CN1310755A - 使用多孔硅将物质转入细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及应用多孔硅将物质运送到细胞中。为了侵入细胞中,多孔硅可以被成型为微刺(micropierces),微针(microneedles)和生物弹射子弹(biolistic bullets)。通过调节多孔硅的孔径大小和孔隙度可以控制多孔硅的生物活性。多孔硅还是可以再吸收的,因此可从细胞中再吸收该多孔硅而不留下任何颗粒或被视为外来物质。本发明还涉及制备多孔硅微刺,微针,微电极,生物弹子弹的方法,以及在生物活性底物中沉淀磷酸钙的方法,以及这些方法相比于已知的运送物质进入细胞的方法的优点。

Description

使用多孔硅将物质转入细胞
本发明涉及将物质转入细胞的方式以及微针阵列。
经常会有许多时候需要将物质转入细胞，例如出于基因操作的目的，常需要将核酸或核酸的构建物如载体或质粒转入细胞。此外，化学制品也需要转入细胞，如核苷酸或染料以及影响细胞生理的化学制品。现在已经开发出相当数量的化学及机械的方法将物质转入细胞内，这些技术包括：
1．直接注射：将针插入细胞，物质通过针被推入细胞；
2．电穿孔法：细胞膜通过高压电击使之变得对某些分子具有通透性；
3．生物弹射：钨或金粒子被待转移的物质所覆盖然后被打入细胞；
4．磷酸钙共沉淀法：细胞可以吸收磷酸钙沉淀，因此若将DNA/其他物质与磷酸钙共沉淀便可将其转入细胞；
5．介导转化(通过脂质体，病毒或细菌载体)；
6．原生质体转化。
本发明的一方面的目的是使用一种新材料来辅助将物质转移进入细胞。
本发明的另一方面的目的是提供一种改进的方法，以提供小体积的物质。
直接微注射包括将含有DNA的微针直接插入单个细胞的细胞核。一个玻璃微吸液器与一个微操作器相连，将10-8-10-7微升的物质通常是DNA片段溶液注入细胞核。只要有足够的操作熟练程度，“击中率”是确定的，但这项技术很繁琐，不能应用于大量细胞。
基于第一个方面所说，本发明包含将物质转入细胞的方法。
优选地可吸收或可被生物吞噬的多孔硅将被使用。
在一个实施方案中，包含最少一个区域(region)的多孔硅的微针被使用，或者，这样的微针阵列被使用。
基于第二方面所说，本发明包括含多孔硅的微针或微针阵列。
基于第三方面，本发明包括将物质转移进入细胞的工具，这个工具至少部分包括多孔硅以及将要转入细胞的物质。
优选多孔硅是可吸收的。这种工具可以包括多孔硅生物弹射子弹。这种工具包含可与被转移入细胞的物质共沉淀的物质。这种工具可以包括一个可导电的有生物活性的多孔硅电极。
基于本发明的第四个方面，本发明包括使用多孔硅作为转运物质进入细胞的工具。
现在发现多孔硅是生物相容的，并且多孔硅能侵入或被吸收入哺乳动物细胞，没有明显的有害效应。多孔硅可用于定位和固定化某些生物活性物质(或将转入细胞的物质)，这些物质一旦进入细胞就可以与细胞DNA结合，或者释放入细胞产生效应。
从PCT专利申请WO 96/10630可知有一种微型机器化的硅刺(barbs)或尖头(tips)的阵列来用于同时机械刺穿大量细胞的浆膜。这比用单针刺单个细胞有效的多，后者如需向上百个细胞导入物质将是一项非常工作量巨大的工作。事后看来，WO 96/10630的尖头转移物质的效率很低。例如，在那份文件中设想的是利用紧密排列的尖头之间的表面张力来装载即将被转入细胞的物质，将它限制于尖头(探针)与底物之间。
1993年公开的US5 262 128中讨论了一个建议，并声称可以教本领域的技术人员使用Liga法生产硅针。据信这个文件在提交(及公开时)仍不可实施，因此对本发明的新颖性没有影响。在申请被提交的1989年，以及它被公开的1993年，本领域的普通技术人员还不能制造如文献中所讨论的非常细的中空硅针。Liga法不适合生产中空的硅针，也不能在产品中产生坡度结构。
US 5 457 041公开了一种使用有不齐尖头(ragged tips)的硅所制成的固体的针的阵列。
US 5 591 139公开了在一个硅圆片平面上形成硅微针。
乔治亚技术学院的网站www.gtri.gatech.edu/resnews/NEEDLES.htnl上的文章，发表于1998年6月22日，讨论了由硅生产固体针阵列的方法，并表达了使用一种未知且未鉴定的方法来生产中空针的愿望。
US 4 969 468讨论了应用于与神经接触的固体金属针。
基于另一个方面，发明包含细胞穿透元件(cell-penetratingmember)，或称用多孔硅制成的微穿刺器(mocropiercer)。
细胞穿透元件适于使用多孔硅携带即将转入细胞的物质。
基于另一个方面，本发明包含细胞穿透元件或微穿刺器，它们至少含一个区域的多孔硅。优选待转移的物质含DNA或RNA,DNA或RNA片段，或DNA或RNA的构建体。
细胞穿透元件或微穿刺器优选适于使用多孔硅携带即将转入细胞的物质。
当使用生物惰性物质如钛时，从它的运动性方面来看，多孔硅区域更适于固定化之。多孔硅区域一般位于细胞穿刺装置或细胞穿刺器的顶端，它一般是尖头或刺，无空腔，也可以是中间有通道的针。细胞穿刺装置或细胞穿刺器有一个从储液器到细胞穿刺装置或穿刺器表面物质传递区之间的孔道网络系统。
细胞穿刺装置或细胞穿刺器可以有一个多孔硅的外表，或者一个截面，至少它的尖头部分(若不是尖头，就是其他物质传递区域)是多孔硅的。一般而言，穿过细胞的细胞穿过元件细胞穿刺器的外表面都包含多孔硅。
细胞穿刺器或微穿刺器也许是带多孔硅外壳的大的硅微尖头。
将待转运入细胞的物质置于细胞穿刺器或微穿刺器本身的顶端而不是尖头之间的通道/空间的好处在于，物质可以确定地转入细胞，常是深入细胞。这会提高操作的成功率(在许多情况下，转运DNA进入细胞及DNA片段的稳定整合在统计上都不是非常成功，只有一定的成功百分率，这就是为什麽要对大量细胞进行注射的原因)。
除了使用多孔硅在尖头处来固定化物质以确保尖头上至少有少量待转移的物质外，其它方式也常使用。例如多晶硅在颗粒的边缘也可以携带物质。携带的方式可能包括多孔物质。
已知可以用穿过型基因感受器将DNA片段固定于大孔硅上(Advances in GenosensorResearch.K.L.Beattie et al.C1in.Chem.41,700(1995))。
多孔硅的优点是其生物活性能通过调节其孔径大小及孔隙度而实现。因此生产带有特定大小孔径的的多孔硅尖头以承载/固定化特定的分子或物质的细胞穿刺器或微穿刺器是可能的。当然，这些物质不能被固定化得太厉害了，以致于当尖头在细胞内时，这些物质还不能离开尖头。
选择多孔硅作为制造细胞穿刺器或微穿刺器的材料还有另一个优势就是用硅组装小规模装置的微型机器生产技术已经存在，例如在电子产业中。
现在已知如何使硅的结构多孔化(例如US 5 348 618，其内容已经在参考资料中包括)。
细胞穿刺器或微穿刺器的阵列也可以被提供。这个阵列优选是n×m二维微尖头阵列。微穿刺器通常最好是网格排列，但也可能不必是这样。
也已经知道微尖头阵列还有一种完全不同的应用-真空微电子中应用的场放射阴极。这里一个5平方毫米的硅芯片将包括500个金字塔型的微尖头，基于选择不同的生产标准其宽度为50毫米至1微米，高为10-100微米。回过来看，这些将对多孔化和其后的用于微穿刺器转移物质进入细胞是很适合的。还知道已经有多孔硅金字塔形的阴极-例如
Field emisson from pyramidal cathodes coverd in poroussilicon P.R.Wilshaw et al.J.Vac.Sci.Techn.BI2,I(1994)；Fabrication of Si field emitters by forming poroussilicon.D.Kim et al.J.Vac.Sci.Tech.B14,1906(1996)；以及Porous silicon field emission cathode development.J.R.Jessing et al.J.Vac.Sci.Techn.B14,1899(1996)然而，这些是在完全不同的领域的应用，没有人显示微尖头可用于承载DNA,RNA或其他被转移入细胞的物质。
基于第3个方面所说，本发明包含生产微穿刺器的方法，该方法包括生产一个或多个微穿刺器投射(projections)以及在注射的头部或接近头部的地方驻留物质的方法。
优选该方法包括至少使投射(projections)的一部分多孔化。优选使投射(projections)的尖头或整个尖头的范围多孔化，或者在尖头的外面包一个多孔外壳。优选尖头是用HF阳极化技术进行多孔化。
基于另一个方面所说，本发明包含使物质进入细胞的方法，包括将物质连接到微穿刺器的尖头部分以及使用微穿刺器刺透细胞的方法。
优选该方法包含用多孔硅将物质固定在尖头或接近尖头的部分。
基于更进一步的方面所说，本发明包含对细胞进行遗传操作，即包括将遗传物质与微穿刺器的尖头部分连接起来，用该穿刺器刺透细胞使遗传物质进入细胞。这样遗传物质就可以稳定地整合入细胞。
基于发明的另一个方面，该发明包含一个微针阵列，即许多针从一个基座上伸出，每根针都有一个液流传送装置，该装置适于将液流从基座传向尖部，液流供应装置与传送装置相连，适于供应液体以便将液体注入针的基部。
优选微针的阵列是用硅作的。它也可以是用硅片用微型机器生产出来的。
液流传送装置可包括一个储液池，位于针的下部。基座有一个下层部分和一个上层部分，一个管道或一个储液池位于二者之间，针位于上层部分，液流传递装置延伸至储液池或管道。
液流传递装置可以包含管腔，或者在每根针的中央贯穿其径向部分的一个大孔。或进一步说，液流传递装置包含一个孔或毛细管网，例如许多中孔。
针的阵列可以放置在一个集成硅芯片上，同时上面有一个感受器，感受器可以使人们监测原位转染的进程。例如可以使用光发射/探测系统来检测与DNA偶连的发光标记(如荧光剂)。在芯片上优选有一套能量供应及/或处理回路及/或控制回路。带有光发射装置及照片探测系统的阵列会使转染过程在很高的空间分辨率的情况下被监控。
基于另一个方面所说，本发明包含生产微针或微针阵列的方法，该方法包括取一大块硅圆片，生产针或微针阵列，并生产从每一根针基部到尖部的液流传递装置。
优选地，该方法提供从针的底部到尖部的孔道网络，这些孔可以是大孔或中孔，在某些情况下可以是小孔(但优选是大孔)。
每个针都优选地使用光石印技术生产，如各向异性的蚀刻及感光石印技术。
硅基底可能是电阻为0.1-10欧姆.厘米的n-型的基底。
针或针的阵列可以是平面型的，例如使用非导电的隔膜。
平面化的阵列可以进行处理以只暴露尖头部分。例如使用氧浆处理和HF浸蘸法以只暴露尖头部分。另外，平面化的阵列也许可以包埋在内部。这些尖头可以通过阳极化产生从圆片基部表面到尖部的孔洞，有一个尖头阵列的圆片可以和另一个支持物固定在一起，这个支持物可以在带尖头的硅圆饼和它之间建立通道或储液池的联系。
基于更进一步的方面，本发明还包括转移物质进入细胞的载体，这个载体至少部分包括可吸收的材料。
优选这个载体包含可吸收的硅，例如多孔硅或多晶硅。这个载体可以全部由可吸收材料制成，也可以只是部分由可吸收材料制成。这个工具也可以包括生物活性硅。“可吸收”表示材料是侵入/吸收/腐蚀或在生理溶液中时以别的方式在原位消失。“生物活性”表示材料能使磷酸钙沉淀在其表面上在生理条件之下(在体液中)时发生降解。
当载体在细胞中时，它被吸附/被侵蚀/被腐蚀，或者被再吸收，或者局部地被再吸收，并且，对细胞产生的刺激/异源物的反应更少。可吸收的硅/其他的材料也许是可应用于生物弹射技术里。
例如向细胞转移物质的载体可以是生物弹射的子弹。
向细胞转移物质的载体可以包括用多孔硅制的生物弹射的子弹。
这个子弹上附着有将转移入细胞的物质。子弹包埋物质(DNA)。它可能被该物质所饱和。这个硅子弹可能含有亚微硅颗粒。它可以用染料蚀刻技术进行多孔化。这些颗粒优选是中孔的。
可吸收的生物弹射的子弹将不在细胞中留下粒子，这一点不象金或者钨的子弹一样。这些子弹不必从头到尾都是多孔的，它可以有一个多孔外壳。可吸收的枪弹不一定是多孔硅，或者由硅制成。但是，多孔硅已经被确认为是尤其适当的材料。
基于另一个方面所说，发明提供转移物质进入细胞的方法，包括将含上述物质的载体射入细胞的步骤。
优选地上述工具是上述已被定义的工具。优选枪弹是通过高压气体射入细胞，例如用氦气。
生物弹射的过程经常被使用于标准技术行不通的地方。可吸收的包埋物质如多孔硅常比抗腐蚀的大型金属材料有更好的生物相容性。
基于本发明提供的更进一步的方面所说，本发明提供制造转移物质进入细胞的载体的方法，该方法包括以下步骤即使载体变得至少部分多孔化以及将待转移的物质引入载体中。
优选地该工具包含一个硅子弹--优选是亚微硅颗粒--这样可用染料蚀刻技术对其进行多孔化，优选是中孔。将被转移的物质或是附着在子弹上，或者包埋于其中。
这个载体可以是个亚微颗粒，将被转移的物质以这个载体为核进行共沉淀。
用来转移物质进入细胞的工具可以包含生物活性硅。将被转移入细胞的物质以易与沉淀物共沉淀的方式偶连在载体上。共沉淀物可以是钙磷酸盐沉淀物。
基于另一个方面所说，本发明包含把将物质转移入细胞的方法，包括将物质与硅粒子偶连，将磷酸钙沉淀于硅微粒上，形成钙磷酸盐/硅粒子结合的粒子，然后使细胞吸收钙磷酸盐/硅粒子的的组合物。
在电穿孔技术中细胞膜暴露在非常高电压的短的电休克之后，会使细胞膜具有通透性。低孔隙度的生物活性硅是可导电的，适于将其发展为一种紧密偶连基质，用于贴壁哺乳细胞在微电极阵列上的生长。
有了生物活性硅，即多孔硅或多晶硅作为电穿孔装置中的一个或两个电极，可以想见，就可以进行更好的DNA转染了。
基于更进一步的方面所说，本发明包含电穿孔的方法，包括提供可导电的生物活性硅电极。
优选包含在电极上生长细胞的方法。这个方法包括提供带生物活性的硅电极阵列，细胞可以在上面生长。电极或这些电极可以用多孔硅包裹，或者他们的横断面，至少在其高向的一个区域为多孔硅。
基于更进一步的方面所说，本发明包括含生物活性电极的电穿孔装置。优选电极是生物活性硅的，优选是多孔硅。可以提供电极或微电极阵列。
另外，本发明也可以用于用生物活性硅优选是多孔硅制造将物质转入细胞的装置。
说明这一点是很有帮助的，生物活性物质是指这样一类物质，当在体内时可以产生特定的生物反应，在活组织与该物质之间形成键。生物活性物质也指表面活性生物物质。可吸收物质是指在体内可逐渐消失或随时间降解的物质，它可以也可以不被组织替代。生物侵蚀物质是指可以被细胞吸收，也可能不被吸收的物质。生物惰性物质是指在体内不产生很强烈的生物反应的物质。
本发明的实施可以通过几个例子用图表来说明
图1显示被部分的多孔化了的硅微尖头；
图2显示硅微针阵列；
图3显示图2所示的硅微针阵列的从尖头到根部储液池的大孔网络；
图4显示用DNA包埋的多孔硅子弹；
图5显示被磷酸钙包围的用DNA包埋的多孔硅核；
图6图解本发明的电穿孔技术；
图7和8 SIMS图显示DNA对多孔硅的亲和力以及它可以从多孔硅表面释放。
图1显示了微穿刺器10在微尖头12中，其底宽A为50微米，高B为100微米，尖头宽C为0.5微米。微尖头12包有多孔硅14外壳，深度D0.1微米。
在应用当中，多孔硅外壳14将转运入细胞的物质(DNA/RNA)固定于尖头上，增加了尖头上固定化物质的转移入活细胞的效率。
多孔硅外壳的孔径大小及孔隙度是可以控制的，以便调节微尖头12的生物活性。通过控制多孔硅孔大小及多孔程度，我们能使特定的分子更容易或者更不容易地离开它。我们可以将微尖头在细胞中保留预定的时间，以便使分子从多孔硅上游离出来。
图2为从硅支持物或基底元件(back member)＞4伸出的微针22的阵列20。微针22包括多孔硅微头26和中空腔28，它将微尖头26和由上部元件32所限定的储液池30连接起来，而上部元件32由微针22和基底支持元件24所维持。基底元件24由硅块制成。
图3所示由硅微针34的阵列33，与图2所示类似。图2与图3所示阵列的主要区别在于图3中的微针34无空腔28。取而代之的是图3中由硅微针34组成的阵列33由中孔网络36提供，从微针的微尖头到储液池30’，使液体在储液池30’及微尖头之间流通。
在应用中，将转移入细胞的物质从储液池30,30’通过中空腔28或中孔(mesoporous)网络36运送到多孔微尖头22,34。这些物质被保留在多孔硅微尖头上，便于转入细胞。
待转移物质泵入储液池30,30’，通过空腔28或多孔网络泵出，本图未示出(但箭头39显示了泵向储液池注入液体。)
最后结构中的全部或部分硅表面均用下列方法进行处理，以便于调整其与生物系统的相互作用。这一点可以通过在表面形成多孔硅层而实现。这层硅膜可以通过电化学的阳极化过程或将该结构浸泡于染料蚀刻溶液如氢氟酸和硝酸中完成。
图4显示了生物弹射子弹40。它包括通过染料蚀刻产生的中孔亚微硅颗粒。
在现实应用中，子弹40把将导入细胞的物质包埋，然后通过高压氦气射入细胞。因为多孔硅是可吸收材料，它优选地是可完全或至少部分被它进入的细胞吸收，与已知的生物弹子弹如金或钨在细胞内留下金属颗粒，它将留下尽可能少的物质。
图5显示了多孔硅核心50，它包埋了待转移的物质(例如DNA/RNA)以及在核心50周围形成的磷酸钙沉淀物52。磷酸钙52与DNA/RNA共沉淀，这样就围绕生物活性核心50形成遗传物质/磷酸钙层。生物活性硅核心于其处导致磷酸钙过饱和。也许可能将生物活性硅核心靠着细胞或细胞壁，DNA/磷酸钙共沉淀物靠着核心及细胞壁。如果核心被吞噬它将被吸收。
核心50不必带有DNA/RNA/其他活性物质，它可以只作为DNA/磷酸钙共沉淀的一个很好的成核位点。
已知使用玻璃珠作为DNA/磷酸钙共沉淀物转染的成核位点，见文章如下Watson and Latchman in "Methods(san Diego)1996 10(3),289-291(Eng)。
如果微孔的孔径直径为2nm或更小，中孔为2nm-50nm，大孔为50nm或更大，这是很好的。
如图6所示，在电穿孔技术中使用多孔硅，最好是中孔硅(大孔和微孔也可以)，可以提高将物质转入细胞的效率是可能的，这一点也实现了。
使用多孔硅电极60,61(或其他多孔生物活性材料或生物活性多晶硅)有很好的电穿孔效果。因为电极是生物活性的而非生物惰性的，细胞(常为动物细胞)对它有亲和力，易于附于其表面。
低孔率的生物活性硅(50％或更少，30％或更少，10％或更少)是可导电的，适宜作为贴壁哺乳细胞62的生长基质，它可以在微电极阵列60,61上生长。这样在生物活性多孔硅电极上培养哺乳细胞并通过电穿孔将DNA(或其他物质)导入细胞是可能的。细胞生长的基质是电极，甚至是电穿孔装置的电极60,61。这在处理细胞方面有优势，并且比单单将细胞悬浮在液体培养基63中可以获得更好的DNA转染效率。
多孔硅在哺乳动物中是可吸收/吞噬的这一点已被发明人证实，这是本发明某些方面的支柱。硅可以变成生物活性的支持着本发明的另一些方面。
下面图7显示SIMS图(二级离子质谱)该图显示了一张多孔硅不同深度的氮浓度示意图。DNA富含氮，检测多孔硅中高氮水平既是检测硅中有多少DNA。图表70表明“老化的”多孔硅片氮分析结果，其表面无添加DNA。氮的背景水平决定于多孔硅薄膜及其“年龄”，即在周围的空中的保留的时间。图表72显示表面滴加一滴水后对多孔硅片的分析。在这滴水中，每微升水含1纳克DNA。硅片分析之前，这滴DNA溶液在50℃烘干。图表74显示了多孔硅片中的氮含量，该硅片滴加有1滴如上浓度为每微升1纳克的DNA溶液，然后烘干，用去离子水在50℃漂洗。
从图中可以看出，图表72中比图表70显示了更多的氮含量。说明该检测测到了DNA，图表74显示洗涤步骤可以洗去一些，但非全部DNA，还有一部分DNA可能固定在多孔硅上，可以以后释放(在洗涤过程中)。
图8显示纯水洗后同一层的SIMS图。“老化的”多孔硅曾经在空气中滞留了一段时间，因为吸收了来源于空气中的氮的氧化物和氨，即共有的痕量污染气体，获得了氮背景。图表80为“老化的”的不含DNA的多孔硅片，图表82为含有一个水滴(无DNA)的老的多孔硅，图表84又一次显示了加了1纳克/微升的DNA溶液的并于50℃烘干的多孔硅片的分析比较。
图7,8所示的SIMS数据表明多孔硅可以可逆地结合DNA。
本发明或许可以被认为是用多孔硅(或多晶硅)作为转移物质进入活细胞的无机载体。
权利要求书
按照条约第19条的修改中国专利局PCT处：
我公司卷号：CPCH0063511P
申请人根据“专利合作条约第34条”的有关规定，对本国际申请的权利要求书和说明书作了如下修改：
原权利要求书：全文修改。
原说明书2-4进行了修改。
随函附上原权利要求书全文的替换页，共1页。3
随函附上原说明书的替换页，共3页。
请专利局在以上修改的基础上进行审查。此致
                    敬礼！
          中国专利代理(香港)有限公司化学部
          2001年1月16日具至少部分包括多孔硅以及将要转入细胞的物质。
优选多孔硅是可吸收的。这种工具可以包括多孔硅生物弹射子弹。这种工具包含可与被转移入细胞的物质共沉淀的物质。这种工具可以包括一个可导电的有生物活性的多孔硅电极。
基于本发明的第四个方面，本发明包括使用多孔硅作为转运物质进入细胞的工具。
现在发现多孔硅是生物相容的，并且多孔硅能侵入或被吸收入哺乳动物细胞，没有明显的有害效应。多孔硅可用于定位和固定化某些生物活性物质(或将转入细胞的物质)，这些物质一旦进入细胞就可以与细胞DNA结合，或者释放入细胞产生效应。
从PCT专利申请WO 96/10630可知有一种微型机器化的硅刺(barbs)或尖头(tips)的阵列来用于同时机械刺穿大量细胞的浆膜。这比用单针刺单个细胞有效的多，后者如需向上百个细胞导入物质将是一项非常工作量巨大的工作。事后看来，WO96/10630的尖头转移物质的效率很低。例如，在那份文件中设想的是利用紧密排列的尖头之间的表面张力来装载即将被转入细胞的物质，将它限制于尖头(探针)与底物之间。
1993年公开的US5 262 128中讨论了一个建议，并声称可以教本领域的技术人员使用Liga法生产硅针。据信这个文件在提交(及公开时)仍不可实施，因此对本发明的新颖性没有影响。在申请被提交的1989年，以及它被公开的1993年，本领域的普通技术人员还不能制造如文献中所讨论的非常细的中空硅针。Liga法不适合生产中空的硅针，也不能在产品中产生坡度结构。
US 5 457 041公开了一种使用有不齐尖头(ragged tips)的硅所制成的固体的针的阵列。
US 5 591 139公开了在一个硅圆片平面上形成硅微针。
WO 97/06101公开了生产生物活性硅圆片的方法，并暗示了生物活性硅在制备生物传感器和生物测定中的应用。
WO 92/01802公开了一种转移物质进入细胞的思路，即将待转移物质制成溶液，然后制成冰颗粒，加速这些颗粒以打入细胞，穿入细胞后冰颗粒融化。
JP06034361公开了一种多孔硅原子力尖头。该装置不穿透待成像的表面。
US4969468公开了与神经进行电接触的固体金属针。
基于另一个方面，发明包含细胞穿透元件(cell-penetratingmember)，或称用多孔硅制成的微穿刺器(mocropiercer)。
细胞穿透元件适于使用多孔硅携带即将转入细胞的物质。
基于另一个方面，本发明包含细胞穿透元件或微穿刺器，它们至少含一个区域的多孔硅。优选待转移的物质含DNA或RNA,DNA或RNA片段，或DNA或RNA的构建体。
细胞穿透元件或微穿刺器优选适于使用多孔硅携带即将转入细胞的物质。
当使用生物惰性物质如钛时，从它的运动性方面来看，多孔硅区域更适于固定化之。多孔硅区域一般位于细胞穿刺装置或细胞穿刺器的顶端，它一般是尖头或刺，无空腔，也可以是中间有通道的针。细胞穿刺装置或细胞穿刺器有一个从储液器到细胞穿刺装置或穿刺器表面物质传递区之间的孔道网络系统。
细胞穿刺装置或细胞穿刺器可以有一个多孔硅的外表，或者一个截面，至少它的尖头部分(若不是尖头，就是其他物质传递区域)是多孔硅的。一般而言，穿过细胞的细胞穿过元件细胞穿刺器的外表面都包含多孔硅。
细胞穿刺器或微穿刺器也许是带多孔硅外壳的大的硅微尖头。
将待转运入细胞的物质置于细胞穿刺器或微穿刺器本身的顶端而不是尖头之间的通道/空间的好处在于，物质可以确定地转入细胞，常是深入细胞。这会提高操作的成功率(在许多情况下，转运DNA进入细胞及DNA片段的稳定整合在统计上都不是非常成功，只有一定的成功百分率，这就是为什麽要对大量细胞进行注射的原因)。
除了使用多孔硅在尖头处来固定化物质以确保尖头上至少有少量待转移的物质外，其它方式也常使用。例如多晶硅在颗粒的边缘也可以携带物质。携带的方式可能包括多孔物质。
已知可以用穿过型基因感受器将DNA片段固定于大孔硅上(Advanees in GenosensorResearch.K.L.Beattie et al.Clin.Chem.41,700(1995))。
多孔硅的优点是其生物活性能通过调节其孔径大小及孔隙度而实现。因此生产带有特定大小孔径的的多孔硅尖头以承载/固定化特定的分子或物质的细胞穿刺器或微穿刺器是可能的。当然，这些物质不能被固定化得太厉害了，以致于当尖头在细胞内时，这些物质还不能离开尖头。
选择多孔硅作为制造细胞穿刺器或微穿刺器的材料还有另一个优势就是用硅组装小规模装置的微型机器生产技术已经存在，例如在电子产业中。
现在已知如何使硅的结构多孔化(例如US 5 348 618)。
细胞穿刺器或微穿刺器的阵列也可以被提供。这个阵列优选是n×m二维微尖头阵列。微穿刺器通常最好是网格排列，但也可能不必是这样。
也已经知道微尖头阵列还有一种完全不同的应用-真空微电子中应用的场放射阴极。这里一个5平方毫米的硅芯片将包括500个金字塔型的微尖头，基于选择不同的生产标准其宽度为50毫米至1微米，高为10-100微米。回过来看，这些将对多孔化和其后的用于微穿刺器转移物质进入细胞是很适合的。还知道已经有多孔硅金字塔形的阴极-例如
Field emisson from pyramidal cathodes coverd in poroussilicon P.R.Wilshaw et al.J.Vac.Sci.Techn.BI2,I(1994)；Fabrication of Si field emitters by forming poroussilicon.D.Kim et al.J.Vac.Sci.Tech.B14,1906(1996)；以及Porous silicon field emission cathode development.J.R.Jessing et al.J.Vac.Sci.Techn.B14,1899(1996)然而，这些是在完全不同的领域的应用，没有人显示微尖头可用于承载DNA,RNA或其他被转移入细胞的物质。
基于第3个方面所说，本发明包含生产微穿刺器的方法，该方法包括生产一个或多个微穿刺器投射(projections)以及在注射的头部或接近头部的地方驻留物质的方法。
优选该方法包括至少使投射(projections)的一部分多孔化。优选使投射(projections)的尖头或整个尖头的范围多孔化，或者在尖头的外面包一个多孔外壳。优选尖头是用HF阳极化技术进行多孔化。
基于另一个方面所说，本发明包含使物质进入细胞的方法，包括将物质连接到微穿刺器的尖头部分以及使用微穿刺器刺透细胞的方
权利要求书
按照条约第19条的修改
1．一种转移物质进入细胞的方法，包括使用多孔硅或多晶硅转移物质进入细胞。
2．权利要求1的方法，包括使用可吸收或可生物侵蚀的多孔硅或多晶硅。
3．权利要求1或2的方法，包括使用至少含有一小段多孔硅或多晶硅的微针。
4．权利要求3的方法，包括至少在针的尖部有多孔硅或多晶硅。
5．上述任一项权利要求的方法，包括使用下述微针：(1)该微针有一个多孔硅或多晶硅外壳；或(2)该微针基本上全部使用多孔硅或多晶硅制造；至少针的一部分长度由多孔硅制造。
6．上述任一项权利要求的方法，包括使用微针阵列，这些微针至少含有部分多孔硅或多晶硅。
7．上述任一项权利要求的方法，包括使用微针或微针阵列，其中微针都是中空的并含多孔硅或多晶硅，物质置于空腔中，或通过空腔传递。
8．上述任一项权利要求的方法，其中使用微针阵列，阵列包括许多由一个支持物上延伸出来的针，这些针全部或部分包含多孔硅或多晶硅，每一个针都有液流传递装置适于从基座向尖部传递液体，液流供应装置和液流传递装置相连，并提供液体注入针的基部。
9．权利要求3～8任意一项的方法，这些针都没有中孔腔，包含一个微穿刺器针，上面有多孔硅或多晶硅，多孔硅上带有待转移的物质。
10．权利要求1～9任意一项的方法，包括向针供应液体的孔道网络系统，该系统从储液池或管延伸道到针表面的物质供应区。
11．权利要求1或2的方法，该方法包含使用多孔硅或多晶硅生物生物弹射子道。
12．权利要求1或2方法，包括使用其上连接有物质的多孔硅或多晶硅，多孔硅或多晶硅以易于与另一种物质形成共沉淀且该沉淀易于被转入细胞的形式存在。
13．权利要求12方法，包含使用钙磷酸盐作为共同沉淀物。
14．权利要求1或2的方法，使用一个导电的生物活性电极，其中该电极至少包括一部分多孔硅或多晶硅并使用电穿孔法将物质转入细胞。
15．权利要求14的方法，其中细胞贴附于电极上。
16．前述任何一项权利要求的方法，其中物质包含DNA或RNA,DNA或RNA片段，或者DNA或RNA的构建体。
17．包含多孔硅或多晶硅的微针或微穿刺器。
18．权利要求17的微针，其上有管道。
19．权利要求18的微针，微针的通道从针的基部延伸到针的尖部。
20．权利要求17～19任一项的微针，其中至少有一部分针基本上完全由多孔硅或多晶硅制成。
21．权利要求17～20任一项的微针，其中至少针的一部分包括一层多孔硅或多晶硅的表面层。
22．权利要求17～21任一项的微针，其中有多孔或者毛细管的网络。
23．权利要求17～22任一项的含有微针或微穿刺器的针阵列，其中进一步包含将被运进细胞的物质。
24．权利要求23的针，其中物质通过多孔硅或结晶硅运载或保留在针上。
25．权利要求17～24任一项的针，它是可吸收的或可生物吸收的，或者至少部分是可吸收的或可生物吸收的。
26．从支持物上伸展出来的微针阵列，其上的微针符合权利要求17-25的要求。
27．一种入细胞的转移物质进入细胞的工具，这个工具包括至少部分多孔硅或多晶硅，以及即将转入细胞的物质。
28．权利要求27的工具，其中的多孔硅或多晶硅是可以吸收的。
29．权利要求27或28的工具，其中包括含有多孔硅或多晶硅的生物弹射子道。
30．权利要求29的工具，其中生物弹射子道基本上全部由多孔硅或多晶硅制成。
31．权利要求28或29的工具，其中包含在应用中可以和即将转移入细胞的共沉淀物共沉淀的物质。
32．权利要求28或29的工具，其中包含可导电的生物活性的多孔硅或多晶硅电极。
33．多孔硅或多晶硅作为入细胞的转移物质进入活细胞的介质的应用。

Claims (33)

1．一种转移物质进入细胞的方法，包括使用多孔硅转移物质进入细胞。
2．权利要求l的方法，包括使用可吸收或可生物侵蚀的多孔硅。
3．权利要求1或2的方法，包括使用至少含有一个区域多孔硅的微针。
4．权利要求3的方法，包括至少在针的尖部有多孔硅。
5．上述任一项权利要求的方法，包括使用下述微针：(ⅰ)有一个多孔硅外壳或(ⅱ)基本上全部使用多孔硅制造；或者至少针长度的一部分由多孔硅制造。
6．上述任一项权利要求的方法，包括使用微针阵列，这些微针包括至少部分多孔硅。
7．上述任一项权利要求的方法，包括使用微针或微针阵列。这些微针都是中空的，包括多孔硅，物质置于空腔中，或通过空腔传递。
8．上述任一项权利要求的方法，其中使用了微针阵列，该阵列包括许多从支持物上伸展的针，这些针全部或部分包括多孔硅，每一个针都有液流传递装置适于从基座向失部传递液体，液流供应装置和液流传递装置相连，并提供液体注入针的基部。
9．权利要求3～8任意一项的方法，这些针都没有中空腔，包含一个微穿刺器，上面有多孔硅，多孔硅上带有待转移的物质。
10．权利要求1～9任意一项的方法，包括向针或许多针供应液体的孔道网络系统，该系统从储液池或管道到针表面的物质供应区。
11．上述任一项权利要求的方法，该方法中，与在生物惰性物质如大体积钛上的移动性相比，多孔硅固定化物质。
12．权利要求1或2的方法，该方法包含使用多孔硅的生物弹射子道。
13．权利要求1或2的方法，包括使用其上连接有物质的多孔硅，多孔硅以易于与另一种物质形成共沉淀且沉淀易于被转入细胞的形式存在。
14．权利要求13的方法，包含使用钙磷酸盐作为共同沉淀物。
15．权利要求1或2的方法，包括使用一个导电的生物活性电极，该电极至少包括一部分多孔硅并使用电穿孔法将物质转入细胞。
16．权利要求15的方法，其中细胞贴附于电极上。
17．上述任意一项权利要求的方法，其中物质包含DNA或RNA,DNA或RNA片段，或者DNA或RNA的构建体。
18．包含多孔硅的微针。
19．权利要求18的微针，其上有管道。
20．权利要求19的微针，微针的通道从针的基部区域到针的尖部。
21．权利要求18～20任一项的微针，其中至少有一部分完全由多孔硅制成。
22．权利要求18～21任一项的微针，其中至少针的一部分包括多孔硅的外壳或者一层多孔硅的表面层。
23．权利要求18～22任一项的微针，其中提供了多孔或者毛细管网络。
24．权利要求18～23任一项的针阵列，其中包含将被运进细胞的物质。
25．权利要求24的针，物质通过多孔硅承载或留在针上。
26．权利要求18～25任一项的针，它是可吸收的或可生物吸收的，或者部分是可吸收的或可生物吸收的。
27．固定于基座上的微针阵列，其上的微针符合权利要求18-26的要求的。
28．转移物质进入细胞的工具，这个工具至少是一部分包括多孔硅，以及即将转入细胞的物质。
29．权利要求28的工具，其中的多孔硅是可以吸收的。
30．权利要求28或29的工具，其中包含多孔硅生物弹射子弹。
31．权利要求28或29的工具，其中包含在应用中可以和即将转移入细胞的物质共沉淀的物质。
32．权利要求28或29的工具，其中包含可导电的生物活性的多孔硅电极。
33．多孔硅作为转移物质进入活细胞的介质的应用。
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