriA/S制备，商品名为“Alcalase 2.0M”]。这种碱性蛋白酶具有的效力为2.0AU/g(pH8.3)、具有最佳pH在碱性范围、如表1所示，并也只有肽链内切酶活性，而没有肽链端解酶活性。
使用磷酸二氢钠将pH调到9.2后，将胶乳在30℃放置24小时让其陈化。
酶处理完成后，胶乳用1％非离子型表面活性剂的水溶液稀释，从而将胶乳的橡胶含量降低到10％，然后在13000转/分下进行离心处理30分钟。如此分离的上层乳浆成分再一次在水中分散得到脱蛋白天然橡胶胶乳。[蛋白质分解处理的评估](氮含量测定)
使用实施例7～12和比较例2中离心处理后形成的乳浆成分，再一次在水中分散制备成各自的胶乳，将胶乳涂布到玻璃板上得到流延薄膜。
这些流延薄膜用作测量氮含量的样品。
此外，直接由既未经历蛋白质分解处理、也未经历洗涤处理的HA胶乳制成流延薄膜，这些薄膜用作对照样品。
关于实施例7～12、比较例2和对照的各样品，通过RRIM测试方法(马来西亚橡胶研究所(1973)，‘SMR Bulletin No.7’)来测定氮含量(N％)。
氮含量(N％)测定结果列于表4。(过敏性蛋白质含量指数的测定)
实施例7～12和比较例2得到的各天然橡胶胶乳所包含的过敏性蛋白质含量指数是根据RAST-抑制方法测定的。“过敏性蛋白质的含量指数”是通过竞争免疫抑制方法使用上述德国BGFA(BerufsgenossenschaftlichesForschungsinstitut für Arbeitsmedizin)的Pharmacia Cap系统测定的。
同样，有关实施例7～12和比较例2得到的脱蛋白天然橡胶胶乳用同样的方式做成测量样品，测定其残留抗体的量，计算过敏性蛋白质的含量指数。
过敏性蛋白质含量指数的测定结果列于表4。[表4]
胶乳类别            蛋白质分解处理 氮含量(N％) 过敏性蛋白质的含量指数
蛋白酶类别     量(重量份)
实施例7 田间胶乳   1)Alcalase 2.0M2)Umamizyme     1)0.12)0.1 0.018 2.1μg/g
实施例8 HA胶乳   1)Alcalase 2.0M2)Umamizyme     1)0.12)0.1 0.012 n.d
实施例9 田间胶乳   1)Alcalase 2.0M2)P“Amano”3G     1)0.12)0.1 0.017 n.d
实施例10 HA胶乳   1)Alcalase 2.0M2) P“Amnano”3G     1)0.12)0.1 0.011 n.d
实施例11 田间胶乳   1)Alcalase 2.0M2) Peptidase R     1)0.12) 0.1 0.018 n.d
实施例12 HA胶乳   1)Alcalase 2.0M2)Peptidase R     1)0.12)0.1 0.011 n.d
  比较例2   HA胶乳   Alcalase 2.0M     0.1   0.012   11.1μg/g
  对照   HA胶乳         -     -   0.334   1060μg/g
*：蛋白酶分解处理栏中1)和2)项表示分别被碱性蛋白酶处理和被具有肽链端解酶活性的蛋白酶处理。*：蛋白酶量(重量份)是以100重量份胶乳橡胶含量为基础的数值。*：n.d.表示数值低于检测限度(2μg/g)。
显然从表4看出，虽然实施例7～12的脱蛋白天然橡胶的氮含量(N％)和比较例2的脱蛋白天然橡胶的相同，但过敏性蛋白质的含量指数明显降低了，因此，由蛋白质引起过敏性反应的可能性明显地降低了。还发现在实施例8～12中橡胶脱蛋白被脱到检测不到过敏性蛋白质的程度。(蛋白质分子量分析)
对于实施例7～10和比较例2得到的天然橡胶胶乳，使用蛋白质分析系统包括飞行时间(TOF)型质谱仪和二维表面修饰芯片的结合[例如，蛋白质结构分析仪“蛋白质芯片TM系统”，Ciphergen Biosystems Inc.制造]，分析是否存在数均分子量<Mn>在4500～4700范围内的杂质。
用上述“蛋白质芯片TM系统”对蛋白质分子量的分析是通过下列程序来完成的：(1)首先，天然橡胶胶乳浆液样品被吸附到一个芯片上，(2)该芯片用洗涤缓冲液洗涤到只留下被吸附的蛋白质，(3)在被吸附的蛋白质上涂上能量吸收物质，(4)芯片上的蛋白质被激光束照射而离子化，及(5)使用TOF型质谱测定分子量。
有关剩余的蛋白质和蛋白质分解产物的数均分子量<Mn>的分析结果，分别地，图5表示了由实施例7脱蛋白天然橡胶胶乳得到的样品的测定结果；图7表示了由实施例8脱蛋白天然橡胶胶乳得到的样品的测定结果；图6表示了由实施例9脱蛋白天然橡胶胶乳得到的样品的测定结果；图8表示了由实施例10脱蛋白天然橡胶胶乳得到的样品的测定结果；及图3表示了比较例2使用酶常规处理的脱蛋白天然橡胶胶乳得到的样品的测定结果。
分析了由HA胶乳得到的对照样品的分子量，该胶乳既未经过蛋白质分解处理也未经过蛋白质去除处理。测定结果在图4中表示。
显然，由分子量分析的测定结果看到，比较例2(图3)中峰存在的位置(位置与蛋白质的存在相对应)是数均分子量<Mn>大约为4700的位置。相反，在实施例7(图5)和实施例9(图6)中，没有在数均分子量<Mn>为大约2000或2000以上的范围观察到峰。在实施例8(图7)和实施例10(图8)中，没有在数均分子量<Mn>为大约4500或4500以上的范围观察到峰。[制备低过敏性天然橡胶]实施例13(仅蛋白质分解处理)
在100重量份橡胶含量的田间胶乳中加入1.0重量份非离子型表面活性剂和0.12％环烷酸钠，从而使胶乳稳定化，然后使用5％磷酸二氢钠水溶液将胶乳的pH调到7.0。在100重量份橡胶含量的该胶乳中，加入0.1重量份具有肽链端解酶活性的蛋白酶，然后将胶乳在30℃放置24小时让其陈化，得到经历过蛋白质分解处理的低过敏性天然橡胶胶乳。
至于蛋白酶，所使用的蛋白酶具有肽链端解酶活性和肽链内切酶活性二者、最佳pH在中性范围、并是由米曲霉属微生物产生的[AmanoEnzyme，Inc.制备，商品名为“Umamizyme”](参阅表2)。这种蛋白酶具有肽酶活性为70u/g或更高(pH7.0，LGG(L-亮氨酰基-甘氨酰基-甘氨酸)方法)。
此外，将如此得到的低过敏性天然橡胶胶乳的橡胶成分凝结和干燥，得到经过蛋白质分解处理的低过敏性天然橡胶胶乳。
按照酸凝结方法进行凝结。将上面得到的胶乳的固含量调到10％，然后加入甲酸(87％)使橡胶成分凝结。将得到的含大量水的橡胶通过清洁的压辊以除去大部分水，得到橡胶片。将得到的橡胶片进行空气干燥4天，最后在60℃烘箱中干燥3天，得到固体橡胶。在下面的实施例和比较例中，固体橡胶是根据上述相同的方法得到的。(蛋白质分解处理和蛋白质去除处理)
经过蛋白质分解处理的低过敏性天然橡胶胶乳用1％非离子型表面活性剂水溶液稀释，从而将胶乳的橡胶含量降低到10％，然后在13000转/分下进行离心处理30分钟。取出如此分离的上层乳浆成分，在等量水中再一次分散得到经过蛋白质分解处理和蛋白质去除处理的低过敏性天然橡胶胶乳。
此外，将该乳浆成分干燥，得到经过蛋白质分解处理和蛋白质去除处理的低过敏性天然橡胶胶乳。实施例14(仅蛋白质分解处理)
将一种高氨胶乳(下文称作“HA胶乳”)稀释，使其橡胶含量降低到30重量％。在100重量份橡胶含量的胶乳中，加入1.0重量份非离子型表面活性剂和0.12％环烷酸钠(稳定剂)，从而使胶乳稳定化，及然后使用5％磷酸二氢钠水溶液将胶乳的pH调到7.0。在100重量份橡胶含量的胶乳中加入0.1重量份蛋白酶(上述“Umamizyme”)，及然后将胶乳在30℃放置24小时让其陈化，得到经历过蛋白质分解处理的低过敏性天然橡胶胶乳。
此外，将如此得到的低过敏性天然橡胶胶乳的橡胶成分凝结及干燥，得到经过蛋白质分解处理的低过敏性天然橡胶胶乳。(蛋白质分解处理和蛋白质去除处理)
经过蛋白质分解处理的低过敏性天然橡胶胶乳用1％非离子型表面活性剂水溶液稀释，从而将胶乳的橡胶含量降低到10％，然后在13000转/分下进行离心处理30分钟。取出如此分离的上层乳浆成分，然后在等量水中再一次分散得到经过蛋白质分解处理和蛋白质去除处理的低过敏性天然橡胶胶乳。
此外，将该乳浆成分干燥，得到经过蛋白质分解处理和蛋白质去除处理的低过敏性天然橡胶胶乳。实施例15(仅蛋白质分解处理)
除了使用由蜂蜜曲霉属微生物产生的蛋白酶[Amano Enzyme，Inc.制备，商品名为P“Amano”3G]代替上述“Umamizyme”，作为具有肽链端解酶活性的蛋白酶，并以100重量份胶乳橡胶含量为基础，将酶的量改变为0.1重量份外，用实施例13(即，田间胶乳作原料)同样的方式完成蛋白质的分解处理，得到低过敏性天然橡胶胶乳。
蛋白酶P“Amano”3G是一种蛋白质消解效力为10000u/g或更高(pH7.0，Amano方法)的蛋白酶，它具有肽链端解酶活性和肽链内切酶活性二者，还具有最佳pH在中性范围，如表2所示。
此外，将如此得到的低过敏性天然橡胶胶乳的橡胶成分凝结及干燥，得到经过蛋白质分解处理的低过敏性天然橡胶胶乳。(蛋白质分解处理和蛋白质去除处理)
以实施例13同样的方式，经过蛋白酶P“Amano”3G分解处理蛋白质的低过敏性天然橡胶胶乳进行稀释处理、离心处理和再分散处理，得到经过蛋白质分解处理和蛋白质去除处理的低过敏性天然橡胶胶乳。
此外，将乳浆成分干燥，得到经过蛋白质分解处理和蛋白质去除处理的低过敏性天然橡胶胶乳。实施例16(仅蛋白质分解处理)
除了使用上述P“Amano”3G代替上述“Umamizyme”，作为具有肽链端解酶活性的蛋白酶，及以100重量份胶乳橡胶含量为基础，将其量改变为0.1重量份外，以实施例14同样的方式(即，HA胶乳作原料)完成蛋白质分解处理，得到低过敏性天然橡胶胶乳。
此外，将如此得到的低过敏性天然橡胶胶乳的橡胶成分凝结及干燥，得到经过蛋白质分解处理的低过敏性天然橡胶胶乳。(蛋白质分解处理和蛋白质去除处理)
以实施例14同样的方式，经过蛋白酶P“Amano”3G分解处理蛋白质的低过敏性天然橡胶胶乳进行稀释处理、离心处理和再分散处理，得到经过蛋白质分解处理和蛋白质去除处理的低过敏性天然橡胶胶乳。
此外，将乳浆成分干燥，得到经过蛋白质分解处理和蛋白质去除处理的低过敏性天然橡胶胶乳。实施例17(仅蛋白质分解处理)
除了使用由米根霉属微生物产生的蛋白酶[Amano Enzyme，Inc.制备，商品名为“Peptidase R”]代替上述“Umamizyme”，作为具有肽链端解酶活性的蛋白酶，并以100重量份胶乳橡胶含量为基础，将酶的量改变为0.1重量份外，用实施例13(即，田间胶乳作原料)同样的方式完成蛋白质的分解处理，得到低过敏性天然橡胶胶乳。
蛋白酶“Peptidase R”是一种具有肽酶活性为420u/g或更高(pH7.0，LGG方法)的蛋白酶，它具有肽链端解酶活性和肽链内切酶活性二者，还具有最佳pH在中性范围，如表2所示。
此外，将如此得到的低过敏性天然橡胶胶乳的橡胶成分凝结及干燥，得到经过蛋白质分解处理的低过敏性天然橡胶胶乳。(蛋白质分解处理和蛋白质去除处理)
以实施例13同样的方式，将经过蛋白质解处理的低过敏性天然橡胶胶乳进行稀释处理、离心处理和再分散处理，得到经过蛋白质分解处理和蛋白质去除处理的低过敏性天然橡胶胶乳。
此外，将乳浆成分干燥，得到经过蛋白质分解处理和蛋白质去除处理的低过敏性天然橡胶胶乳。实施例18(仅蛋白质分解处理)
除了使用上述“Peptidase R”代替上述“Umamizyme”，作为具有肽链端解酶活性的蛋白酶，并以100重量份胶乳橡胶含量为基础，将酶的量改变为0.1重量份外，用实施例14(即，HA胶乳作原料)同样的方式完成蛋白质的分解处理，得到低过敏性天然橡胶胶乳。
此外，将如此得到的低过敏性天然橡胶胶乳的橡胶成分凝结及干燥，得到经过蛋白质分解处理的低过敏性天然橡胶胶乳。(蛋白质分解处理和蛋白质去除处理)
以实施例14同样的方式，经过蛋白酶“Peptidase R”分解处理蛋白质的低过敏性天然橡胶胶乳进行稀释处理、离心处理和再分散处理，得到经过蛋白质分解处理和蛋白质去除处理的低过敏性天然橡胶胶乳。
此外，将乳浆成分干燥，得到经过蛋白质分解处理和蛋白质去除处理的低过敏性天然橡胶胶乳。比较例3(仅蛋白质分解处理)
在100重量份橡胶含量的田间胶乳中加入0.1重量份碱性蛋白酶、1.0重量份非离子型表面活性剂和0.12％的环烷酸钠，从而使胶乳稳定化。
关于碱性蛋白酶，是使用一种源自细菌的蛋白酶，它是由一种地衣形芽孢杆菌属微生物产生的[Novo-Nordisk Bioindustri A/S制备，商品名为“Alcalase 2.0M”]。这种碱性蛋白酶具有的效力为2.0AU/g(pH8.3)、具有最佳pH在碱性范围、如表1所示，并也只有肽链内切酶活性，而没有肽链端解酶活性。
使用磷酸二氢钠将pH调到9.2后，将胶乳在30℃放置24小时让其陈化，得到经过蛋白质分解处理的天然橡胶胶乳。(蛋白质分解处理和蛋白质去除处理)
经过蛋白质分解处理的低过敏性天然橡胶胶乳用1％非离子型表面活性剂水溶液稀释，从而将胶乳的橡胶含量降低到10％，然后在13000转/分下进行离心处理30分钟。取出如此分离的上层乳浆成分，然后在等量水中再一次分散，得到经过蛋白质分解处理和蛋白质去除处理的天然橡胶胶乳。
此外，将该乳浆成分干燥，得到脱蛋白天然橡胶胶乳。[蛋白质分解处理的评估]
在实施例13～18和比较例3中，蛋白质分解处理的评估结果(测定氮含量和测定过敏性蛋白质的含量指数)与实施例1～6和比较例1中的相同。(蛋白质分子量分析)
有关实施例13和比较例3得到的天然橡胶胶乳的蛋白质分子量的分析结果与实施例1(图1)和比较例1(图3)的相同。[脱蛋白天然橡胶的制备]实施例19(碱性蛋白酶分解蛋白质)
在100重量份橡胶含量的田间胶乳中，加入1.0重量份非离子型表面活性剂和0.12％环烷酸钠，从而使胶乳稳定化。在100重量份橡胶含量的这种胶乳中加入0.1重量份碱性蛋白酶，然后将胶乳在30℃放置24小时让其陈化。
关于碱性蛋白酶，是使用一种源自细菌的蛋白酶，它是由一种芽孢杆菌类的细菌地衣形芽孢杆菌属微生物产生的[Novo-Nordisk BioindustriA/S制备，商品名为“Alcalase 2.0M”]。这种碱性蛋白酶具有的效力为2.0AU/g(pH8.3)、具有最佳pH在碱性范围、如表1所示，并也只有肽链内切酶活性，而没有肽链端解酶活性。(具有肽链端解酶活性的蛋白酶分解蛋白质)
在陈化过的胶乳中，加入5％磷酸二氢钠水溶液，从而将pH调到7.0。在100重量份橡胶含量的胶乳中，加入0.1重量份具有肽链端解酶活性的蛋白酶，加蛋白酶以后，再一次将胶乳在30℃放置24小时让其陈化。
有关蛋白酶，是使用一种具有肽链端解酶活性和肽链内切酶活性二者的蛋白酶，它的最佳pH在中性范围，并是由米曲霉属微生物产生[AmanoEnzyme Inc.制备，商品名为“Umamizyme”](参阅表2)。这种蛋白酶具有的肽酶活性为70u/g或更高(pH7.0，LGG(L-亮氨酰基-甘氨酰基-甘氨酸)方法)。(去除蛋白质及其分解产物)
酶处理完成后，胶乳用1％非离子型表面活性剂的水溶液稀释，从而将胶乳的橡胶含量降低到10％，然后在13000转/分下离心处理30分钟。再一次稀释如此分离的上层乳浆成分，然后如上述同样的方式进行第二次离心处理。
所生成的乳浆成分再一次在水中分散，得到脱蛋白天然橡胶胶乳。将脱蛋白天然橡胶胶乳凝结及干燥，得到脱蛋白天然橡胶。实施例20(碱性蛋白酶分解蛋白质)
将一种高氨胶乳(下文称作“HA胶乳”)稀释，使橡胶含量降低到30重量％。在100重量份橡胶含量的田间胶乳中加入1.0重量份非离子型表面活性剂和0.12％环烷酸钠，从而使胶乳稳定化。在100重量份橡胶含量的该胶乳中加入0.1重量份的碱性蛋白酶(上述“Alcalase 2.0M”)，然后将胶乳在30℃放置24小时让其陈化。(具有肽链端解酶活性的蛋白酶分解蛋白质)
在陈化过的胶乳中加入5％磷酸二氢钠水溶液，从而将pH调到7.0。在100重量份橡胶含量的胶乳中加入0.1重量份具有肽链端解酶活性的蛋白酶(上述“Umamizyme”)。在加入蛋白酶以后，将胶乳在30℃放置24小时让其再一次陈化。(去除蛋白质及其分解产物)
酶处理完成后，胶乳用1％非离子型表面活性剂水溶液稀释，从而将胶乳的橡胶含量降低到10％，然后在13000转/分下进行离心处理30分钟。
将如此分离的上层乳浆成分再一次稀释，然后如上述同样的方式进行第二次离心处理。
所生成乳浆成分再一次在水中分散，得到脱蛋白天然橡胶胶乳。将脱蛋白天然橡胶胶乳凝结及干燥，得到脱蛋白天然橡胶。实施例21(碱性蛋白酶分解蛋白质)
以实施例19“碱性蛋白酶分解蛋白质”的情况同样的方式，用碱性蛋白酶(上述“Alcalase 2.0M”)分解田间胶乳中的蛋白质。(具有肽链端解酶活性的蛋白酶分解蛋白质)
除了使用由蜂蜜曲霉属微生物产生的蛋白酶[Amano Enzyme Inc.制备，商品名为P“Amano”3G]代替上述“Umamizyme”，作为具有肽链端解酶活性的蛋白酶，并以100重量份胶乳橡胶含量为基础，将酶的量改变为0.1重量份外，以实施例19中“具有肽链端解酶活性的蛋白酶分解蛋白质”的情况同样的方式完成蛋白质的分解处理。
蛋白酶P“Amano”3G是一种蛋白质消解效力为10000u/g或更高(pH7.0，Amano方法)的蛋白酶，它具有肽链端解酶活性和肽链内切酶活性二者，还具有最佳pH在中性范围，如表2所示。(去除蛋白质及其分解产物)
除了使用由蛋白酶P“Amano”3G完成酶处理后的胶乳外，以实施例19中“去除蛋白质及其分解产物”的情况同样的方式完成离心处理，得到脱蛋白天然橡胶胶乳和脱蛋白天然橡胶。实施例22(碱性蛋白酶分解蛋白质)
以实施例20中“碱性蛋白酶分解蛋白质”的情况同样的方式，用碱性蛋白酶(上述“Alcalase 2.0M”)分解HA胶乳中的蛋白质。(具有肽链端解酶活性的蛋白酶分解蛋白质)
除了使用上述P“Amano”3G代替上述“Umamizyme”，作为具有肽链端解酶活性的蛋白酶，并以100重量份胶乳橡胶含量为基础，将酶的量改变为0.1重量份外，以实施例20中“具有肽链端解酶活性的蛋白酶分解蛋白质”的情况同样的方式完成蛋白质的分解处理。(去除蛋白质及其分解产物)
除了使用由蛋白酶P“Amano”3G完成酶处理后的胶乳外，以实施例20中“去除蛋白质及其分解产物”的情况同样的方式完成离心处理，得到脱蛋白天然橡胶胶乳和脱蛋白天然橡胶。实施例23(碱性蛋白酶分解蛋白质)
以实施例19中“碱性蛋白酶分解蛋白质”的情况同样的方式，用碱性蛋白酶(上述“Alcalase 2.0M”)分解田间胶乳中的蛋白质。(具有肽链端解酶活性的蛋白酶分解蛋白质)
除了使用由米根霉属微生物产生的蛋白酶[Amano Enzyme Inc.制备，商品名为“Peptidase R”]代替上述“Umamizyme”，用作具有肽链端解酶活性的蛋白酶，及以100重量份胶乳橡胶含量为基础，将酶的量改变为0.1重量份外，以实施例19中“具有肽链端解酶活性的蛋白酶分解蛋白质”的情况同样的方式完成蛋白质的分解处理。
蛋白酶“Peptidase R”是肽酶活性为420u/g或更高(pH7.0，LGG方法)的蛋白酶，它具有肽链端解酶活性和肽链内切酶活性二者，且最佳pH在中性范围，如表2所示。(去除蛋白质及其分解产物)
除了使用由蛋白酶“Peptidase R”完成酶处理后的胶乳外，以实施例19中“去除蛋白质及其分解产物”的情况同样的方式完成离心处理，得到脱蛋白天然橡胶胶乳和脱蛋白天然橡胶。实施例24(碱性蛋白酶分解蛋白质)
以实施例20中“碱性蛋白酶分解蛋白质”的情况同样的方式，用碱性蛋白酶(上述“Alcalase 2.0M”)分解田间胶乳中的蛋白质。(具有肽链端解酶活性的蛋白酶分解蛋白质)
除了使用上述“Peptidase R”代替上述“Umamizyme”，用作具有肽链端解酶活性的蛋白酶，及以100重量份胶乳橡胶含量为基础，将酶的量改变为0.1重量份外，以实施例20中“具有肽链端解酶活性的蛋白酶分解蛋白质”的情况同样的方式完成蛋白质的分解处理。(去除蛋白质及其分解产物)
除了使用由蛋白酶“Peptidase R”完成酶处理后的胶乳外，以实施例20中“去除蛋白质及其分解产物”的情况同样的方式完成离心处理，得到脱蛋白天然橡胶胶乳和脱蛋白天然橡胶。比较例4
根据日本专利2,905,005所述的方法制备脱蛋白天然橡胶。
将HA胶乳稀释，使其橡胶含量降低到30重量％。在100重量份橡胶含量的田间胶乳中加入0.1重量份碱性蛋白酶、1.0重量份非离子型表面活性剂和0.12％的环烷酸钠，从而使胶乳稳定化。
至于碱性蛋白酶，是使用一种源自细菌的蛋白酶，它是由一种芽孢杆菌类细菌地衣形芽孢杆菌属微生物产生的[由Novo-Nordisk BioindustriA/S制备，商品名为“Alcalase 2.0M”]。这种碱性蛋白酶具有的效力为2.0AU/g(pH8.3)、具有最佳pH在碱性范围、如表1所示，并也只有肽链内切酶活性，而没有肽链端解酶活性。
使用磷酸二氢钠将pH调到9.2后，将胶乳在30℃放置24小时让其陈化。
酶处理完成后，胶乳用1％非离子型表面活性剂水溶液稀释，从而将胶乳的橡胶含量降低到10％，然后在13000转/分下进行离心处理30分钟。
如此分离的上层乳浆成分，在水中再一次分散得到脱蛋白天然橡胶胶乳。将该乳浆成分凝结和干燥，得到脱蛋白天然橡胶。[蛋白质分解处理的评估]
在实施例19～24和比较例4中，蛋白质分解处理的评估结果(测定氮含量和测定过敏性蛋白质的含量指数)与在表4中列出的实施例7～12和比较例2的相同。(红外吸收光谱测定)
取出各(36g)实施例19和比较例4得到脱蛋白天然橡胶胶乳，将胶乳涂布在一块玻璃板上，玻璃板的尺寸为18cm×12cm，让其在室温放置干燥，从玻璃板上剥离下来，与玻璃表面接触的表面再干燥一天，并在真空下干燥，便得到了用于红外吸收光谱测量的粗制橡胶薄膜。
上述薄膜置于KBr片上，用傅立叶红外光谱仪JASCO5300测定其吸收。
作为结果，对于由实施例19和比较例4的胶乳制成的任何样品，都未能检出在3280cm-1处的多肽吸收。(蛋白质分子量分析)
对于实施例19、20、21和22及比较例4的胶乳，剩余蛋白质和蛋白质分解产物的数均分子量<Mn>的分析结果与图5、6、7、8和9所显示的相同。

Claims (25)

1.一种制备低过敏性天然橡胶胶乳的方法，它包括在天然橡胶胶乳中加入具有肽链端解酶活性的蛋白酶，并将天然橡胶胶乳陈化，从而将胶乳中的蛋白质分解到检测不到数均分子量在4500或4500以上的蛋白质及蛋白质分解产物的程度。
2.根据权利要求1的制备低过敏性天然橡胶胶乳的方法，其中胶乳中蛋白质及其分解产物是在蛋白质分解之后除去的。
3.根据权利要求2的制备低过敏性天然橡胶胶乳的方法，其中蛋白质及其分解产物是通过离心处理去除的。
4.根据权利要求1的制备低过敏性天然橡胶胶乳的方法，其中在使用具有肽链端解酶活性的蛋白酶处理之前，将胶乳的pH调到中性范围。
5.根据权利要求1的制备低过敏性天然橡胶胶乳的方法，其中具有肽链端解酶活性的蛋白酶是由属于曲霉属或根霉属的微生物产生的。
6.根据权利要求5的制备低过敏性天然橡胶胶乳的方法，其中属于曲霉属的微生物是列入米曲霉的微生物。
7.根据权利要求5的制备低过敏性天然橡胶胶乳的方法，其中属于曲霉属的微生物是列入蜂蜜曲霉的微生物。
8.根据权利要求5的制备低过敏性天然橡胶胶乳的方法，其中属于根霉属的微生物是列入米根霉的微生物。
9.根据权利要求1的制备低过敏性天然橡胶胶乳的方法，其中蛋白质的分解处理是在表面活性剂存在下完成的。
10.一种制备脱蛋白天然橡胶胶乳的方法，它包括将碱性蛋白酶加到天然橡胶胶乳中，从而分解胶乳中的蛋白质，加入具有肽链端解酶活性的蛋白酶，从而进一步分解胶乳中的蛋白质及其分解产物，以及去除蛋白质及其分解产物。
11.根据权利要求10的制备脱蛋白天然橡胶胶乳的方法，其中蛋白质及其分解产物是通过离心处理去除的。
12.根据权利要求10的制备脱蛋白天然橡胶胶乳的方法，其中在使用具有肽链端解酶活性的蛋白酶处理之前，将胶乳的pH调到中性范围。
13.根据权利要求10的制备脱蛋白天然橡胶胶乳的方法，其中具有肽链端解酶活性的蛋白酶是由属于曲霉属或根霉属的微生物产生的。
14.根据权利要求13的制备脱蛋白天然橡胶胶乳的方法，其中属于曲霉属的微生物是列入米曲霉的微生物。
15.根据权利要求13的制备脱蛋白天然橡胶胶乳的方法，其中属于曲霉属的微生物是列入蜂蜜曲霉的微生物。
16.根据权利要求13的制备脱蛋白天然橡胶胶乳的方法，其中属于根霉属的微生物是列入米根霉的微生物。
17.根据权利要求10的制备脱蛋白天然橡胶胶乳的方法，其中蛋白质的分解处理是在表面活性剂的存在下完成的。
18.一种分解处理蛋白质得到的低过敏性天然橡胶，其中检测不到数均分子量在4500或4500以上的蛋白质和蛋白质分解产物。
19.根据权利要求18的低过敏性天然橡胶，其中检测不到数均分子量在1500或1500以上的蛋白质和蛋白质分解产物。
20.根据权利要求18的低过敏性天然橡胶，其中能够在人血液血清中产生IgE-类抗体的过敏性蛋白质的含量指数为10μg/g或更少。
21.根据权利要求20的低过敏性天然橡胶，其中过敏性蛋白质的含量指数是5μg/g或更少。
22.对蛋白质进行分解处理和去除处理得到的一种脱蛋白天然橡胶，其中依据氮含量，蛋白质的含量是0.02％或更少，红外吸收光谱上3280cm-1的吸收辨认不到，并检测不到数均分子量为4500或4500以上的蛋白质和蛋白质分解产物。
23.根据权利要求22的脱蛋白天然橡胶，其中检测不到数均分子量为1500或1500以上的蛋白质和蛋白质分解产物。
24.根据权利要求22的脱蛋白天然橡胶，其中能够在人血清中产生IgE-类抗体的过敏性蛋白质的含量指数是10μg/g或更少。
25.根据权利要求24的脱蛋白天然橡胶，其中过敏性蛋白质的含量指数为5μg/g或更少。
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