CN1245503A

CN1245503A - 油体及结合蛋白质作为亲和基质

Info

Publication number: CN1245503A
Application number: CN97181507A
Authority: CN
Inventors: M·毛勒尼; J·布斯; G·范路易简
Original assignee: SemBioSys Genetics Inc
Current assignee: SemBioSys Genetics Inc
Priority date: 1996-12-16
Filing date: 1997-12-05
Publication date: 2000-02-23
Anticipated expiration: 2017-12-05
Also published as: CN1325513C; ES2259193T3; IL130403A0; US5856452A; JP2001506241A; DE69735599D1; ATE321777T1; JP3833719B2; EP1007554B1; US20030096320A1; AR010780A1; TW589322B; EP1007554A1; CA2275489A1; KR100421935B1; JP2006306881A; ZA9711237B; US7332587B2; NZ336558A; US6509453B1

Abstract

描述了一种从混合物中分离目标分子的方法。该方法使用油体和它们的结合蛋白质作为亲和基质用于所选择性地非共价结合所需的目标分子。油体蛋白可以基因融合至对预期目标分子有特异性的配体上。天然的油体蛋白也可以与油体蛋白特异性配体,例如抗体或油体结合蛋白质一起使用。该方法使得可以根据油体和水溶液密度之间的差异分离和回收所需的目标分子。

Description

油体及结合蛋白质作为亲和基质

发明领域

本发明涉及用油体及其结合蛋白质作为亲和基质从样品中分离和纯化目标分子。

发明背景

在生物技术普遍领域内，从复杂的来源(例如活细胞、血清或发酵液)中有效分离和纯化分子的能力非常重要。在工业和科研实验室(在此，例如，要用纯化或部分纯化的蛋白质)中的应用很多，并且已有文献很好证明。参考，例如，R.Meadon和G.Walsh，生物技术进展1994，12：635-646页。

大部分目前用于分离分子的技术利用了所关心的分子自身的物理和化学性质。基于亲和力的纯化技术的独特性在于它们利用了能形成亲和对的两种分子间的高度特异的生物识别。亲和对中两个个体的结合在几乎所有情况中都是由于比较弱的化学相互作用，称为非共价键。本领域公认和普遍使用的亲和对包括抗体及其抗原结合物、核酸结合蛋白质和核酸、脂质结合蛋白和脂质，植物凝集素和糖类、链霉抗生物素蛋白/生物素复合体、蛋白A/免疫球蛋白G复合体以及受体和它们的结合分子。

通常，亲和纯化过程要求亲和对中的一个成分固定在固体底层或基质上，该底层或基质在亲和对中另一个成分所存在的液体中不溶。亲和对中结合在基质上的分子种类通常称为配体，而溶解在液体中的成分通常称为目标成分。但是，注意到这些定义并不是严格化学意义上的限定这一点是很重要的。大部分通用配体固定技术依赖于物理或化学方法。配体固定化物理方法包括配体吸附或俘获到合适的支持物上，而化学固定方式的特点在于在配体和基质间形成强大交联或共价结合。对实现固定化的方式有一个要求，即固定化操作对亲和对成分间相互识别的能力应没有不利影响。

现有的配体固定物理和化学技术的缺点之一是常常比较费时、昂贵。这主要是因为固定技术要求分别生产基质材料和配体，并必须在随后的步骤中将它们偶联。美国专利第5474925号公开了一种固定蛋白质的替代方式，该专利阐明了一种用于固定棉花植物纤维中的酶的生物学生产系统。据称，这份专利首次公开了一种生物学方法产生的酶固定系统，能一步生产基质和配体。

配体在基质上固定后，可以采用许多基于亲和力的纯化技术，以实现亲和力固定的配体和目标成分间的选择性结合。现有技术已知的基于亲和力的纯化技术包括灌注亲和层析，亲和排阻层析，超扩散亲和层析，亲和沉淀，膜亲和分配，亲和交叉流超滤和亲和沉淀。在最广泛使用的基于亲和力的纯化技术-亲和层析中，含有配体的基质被包裹在或填装在层析柱的内部。然后将含有目标成分的复杂混合物上样到层析柱中。理想地，只有特异识别配体的目标分子以非共价方式结合到层析柱上，而样品中所有其它种类的分子均流过柱子。

在亲和分配中，采用两种密度有相当差别的溶液。将含有目标成分的复杂溶液与含有亲和配体的密度不同的溶液混合。混合后，溶液静置以便形成两个分离相。分子将按照大小、电荷和与形成相的溶液的特异相互作用而在两相间有差异地分配。结合配体的目标蛋白质选择性地分配到含有亲和配体的相中。例如，Coughlin和Baclaski在生物技术进展(1990，6：307-309)中报导用含生物素的有机溶液异辛烷将抗生物素蛋白从水溶液中转移到异辛烷溶液中。但是，迄今亲和分配的应用一直受到限制，这主要是由于缺少合适的、能用于两相系统中进行特异分配的亲和基质物质。

生物技术商业发展的一个重要因素是生物产品的纯化，它通常占总成本的50％或以上(Labrou，N.和Clonis，Y.D.，生物技术杂志36：95-119(1994))。许多蛋白质纯化步骤依赖于柱类型分离过程。更具体地说，大规模高度分离技术例如柱层析或成批类型的蛋白质纯化技术花费高。另外，粗样本不太适合进行柱层析或成批分离，因为杂质可能会损坏沉积的树脂并堵塞柱子。因此，经常只在要求较高纯度、蛋白质以极稀浓度存在或需要高价值蛋白质(例如诊断和治疗蛋白质)时，才在纯化方法的较后阶段中应用亲和基质。Labrou，N.和Clonis，Y.D.在生物技术杂志36：95-119(1994)综述了这些和其它有关生物技术方法中使用亲和技术的课题。

本领域需要开发从复杂混合物中分离和纯化生物产品的新的、经济的方法。本发明人已发现，在这方面，可以使用亚细胞油储存结构(称为油体)和它们的结合蛋白质。

发明概述

本发明涉及生产亲和基质的一种新型多用途生物系统。本发明人发现油体及其结合蛋白质可以作为亲和基质，用来从样品中分离多种目标分子，例如蛋白质、糖类、脂质、有机分子、核酸、金属、细胞和细胞组分。

根据本发明，提供了一种从样品中分离目标分子的方法，该方法包括：1)使能直接或间接结合目标分子的i)油体与ii)含有目标分子的样品接触；和2)从样品中分离结合了目标分子的油体。油体和含有目标分子的样品进行接触的方式能有效保证油体和目标分子结合。优选地，油体与目标混合在一起。如果需要，可以进一步将目标分子与油体分离。

一方面，目标分子对油体或油体蛋白有亲和力，或可与其直接结合。这种目标的例子包括抗体或可结合油体的其它蛋白质。

另一方面，可以用配体分子将目标分子和油体结合在一起。

在一个实施方案中，配体对油体或油体蛋白有天然的亲和力。在一个具体实施方案中，配体是可结合油体蛋白的抗体。这种抗体可以用来分离对配体抗体(例如，抗IgG抗体或蛋白A)有亲和力的目标分子。也可以制备对油体蛋白和目标分子都有结合特异性的二价抗体。也可以将抗油体蛋白的抗体与对目标分子有亲和力的第二配体融合。

在另一个实施方案中，配体被共价连接到油体或油体蛋白上。一个实施方案中，配体是经化学方式与油体蛋白缀合的蛋白质，或以与油体蛋白形成的融合蛋白的形式产生的蛋白质(如WO96/21029所述)。后一种情况下，融合蛋白质被靶向并表达于油体上。在一个实施例中，与油体蛋白融合的配体可以是水蛭素，可以用来纯化凝血酶。在另一个实施例中，与油体蛋白融合的配体可以是金属硫蛋白，可以用来从样品中分离镉。在又一个实施例中，与油体蛋白融合的配体可以是蛋白A，可以用来分离免疫球蛋白。在又一个实施例中，与油体蛋白融合的配体可以是纤维素结合蛋白质，可以用来从样品中分离纤维素。

另一个实施方案中，配体可以与油体共价结合。例如，配体可以是小的有机分子象生物素。生物素化的油体可以用来从样品中分离抗生物素蛋白。

本发明还包括可用做亲和基质的改性油体。相应地，本发明包括一种组合物，它包含结合了例如配体分子或目标分子之类分子的油体。一个实施方案中，该组合物包含共价结合了配体分子(如生物素)的油体。

本发明还包括用于从样品中分离目标分子的亲和基质，其中包含能结合目标分子的油体。亲和基质另外可以包括与油体结合的配体分子，其中的配体分子能结合目标分子。

根据以下的详细叙述和附图，本发明其它主题、特性和优点是显而易见的。但应该明白，发明详述和相关的实施例仅是举例说明，落在本发明范围内的另外的各种变化和修饰对本领域技术人员是显然的。另外，各种出版物、专利和专利申请在此全文引做参考文献。

附图简述

图1：拟南芥(Arabidopsis thaliana)18KD油质蛋白的核苷酸序列和推知的氨基酸序列(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)。

图2：拟南芥油质蛋白-水蛭素融合蛋白序列。图示是部分油质蛋白基因组序列(碱基1-1620如Van Rooijen等1992，植物分子生物学18：1177-1179的报导)，间隔序列(碱基1621-1635，加下划线)和合成的编码成熟水蛭素变体-2异构体的DNA序列(碱基1636-1833，斜体)。该融合基因由拟南芥油质蛋白5’上游区(碱基1-861)和胭脂氨酸合成酶终止序列(碱基1855-2109)调控。序列见SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。

图3构建含有完整油质蛋白-水蛭素构建体的pCGOBHIRT的概要步骤。

图4油质蛋白-水蛭素融合蛋白在油体上的构象和凝血酶结合的示意图。

图5从野生型和转化了表达油质蛋白-水蛭素融合蛋白的构建体的4A4油体基质进行NaCl洗脱凝血酶的曲线。

图6用抗油质蛋白抗体作为配体纯化缀合了辣根过氧化物酶的抗IgG抗体。结合在油体上的油质蛋白/抗油质蛋白/抗IgG三明治复合体(sandwich complex)的构象示意图。

图7说明抗IgG抗体与复合了初级抗油质蛋白抗体作为配体的野生型油体的特异结合(左)，以及抗IgG抗体与在结合二级抗体前未与初级抗体复合的油体的结合(右)。

图8油质蛋白金属硫蛋白融合体序列。图示是蔓菁(B.napus)油质蛋白cDNA编码序列(碱基1092-1652，Van Rooijen，1993，University of Calgary，博士论文)，间隔序列(碱基1653-1670，加下划线)和人金属硫蛋白基因mt-II(碱基1671-1876，Varshney和Gedamu，1984，基因31：135-145)。该融合基因由拟南芥油质蛋白启动子(碱基1-1072)和遍在蛋白终止序列(碱基1870-2361，ubi3’，Kawalleck等，1993，植物分子生物学21：673-684)调控。序列见SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7。

图9构建含有完整油质蛋白-金属硫蛋白构建体的pBIOOM3’的简要步骤。

图10油质蛋白-金属硫蛋白融合蛋白在油体上的构象和镉离子结合的示意图。

图11图解说明镉与来自野生型B.carinata种子和转化了表达油质蛋白-金属硫蛋白融合蛋白之构建体的B.carinata种子的油体基质的结合(A)和洗脱(B)。图中给出了结合镉的油体占从转基因和非转化种子收获的油体的百分比。条形图代表5次重复实验(结合)和3次重复实验(洗脱)的平均值。

图12：显示表达蛋白A的金黄色葡萄球菌细胞与经不同量抗油质蛋白IgG处理过的油体的结合。条形图代表在用不同量IgG(加入0，3，30，100μl IgG)按实施例5所述步骤处理之后读取的OD₆₀₀。

图13：扩增金黄色葡萄球菌蛋白A所用的寡核苷酸引物(序列见SEQ ID NO：8；蛋白质序列见SEQ ID NO：9)。图中显示了引物BK266，5’C TCC ATG GAT CAA CGC AAT GGT TTA TC3’(SEQ ID NO：10)，NcoI位点(斜体)和与载体pRITZ2T(Pharmacia)中所含蛋白A基因一部分相同的序列(加下划线)。还显示了引物BK267，5’GCAAG CTT CTA ATT TGT TAT CTG CAG GTC3’(SEQ ID NO：11)，HindIII位点(斜体)，终止密码子(粗体)及与pRIT2T(Pharmacia)所含蛋白A基因一部分互补的序列(加下划线)。PCR产物用NcoI和HindIII消化，并连接到已去除NcoI-GUS-HindIII片段的pCGNOBPGUSA(Van Rooijen和Moloney，1995，植物生理学109：1353-1361)中。

图14：拟南芥油质蛋白-蛋白A融合基因序列(见SEQ ID NO：12，蛋白质序列见SEQ ID NO：13和14)。图示为部分油质蛋白基因组序列(碱基1-1626，如Van Rooijen等，1992植物分子生物学18：1177-1179报导)，编码凝血酶切割位点的间隔序列(碱基1627-1647，加下划线)和编码蛋白A的DNA序列(碱基1648-2437，斜体)。基因表达由拟南芥油质蛋白5’上游区(碱基1-867)和胭脂氨酸合成酶终止子区(碱基2437-2700)进行调控。

图15：油质蛋白-蛋白A融合蛋白在油体上的构象和免疫球蛋白结合的示意图。

图16：显示缀合了HRP的小鼠抗兔抗体与油体蛋白提取物结合的Western印迹，这种蛋白质提取物来自表达油质蛋白-蛋白A融合蛋白的转基因蔓菁系。在用缀合了HRP的抗体进行探查的Western印迹上，显示的油体蛋白提取物分别来自表达油质蛋白-蛋白A融合蛋白的转基因系opa30(第3道)，opa31(第4道)，opa34(第5道)，opa36(第6道)，opa47(第7道)，opa93(第8道)，和未转化的蔓菁系对照(第9道)以及用表达蛋白A之pRIT2T转化了的大肠杆菌DH5α的裂解物(第2道)和未转化的大肠杆菌DH5α的裂解物(第1道)。

图17：图解说明IgG与从野生型蔓菁(bn wt)和表达油质蛋白-蛋白A融合蛋白之转基因蔓菁系分离得到的油体的结合和洗脱。误差条形图代表4次独立实验的结果。

发明详述

正如前面提到的，本发明涉及一种利用油体及其结合蛋白质的新型生物亲和基质系统。该亲和基质适合用于从样品中高效分离特定的目标分子，包括蛋白质、糖类、脂质、核酸、细胞和亚细胞器，金属和离子。

本发明提供的从样品中分离目标分子的方法包含：1)使能直接或间接结合目标分子的(i)油体与(ii)含有目标分子的样品接触；和2)从样品中分离结合了目标分子的油体。油体和含有目标分子的样品进行接触的方式能有效保证油体和目标分子的结合。优选地，将油体与目标物质混合。用可以结合油体和目标分子两者的配体分子可以达到油体与目标分子的间接结合。这样，配体将油体与目标分子桥接或连接在一起。如果需要，可以进一步将目标分子与油体和配体(如果存在的话)分离。

以下按顺序讨论亲和基质的各个成分。

目标物

文中所用术语“目标物”表示想从样品(如生物混合物)中纯化、离析或分离的所需分子。对于可以获得配体的任何目标物或者能直接连接或结合油体或油体蛋白的任何目标物，这一技术差不多都可以使用。可能的配体/目标物对包括，但不限于：蛋白质亚基/亚基结合，抗体/抗原，受体蛋白/信号分子，核酸结合蛋白/核酸，植物凝集素/糖类，脂质结合蛋白质/脂质，离子结合蛋白质/离子，表面抗原决定基配体/细胞或细胞器。目标物可以得自任何天然来源，或者可以化学合成得到。如果目标物是蛋白质或核酸之类的大分子，也可以用合适的表达系统(如细菌、酵母、植物、昆虫、哺乳动物等)以重组的形式产生。

配体

文中所用术语“配体”表示与目标分子和油体或油体蛋白均能够结合的分子(以下讨论)。本文所用术语“与…结合”包括配体与油体或目标分子的共价和非共价结合。例如，配体分子可以与油体共价连接并与目标分子非共价结合(反之亦然)，或者，配体可以是与油体和目标分子均非共价结合。配体可以是任何能够桥接油体或油体蛋白与目标分子的分子，可以包括蛋白质、核酸、糖类或小有机分子。配体可以包含两种分子，即结合油体的第一分子和结合目标物的第二分子，其中第一分子和第二分子相互结合在一起。

用于这种方法的亲和配体蛋白质可以来源于天然存在的已知配体对，如上述列举的那些。可选择地，可以通过筛选从细胞或生物体提取的蛋白质获得配体，化学合成得到配体，或者由包含组合肽序列、抗体或表达DNA序列的文库产生。

一个实施方案中，配体对油体或油体蛋白有天然的亲和力。例如，配体可以是对油体蛋白有亲和力的蛋白质(如抗体)。配体也可以是对油体或油体蛋白有天然亲和力的非蛋白质的分子。这种能结合油体或油体蛋白的配体可以与能结合目标分子的第二分子结合。例如，配体分子可以是缀合了抗生物素蛋白的抗体，能用来从样品中纯化生物素。

另一个实施方案中，配体通过化学或重组手段共价连接到油体或油体蛋白上。制备融合体或缀合物的化学手段是本领域已知的，可以用于制备配体-油体蛋白融合蛋白。用来将配体和油体缀合的方法必须能够将配体与油体蛋白连接起来而不影响配体与目标分子结合的能力。在一个实施例中，配体可以是共价结合到油体上的小有机分子(象生物素)。生物素化的油体可以用于从样品中分离抗生物素蛋白。本发明还包括可用作亲和基质的改性油体，象生物素化的油体。相应地，本发明包括含有结合了诸如配体或目标分子之类分子的油体的组合物。

在一个优选实施方案中，配体是一种蛋白质，可以用本领域的熟知技术将它与油体蛋白缀合。现有几百种交联剂能将两种蛋白质缀合在一起。(例子可参见“蛋白质缀合和交联化学”，1991，ShansWong，CRC Press，Ann Arbor)。通常根据配体上带有的或插入的反应活性官能团选择交联剂。另外，如果没有反应活性基团，则可以用光敏交联剂。在某些情况下，在配体和油体蛋白之间加入一个间隔子可能是有用处的。本领域已知的交联剂包括同型双功能试剂：戊二醛，二甲基己二酰亚胺(dimethyladipimidate)和双(重氮基联苯胺)，和异型双功能试剂：间马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺和磺基间马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺。

可以用重组DNA技术制备配体蛋白-油体蛋白融合蛋白。在这种情况中，将编码配体的DNA序列与编码油体蛋白的DNA序列融合在一起，产生表达配体-油体蛋白融合蛋白的嵌合DNA分子(以下更详细地讨论)。为了制备重组融合蛋白，编码配体的DNA序列必须是已知的或能得到的。“能得到的”意味着能从已知的氨基酸序列推断出足够编码蛋白质配体的DNA序列。如果编码蛋白质配体结合结构域的亚序列已知，就不必使用配体的全部基因序列。因此，配体可以包括所考虑的特定配体蛋白质的完整序列或其中的结合结构域。

如果所需配体的DNA序列是已知的，则可以用寡核苷酸合成仪化学合成该基因。可选择地，可以用标记的互补DNA序列进行探查，从含有该基因的cDNA或基因组文库得到携带配体基因的克隆。也可以用基因特异的寡核苷酸引物和PCR从文库中特异扩增该基因。如果所需配体的DNA序列是未知的，则可以通过蛋白质N-末端测序得到它的部分氨基酸序列(Matsudaira 1987，生物学化学杂志262：10035-10038)。可以根据由这一氨基酸序列推断出的DNA序列合成标记探针，并用于筛选上述cDNA或基因组文库。也可以用针对该蛋白质配体产生的抗体或用目标蛋白质作为探针，从cDNA表达文库鉴定携带该基因的克隆。

也可以通过目标物探查蛋白质混合物而发现配体。目标物可以被固定在支持基质上，用于对从细胞和组织提取的或者化学合成的蛋白质进行筛选。配体蛋白质和固定的目标物结合后，将基质从溶液中分离，清洗。随后从基质中洗脱下蛋白质配体，如上述确定其序列。可选择地，可以用固定化的目标物筛选由噬菌体展示产生的重组蛋白质文库，如含有组合肽序列(Smith，1985，科学228：1315-1317)或者抗体谱(Griffiths等，1994，EMBO杂志13：3245-3260，Nissim等，1994，EMBO杂志13：692-698)的文库。这种情况中，蛋白质配体和目标分子间的结合能够保证从编码非结合蛋白质的大量复杂噬菌体群体中分离和回收表达配体的噬菌体。还可以用双杂交系统(如酵母中的那种，Fields和Sternglanz，1994，Trends Genet.10：286-292)，从表达的cDNA文库中鉴定配体。这里，构建了目标蛋白质编码序列和DNA结合蛋白质编码序列间的融合基因。用来自其中序列已与转录激活因子序列融合之cDNA文库的构建体转化含有这个构建体的细胞。来源于cDNA文库的配体和目标蛋白质之间的结合使报告基因能够转录。再回收得到表达配体的克隆。

为了特异地找出油体的配体，在上述每种方法中都可以用完整或部分的油质蛋白作为目标分子。可选择地，有可能利用完整的油体筛选蛋白质提取物，合成肽或噬菌体展示文库。这种情况中，油体既作为目标物又作为固定基质。用这种方法，可以找到更多的对油质蛋白和位于油体上的其它表位都有亲和力的配体。

油体和油体蛋白

油体是小的圆形亚细胞器，其中包裹着许多植物作为能量储备的三酰甘油酯。尽管在多数植物和不同的组织中都有发现，但它们在油籽类植物的种子中特别丰富，直径大小从低于1微米到几个微米。油体含有三酰甘油酯，周围环绕着磷脂半单位膜，其中嵌有称为油体蛋白的独特蛋白质。文中所用术语“油体”包括位于完整结构内的三酰甘油酯、磷脂或蛋白质诸成分中的任何形式或全部种类。文中所用术语“油体蛋白”表示天然存在于油体中的蛋白质。在植物中，多数油体蛋白定义为油质蛋白。已对来自许多种植物(包括玉米、油菜籽、胡萝卜和棉花)的油质蛋白进行了克隆和测序。油质蛋白显示含有三个结构域，此蛋白质的两个末端，N-和C-端，主要是亲水性的，位于油体朝向胞质溶胶的表面，而油质蛋白的高度疏水的中央核心牢固地锚定在膜和三酰甘油酯中。来自不同物种的油质蛋白组成的一小族蛋白质显示有相当的氨基酸序列保守性，特别是在蛋白质的中央区域。在单个种内，可能会存在少数不同异构体。

来自各个物种的油体呈现大体一致的大小和密度，这部分取决于蛋白质/磷脂/三酰甘油酯的精确组成。因此，可以将它们简单快速地与它们悬浮其中的不同密度液体分离开。例如，在密度大于油体的含水介质中，由于受到重力或施加的离心力的影响，它们会漂浮在上面。在密度小于油体的95％乙醇中，同样的条件下它们会发生沉积。还可以用基于大小进行分级分离的方法将油体与溶液或悬液中的液体和其它固体分开。例如，蔓菁的油体很小，直径接近0.5μm，因此，可以用孔径小于这一直径的滤膜，将其与更小的成分分开。

优选本发明的油体来自种子植物，更优选来自以下植物种类：thale cress(拟南芥)，油菜籽(芸苔属各种)，大豆(Glycine max)，向日葵(Helianthus annuus)，油棕(Elaeis guineeis)，棉籽(棉属各种)，落花生(Arachis hypogaea)，椰子(Cocus nucifera)，蓖麻(Ricinus communis)，红花(Carthamus tinctorius)，芥子(芸苔属各种和欧白芥)，胡荽(Coriandrum sativum)，亚麻籽/亚麻(Linumusitatissimum)，和玉米(Zea mays)。采用本领域公知的农业栽培技术培养植物并使其结籽。收获种子，并去除石头等异物或种壳(例如过筛)后，优选将种子干燥，随后进行机械压榨、研磨或粉碎处理。从粉碎的种子部分得到油体部分可以选用利用油体部分和水性部分之间密度差异的分离技术，如离心，或者用基于大小排阻的分离技术，如膜过滤，或者两者结合使用。通常，在5倍体积冷的含水缓冲液中彻底研磨种子。有多种缓冲液可供使用，只要缓冲液中不含高浓度的丙酮、二乙醚等强有机溶剂即可(这些溶剂可能会破坏油体)。加入0.4-0.6M蔗糖可以提高研磨缓冲液的溶液密度，以利于以下所述的清洗。通常研磨缓冲液中还含有0.5M NaCl，这样有助于去除非整合性地结合在油体表面的可溶性蛋白质。

研磨后，离心匀浆物，得到颗粒和不溶物质的沉淀，含有种子可溶性成分的水相，以及包含油体及其结合蛋白质的表层。从表面撇出油体层，完全重悬于一体积的新鲜研磨缓冲液中。比较重要的是，应使油体团聚物尽可能地分散开，以便保证在后续的清洗步骤中有效去除杂质。将重悬的油体制剂分层置于低密度的浮选溶液(如水、含水缓冲液)下并离心，再次分离油体与水相。洗涤过程通常至少重复三次，这样处理之后，油体中已基本上无污染的可溶性蛋白质(经凝胶电泳可测知)。不必去除全部水相，可以向最终的制剂中加入水或50mM Tris-HCl(pH7.5)，也可按需要将pH降到pH2或升高到pH10。Murphy D.J.和Cummins I.，1989，植物化学28：2063-2069和Jacks T.J.等，1990，JAOCS，67：353-361文中有从油籽中分离油体的方案。本说明书实施例1详细描述了一种优选方案。

本发明还可以使用植物来源以外的油体。曾报导的功能等同于植物油体和油质蛋白的系统有细菌中的(Pieper-Furst等，1994，细菌学杂志176：4328)，藻类的(Rossler P.G.1988，生理学杂志(London)24：394-400)和真菌的(Ting J.T.等，1997，生物学化学杂志272：3699-3706)。来自这些生物体的油体，以及本领域技术人员可能在其它活细胞中发现的油体都可以用于发明。

亲和基质

如上文所述，本发明提供了从样品中提纯目标分子的一种新的亲和基质系统。在一个实施方案中，亲和基质包含能结合样品中的目标分子的油体。在这种实施方案中，目标分子可以是能结合油体蛋白的抗体。另一个实施方案中，亲和基质包含油体或油体蛋白，以及与油体或油体蛋白结合在一起并对目标分子有亲和力的配体。在这种实施方案中，配体可以是非共价或共价结合于油体或油体蛋白上(如上所述)。

本发明的一个优点在于可以通过与油体非共价结合、随后分离油体而从样品中纯化或提取目标物质。许多不同的油体-配体构型都是可行的。对特定配体蛋白质有天然亲和力的目标分子(如水蛭素对凝血酶或者重金属对金属硫蛋白)，可以用含有融合到油质蛋白上的该配体的油体进行纯化或分离。可选择地，可以通过将目标分子与油体特异的配体融合，或者与和油质蛋白融合的配体互补的配体融合，再用油体亲和基质纯化或分离蛋白质目标分子。如果需要，可以在配体和目标蛋白质之间加上蛋白酶识别位点或化学裂解位点，以便在纯化时能从目标蛋白质上通过蛋白水解去除配体。还可以构建多价配体，如二价单链抗体，其中配体的一个结构域对油体有亲和力，其它结构域对目标分子有亲和力。这种情况下，油体和目标分子都不需要与配体共价融合。同样，可以用配体多联体来增强基质对目标分子的亲和力，或者在需要时将配体序列突变来调节它对目标的亲和力。另外，可以将不同配体的混合物进行融合以同时回收/提取不同种类的目标分子。还可以构建不同配体间的融合体，以在不同种类目标分子间或目标分子和油体亲和基质间形成桥接。还可以象锌离子在多聚组氨酸序列间形成桥接那样，通过在配体间或配体和目标序列间形成桥接来实现与亲和基质的结合。

使用油体亲和基质具有几个优点，这些优点使它们成为有吸引力的纯化手段。由于上述不同构型设计具有的机动性，可以构建最合乎特定目标分子需要的基质。还有，利用种子天然生物加工过程中的一部分生产基质是非常合算的，因为不需要纯化和固定配体。就油质蛋白-配体融合体而言，油质蛋白在细胞内的寻靶使配体固定在油体上，而在复杂的混合物中，油体特异的配体将与基质自然结合。配体自然固定在基质上还有的优点在于它能省去可能会危害配体对目标分子的亲和力的化学交联。最后，油体亲和基质为特别是大规模操作提供了一种独特的有吸引力的纯化选择。它能通过浮选将基质以松散的悬浮物形成分离出来，因此可以应用于含有大量微粒杂质的原材料，要不然的话，含有如此大量微粒杂质的原材料将是很难处理的。这些杂质的存在经常会弄脏并堵塞柱子或者分批悬浮液中的常规固体基质，限制了它们在纯化加工早期阶段的应用。

正如前面提到的，在本发明的一个实施方案中，配体蛋白质序列与油体蛋白基因化融合在一起。为了制备这种基因融合体，先制备编码油体蛋白-配体融合蛋白质的嵌合DNA序列，它含有a)编码足够使融合蛋白质靶向油体的油体蛋白部分的DNA序列；b)编码足够结合目标分子的配体蛋白质部分的DNA序列。发明人已经确定，通常情况下，油体蛋白的N-末端和疏水核心足够使融合蛋白质靶向油体。具体来说，就来自植物拟南芥的油质蛋白而言，氨基酸2到123在这方面是足够的。

可以将配体融合到油质蛋白的N-和/或C-末端。在配体和油质蛋白间构建一个内部融合或者将配体融合到两个油质蛋白之间也是可能的。可以将编码融合了配体的油体蛋白的嵌合DNA序列转染到合适的载体中，用于转化植物。通常使用两类载体。第一类载体用于构建体的基因工程和组合，其通常含有诸如可见于pUC族载体之类中的骨架，使得能够在易于操作和维持的革兰氏阴性细菌(如大肠杆菌)中复制。以Ti和Ri质粒为代表的第二类载体具有DNA转移功能，当需要将构建体导入植物并通过农杆菌介导的转化稳定地整合到植物的基因组时，即可使用这类载体。

按5’到3’方向，典型的构建体由末尾是能指导在植物中表达(优选种子特异性表达)的启动子的调控区、蛋白质编码区和一段含有在植物中有功能的转录终止信号的序列组成。

可以使用非种子特异性启动子(如35-S CaMV启动子，Rothstein等，1987，基因53：153-161)和种子特异性启动子[如云扁豆蛋白启动子(Sengupta-Gopalan等，1985，PNAS USA82：3320-3324)；或拟南芥18kDa油质蛋白启动子(Van Rooijen等，1992，植物分子生物学18：1177-1179)]。除了启动子，调控区还含有保证转录物在植物中翻译的核糖体结合位点，也可以含有一或多个增强子序列，如AMV前导序列(Jobling和Gehrke，1987，自然325：622-625)，以提高产物的表达。

构建体的编码区通常包含与油质蛋白读框一致地融合的编码配体的序列，该序列以转录终止密码子结束。编码油质蛋白的序列可以含有足以编码能正确靶向油体并在油体上稳定表达的蛋白质的任何天然或合成DNA序列或其部分序列。这种序列特征的详细描述先前已有报导(Moloney，1993，PCT专利申请WO93/21320，此处引作参考文献)。序列内还可以包括内含子。因此，配体编码区可以含有上述配体序列中的任何单个序列或者组合。如果需要，可以在配体和目标蛋白质之间加上蛋白酶或化学识别位点，以便纯化时能从目标蛋白质上蛋白水解去除配体。

带有转录终止信号的区域可以包含诸如胭脂氨酸合成酶终止序列之类在植物中有功能的任何这种序列，另外还可以包括增强子序列，以提高产物的表达。

通常用常规方法将构建体的各个成分连接到基于pUC的载体内。然后可以用以下概括的转化步骤，将构建体导入农杆菌载体中，再导入宿主植物内。

将DNA导入宿主细胞有多种技术可供选用。例如，可以用标准农杆菌载体，通过如Moloney等(1989，Plant Cell Rep.8：238-242)或Hinchee等(1988，Bio/Technol.6：915-922)描述的转化方案，或者本领域已知的其它技术，将嵌合DNA构建体导入来自双子叶植物(例如烟草)和产油种类(如蔓菁)的宿主细胞。例如，在植物细胞转化中使用T-DNA已得到广泛的研究，详细描述见于EPA丛书No.120,516；Hoekema等，1985，《二元植物载体系统》第5章，Offset-drukkerij Kanters B.V.，Alblasserdam；Knauf等，1983，农杆菌表达宿主的基因分析，《细菌-植物相互作用的分子遗传学》245页，Puhler A.Springer-Verlag，NY.和An等，1985，(EMBO杂志4：277-284)。与根癌农杆菌或毛根农杆菌一起培养外植体可以方便地将转录构建体转移到植物细胞中。被农杆菌转化后，将植物细胞分散在合适的培养基中进行筛选，相继得到愈伤组织、苗和最终的植株。农杆菌宿主应携带含有T-DNA向植物细胞转移所必需的vir基因的质粒。为了进行注射和电穿孔(见下文)，可以将去臂的Ti质粒(缺少肿瘤基因，具体说是T-DNA区域)导入植物细胞。

用非农杆菌技术能使本文所述构建体在多种单子叶和双子叶植物及其它生物体中实现转化。这些技术对于在农杆菌转化体系中难处理的物种尤其有用。基因转移的其它技术包括biolistics(Sanford，1988，生物技术进展6：299-302)，电穿孔(Fromm等，1985，美国国家科学院学报82：5824-5828；Riggs和Bates，1986，美国国家科学院学报83：5602-5606)或PEG-介导的DNA摄入(Potrykus等，1985，分子普通遗传学199：169-177)。

在一种特定应用中，例如导入蔓菁内，被靶向以获得重组DNA构建体的宿主细胞通常应来源于Moloney等(1989，Plant CellRep.8：238-242)描述的子叶叶柄。其他使用商品油籽的例子包括在大豆外植体中进行子叶转化(Hinchee等，1988，生物/技术学，6：915-922)和棉花的茎转化(Umbeck等，1981，生物/技术学，5：263-266)。

转化后，将细胞(例如作为叶盘)在选择培养基上培养。一旦长出小苗，即将其切下并置于生根培养基中。待形成足够的根后，将植物转移到土壤中。检测推断的转化植物中是否存在标记基因。用合适的探针(例如拟南芥油质蛋白基因)对基因组DNA进行Southern印迹，分析目的序列是否已整合到宿主细胞基因组中。

为了在植物细胞中进行挑选，通常要给表达盒连接上一个标记。标记可以是对除草剂(如膦丝菌素或草甘膦)的抗性，或更特别是对一种抗生素(例如卡那霉素、G418、博莱霉素、潮霉素，氯霉素等)的抗性。采用的特定标记应该是这样一种标记，即与缺少所导入的重组DNA的细胞比较，这种标记能使得将转化细胞选择出来。

如上构建的表达盒中的融合肽优选至少在发育着的种子中表达。相应地，可以使依照传统方法培养的转化植物结籽。参见例如McCormick等，1986，植物细胞报告，5：81-84。可以用合适的基因探针，对从预期会发生转录的组织(如种胚)分离获得的RNA作Northern印迹。然后可以对转录物的大小与融合蛋白质转录物的预期大小进行比较。

然后从种子分离油体蛋白，并进行检测，以确定融合肽已表达。检测可以通过例如SDS-PAGE进行。可以用针对融合肽之油质蛋白部分的抗体检测融合肽。将得到的融合肽的大小与融合蛋白的预期大小进行比较。

可以培养两或更多代转基因植物，通过杂交或自交鉴定出具有希望的表型特征(包括重组蛋白质的产生)的植物和株系。为了确保重组性状的继续遗传，可能需要保证产生重组蛋白质的植物、植株或株系纯合。选择纯合基因植物的方法对植物育种领域技术人员是公知的，包括循环地自花授粉和筛选以及花药和小孢子培养。还可以转化单倍体细胞或组织，再通过已知手段(例如用秋水仙素或其它微管破坏试剂处理)，使随后转变为双倍体的单倍体植株再生，由此获得纯合植物。

用亲和基质分离目标分子的方法

如上所述，本发明涉及用上述油体蛋白以及在某些情况下用配体从样品中分离目标分子的方法。在本发明的方法中，将油体与含有所需目标分子的样品混合，配体和目标分子间的相互作用导致目标分子与油体间非共价结合。离心后，油体和亲和结合的目标分子与水相分离开，这样，有效地从存在于原样品的任何杂质中纯化出了目标分子。重复洗涤步骤可确保除去残余的任何杂质。

目标分子附着于油体之后，可以在根据经验对各配体-目标物对确定的条件下洗脱目标物。用合适的洗脱液处理结合基质并离心，即能够从水相中回收纯化的目标分子。如果目标分子是含有蛋白酶识别位点的配体-蛋白质融合体，则可以用合适的蛋白酶处理以去除配体。然后可以再用油体亲和基质或通过常规蛋白质纯化方法，将目标蛋白质与游离的配体分离开。

亲和基质的化学和物理性质至少可以在两个方面有变化。首先，不同植物种类包含具不同油组成的油体。例如，椰子富含月桂油(C12)，而在芸苔属的某些种中有丰富的芥子酸油(C22)。并且，与油体结合的蛋白质在种间是变化的。其次，可以通过使用本领域技术人员已知的育种和基因工程技术或这些技术组合来改变特定植物种类的相对含油量。这些技术目标在于改变控制油合成所涉及的代谢途径的酶的相对活性。通过使用这些技术，可以得到含有不同油量的一批种子。例如，育种工作已开发出了芥子酸油含量低的油菜籽(Canola)(Bestor，T.H.1994，发育遗传学15：458)，通过基因工程产生了一些植物株系，这些株系中所含油的双键位置及数量有改变、脂肪酸链长度有变化，并且导入了需要的官能团(Topfer等，1995，科学268：681-685)。应用相似的方法，本领域技术人员可以进一步扩展目前已有的油体资源。不同的油组成将导致油体部分具有不同的物理和化学性质。这样，通过从作为油体资源的不同种类或植物株系中挑选油籽或其混合物，能够获得有不同结构和粘性的宽范围油体基质。

油体亲和基质的应用

假设有可能为几类蛋白质设计出油体亲和基质，可以想见，基于油体的亲和基质有多种用途。细菌、真菌、植物和动物都含有能与诸如离子、金属、核酸、糖类、脂质和其它蛋白质之类试剂特异相互作用的蛋白质。可以用油体技术将这些试剂固定化。

可以直接或间接通过配体分子，用油体蛋白亲和基质分离任何能结合油体蛋白的目标分子。能用本发明的方法从样品中分离的目标分子的例子包括蛋白质、肽、有机分子、脂质、糖类、核酸、细胞、细胞片段、病毒和金属。具体地说，发明人已说明，本发明的亲和基质能用来分离治疗用蛋白质(如凝血酶)、抗体、金属(如镉)、糖类(如纤维素)、有机分子(如生物素)和细胞(如细菌细胞)。

还可以用油体亲和基质从混合细胞群中分离有工业或医药价值的细胞。例如，利用基于油体的亲和技术，可以将造血干细胞(它是血细胞的亚群，可用于骨髓移植和干细胞基因治疗中)与其它血细胞分离开。在重组DNA技术中，经常需要将已成功导入了重组DNA的细胞(称为转化细胞)与没有获得重组DNA的细胞区别和分离开。只要部分重组DNA表达与基于油体的亲和配体互补的细胞表面蛋白质，就有可能用油体将转化细胞与未转化细胞分开。油体亲和技术还可以用于将细胞器(如叶绿体和线粒体)与其它细胞物质分离开。也可以从复杂混合物中分离病毒颗粒。

将被称为金属蛋白的一族含有特异结合离子之辅基的蛋白质进行固定化也是可能的。金属蛋白质的例子有结合铁的血红蛋白，结合钙的小清蛋白，结合锌和其它金属离子的金属硫蛋白。可以预见，能用油体从例如被实验室和工业处理的废金属污染的水这样的流体中清除金属。下面的实施例4进一步阐述了这种应用。其它将蛋白质生物固定化并用于生物除污策略的实例包括从废液中去除磷酸盐、硝酸盐和苯酚。这个方法可以部分克服细菌生物除污中确实存在的或推测的局限性。在某些情况下，依赖亲和分配技术将油体基质与目标化合物分离开可能是不现实的或不必要的。在这些情况下，可以预见，能将油体固定在固态惰性表面上，该表面可以是平面或柱面。然后，使含有亲和配体的溶液流过被固定化油体包被的表面，就会在上面进行选择性亲和结合。可以预见，固定化油体可以用于管道和池中，以协助生物除污。

以下实施例阐述用油体作为亲和基质的多个系统。应明白所给实施例旨在举例说明而非限制本发明。

实施例

实施例1凝血酶的纯化

以下实施例描述用油体亲和基质纯化凝血酶。凝血酶是一种在血液凝固中有重要作用的丝氨酸蛋白酶。它切割血纤蛋白原，产生血纤蛋白单体，单体聚合成为形成血块的基础(Fenton 1981；Ann.N.Y.Acad.Sci.370：468-495)。α凝血酶由以二硫键连接的含36个残基(A链)和259个残基(B链)的两条肽链组成(Degen等，1983，生物化学22：2087-2097)。在医用水蛭Hirudomedicinalis的唾液腺中发现的水蛭素是凝血酶非常特异和有力的抑制剂。这种抑制作用是水蛭素与α凝血酶链的特定部位非共价结合造成的(Stone和Hofsteenge1986；生物化学25：4622-4628)。

固定化的配体包含与18KD拟南芥油质蛋白(油体蛋白)融合的水蛭素异构体(Van Rooijen等，1992；植物分子生物学18：1177-1179)。构建体的表达由拟南芥18KD油质蛋白启动子调控(VanRooijen等，1994；植物分子生物学18：1177-1179)。油质蛋白-水蛭素融合体的序列见图2和SEQ ID NO：3。

油质蛋白-水蛭素构建体

在报导的蔓菁(Brassica napus)油质蛋白基因序列(Murphy等，1991，Biochim.Biophys.Acta1088：86-94)的基础上设计寡核苷酸引物，用于经PCR从蔓菁基因组DNA扩增片段。用该片段作为探针，从EMBL3拟南芥基因组文库中鉴定并分离到一个携带15Kbp插入片段的克隆。用寡核苷酸引物，从该插入片段中扩增出含有完整油质蛋白编码序列和内含子以及5’上游区840个碱基对的片段。设计引物，使其可删除翻译终止密码子，并在片段的5’末端导入一个PstI限制内切酶识别位点，在3’末端导入一个SalI位点及紧随其后的PvuI位点。将片段末端填平，连接到质粒载体pUC19的SmaI位点。然后插入来自质粒pBI121、包含胭脂氨酸合成酶终止子序列的SalI-EcoRI片段，产生pOBILT。

根据报导的序列信息(Harvey等，1986，美国国家科学院学报83：1084-1088)，但遵照蔓菁和拟南芥的密码子用法，合成水蛭素变体2(HV2)序列。用四个重叠的寡核苷酸引物扩增该序列，这几个引物设计成能使所得片段在5’和3’末端分别具有PvuI和SalI位点。将该片段连接到pUC19质粒载体的SmaI位点内，产生pHIR。然后将pHIR的PvuI-SalI片段插入到pUCOBILT内油质蛋白和终止子序列之间，与油质蛋白编码区形成符合读框的融合体，产生pUCOBHIRT。将整个构建体亚克隆到pBluescriptKS+中(pBIOBHIRT)，然后再亚克隆到携带35-S CaMV启动子调控下的新霉素磷酸转移酶基因的pCGN1559质粒(McBride和Summerfelt，1990，植物分子生物学14：269-276)中PstI位点处(pCGOBHIRT)。将该质粒导入根癌农杆菌。该质粒的制备如图3所示。

转化和再生

转化农杆菌和植物的步骤先前已有描述。用上述构建体通过电穿孔转化根癌农杆菌(Dower等，1988；核酸研究16：6127-6145)。然后用已转化的细菌转化蔓菁的子叶外植体，再根据Moloney等的方法进行植株再生(1989；植物细胞报导8：238-242)。先用新霉素磷酸转移酶测定鉴定转基因植株，随后对通过Northern和免疫印迹分析确定的油质蛋白-水蛭素融合蛋白的表达加以确定。

油体的制备

用高速运行的polytron，将来自对照(未转基因)植物或表达油质蛋白-水蛭素融合蛋白之转基因植物的种子在5倍体积的冷研磨缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5，0.4M蔗糖和0.5M NaCl)中匀浆。匀浆物在约10xg离心30分钟，以去除颗粒物质，并将油体与含有可溶性种子蛋白质群的水相分离开。用金属刮刀从上清液表面撇取油体，放入1体积的新鲜研磨缓冲液中。为了在随后的步骤中进行有效的洗涤，确保油体彻底重新分散是很重要的。用低速运行的polytron，在研磨缓冲液中轻轻地重匀浆油体可以实现这个目标。用注射器小心地将重悬的油体置于5倍体积的冷50mM Tris-HCl(pH7.5)下分层，如上离心。离心后，再将油体取出，重复洗涤三次，以去除残留污染的可溶性种子蛋白质。最终洗过的油体制剂重悬在1体积的冷50mM Tris-HCl(pH7.5)中，用polytron重新分散，这样即可用作亲和基质。

凝血酶的亲和纯化

图4中简要示意了用油质蛋白-水蛭素融合蛋白纯化凝血酶。为了评价凝血酶的结合，从表达油质蛋白-水蛭素融合蛋白的转基因蔓菁种子(4A4种子)(Parmenter等，植物分子生物学1995，29：1167-1180)和野生型蔓菁栽培品种Westar种子制备亲和基质。评价凝血酶与两种基质的结合情况。用种子制备洗过的油体的步骤与上面描述的一样。将含有凝血酶活性在0到1个单位的溶液与10μl固定量的亲和基质(从总共10mg干种子制得；相当于约100μg总油体蛋白质)混合在500μl结合缓冲液(50mM Tris-HCl(pH7.5)；0.1％(w/v)BSA)中。将油体悬浮液置冰上保持30分钟，再在4℃下于14000rpm离心15分钟。用皮下注射针回收油体下含有未结合的游离凝血酶的缓冲液(称为下层液(unternatant))，如下检测凝血酶活性。将总共250μl下层液加入700μl结合缓冲液中，预热到37℃。向下层液中加入50μl 1mM凝血酶底物N-对甲苯磺酰基-gly-pro-arg-酰基对硝基苯胺(Sigma)后，用分光光度计监测405纳米处的光密度变化3分钟。用一系列含有已知浓度的凝血酶样品绘制标准曲线，利用该标准曲线确定检测混合物中的凝血酶浓度。检测中所得的数值用于计算结合凝血酶的浓度，其中假设：

[结合凝血酶]＝[总凝血酶]-[游离凝血酶]

将结合凝血酶浓度与游离凝血酶浓度的比率作为结合凝血酶浓度的函数作曲线(Scatchard曲线)。从这些曲线，按照标准步骤(Scatchard，G.Ann.N.Y.Acad.Sci.(1949)57：660-672)，并假设Ka＝1/K_d，计算亲和基质的解离常数。野生型油体亲和基质的解离常数为3.22×10^-7m，4A4油体亲和基质的解离常数为2.60×10^-8m。

用NaCl梯度评估从基质回收结合凝血酶的情况。将结合于油质蛋白-水蛭素油体基质上的凝血酶的洗脱曲线和结合于野生型油体基质上的凝血酶的洗脱曲线进行比较。由野生型蔓菁栽培品种Westar种子制备野生型油体和由蔓菁4A4种子(Parmenter等，植物分子生物学(1995)29：1167-1180)制备油质蛋白-水蛭素油体的步骤与上面描述的相同。除了用100μl油体样品结合0.5单位凝血酶外，使凝血酶与基质结合的步骤与上面描述的相同。油体悬浮液先置冰上30分钟，再在4℃于14000rpm离心15分钟。测定下层液，以分析(未结合的)凝血酶活性。然后将油体基质重新悬浮于结合缓冲液中，向该缓冲液加入NaCl至终浓度为0.05M。从油体悬浮液在冰上保持30分钟开始，将上述步骤重复5次，逐步提高NaCl浓度。所用的NaCl终浓度为0.05M，0.1M，0.2M，0.3M，0.4M和0.6M。凝血酶测定中的NaCl浓度维持在150mM不变。图5显示用野生型油体和4A4油体时得到的洗脱曲线。

实施例2抗体作为二价配体

由于抗体对特异表位和其他对免疫球蛋白(IgGs)有亲和力的抗体或蛋白质(例如金黄色葡萄球菌蛋白A)都有亲和力，因此可将其用作二价抗体。本实施例中，多克隆的抗油质蛋白抗体充当二价配体，在兔子体内针对抗油质蛋白抗体产生的抗体充当目标分子。本实施例在图6中示意。

按照实施例1描述的步骤，由5g野生型蔓菁栽培品种Westar种子制备油体。随后，用100mM甘氨酸(pH2.5)将油体洗两次，在结合缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5)中洗两次以进行中和，并重悬于5ml结合缓冲液中。将洗过的油体制剂150μl等分样品与用结合缓冲液按1∶10稀释过的含有抗油质蛋白抗体(配体抗体)的兔血清500μl合并。将油体悬浮液彻底混匀，在4℃搅拌下保温1小时。保温之后，通过用1ml结合缓冲液洗3次而从油体悬浮液中去除未结合的配体抗体。然后将油体与500μl按1∶500稀释在结合缓冲液中并含有与检测标记辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗兔IgG抗体(目标抗体)的血清(Sigma)合并。混合悬浮液，在与抗油质蛋白抗体结合所用的相同条件下保温。作为对照，将目标抗体与未事先结合配体抗体的油体一同保温。随后两种样品均用1ml结合缓冲液洗4次，以去除未结合的抗体。用结合缓冲液将样品在油体浓度(由在600nm经分光光度术测得的样品浊度确定)方面等同化。为了检测结合的目标抗体，将含有5μl油体的样品与1ml溶于0.01％过氧化氢的HRP显色底物四甲基对二氨基联苯混合，于室温反应10分钟。加入500μl 1M H₂SO₄终止反应，确定450nm处的光吸收值。通过检测5μl最后洗涤组分，针对洗涤后仍存在的残余未结合目标抗体进行校正。有关对照和结合配体之油体制品获得的结果列在图7中。

实施例3油质蛋白特异配体的用途

油质蛋白特异性配体的使用代表了使用抗体或基因工程化油质蛋白融合蛋白纯化重组目标蛋白质的的一种替代方法。在这种情况中，将目标蛋白质与油质蛋白特异性配体融合，位于非转基因种子油体上的内源油质蛋白充当互补性配体-亲和基质。这个方法除了不必要求表达油质蛋白融合体的转基因株系之外，还提高了亲和基质的总容量，因为现在所有的内源油质蛋白都可以参与结合。

用油质蛋白筛选肽噬菌体展示文库，可以从中鉴定和分离出油质蛋白特异性配体。由于油质蛋白从油体上移下后，油质蛋白中央区域的极端疏水性会导致该蛋白质的凝聚和沉淀，因此可以用缺少这一区域的突变蛋白质进行筛选。因为只有油质蛋白的亲水部分暴露于细胞质(即N-和C-末端)，所以这对配体的效力影响很小。因此，这些是可用于配体结合的仅有区域。配体一分离后，就可以与一个常用报告蛋白质(绿色荧光蛋白(GFP)(Prasher，1995，TrendsGenet.11：320-323))融合，以显示纯化。

油质蛋白中央区域的去除

可以用以上描述的拟南芥油质蛋白基因的特异寡核苷酸引物从蔓菁cDNA文库(Van Rooijen 1993，博士论文，University ofCalgary)扩增油质蛋白基因。可以用编码N-末端62个氨基酸和C-末端55个氨基酸的序列旁侧的引物，分别反应扩增编码相应的油质蛋白N-和C-末端结构域的序列。另外，N-末端结构域5’引物包含一个编码凝血酶识别位点的序列，使融合蛋白质能够如下裂解。将所得片段连接到细菌表达载体pEZZ18(Pharmacia)的SmaI位点。这个载体在多克隆位点下游包含编码使蛋白质分泌到周质空间的信号肽的序列，还含有衍生自蛋白A的合成IgG结合结构域以便于蛋白质纯化。

油质蛋白缺失构建体的表达和纯化

用标准方法将携带缺失突变构建体的载体导入大肠杆菌并筛选转化子。可以通过加入1mM IPTG来诱导转化细菌的培养物表达合成的蛋白A-突变油质蛋白融合蛋白质。可以将诱导细胞沉淀，并重新悬浮在5mM MgSO₄中，通过渗透压休克引起周质空间膜裂解。离心裂解细胞，将含有分泌蛋白质的上清液上样到含有偶联了IgG的sepharose柱子内。洗涤除去未结合的蛋白质后，向柱子中装入含50mM Tris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl和1.0U/ml纯化牛凝血酶(Sigma)的缓冲液，以将突变的油质蛋白从合成蛋白A上切割下来。37℃保温4小时后，排干柱子，使洗脱液流过偶联肝素的sepharose柱子，以除去凝血酶。回收由该柱流出的含有突变油质蛋白的洗脱液，经过凝胶电泳随后用考马斯蓝R250染色检测蛋白质的纯度。

肽组合文库的制备

可以根据Scott和Smith的方法(1990，科学249：386-390)制备随机肽组合文库。简要步骤是，用PCR扩增含有简并序列(NNK)₆的合成DNA片段；其中N代表脱氧核苷酸G、T、A和C的均等混合物，K代表脱氧核苷酸G、T的均等混合物。该简并序列编码6肽，代表了20种氨基酸和琥珀型终止密码子的任一种可能组合。将PCR产物连接到丝状噬菌体fUSE的基因III序列内，并将所得噬菌粒通过电穿孔导入大肠杆菌。

油质蛋白特异配体的鉴定和分离

扩增肽噬菌体展示文库，浓缩，并以10¹²tdu/ml的等分试样储存。用巯基裂解性接头(S-S生物素，Pierce)将纯化的突变油质蛋白生物素化，并经体积排阻层析纯化。用浓度为50nM的该生物素化蛋白质筛选2ml中含有5×10¹¹tdu的肽噬菌体展示文库样品。用链霉抗生物素蛋白包被的顺磁磁珠回收与突变油质蛋白结合的噬菌体。洗涤后，经加入裂解二硫键的50mM二硫苏糖醇洗脱噬菌体。然后将洗脱下的噬菌体与过量的对数期F+大肠杆菌一起温育。将感染细胞样品铺平板以确定噬菌体滴度，并将余下的细胞用于连续的扩增和筛选轮回。将洗脱噬菌体扩增3-4个数量级后，挑选单个噬菌体，并通过直接ELISA检测其与突变油质蛋白的结合。用抗噬菌体抗体(Crosby和Schorr，1995，细胞生物学年度综述)检测与噬菌体发生的结合。从表现有结合的噬菌体中分离单链DNA，确定肽编码序列。

使用油质蛋白特异配体的亲和纯化

将如上所述分离的油质蛋白配体编码序列读框一致地融合到gfp10序列(编码GFP)(Prasher等，1992，基因111：229-233)的上游，并将构建体连接到细菌表达载体pKK233(Pharmacia)内。将经诱导表达配体-GFP融合蛋白的细胞超声处理提取可溶性蛋白质，在50mM Tris-HCl(pH7.5)中调至浓度为10mg/ml。

将20ml蛋白质溶液与2ml从非转基因植物种子如上所述制备的油体混合。混合物在4℃、搅拌下保温30分钟，以便进行结合，然后离心分离油体和可溶性部分。用荧光光度计在508nm确定除去油体后残留在可溶性部分中的GFP量，并与原始细菌提取物中的含量比较。计算结合GFP的量以确定基质的容量。

将油体在20ml 50mM Tris-HCl(pH7.5)中洗涤两次，重新悬浮于2ml同样的缓冲液中，分成100μl的20等份。将pH范围在2-10和NaCl浓度在0-1M的1ml溶液加入不同等份中，确定配体-GFP融合蛋白质的洗脱条件。混匀并在4℃保温30分钟后，除去油体并收集可溶性部分。用荧光光度法确定可溶性部分中的配体-GFP融合蛋白质的量。

实施例4去除重金属离子

以下实施例展示油体亲和基质从复杂溶液中回收/去除非蛋白质目标物的应用。为了本实施例的目的，使用了金属硫蛋白/Cd⁺⁺配体对。但是也可以使用其他金属结合蛋白质[例如植物螯合肽(Rauser，1990，生物化学年度综述59：61-86)]和包括Cu⁺⁺、Zn⁺⁺等的金属离子。

油质蛋白-金属硫蛋白融合体

利用设计成能分别在基因的5’和3’末端产生NotI和NcoI位点的引物，通过PCR，从蔓菁cDNA文库(Van Rooijen，1993，博士论文，University of Calgary，)扩增油质蛋白基因。将得到的片段消化，置于pGN的NotI/NcoI位点内，产生质粒poleGN。用设计成能在基因的3’末端产生单个NotI位点的寡核苷酸引物扩增人金属硫蛋白基因mt-II(Varshney和Gedamu，1984，基因31：135-145)。将得到的PCR产物亚克隆到pBluescript KS+的平末端EcoRV位点，形成pBSMTC。将mt-II基因从该质粒上切下来，并亚克隆到poleGN的NcoI/KpnI位点取代GUS-NOS区域，产生pOLEMTC。用NotI消化切下pOLEMTC中773个碱基的油质蛋白-MT融合体，并将其插入到polePN3’中位于油质蛋白基因启动子(oleP；Van Rooijen 1992，植物分子生物学18：1177-1179)和P.crispum ubi4-2基因终止子(ubi3’；Kawalleck等，1993，植物分子生物学21：673-684)之间的单个NotI位点内，产生pOOM3’。确定融合体方向正确后，用KpnI消化pOOM3’，以释放oleP-oleMT-ubi3’插入片段。将该表达盒插入二元载体pCGN1559的KpnI位点，得到最终的构建体pBIOOM3’。油质蛋白-金属硫蛋白融合体的序列见图8和SEQ ID NO.6。质粒pBIOOM3’的构建过程见图9。

转化和再生

用实施例1描述的转化和再生方案制备表达油质蛋白-金属硫蛋白融合体的转基因B.carinata植株。

油体制品

由B.carinata的转基因和对照植株种子如实施例1所述制备洗过的油体。

用油体亲和基质从溶液中去除Cd⁺⁺

油质蛋白-金属硫蛋白融合体在结合溶液中的镉离子方面的用途如图10所示。

制备于10mM Tris-HCl，pH7.2中的含有0.01μCi/ml ¹⁰⁹Cd的10μM CdCl₂溶液。将1ml该CdCl₂溶液与从表达油质蛋白-金属硫蛋白融合蛋白质的种子制得的100μl已洗过油体(1.6mg油体蛋白)彻底混匀，于22℃保温1小时。在10000×g离心5分钟将油体与水相分开，并在1ml 10mM Tris-HCl(pH7.2)中洗涤两次后，用γ-计数器(Cobra auto-gamma，Canberra Packard，Canada)确定仍与油体组分结合的¹⁰⁹Cd⁺⁺的量。用来自非转基因种子的油体做相同的实验，以检测并校正Cd离子与基质的非特异性结合。

将油体组分与1ml 100mM甘氨酸缓冲液(pH＝3.0)混合，从油体金属硫蛋白亲和基质洗脱下Cd⁺⁺离子(Pazirandeh等，1995，应用微生物学与生物技术43：1112-1117)。在10000×g离心5分钟后，取出油体组分，如上检测结合的Cd⁺⁺离子。图11显示Cd与亲和基质的结合和洗脱。

实施例5分离完整细胞

以下实施例说明油体固定完整细胞的能力。细菌细胞分离的一个潜在应用在于用于诊断。也希望能从目的细胞类型存在数相对较少的复杂细胞混合物中分离独特的真核细胞(例如淋巴细胞和干细胞)。

金黄色葡萄球菌通过蛋白A结合于油体

为了本实施例的目的，将表达蛋白A作为表面抗原的金黄色葡萄球菌与带有不同量多克隆抗油质蛋白抗体的油体混合。

油体的制备

蔓菁栽培品种Westar种子用漂白剂表面消毒，冲洗，并用研钵和杵在研磨缓冲液(50mM Tris，pH7.5，0.4M蔗糖和100mM甘氨酸)中研磨。用Miracloth将匀浆物过滤到无菌的15ml Corex试管内。将滤过的匀浆物于4℃、10000×g离心10分钟。取出油体组分，重悬于50mM Tris，pH7.5和0.4M蔗糖中，并用同样的缓冲液洗涤两次。将1ml油体样品转入1.5ml Eppendorf管内，于室温在16000×g离心10分钟。油体在50mM Tris，pH7.5和0.4M蔗糖中再洗5-6次，直至观察不到可见的沉淀。

金黄色葡萄球菌细胞与抗油质蛋白包被的油体的结合

将福尔马林固定的金黄色葡萄球菌细胞(Sigma，P-7155)在50mMTris(pH7.5)中洗3-4次，并重新悬浮。将洗过的油体(300μl)和金黄色葡萄球菌细胞与不同量的抗油质蛋白IgG(50μl)混合。混匀并于室温保温2小时后，将混合物于室温在16000×g离心5分钟。小心除去油体组分和下层液，细胞沉淀在1ml 50mM Tris(pH7.5)中洗两次。试管壁用棉纸擦去油迹。随后将细胞沉淀重新悬浮在1ml的水中，确定OD₆₀₀。图12是一个代表性实验，显示当油体金黄色葡萄球菌混合物中的抗IgG的浓度增加时，细胞沉淀中的细胞量降低。

两株金黄色葡萄球菌的不同结合

本实验中，利用油体亲和基质来展示两株金黄色葡萄球菌的不同结合情况。福尔马林固定的金黄色葡萄球菌菌株(一株表达IgG结合表面抗原蛋白A，一个缺少蛋白A)可购自Sigma。可制备相同OD₅₅₀的两株金黄色葡萄球菌稀释样品。向每份样品中加入来自未转化植株的对照油体或者混合了抗油质蛋白抗体的油体。在合适温度下保温适当时间后，离心样品，以沉淀未结合的细菌细胞，并分离油体组分。轻轻倒出油体，涡旋处理，并确定OD₅₅₀。重新悬浮沉淀，并确定下层液的OD₅₅₀。预计只有在含有表达蛋白A的金黄色葡萄球菌以及油体与抗油质蛋白抗体复合的样品中，才能观察到这些细胞分馏到油体组分中。通过降低油体组分的pH，可以进一步显示细胞与油体的结合。离心后，有沉淀存在和/或沉淀重新悬浮后其OD₅₅₀的升高，可以证明细胞从油体上释放下来了。

将大肠杆菌与金黄色葡萄球菌分离开

将金黄色葡萄球菌活菌株与一株有特定抗生素抗性的大肠杆菌的不同量细胞混合。将混合的细菌样品与对照抗体和复合了抗油质蛋白抗体的油体一起涡旋处理。在合适温度下保温适当时间后，洗涤油体，直接滴定测量下层液和油体，并选择性地铺在血琼脂平板(使金黄色葡萄球菌生长)和LB平板(使大肠杆菌生长)上。通过估计菌落形成单位可确定达到了富集或实际分离的目的。

鉴定复杂混合物中低浓度存在的病原体

为了进行诊断，经常需要浓缩以较低数目侵染人体或动物组织的细菌或病毒病原体。可以用油体亲和基质来富集这些病原体，这样，随后可以进行鉴定和表征。

病原体经常通过与受体或表面蛋白质的相互作用而特异结合到人或动物细胞上。可以将油质蛋白融合到人或动物蛋白质配体上，还可以用重组油体来固定病原体。本领域已知的在人体和病原体来源的蛋白质间形成蛋白质复合体的例子包括：人纤维蛋白原或可结合金黄色葡萄球菌聚集因子A(clf-A)的纤维蛋白特异结构域(McDevitt等，1995，分子微生物学16：895-907)；与尿道和肠道病原性大肠杆菌结合的人衰变加速因子(DAF)(Nowicki等，1993，实验医学杂志178：2115-2121)；人癌细胞系Caco-2表达的、特异性结合28KD肺炎克雷伯氏菌菌毛蛋白质KPF-28的人细胞配体(DiMaretino，1996，感染与免疫64：2263-2266)；以及与酿脓链球菌(Streptococcus pyrogenes )粘附素(蛋白F)特异复合的人细胞胞外基质纤连蛋白特异结构域(Ozeri等，1996，EMBO杂志15：989-998)。

实施例6分离小有机分子

本实施例描述如何用油体亲和基质从溶液中回收/去除小有机分子。作为例子，以抗生物素蛋白为配体纯化小有机分子-生物素。

构建抗生物素蛋白配体

抗生物素蛋白是鸟类合成的一种蛋白质，对生物素(它是许多羧化酶的辅助因子)表现出极高的亲和力。可以用本领域已知的标准步骤，将纯化抗生物素蛋白的制品(购自Sigma)与抗油质蛋白抗体化学缀合在一起。这种方法将产生一种适合用于证实基于亲和力去除生物素的二价抗生物素蛋白配体。可替代地，可以用油质蛋白-抗生物素蛋白基因融合体。已经鉴定了鸡(Gallus gallus)内编码抗生物素蛋白的基因，其序列也已确定(Beattie等，1987，核酸研究15：3595-3606)。根据该序列，可以用化学方法或PCR合成抗生物素蛋白基因，并如实施例4所述与蔓菁油质蛋白(VanRooijen，1993，博士论文，University of Calgary)融合在一起。也可以使用链霉抗生物素蛋白(一种类似的细菌生物素结合蛋白)。

油体制品

如实施例1所述由转基因植株和/或对照植株的种子制备洗过的油体。

二价抗生物素蛋白-油质蛋白配体的结合

如实施例3的详细描述进行抗油质蛋白抗体的结合和除去未结合配体。

从溶液中除去生物素

将含有已知浓度生物素的溶液与固定量的复合了抗油质蛋白抗体(缀合了抗生物素蛋白)的油体合并。结合后，离心混合物以分离油体和水相。用缀合了辣根过氧化物酶(HRP)的抗生物素抗体通过竞争性ELISA确定存留在水相中的生物素的量。计算结合生物素的量，其中假定：

[结合生物素]＝[总生物素]-[游离生物素]

由得到的数值，可以如实施例2所述确定解离常数。作为对照，用与未缀合生物素的抗油质蛋白抗体结合的油体进行相同的实验。如果需要，可以用过量的2-(4’-羟苯)苯甲酸(HABA)进行竞争性洗脱，从油体-抗生物素蛋白基质中释放下生物素。也可以使用经基因工程开发的对生物素有更低亲和力的抗生物素蛋白突变体协助洗脱。已经描述过细菌的类似生物素结合蛋白质这种突变体-链霉抗生物素蛋白(Chilkoti等，1995，生物/技术13：1198-1204)。

实施例7分离羧化酶

以下实施例描述使用油体基质从复杂生物混合物中回收糖类。发明人在本实施例中展示了油体固定化纤维素酶能够结合纤维素。

粪肥纤维单胞菌产生的几种纤维素酶含有离散的纤维素结合结构域(CBD)。即使通过蛋白酶切割或基因操作而将它们与酶的催化结构域分隔开，这些CBD也能独立结合纤维素。质粒pUC18-CBDPT含有β-1，4-葡聚糖酶的CBD的编码片段(Gilkes等，1992，生物化学杂志267：6743-6749)，可以用它构建油质蛋白-CBD基因融合体。可以用合适的限制酶或PCR，从pUC18-CBDPT分离编码CBD结构域的DNA片段。或者，可以使用粪肥纤维单胞菌的其它纤维素酶的CBD或者其它来源的纤维素酶的CBD。如实施例4所描述，用PCR将从cDNA文库(Van Rooijen，1993，博士论文，University ofCalgary)分离到的蔓菁油质蛋白基因克隆到pGN中，得到质粒pOLEGN。用本领域技术人员已知的标准分子技术，可以制备油质蛋白基因和CBD基因之间形成的符合读框的基因融合体。最终的构建体将含有可译性地融合在油质蛋白基因下游紧邻处的CBD结构域。

转化和再生

为了将融合基因构建体导入植物，可以将其亚克隆到二元载体中，例如pCGN1559中。可以按实施例1所述制备表达油质蛋白-CBD融合体的转基因植株。

油体制品

如实施例1所述从转基因和对照野生型植株的种子制备洗过的油体。

用油体亲和基质从溶液中去除纤维素

为了评价纤维素与油体亲和基质的结合，对野生型和转基因植株油体的结合能力进行比较。可以将油体与含有系列纤维素浓度的适当缓冲的溶液混合。然后可以在合适的温度下将油体悬浮液保温适当时间。经过离心，可以回收下层液，并检测纤维素浓度。计算结合和游离纤维素的浓度，其中假定：

[结合纤维素]＝[总纤维素]-[游离纤维素]

以结合纤维素浓度与游离纤维素浓度的比率作为结合纤维素浓度的函数作曲线。从这些曲线，按照标准步骤(Scatchard，G.，Ann.N.Y.Acad.Sci.(1949)57：660-672)以及实施例2的详细描述，可以计算出解离常数。

实施例8分离核酸

以下实施例描述了使用油体结合单链(SS)核酸的方法。

单链核酸的分离

获取单链核酸的方法可以用于诊断例如植物病毒病，或应用在那些需要从溶液中选择性分离未重退火的SS核酸的研究中(例如用在表达基因差式筛选的杂交反应中)。为了进行鉴定或进一步扩增，可以将油质蛋白与SS DNA或RNA结合蛋白质或其特异结构域融合，并用来捕获SS核酸。已充分鉴定的SS核酸结合蛋白质包括：农杆菌Ti质粒Vir E2蛋白(Zupan等，1995，植物生理学107：1041-1047)；烟草花叶病毒(TMV)移动蛋白P30(Citovsky等，1990，细胞60：637-647；Waigmann等，1994，美国国家科学院学报91：1433-1437)；花椰菜花叶病毒外壳蛋白(Thompson等，1993，普通病毒学杂志74：1141-1148)和大肠杆菌RecA以及单链结合(SSB)蛋白(Radding，1991，生物化学杂志266：5355-5358)。

实施例9分离重组蛋白质

以下实施例进一步展示用油体亲和基质纯化重组目标蛋白质。本实施例中选用了IgG/蛋白A配体对。使用的构建体包含与18KDa拟南芥油质蛋白(Van Rooijen等，1992，植物分子生物学18：1177-1179)融合的蛋白A结构域。分离含有油质蛋白-蛋白A融合蛋白质的油体，用来证实与缀合了辣根过氧化物酶(HRP)的兔抗小鼠IgG的特异结合。油质蛋白-蛋白A融合体在油体上的构型和IgG与此融合体的结合见图15。

油质蛋白-蛋白A融合体

编码能与IgG结合的蛋白A的合成序列是在已报导的序列信息(pRIT2T，蛋白A基因融合载体，Pharmacia)的基础上合成的，并经PCR扩增。PCR中所用的每个引物含有在蛋白A特异序列5’方向的限制位点以方便克隆。反向引物(即反义方向的引物)还在编码序列之后含有翻译终止密码子。图13显示PCR引物与蛋白A序列的相对位置(蛋白A序列和引物序列还分别示于SEQ ID NO：8，SEQ IDNO：10和SEQ ID NO：11)。将得到的片段连接到携带拟南芥油质蛋白基因的pUC19质粒中，该基因含有867bp的上游启动子区和其后的编码区(及其相连的内含子)，并已除去了编码区中的翻译终止密码子。构建体的3’端含有胭脂氨酸合成酶转录终止子。将编码内切蛋白酶(凝血酶)的识别序列的间隔序列插入在油质蛋白编码序列的下游紧邻处。在这个间隔序列和终止子序列之间导入蛋白A基因序列。在最终的表达构建体中，油质蛋白和蛋白A编码区以相同的读框融合在一起。然后将整个构建体(图14和SEQ ID NO：12)从pUC19中切割下来，并亚克隆到携有在35S CaMV启动子调控下的新霉素磷酸转移酶基因的植物转化载体pCGN1559(McBride和Summerfelt，1990，植物分子生物学14：269-276)中。将产生的质粒导入农杆菌(菌株EHA101)内。

转化和再生

如实施例1所述转化和再生植物。先通过新霉素磷酸转移酶检测鉴别转基因植株，随后经免疫印迹分析检测蛋白A融合体的表达情况进行证实。

油体制备

按照实施例1描述的步骤，由表达油质蛋白-蛋白A融合体的蔓菁和B.carinata株系制备油体。

油质蛋白-蛋白A融合体与IgG的结合

对来自表达油质蛋白-蛋白A融合蛋白质的转基因蔓菁株系的油体蛋白提取物(20μg/份)作聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后按照标准步骤转移到PVDF膜上。用缀合了HRP的小鼠抗兔抗体探测膜，并按照《抗体，实验室指南》(Harlow和Lane，1988，Cold Spring Harbor)叙述的步骤显色。图16显示了染色后的PVDF膜。在测试的所有6个转基因蔓菁株系的蛋白质提取物中，均特异性地检测到一种50kDa的蛋白质(油质蛋白-蛋白A融合蛋白质的预测分子量：48801Da)。未转化的对照植株没有HRP活性，而编码蛋白A的pRIT2T转化了的细菌的裂解物中存在一种30Kda的蛋白质(预测分子量为29652Da)，在未转化的裂解物中没有检测到这种蛋白质。

IgG与含有油质蛋白-蛋白A融合蛋白质之油体的结合和洗脱

如实施例1所述，从野生型蔓菁和转化了表达油质蛋白-蛋白A融合蛋白质的构建体的转基因蔓菁株系制备洗过的油体(10mg/ml蛋白质)，并将其重新悬浮在10mM Tris-Cl，pH8.0中。将2μl(±34μg)缀合了HRP的兔抗小鼠抗体(Sigma，目录号A9044)加入500μl已洗过的油体制品中，悬浮液于室温保温1小时或者在4℃过夜。然后在16000×g离心样品15分钟，除去undernatant。随后，用杵将油体彻底重悬于500μl 10mM Tris-Cl，pH8.0中。在Tris-Cl中的这一洗涤步骤重复4次(以后称为洗过的油体制品)。从洗过的油体制品中取5μl样品，洗第5次后，再检测HRP活性。

进行HRP检测时，将1μl洗过的油体制品加到1ml HRP检测混合液(9.8ml 0.1M NaOAc，0.2ml含2.5mg/ml三甲基联苯胺的DMSO，4μlH₂O₂)中，并将混合液于室温保温5分钟。加入0.5ml 1M H₂SO₄终止反应。样品经0.22μm滤膜过滤，随后经分光光度法确定OD₄₅₀。

为了从油体上洗脱下IgG，将洗好的油体制品重悬于100 mM甘氨酸(pH3.0)中，16000×g离心15分钟，并于室温保持30分钟。用500μl 100mM Tris-Cl(pH8.0)中和后，如上检测油体组分和洗脱液的HRP活性。图17显示IgG与来自野生型蔓菁和表达油质蛋白-蛋白A融合体之转基因蔓菁的油体的结合和洗脱。

所有出版物、专利和专利申请均相同程度地全文引入本文作为参考文献，每篇出版物、专利和专利申请均视作是逐一并个别地全文引入作为参考文献的。

序列表(1)一般资料：(i)申请人：

(A)姓名：SemiBioSys Genetics Inc.

(B)街道：609-14 Street，N.W.

(C)城市：Calgary

(D)州： Alberta

(E)国家：加拿大

(F)邮政编码：T2N 2A1

(G)电话：(403)220-5161

(H)传真：(403)220-0704

(A)姓名：Moloney Maurice

(B)街道：34Edgebrook Cove N.W.

(C)城市：Calgary

(D)州： Alberta

(E)国家：加拿大

(F)邮政编码：T3A 5N5

(A)姓名：Boothe Joseph

(B)街道：#302,332 6th Avenue N.W.

(C)城市：Calgary

(D)州： Alberta

(E)国家：加拿大

(F)邮政编码：T2E OL9

(A)姓名：Rooijen Gijs Van

(B)街道：3223 Bearspaw Drive N.W.

(C)城市：Calgary

(D)州： Alberta

(E)国家：加拿大

(F)邮政编码：T2L 1T1(ii)发明题目：油体及结合蛋白质作为亲和基质(iii)序列数：14(iv)通讯地址：

(A)收件人：BERESKIN & PARR

(B)街道：40 King Street West

(C)城市：Toronto

(D)州：Ontario

(E)国家：加拿大

(F)邮政编码：M5H 3Y2(v)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC可兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release #1.0，Version #1.30(vi)目前的申请资料：

(A)申请号：

(B)申请日：

(C)分类号：(vii)在先申请资料：

(A)申请号：US 08/767,026

(B)申请日：16-DEC-1997(viii)代理人/代理资料：

(A)姓名：Gravelle Micheline

(B)登记号：40,261

(C)资料/文档号：9369-050 (ix)通讯资料：

(A)电话：(416)364-7311

(B)传真：(416)361-1398(2)SEQ ID NO：1的资料：(i)序列特征：

(A)长度：522个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(vi)来源：

(A)生物：来自拟南芥的油质蛋白

(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1...522

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：ATG GCG GAT ACA GCT AGA GGA ACC CAT CAC GAT ATC ATC GGC AGA GAC 48Met Ala Asp Thr Ala Arg Gly Thr His His Asp Ile Ile Gly Arg Asp1 5 10 15CAG TAC CCG ATG ATG GGC CGA GAC CGA GAC CAG TAC CAG ATG TCC GGA 96Gln Tyr Pro Met Met Gly Arg Asp Arg Asp Gln Tyr Gln Met Ser Gly

20 25 30CGA GGA TCT GAC TAC TCC AAG TCT AGG CAG ATT GCT AAA GCT GCA ACT 144Arg Gly Ser Asp Tyr Ser Lys Ser Arg Gln Ile Ala Lys Ala Ala Thr

35 40 45GCT GTC ACA GCT GGT GGT TCC CTC CTT GTT CTC TCC AGC CTT ACC CTT 192Ala Val Thr Ala Gly Gly Ser Leu Leu Val Leu Ser Ser Leu Thr Leu

50 55 60GTT GGA ACT GTC ATA GCT TTG ACT GTT GCA ACA CCT CTG CTC GTT ATC 240Val Gly Thr Val Ile Ala Leu Thr Val Ala Thr Pro Leu Leu Val Ile65 70 75 80TTC AGC CCA ATC CTT GTC CCG GCT CTC ATC ACA GTT GCA CTC CTC ATC 288Phe Ser Pro Ile Leu Val Pro Ala Leu Ile Thr Val Ala Leu Leu Ile

85 90 95ACC GGT TTT CTT TCC TCT GGA GGG TTT GGC ATT GCC GCT ATA ACC GTT 336Thr Gly Phe Leu Ser Ser Gly Gly Phe Gly Ile Ala Ala Ile Thr Val

100 105 110TTC TCT TGG ATT TAC AAG TAC GCA ACG GGA GAG CAC CCA CAG GGA TCA 384Phe Ser Trp Ile Tyr Lys Tyr Ala Thr Gly Glu His Pro Gln Gly Ser

115 120 125GAC AAG TTG GAC AGT GCA AGG ATG AAG TTG GGA AGC AAA GCT CAG GAT 432Asp Lys Leu Asp Ser Ala Arg Met Lys Leu Gly Ser Lys Ala Gln Asp

130 135 140CTG AAA GAC AGA GCT CAG TAC TAC GGA CAG CAA CAT ACT GGT GGG GAA 480Leu Lys Asp Arg Ala Gln Tyr Tyr Gly Gln Gln His Thr Gly Gly Glu145 150 155 160CAT GAC CGT GAC CGT ACT CGT GGT GGC CAG CAC ACT ACT TAA 522His Asp Arg Asp Arg Thr Arg Gly Gly Gln His Thr Thr *

165 170(2)SEQ ID NO：2的资料：(i)序列特征：

(A)长度：174个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Ala Asp Thr Ala Arg Gly Thr His His Asp Ile Ile Gly Arg Asp1 5 10 15Gln Tyr Pro Met Met Gly Arg Asp Arg Asp Gln Tyr Gln Met Ser Gly

20 25 30Arg Gly Ser Asp Tyr Ser Lys Ser Arg Gln Ile Ala Lys Ala Ala Thr

35 40 45Ala Val Thr Ala Gly Gly Ser Leu Leu Val Leu Ser Ser Leu Thr Leu

50 55 60Val Gly Thr Val Ile Ala Leu Thr Val Ala Thr Pro Leu Leu Val Ile65 70 75 80Phe Ser Pro Ile Leu Val Pro Ala Leu Ile Thr Val Ala Leu Leu Ile

85 90 95Thr Gly Phe Leu Ser Ser Gly Gly Phe Gly Ile Ala Ala Ile Thr Val

100 105 110Phe Ser Trp Ile Tyr Lys Tyr Ala Thr Gly Glu His Pro Gln Gly Ser

115 120 125Asp Lys Leu Asp Ser Ala Arg Met Lys Leu Gly Ser Lys Ala Gln Asp

130 135 140Leu Lys Asp Arg Ala Gln Tyr Tyr Gly Gln Gln His Thr Gly Gly Glu145 150 155 160His Asp Arg Asp Arg Thr Arg Gly Gly Gln His Thr Thr *

165 170(2)SEQ ID NO：3的资料：(i)序列特征：(A)长度：2115个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(vi)来源：

(A)生物：油质蛋白-水蛭素融合体(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：862...1215(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1456..1833(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：CTATACCCAA CCTCGGTCTT GGTCACACCA GGAACTCTCT GGTAAGCTAG CTCCACTCCC 60CAGAAACAAC CGGCGCCAAA TTGCCGGAAT TGCTGACCTG AAGACGGAAC ATCATCGTCG 120GGTCCTTGGG CGATTGCGGC GGAAGATGGG TCAGCTTGGG CTTGAGGACG AGACCCGAAT 180CGAGTCTGTT GAAAGGTTGT TCATTGGGAT TTGTATACGG AGATTGGTCG TCGAGAGGTT 240TGAGGGAAAG GACAAATGGG TTTGGCTCTG GAGAAAGAGA GTGCGGCTTT AGAGAGAGAA 300TTGAGAGGTT TAGAGAGAGA TGCGGCGGCG ATGACGGGAG GAGAGACGAC GAGGACCTGC 360ATTATCAAAG CAGTGACGTG GTGAAATTTG GAACTTTTAA GAGGCAGATA GATTTATTAT 420TTGTATCCAT TTTCTTCATT GTTCTAGAAT GTCGCGGAAC AAATTTTAAA ACTAAATCCT 480AAATTTTTCT AATTTTGTTG CCAATAGTGG ATATGTGGGC CGTATAGAAG GAATCTATTG 540AAGGCCCAAA CCCATACTGA CGAGCCCAAA GGTTCGTTTT GCGTTTTATG TTTCGGTTCG 600ATGCCAACGC CACATTCTGA GCTAGGCAAA AAACAAACGT GTCTTTGAAT AGACTCCTCT 660CGTTAACACA TGCAGCGGCT GCATGGTGAC GCCATTAACA CGTGGCCTAC AATTGCATGA 720TGTCTCCATT GACACGTGAC TTCTCGTCTC CTTTCTTAAT ATATCTAACA AACACTCCTA 780CCTCTTCCAA AATATATACA CATCTTTTTG ATCAATCTCT CATTCAAAAT CTCATTCTCT 840CTAGTAAACA AGAACAAAAA A ATG GCG GAT ACA GCT AGA GGA ACC CAT CAC 891

Met Ala Asp Thr Ala Arg Gly Thr His His

1 5 10GAT ATC ATC GGC AGA GAC CAG TAC CCG ATG ATG GGC CGA GAC CGA GAC 939Asp Ile Ile Gly Arg Asp Gln Tyr Pro Met Met Gly Arg Asp Arg Asp

15 20 25CAG TAC CAG ATG TCC GGA CGA GGA TCT GAC TAC TCC AAG TCT AGG CAG 987Gln Tyr Gln Met Ser Gly Arg Gly Ser Asp Tyr Ser Lys Ser Arg Gln

30 35 40ATT GCT AAA GCT GCA ACT GCT GTC ACA GCT GGT GGT TCC CTC CTT GTT 1035Ile Ala Lys Ala Ala Thr Ala Val Thr Ala Gly Gly Ser Leu Leu Val

45 50 55CTC TCC AGC CTT ACC CTT GTT GGA ACT GTC ATA GCT TTG ACT GTT GCA 1083Leu Ser Ser Leu Thr Leu Val Gly Thr Val Ile Ala Leu Thr Val Ala

60 65 70ACA CCT CTG CTC GTT ATC TTC AGC CCA ATC CTT GTC CCG GCT CTC ATC 1131Thr Pro Leu Leu Val Ile Phe Ser Pro Ile Leu Val Pro Ala Leu Ile75 80 85 90ACA GTT GCA CTC CTC ATC ACC GGT TTT CTT TCC TCT GGA GGG TTT GGC 1179Thr Val Ala Leu Leu Ile Thr Gly Phe Leu Ser Ser Gly Gly Phe Gly

95 100 105ATT GCC GCT ATA ACC GTT TTC TCT TGG ATT TAC AAG TAAGCACACA 1225Ile Ala Ala Ile Thr Val Phe Ser Trp Ile Tyr Lys

110 115TTTATCATCT TACTTCATAA TTTTGTGCAA TATGTGCATG CATGTGTTGA GCCAGTAGCT 1285TTGGATCAAT TTTTTTGGTC GAATAACAAA TGTAACAATA AGAAATTGCA AATTCTAGGG 1345AACATTTGGT TAACTAAATA CGAAATTTGA CCTAGCTAGC TTGAATGTGT CTGTGTATAT 1405CATCTATATA GGTAAAATGC TTGGTATGAT ACCTATTGAT TGTGAATAGG TAC GCA 1461

Tyr Ala

1ACG GGA GAG CAC CCA CAG GGA TCA GAC AAG TTG GAC AGT GCA AGG ATG 1509Thr Gly Glu His Pro Gln Gly Ser Asp Lys Leu Asp Ser Ala Arg Met

5 10 15AAG TTG GGA AGC AAA GCT CAG GAT CTG AAA GAC AGA GCT CAG TAC TAC 1557Lys Leu Gly Ser Lys Ala Gln Asp Leu Lys Asp Arg Ala Gln Tyr Tyr

20 25 30GGA CAG CAA CAT ACT GGT TGG GAA CAT GAC CGT GAC CGT ACT CGT GGT 1605Gly Gln Gln His Thr Gly Trp Glu His Asp Arg Asp Arg Thr Arg Gly35 40 45 50GGC CAG CAC ACT ACT GCG ATC GAA GGG AGA ATC ACT TAC ACT GAC TGT 1653Gly Gln His Thr Thr Ala Ile Glu Gly Arg Ile Thr Tyr Thr Asp Cys

55 60 65ACT GAA TCT GGA CAG AAC CTC TGT CTC TGT GAA GGA TCT AAC GTT TGT 1701Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys

70 75 80GGA AAG GGA AAC AAG TGT ATC CTC GGA TCT AAC GGA AAG GGA AAC CAG 1749Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asn Gly Lys Gly Asn Gln

85 90 95TGT GTT ACT GGA GAA GGA ACT CCA AAC CCA GAA TCT CAC AAC AAC GGA 1797Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Asn Pro Glu Ser His Asn Asn Gly

100 105 110GAC TTC GAA GAA ATC CCT GAA GAA TAC CTC CAG TAA GTCGACTCTA 1843Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gln *115 120 125GACGGATCTC CCGATCGTTC AAACATTTGG CAATAAAGTT TCTTAAGATT GAATCCTGTT 1903GCCGGTCTTG CGATGATTAT CATATAATTT CTGTTGAATT ACGTTAAGCA TGTAATAATT 1963AACATGTAAT GCATGACGTT ATTTATGAGA TGGGTTTTTA TGATTAGAGT CCCGCAATTA 2023TACATTTAAT ACGCGATAGA AAACAAAATA TAGCGCGCAA ACTAGGATAA ATTATCGCGC 2083GCGGTGTCAT CTATGTTACT AGATCGGAAT TC 2115(2)SEQ ID NO：4的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：118个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：Met Ala Asp Thr Ala Arg Gly Thr His His Asp Ile Ile Gly Arg Asp1 5 10 15Gln Tyr Pro Met Met Gly Arg Asp Arg Asp Gln Tyr Gln Met Ser Gly

20 25 30Arg Gly Ser Asp Tyr Ser Lys Ser Arg Gln Ile Ala Lys Ala Ala Thr

35 40 45Ala Val Thr Ala Gly Gly Ser Leu Leu Val Leu Ser Ser Leu Thr Leu

85 90 95Thr Gly Phe Leu Ser Ser Gly Gly Phe Gly Ile Ala Ala Ile Thr Val

100 105 110Phe Ser Trp Ile Tyr Lys

115(2)SEQ ID NO：5的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：126个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：Tyr Ala Thr Gly Glu His Pro Gln Gly Ser Asp Lys Leu Asp Ser Ala1 5 10 15Arg Met Lys Leu Gly Ser Lys Ala Gln Asp Leu Lys Asp Arg Ala Gln

20 25 30Tyr Tyr Gly Gln Gln His Thr Gly Trp Glu His Asp Arg Asp Arg Thr

35 40 45Arg Gly Gly Gln His Thr Thr Ala Ile Glu Gly Arg Ile Thr Tyr Thr

50 55 60Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn65 70 75 80Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asn Gly Lys Gly

85 90 95Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Asn Pro Glu Ser His Asn

100 105 110Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gln *

115 120 125(2)SEQ ID NO：6的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：2366个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(vi)来源：

(A)生物：油质蛋白-金属硫蛋白融合体

(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1092...1856(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：GAGCTCAAAT ACGATCTGAT ACTGATAACG TCTAGATTTT TAGGGTTAAA GCAATCAATC 60ACCTGACGAT TCAAGGTGGT TGGATCATGA CGATTCCAGA AAACATCAAG CAAGCTCTCA 120AAGCTACACT CTTTGGGATC ATACTGAACT CTAACAACCT CGTTATGTCC CGTAGTGCCA 180GTACAGACAT CCTCGTAACT CGGATTATGC ACGATGCCAT GGCTATACCC AACCTCGGTC 240TTGGTCACAC CAGGAACTCT CTGGTAAGCT AGCTCCACTC CCCAGAAACA ACCGGCGCCA 300AATTGCCGGA ATTGCTGACC TGAAGACGGA ACATCATCGT CGGGTCCTTG GGCGATTGCG 360GCGGAAGATG GGTCAGCTTG GGCTTGAGGA CGAGACCCGA ATCGAGTCTG TTGAAAGGTT 420GTTCATTGGG ATTTGTATAC GGAGATTGGT CGTCGAGAGG TTTGAGGGAA AGGACAAATG 480GGTTTGGCTC TGGAGAAAGA GAGTGCGGCT TTAGAGAGAG AATTGAGAGG TTTAGAGAGA 540GATGCGGCGG CGATGACGGG AGGAGAGACG ACGAGGACCT GCATTATCAA AGCAGTGACG 600TGGTGAAATT TGGAACTTTT AAGAGGCAGA TAGATTTATT ATTTGTATCC ATTTTCTTCA 660TTGTTCTAGA ATGTCGCGGA ACAAATTTTA AAACTAAATC CTAAATTTTT CTAATTTTGT 720TGCCAATAGT GGATATGTGG GCCGTATAGA AGGAATCTAT TGAAGGCCCA AACCCATACT 780GACGAGCCCA AAGGTTCGTT TTGCGTTTTA TGTTTCGGTT CGATGCCAAC GCCACATTCT 840GAGCTAGGCA AAAAACAAAC GTGTCTTTGA ATAGACTCCT CTCGTTAACA CATGCAGCGG 900CTGCATGGTG ACGCCATTAA CACGTGGCCT ACAATTGCAT GATGTCTCCA TTGACACGTG 960ACTTCTCGTC TCCTTTCTTA ATATATCTAA CAAACACTCC TACCTCTTCC AAAATATATA 1020CACATCTTTT TGATCAATCT CTCATTCAAA ATCTCATTCT CTCTAGTAAA CAGGATCCCC 1080CTCGCGGCCG C ATG GCG GAT ACA GCT AGA ACC CAT CAC GAT GTC ACA AGT 1130

Met Ala Asp Thr Ala Arg Thr His His Asp Val Thr Ser

1 5 10CGA GAT CAG TAT CCC CGA GAC CGA GAC CAG TAT TCT ATG ATC GGT CGA 1178Arg Asp Gln Tyr Pro Arg Asp Arg Asp Gln Tyr Ser Met Ile Gly Arg

15 20 25GAC CGT GAC CAG TAC TCT ATG ATG GGC CGA GAC CGA GAC CAG TAC AAC 1226Asp Arg Asp Gln Tyr Ser Met Met Gly Arg Asp Arg Asp Gln Tyr Asn30 35 40 45ATG TAT GGT CGA GAC TAC TCC AAG TCT AGA CAG ATT GCT AAG GCT GTT 1274Met Tyr Gly Arg Asp Tyr Ser Lys Ser Arg Gln Ile Ala Lys Ala Val

50 55 60ACC GCA GTC ACG GCG GGT GGG TCC CTC CTT GTC CTC TCC AGT CTC ACC 1322Thr Ala Val Thr Ala Gly Gly Ser Leu Leu Val Leu Ser Ser Leu Thr

65 70 75CTT GTT GGT ACT GTC ATT GCT TTG ACT GTT GCC ACT CCA CTC CTC GTT 1370Leu Val Gly Thr Val Ile Ala Leu Thr Val Ala Thr Pro Leu Leu Val

80 85 90ATC TTT AGC CCA ATC CTC GTG CCG GCT CTC ATC ACC GTA GCA CTT CTC 1418Ile Phe Ser Pro Ile Leu Val Pro Ala Leu Ile Thr Val Ala Leu Leu

95 100 105ATC ACT GGC TTT CTC TCC TCT GGT GGG TTT GCC ATT GCA GCT ATA ACC 1466Ile Thr Gly Phe Leu Ser Ser Gly Gly Phe Ala Ile Ala Ala Ile Thr110 115 120 125GTC TTC TCC TGG ATC TAT AAG TAC GCA ACG GGA GAG CAC CCA CAG GGG 1514Val Phe Ser Trp Ile Tyr Lys Tyr Ala Thr Gly Glu His Pro Gln Gly

130 135 140TCA GAT AAG TTG GAC AGT GCA AGG ATG AAG CTG GGA ACC AAA GCT CAG 1562Ser Asp Lys Leu Asp Ser Ala Arg Met Lys Leu Gly Thr Lys Ala Gln

145 150 155GAT ATT AAA GAC AGA GCT CAA TAC TAC GGA CAG CAA CAT ACA GGT GGT 1610Asp Ile Lys Asp Arg Ala Gln Tyr Tyr Gly Gln Gln His Thr Gly Gly

160 165 170GAG CAT GAC CGT GAC CGT ACT CGT GGT GGC CAG CAC ACT ACT CTC GTT 1658Glu His Asp Arg Asp Arg Thr Arg Gly Gly Gln His Thr Thr Leu Val

175 180 185CCA CGA GGA TCC ATG GAT CCC AAC TGC TCC TGT GCC GCC AGT GAC TCC 1706Pro Arg Gly Ser Met Asp Pro Asn Cys Ser Cys Ala Ala Ser Asp Ser190 195 200 205TGC ACC TGC GCC GGC TCC TGC AAG TGC AAA GAG TGC AAA TGC ACC TCC 1754Cys Thr Cys Ala Gly Ser Cys Lys Cys Lys Glu Cys Lys Cys Thr Ser

210 215 220TGC AAG AAA AGC TGC TGC TCC TGC TGT CCT GTG GGC TGT GCC AAG TGT 1802Cys Lys Lys Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Val Gly Cys Ala Lys Cys

225 230 235GCC CAG GGC TGC ATC TGC AAA GGG GCG TCG GAC AAG TGC AGC TGC TGT 1850Ala Gln Gly Cys Ile Cys Lys Gly Ala Ser Asp Lys Cys Ser Cys Cys

240 245 250GCC TGA GCGGCCGCGA GGGCTGCAGA ATGAGTTCCA AGATGGTTTG TGACGAAGTT 1906Ala *

255AGTTGGTTGT TTTTATGGAA CTTTGTTTAA GCTTGTAATG TGGAAAGAAC GTGTGGCTTT 1966GTGGTTTTTA AATGTTGGTG AATAAAGATG TTTCCTTTGG ATTAACTAGT ATTTTTCCTA 2026TTGGTTTCAT GGTTTTAGCA CACAACATTT TAAATATGCT GTTAGATGAT ATGCTGCCTG 2086CTTTATTATT TACTTACCCC TCACCTTCAG TTTCAAAGTT GTTGCAATGA CTCTGTGTAG 2146TTTAAGATCG AGTGAAAGTA GATTTTGTCT ATATTTATTA GGGGTATTTG ATATGCTAAT 2206GGTAAACATG GTTTATGACA GCGTACTTTT TTGGTTATGG TGTTGACGTT TCCTTTTAAA 2266CATTATAGTA GCGTCCTTGG TCTGTGTTCA TTGGTTGAAC AAAGGCACAC TCACTTGGAG 2326ATGCCGTCTC CACTGATATT TGAACAAAGA ATTCGGTACC 2366(2)SEQ ID NO：7的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：255个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：Met Ala Asp Thr Ala Arg Thr His His Asp Val Thr Ser Arg Asp Gln1 5 10 15Tyr Pro Arg Asp Arg Asp Gln Tyr Ser Met Ile Gly Arg Asp Arg Asp

20 25 30Gln Tyr Ser Met Met Gly Arg Asp Arg Asp Gln Tyr Asn Met Tyr Gly

35 40 45Arg Asp Tyr Ser Lys Ser Arg Gln Ile Ala Lys Ala Val Thr Ala Val

50 55 60Thr Ala Gly Gly Ser Leu Leu Val Leu Ser Ser Leu Thr Leu Val Gly65 70 75 80Thr Val Ile Ala Leu Thr Val Ala Thr Pro Leu Leu Val Ile Phe Ser

85 90 95Pro Ile Leu Val Pro Ala Leu Ile Thr Val Ala Leu Leu Ile Thr Gly

100 105 110Phe Leu Ser Ser Gly Gly Phe Ala Ile Ala Ala Ile Thr Val Phe Ser

115 120 125Trp Ile Tyr Lys Tyr Ala Thr Gly Glu His Pro Gln Gly Ser Asp Lys

130 135 140Leu Asp Ser Ala Arg Met Lys Leu Gly Thr Lys Ala Gln Asp Ile Lys145 150 155 160Asp Arg Ala Gln Tyr Tyr Gly Gln Gln His Thr Gly Gly Glu His Asp

165 170 175Arg Asp Arg Thr Arg Gly Gly Gln His Thr Thr Leu Val Pro Arg Gly

180 185 190Ser Met Asp Pro Asn Cys Ser Cys Ala Ala Ser Asp Ser Cys Thr Cys

195 200 205Ala Gly Ser Cys Lys Cys Lys Glu Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys

210 215 220Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Val Gly Cys Ala Lys Cys Ala Gln Gly225 230 235 240Cys Ile Cys Lys Gly Ala Ser Asp Lys Cys Ser Cys Cys Ala *

245 250 255(2)SEQ ID NO：8的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：804个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(vi)来源：

(A)生物：蛋白A引物

(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：5...796(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：CTCC ATG GAT CAA CGC AAT GGT TTT ATC CAA AGC CTT AAA GAT GAT CCA 49

Met Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro

1 5 10 15AGC CAA AGT GCT AAC GTT TTA GGT GAA GCT CAA AAA CTT AAT GAC TCT 97Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser

20 25 30CAA GCT CCA AAA GCT GAT GCG CAA CAA AAT AAC TTC AAC AAA GAT CAA 145Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Gln Gln Asn Asn Phe Asn Lys Asp Gln

35 40 45CAA AGC GCC TTC TAT GAA ATC TTG AAC ATG CCT AAC TTA AAC GAA GCG 193Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala

50 55 60CAA CGT AAC GGC TTC ATT CAA AGT CTT AAA GAC GAC CCA AGC CAA AGC 241Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser

65 70 75ACT AAC GTT TTA GGT GAA GCT AAA AAA TTA AAC GAA TCT CAA GCA CCG 289Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro80 85 90 95AAA GCT GAT AAC AAT TTC AAC AAA GAA CAA CAA AAT GCT TTC TAT GAA 337Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu

100 105 110ATC TTG AAT ATG CCT AAC TTA AAC GAA GAA CAA CGC AAT GGT TTC ATC 385Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile

115 120 125CAA AGC TTA AAA GAT GAC CCA AGC CAA AGT GCT AAC CTA TTG TCA GAA 433Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu

130 135 140GCT AAA AAG TTA AAT GAA TCT CAA GCA CCG AAA GCG GAT AAC AAA TTC 481Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe

145 150 155AAC AAA GAA CAA CAA AAT GCT TTC TAT GAA ATC TTA CAT TTA CCT AAC 529Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn160 165 170 175TTA AAC GAA GAA CAA CGC AAT GGT TTC ATC CAA AGC CTA AAA GAT GAC 577Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp

180 185 190CCA AGC CAA AGC GCT AAC CTT TTA GCA GAA GCT AAA AAG CTA AAT GAT 625Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp

195 200 205GCT CAA GCA CCA AAA GCT GAC AAC AAA TTC AAC AAA GAA CAA CAA AAT 673Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn

210 215 220GCT TTC TAT GAA ATT TTA CAT TTA CCT AAC TTA ACT GAA GAA CAA CGT 721Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg

225 230 235AAC GGC TTC ATC CAA AGC CTT AAA GAC GAT CCG GGG AAT TCC CGG GGA 769Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Gly Asn Ser Arg Gly240 245 250 255TCC GTC GAC CTG CAG ATA ACA AAT TAG AAGCTTGC 804Ser Val Asp Leu Gln Ile Thr Asn *

260(2)SEQ ID NO：9的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：264个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：Met Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser1 5 10 15Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln

20 25 30Ala Pro Lys Ala Asp Ala Gln Gln Asn Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln

35 40 45Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln

50 55 60Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr65 70 75 80Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys

85 90 95Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile

100 105 110Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln

115 120 125Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu Ala

130 135 140Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn145 150 155 160Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu

165 170 175Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro

180 185 190Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala

195 200 205Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala

210 215 220Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn225 230 235 240Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Gly Asn Ser Arg Gly Ser

245 250 255Val Asp Leu Gln Ile Thr Asn *

260(2)SEQ ID NO：10的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：27个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(vi)来源：

(A)生物：Primer Bk 266

(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：CTCCATGGAT CAACGCAATG GTTTATC 27(2)SEQ ID NO：11的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：29个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(vi)来源：

(A)生物：Primer Bk 267

(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：

29GCAAGCTTCT AATTTGTTAT CTGCAGGTC

(2)SEQ ID NO：12的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：2709个碱基对 (B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：868...1220(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1462...2436(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：CCATGGCTAT ACCCAACCTC GGTCTTGGTC ACACCAGGAA CTCTCTGGTA AGCTAGCTCC 60ACTCCCCAGA AACAACCGGC GCCAAATTGC CGGAATTGCT GACCTGAAGA CGGAACATCA 120TCGTCGGGTC CTTGGGCGAT TGCGGCGGAA GATGGGTCAG CTTGGGCTTG AGGACGAGAC 180CCGAATCGAG TCTGTTGAAA GGTTGTTCAT TGGGATTTGT ATACGGAGAT TGGTCGTCGA 240GAGGTTTGAG GGAAAGGACA AATGGGTTTG GCTCTGGAGA AAGAGAGTGC GGCTTTAGAG 300AGAGAATTGA GAGGTTTAGA GAGAGATGCG GCGGCGATGA CGGGAGGAGA GACGACGAGG 360ACCTGCATTA TCAAAGCAGT GACGTGGTGA AATTTGGAAC TTTTAAGAGG CAGATAGATT 420TATTATTTGT ATCCATTTTC TTCATTGTTC TAGAATGTCG CGGAACAAAT TTTAAAACTA 480AATCCTAAAT TTTTCTAATT TTGTTGCCAA TAGTGGATAT GTGGGCCGTA TAGAAGGAAT 540CTATTGAAGG CCCAAACCCA TACTGACGAG CCCAAAGGTT CGTTTTGCGT TTTATGTTTC 600GGTTCGATGC CAACGCCACA TTCTGAGCTA GGCAAAAAAC AAACGTGTCT TTGAATAGAC 660TCCTCTCGTT AACACATGCA GCGGCTGCAT GGTGACGCCA TTAACACGTG GCCTACAATT 720GCATGATGTC TCCATTGACA CGTGACTTCT CGTCTCCTTT CTTAATATAT CTAACAAACA 780CTCCTACCTC TTCCAAAATA TATACACATC TTTTTGATCA ATCTCTCATT CAAAATCTCA 840TTCTCTCTAG TAAACAAGAA CAAAAAA ATG GCG GAT ACA GCT AGA GGA ACC 891

Met Ala Asp Thr Ala Arg Gly Thr

1 5CAT CAC GAT ATC ATC GGC AGA GAC CAG TAC CCG ATG ATG GGC CGA GAC 939His His Asp Ile Ile Gly Arg Asp Gln Tyr Pro Met Met Gly Arg Asp

10 15 20CGA GAC CAG TAC CAG ATG TCC GGA CGA GGA TCT GAC TAC TCC AAG TCT 987Arg Asp Gln Tyr Gln Met Ser Gly Arg Gly Ser Asp Tyr Ser Lys Ser25 30 35 40AGG CAG ATT GCT AAA GCT GCA ACT GCT GTC ACA GCT GGT GGT TCC CTC 1035Arg Gln Ile Ala Lys Ala Ala Thr Ala Val Thr Ala Gly Gly Ser Leu

45 50 55CTT GTT CTC TCC AGC CTT ACC CTT GTT GGA ACT GTC ATA GCT TTG ACT 1083Leu Val Leu Ser Ser Leu Thr Leu Val Gly Thr Val Ile Ala Leu Thr

60 65 70GTT GCA ACA CCT CTG CTC GTT ATC TTC AGC CCA ATC CTT GTC CCG GCT 1131Val Ala Thr Pro Leu Leu Val Ile Phe Ser Pro Ile Leu Val Pro Ala

75 80 85CTC ATC ACA GTT GCA CTC CTC ATC ACC GGT TTT CTT TCC TCT GGA GGG 1179Leu Ile Thr Val Ala Leu Leu Ile Thr Gly Phe Leu Ser Ser Gly Gly

90 95 100TTT GGC ATT GCC GCT ATA ACC GTT TTC TCT TGG ATT TAC AA 1220Phe Gly Ile Ala Ala Ile Thr Val Phe Ser Trp Ile Tyr105 110 115GTAAGCACAC ATTTATCATC TTACTTCATA ATTTTGTGCA ATATGTGCAT GCATGTGTTG 1280AGCCAGTAGC TTTGGATCAA TTTTTTTGGT CGAATAACAA ATGTAACAAT AAGAAATTGC 1340AAATTCTAGG GAACATTTGG TTAACTAAAT ACGAAATTTG ACCTAGCTAG CTTGAATGTG 1400TCTGTGTATA TCATCTATAT AGGTAAAATG CTTGGTATGA TACCTATTGA TTGTGAATAG 1460G TAC GCA ACG GGA GAG CAC CCA CAG GGA TCA GAC AAG TTG GAC AGT 1506Tyr Ala Thr Gly Glu His Pro Gln Gly Ser Asp Lys Leu Asp Ser

1 5 10 15GCA AGG ATG AAG TTG GGA AGC AAA GCT CAG GAT CTG AAA GAC AGA GCT 1554Ala Arg Met Lys Leu Gly Ser Lys Ala Gln Asp Leu Lys Asp Arg Ala

20 25 30CAG TAC TAC GGA CAG CAA CAT ACT GGT GGG GAA CAT GAC CGT GAC CGT 1602Gln Tyr Tyr Gly Gln Gln His Thr Gly Gly Glu His Asp Arg Asp Arg

35 40 45ACT CGT GGT GGC CAG CAC ACT ACT CTC GTT CCA CGA GGA TCC ATG GAT 1650Thr Arg Gly Gly Gln His Thr Thr Leu Val Pro Arg Gly Ser Met Asp

50 55 60CAA CGC AAT GGT TTT ATC CAA AGC CTT AAA GAT GAT CCA AGC CAA AGT 1698Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser

65 70 75GCT AAC GTT TTA GGT GAA GCT CAA AAA CTT AAT GAC TCT CAA GCT CCA 1746Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro80 85 90 95AAA GCT GAT GCG CAA CAA AAT AAC TTC AAC AAA GAT CAA CAA AGC GCC 1794Lys Ala Asp Ala Gln Gln Asn Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala

100 105 110TTC TAT GAA ATC TTG AAC ATG CCT AAC TTA AAC GAA GCG CAA CGT AAC 1842Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn

115 120 125GGC TTC ATT CAA AGT CTT AAA GAC GAC CCA AGC CAA AGC ACT AAC GTT 1890Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val

130 135 140TTA GGT GAA GCT AAA AAA TTA AAC GAA TCT CAA GCA CCG AAA GCT GAT 1938Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp

145 150 155AAC AAT TTC AAC AAA GAA CAA CAA AAT GCT TTC TAT GAA ATC TTG AAT 1986Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn160 165 170 175ATG CCT AAC TTA AAC GAA GAA CAA CGC AAT GGT TTC ATC CAA AGC TTA 2034Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu

180 185 190AAA GAT GAC CCA AGC CAA AGT GCT AAC CTA TTG TCA GAA GCT AAA AAG 2082Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys

195 200 205TTA AAT GAA TCT CAA GCA CCG AAA GCG GAT AAC AAA TTC AAC AAA GAA 2130Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu

210 215 220CAA CAA AAT GCT TTC TAT GAA ATC TTA CAT TTA CCT AAC TTA AAC GAA 2178Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu

225 230 235GAA CAA CGC AAT GGT TTC ATC CAA AGC CTA AAA GAT GAC CCA AGC CAA 2226Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln240 245 250 255AGC GCT AAC CTT TTA GCA GAA GCT AAA AAG CTA AAT GAT GCT CAA GCA 2274Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala

260 265 270CCA AAA GCT GAC AAC AAA TTC AAC AAA GAA CAA CAA AAT GCT TTC TAT 2322Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr

275 280 285GAA ATT TTA CAT TTA CCT AAC TTA ACT GAA GAA CAA CGT AAC GGC TTC 2370Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe

290 295 300ATC CAA AGC CTT AAA GAC GAT CCG GGG AAT TCC CGG GGA TCC GTC GAC 2418Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Gly Asn Ser Arg Gly Ser Val Asp

305 310 315CTG CAG ATA ACA AAT TAG AAGCTTGCAT GCCTGCAGGT CGATCGTTCA 2466Leu Gln Ile Thr Asn *320 325AACATTTGGC AATAAAGTTT CTTAAGATTG AATCCTGTTG CCGGTCTTGC GATGATTATC 2526ATATAATTTC TGTTGAATTA CGTTAAGCAT GTAATAATTA ACATGTAATG CATGACGTTA 2586TTTATGAGAT GGGTTTTTAT GATTAGAGTC CCGCAATTAT ACATTTAATA CGCGATAGAA 2646AACAAAATAT AGCGCGCAAA CTAGGATAAA TTATCGCGCG CGGTGTCATC TATGTTACTA 2706GAT 2709(2)SEQ ID NO：13的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：117个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：Met Ala Asp Thr Ala Arg Gly Thr His His Asp Ile Ile Gly Arg Asp1 5 10 15Gln Tyr Pro Met Met Gly Arg Asp Arg Asp Gln Tyr Gln Met Ser Gly

20 25 30Arg Gly Ser Asp Tyr Ser Lys Ser Arg Gln Ile Ala Lys Ala Ala Thr

35 40 45Ala Val Thr Ala Gly Gly Ser Leu Leu Val Leu Ser Ser Leu Thr Leu

85 90 95Thr Gly Phe Leu Ser Ser Gly Gly Phe Gly Ile Ala Ala Ile Thr Val

100 105 110Phe Ser Trp Ile Tyr

115(2)SEQ ID NO：14的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：325个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：Tyr Ala Thr Gly Glu His Pro Gln Gly Ser Asp Lys Leu Asp Ser Ala1 5 10 15Arg Met Lys Leu Gly Ser Lys Ala Gln Asp Leu Lys Asp Arg Ala Gln

20 25 30Tyr Tyr Gly Gln Gln His Thr Gly Gly Glu His Asp Arg Asp Arg Thr

35 40 45Arg Gly Gly Gln His Thr Thr Leu Val Pro Arg Gly Ser Met Asp Gln

50 55 60Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala65 70 75 80Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys

85 90 95Ala Asp Ala Gln Gln Asn Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe

100 105 110Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly

115 120 125Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu

130 135 140Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn145 150 155 160Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met

165 170 175Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys

180 185 190Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu

195 200 205Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln

210 215 220Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu225 230 235 240Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser

245 250 255Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro

260 265 270Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu

275 280 285Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile

290 295 300Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Gly Asn Ser Arg Gly Ser Val Asp Leu305 310 315 320Gln Ile Thr Asn *

325

Claims

1.一种从样品中分离目标分子的方法，包含：

1)将(i)油体与(ii)含有目标分子的样品接触，以使目标分子结合至油体上；和

2)从样品中分离结合了目标分子的油体。

2.权利要求1的方法，进一步包含与油体和目标分子结合的配体分子。

3.权利要求2的方法，其中所述配体分子共价结合至油体上。

4.权利要求3的方法，其中所述配体分子共价结合至油体中的油体蛋白上。

5.权利要求2的方法，其中所述配体包含两种分子，第一分子结合油体，第二分子结合目标物，而第一分子和第二分子相互结合在一起。

6.权利要求5的方法，其中第一和第二配体分子相互缀合在一起。

7.权利要求4的方法，其中所述配体分子是一种蛋白质。

8.权利要求7的方法，其中所述蛋白质配体是与油体蛋白形成的融合蛋白质。

9.权利要求1到8中任一项的方法，其中所述目标分子选自蛋白质、肽、有机分子、脂质、糖类、核酸、细胞、细胞器、细胞组分、病毒、金属、金属离子和离子。

10.权利要求8的方法，其中所述配体分子是水蛭素，所述目标分子是凝血酶。

11.权利要求8的方法，其中所述配体分子是蛋白A，所述目标分子是免疫球蛋白。

12.权利要求8的方法，其中所述配体分子是金属硫蛋白，所述目标分子是镉。

13.权利要求8的方法，其中所述配体分子是纤维素结合蛋白，所述目标分子是纤维素。

14.权利要求8的方法，其中所述配体分子是核酸结合蛋白，所述目标分子是核酸。

15.权利要求14的方法，其中所述配体是单链DNA结合蛋白或RNA结合蛋白，所述目标分子是单链核酸分子。

16.权利要求2的方法，其中所述配体是可与油体或油体蛋白结合的抗体。

17.权利要求16的方法，其中所述目标物是能结合配体抗体的细胞、细胞器或细胞组分。

18.权利要求16的方法，其中所述细胞是金黄色葡萄球菌。

19.权利要求16的方法，其中所述配体是与油体和目标物均能结合的二价抗体。

20.权利要求16的方法，其中所述配体是缀合了抗生物素蛋白的抗体，所述目标分子是生物素。

21.权利要求4、7、8、9、10、11、12、13、14、15中任一项的方法，其中所述油体蛋白是油质蛋白。

22.权利要求21的方法，其中所述油质蛋白来源于选自下列的植物：油菜籽(芸苔属各种)，大豆(Glycine max)，向日葵(Helianthus annuus)，油棕(Elaeis guineeis)，椰子(Cocusnucifera)，蓖麻(Ricinus communis)，红花(Carthamustinctorius)，芥子(芸苔属各种和欧白芥)，胡荽(Coriandrumsativum)，亚麻籽/亚麻(Linum usitatissimum)，thale cress(拟南芥)，和玉米(Zea mays)。

23.权利要求1到22中任一项的方法，其中在步骤1)中将油体和样品混合，然后保温大约1分钟到约24小时。

24.权利要求23的方法，其中混合的油体和样品在大约4℃到大约室温的范围内保温。

25.权利要求1到24中任一项的方法，其中在步骤2)中，通过离心、浮选或体积排阻而从样品中分离结合了目标分子的油体。

26.权利要求1到25中任一项的方法，进一步包含3)将目标分子与油体分开。

27.权利要求26的方法，其中所述目标分子在适当条件下经洗脱分离。

28.权利要求1到27中任一项的方法，其中所述油体得自下述植物：油菜籽(芸苔属各种)，大豆(Glycine max)，向日葵(Helianthus annuus)，油棕(Elaeis guineeis)，椰子(Cocusnucifera)，蓖麻(Ricinus communis)，红花(Carthamustinctorius)，芥子(芸苔属各种和欧白芥)，胡荽(Coriandrumsativum)，亚麻籽/亚麻(Linum usitatissimum)，thale cress(拟南芥)，和玉米(Zea mays)。

29.包含与一种分子结合的油体的一种组合物。

30.权利要求29的组合物，其中所述分子是选自由下述组成之组的目标分子：有机分子、脂质、糖类、核酸、细胞、细胞器、细胞组分、病毒、金属、金属离子和离子。

31.权利要求30的组合物，其中还含有可结合油体和目标分子的配体分子。

32.权利要求29的组合物，其中所述分子是配体分子。

33.权利要求31或32的组合物，其中所述配体分子共价结合至油体上。

34.权利要求33的组合物，其中所述配体分子是生物素。

35.一种适用于从样品中分离目标分子的亲和基质，其中包含能与目标分子结合的油体。

36.一种适用于从样品中分离目标分子的亲和基质，其中包含(a)油体，和(b)与油体结合的配体分子，其中所述配体分子能与目标分子结合。