TW589322B - Oil bodies and associated proteins as affinity matrices - Google Patents

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589322 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（2 ) 物理的配位基掘定化涉及吸附或夾帶配位塞於適當載體， 而固定化的化學模式之特徵爲，在配位基和母賛之間形成 強烈交聯或共價附著。固定化需要以此方式完成，即親和 性對偶成份彼此_認的能力，不受固定化程式的負面影 響。 現行配位基固定化所用物理和化學技術之缺點是，生 產製法常費時又昂貴。主要是由於事實上固定化技術，需 分別製簿母質材料和配位基，在隨後步驟中必須加以偶 合。翬白質另一固定化模式載於美國專利5474925號，該 項文件是酵素在棉植物纖維內固定化之生物生產系統。此 專利所揭示咸信是第一次生物製造的酵素固宰化系統，可 以一步驟生產母質和配位基。 配位基在母質上固定化之後，即可採用各種親和性基 礎的精製技術，完成親和性固定化配位基與標的成份間之 選擇性結合。習知技藝上已知的親和性基礎之精製技術， 包含禪注親和性層析、親和性排斥層析、超擴散親和性層 析、親和性沉析、隔膜親和性分隔、親和性交流超濾和親 和性沉析。最廣用的親和性基礎精製技術親和性層析，是 在層析管柱內側塗佈或填充含配位基的母質。再於層析管 柱施加含標的成份之複合混合物。理想的是只有特別辨認 配位基之標的分子，以非共儐方式結合於層析管柱，而樣 品內存在的所有其他分子種類則通過管柱。 在親和性分隔中，採用實質上不同密度之二種溶液。 含有標的成份的複合物溶液，與含有親和性配位基的不同 一 2 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4· ( 210X297公釐) " 589322 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（3 ) 密度之溶液混合。混合後，令溶液沉析，以便形成分開的 二相。分子視其大小、電荷以及與形成栢的溶液特殊瓦動， 而有在相間微分隔離之傾向。配位基結合之標的蛋白質， 可犟擇性隔離於含親和性配位基之相。例如，Coughlin和 Baclaski在《生物科技進步》1 990, 6 : 307-309內報導使 用含有機溶液異辛烷的生物素，將卵白素從水溶液傳送至 異辛烷溶液。然而，迄今親和性分隔的應用有限，主要因 目前缺乏在二相系統內特殊分隔所用之適當親和性母質物 商業上生物科技發展上的重要因素是生物產品之精 製，典型上佔總成本之50 %或以上，參見N· Labrou和Y.D. Clonis載於《生物科技會誌》36 : 95-1 1 9(1 994)，許多蛋 白質精製步驟有賴管柱型分離程序。尤其是大型高度分離 技術，諸如管柱層析或分批式基礎的蛋白質精製技術成本 高。此外，粗製物較不適用於管柱層析或分批分離，因爲 污染物會弄髒沉析樹脂和填塞管柱。因此，親和性母質往 往只用在精製過程中實質純度具有關鍵性的較後階段，蛋 白質存在濃度已極稀，或需要高質蛋白質，例如在診療用 的蛋白質之時。在生物科技製法上使用親和性技術之上述 和其他相關議題，已由N. Labrou和Y.D· Clonis在《生物 科技會誌》36: 95-1 1 9(1 994)加以檢討。 在技藝上需要開發新穎而經濟的方法，以便從複合混 合物分離和精製生物產品。本發明人已發現細胞以下的儲 油結構，稱爲油體，及其相關蛋白質，可用於此方面。 -3 — 本紙張尺度適用中關家標準（CNS ) A4規格（21GX297公釐) 一 ' (請先閲讀背面之注意事項 丨Φ — 再HR本頁

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589322 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A7 ____B7 __ 五、發明説明（6 ) 本發明其他目的、特點和優點，由以下詳述和附圖即 可明瞭。然而，須知詳細說明和相關實施例只供說明，而 在本發明範圍內的各種變化和修飾，凡精於此道之士均可 明白。此外，可參見各種出版品、專利和專利申請案，於 此全部列入參考。 圖示簡單說明 圖1爲ID序列1號和ID序列2號所示來自Arabidopsis. thaliana的18 KDa油伊紅之核苷酸和推衍氨基酸序列。 圖2爲Arabidopsis油伊紅一水蛭素熔合之序列。所示 爲一部份油伊紅基因組序列（來自van Rooijen等人1 992在 Plant MoIBiol，18; 1177-1179 所載基質 1-162 0)，隔體序 列（基質1621 63 5，劃線），以及成熟水蛭素變體二異型解 碼之合成DNA序列（基質1636-1833 ?斜體字）。此項基因 溶合是利用Arabidopsis油伊紅（基質1_861)的尸上游區， 和藍伊紅合成終結序列（基質1 85 5-2 1 09)。此序列亦稱爲ID 序列3號和ID序列4號。 圓3爲含有全部油伊紅一水蛭素構成的pCGOBHIRT 構造中所用步驟概要。 圖4爲油伊紅-水蛭素熔合蛋白質在油體上形態並結 合凝血酵素之簡圖。 圖5爲從表現油伊紅-水蛭素熔合的構造轉型的粗型 和4A4油體母質，以NaCl洗提凝血酵素的形態。 圓6爲使用抗油伊紅抗體爲配位基精製辣根過氧化物 酵素共軛抗IgG抗體，表示結合於油體的油伊紅/抗油伊 -6 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）" (請先閲讀背面之注意事項再頁)

589322 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7__ 五、發明説明（7 ) 紅/抗IgG夾包複合物形態之簡圓。 圖7表示抗IgG抗體特別結合於與做爲配合基的主要 抗油伊紅抗體複合之粗型油體（左側），以及抗IgG抗體結 合於在與次要抗體結合之前，不與主要抗體複合之油體（右 側）。 圖8爲油伊紅金屬硫因熔合之序列。表示B. napus油 伊紅 cDNA 的解碼序列（基質 1 092-1 652, yan Rooijen，1993, Calgary大學博士論文）、隔體序列（基質1 653- 1 670，劃線） 以及人體金屬硫因基因mt-II (基質1671- 1 876, Varshney和 Gedamu，1 984，《基因》3 1 : 1 3 5- 1 45)。基因熔合是利用

Arabidopsis油伊紅促進劑（基質1-1072)和Ubiquitin終端序 列（基質 U70-2361，ubi3f ; Kawalleck 等人 1 993，PlantMol· Biol. 2 1 : 673-684)。此序列亦顯示於ID序列6號和ID序 列7號。 圓9爲含有全部油伊紅金屬硫因構成的ΡΒΙΟΟΜ3'構 造所用步驟概要。 圓10爲油伊紅-金屬硫因熔合蛋白質在油體上形態 並結合鎘離子之簡圓。 圖11表示從粗型B.carinata種籽和以表現油伊紅-金 屬硫因基因熔合所轉型的B.carinata種籽，結合（A)和洗提 (B)鎘對油體母質。表示結合於油體部份的鎘，佔有從基因 變化和未轉型種籽所收穫油體部份之百分比，條碼代表重 複5次（結合）和重複3次（洗提）的平均值。 圖12表示表現S· aureus細胞的蛋白質A結合於用變 -7 — 本7氏張尺度適用中關家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) J--^-------- (請先閲讀背面之注意事項再|||^本頁) •‘I訂

589322 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（8 ) 化暈抗油伊紅IgGs處理過的油體。條碼代表按實施例5所 述程序，並使用變化量IgGs(添如IgG Ομ( 3μ^，30μ6 100μ〇 所得OD6G〇讀數。

圖13爲放大S· Aureus蛋白質A序列所示寡核苷酸原 始質（此序列亦表示於ID序列8號，蛋白質序列亦表示於 ID序列9號內）。圖示原始質BK2665WTCCATG GAT CAA CGC AAT GGT TTA TC 3，（ID 序列 10 號），Ncol 側（斜體）， 以及與病媒PRITZ2T (Pharmacia)(劃線）內所含蛋白質A基 因部份一致的序列，亦表示原始質BK 267 GC AAG CTT CTA ATT TGT TAT CTG CAG fiTC ΠΡ 序初I 1 1 膽、，Hind III側（斜體），停止授符碼（黑體），以及PRIT2T (Pharmacia )(劃線）內所含蛋白質A基因一部份相輔之序 列。PCR生成物以Ncol和Hind III消化，並結紮於 pCGNOBPGUSA (Van Rooijen 和 Molorey，1 995，Plant Physiol，109 ： 1 353- 1 36 1 )，由此除去 Ncol-GUS-Hind III 斷片。 圖14爲Arabidopsis油伊紅—蛋白質A熔合之序列（此 序列亦顯示於ID序列12號，而蛋白質序列亦見於ID序列 13和14號）。圖示爲一部份油伊紅基因組序列（由基質1-1 626，載於 Van Rooijen 等人，1 992, Plant Mol. Biol· 18 : 1 1 77- 1 1 79)，凝血酵素裂解側編碼之隔體序列（基質1 627-1 647，劃線），以及蛋白質A編碼之DNA序列（基質1 648-2437，斜體）。表現是利用Arabidopsis油伊紅的Arabidopsis 上游區（基質1 -867)和藍伊紅合成終端劑區（基質2437- —8 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） —?;11-: —------- (請先閲讀背面之注意事項再||||*本頁)

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589322 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（11 ) 油體蛋白質具有天然親和性的蛋白質以外之分子。 在另一具體例中，配位基是利用化學或重組手段，共 價連結於油體或油體蛋白質。製備熔合或共軛用的化學手 段，在技藝上已知，可用來製造配位基-油體蛋白質熔合。 用來將配位棊和油體共鈪的方法，必須能把配位基與油體 蛋白結合，而不得配位基結合於標的分子之能力。配位基 爲可跨越油體或油體蛋白質，以及諸如蛋白質、核酸、碳 水化合物或小有機分子（諸如生物素）等標的分子之任何分 子。配位基可共價附設於油體，例如，油體可用來從樣品 分離卵白素。本發明亦包含改質之油體，諸如生物素化油 體，用做親和性母質。因此，本發明包含一種組成物，包 括附於分子的油體，諸如配位基或標的分子。 在較佳具體例中，配位基爲蛋白質，可用技藝上已知 技術共軛於油體蛋白質。有數百種交聯劑可將二種蛋白質 共軛，例如參見《蛋白質共軛和交聯之化學》，1991，Shans Wong，CRC出版社，Ann Ai bo r。交聯劑一般是根據可得或 插在配位基上的反應性功能團選擇。此外，若無反應基， 可用光活性交聯劑。在某些情況下，需在配位基和油體蛋 白質之間含有隔體。技藝上已知的交聯劑包含均雙官能 劑：戊醛、二甲基己二醯二亞胺物和雙（重氮聯苯胺），和 異雙官能劑：間馬來醯亞胺苯申醯基- N -烴基丁二醯二 亞胺和碳間馬來醯亞胺苯甲醯基- N -烴基丁二醸二亞 胺。 配位基蛋白質-油體蛋白質熔合，亦可用重組DNA技 — 11 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再本頁)

589322 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（12 ) 術製造。在此情況下，對配位基編碼的DNA序列熔合於對 油體蛋白質編碼的DNA序列，造成交移性DNA分子，表 現配位基-油體蛋白質熔合蛋白質（詳後），爲製造重組熔 合蛋白質，必須已知或可得_配位基編碼之PN A序列。「可 得」指足以將蛋白質配位基編碼的DNA序列，可由已知氨 基酸序列導出。不一定用到配位基的全部基因序列，惟對 蛋白質配位基的結合領域編碼的周序列要知道。所以，需 知「配位基」係指所述特定配位基蛋白質之完全序列或結 合領域。 若所需配位基的DNA序列已知，基因可用寡核苷酸合 成劑，以化學方式合成。另外，攜帶配位基基因的同本生 物，可由cDN A或含基因的基因組庫，以標誌的相輔DN A 序列探測而得。基因亦可使用基因特定寡核苷酸原始質和 PCR，由庫特別放大。若所需配位基的DNA序列未知，則 透過蛋白質的N -終端序列，可得部份氨基酸序列，參見 Matsudaira 1987; J. Biol. Chem. 262 ： 10035-10038 0 標誌 探針可根據由此氨基酸序列導出並用於上述篩檢cDNA或 基因組庫之DNA序列合成。攜帶基因的同本生物亦可以對 蛋白質配位基栽培的抗體，或以標的蛋白質探測，而由 eDNA表現庫檢定。 配位基亦可以標的探測蛋白質混合物而揭開。標的可 固定在載體母質上，並用來篩檢由細胞和組織萃取，或以 化學方式合成的蛋白質。在配位基蛋白質與固定標的間結 合後，母質從溶液分離並洗淨。蛋白質配位基隨即從母質 一 1 2 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再頁)

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589322 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ___B7_五、發明説明（B ) 洗提，按上述確定序列。另外，由嗜菌體顯示劑產生的重 組蛋白質庫，諸如包括組合肽序列/Smith，1 985;《科 學》，228 : 1315-1317)或抗體組成部份（Griffiths等人，1 994, EMBO J. 13 ： 3245-3260, Niaaim 等人，1994, EMBO J. 13 ： 692-698)，即可以固定化標的篩檢。在此情況下，蛋白質 配合基和標的間的結合，會使表現配位基的嗜菌體，從對 非結合蛋白質編碼的嗜菌體大量複雜群數，分離和回收。 諸如在酵母內的二種混雜系統（Fields和Sternglanz, 1 994; Trends Geuet，10 : 2 86-292)，亦可用來從表現的 cDN A 庫 檢定配位基。於此，基因熔合是建構在標的蛋白質編碼序 列與DNA結合蛋白質之間。含有此項構成的細細胞，是由 序列已熔合於轉錄活化劑之cDNA庫構造轉型。衍自cDNA 庫的配位基與標的蛋白質間的結合，容許發生記錄基因的 轉錄。然後，將表現配位基的同本生物回收。 爲了對油體特別揭開配位基，在上述任何方法中，可 用完全或部份油伊紅蛋白質爲標的。另外，可採用原狀的 油體來篩檢蛋白質萃取物、合成肽或嗜菌體顯示劑庫。在 此情況下，油體可兼用做標的和固定化母質。使用此項措 施，可以揭開更多種類的配位基；顯示不但對油伊紅，且 對油體上存在的其他抗原決定基，具有親和性。 油體和油體蛋白質 油體爲小型球狀，細胞以下的小器官，包容儲存的三 醯基甘油酯，由許多植物所用的能量資源。雖然見於大部 份植物和不同組織，在油籽的種籽內特別豐富，其直徑大 一 13 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再頁)

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589322 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ___B7__五、發明説明（Η ) 小從1微米以下至數微米。油體包括三醯基甘油酯，以半 單元膜的磷脂包圍，並埋獨特型蛋白質，稱爲油體蛋白質。 於此所用「油體」包含任何或全部三醯基甘油酯、磷脂， 或完整結構內存在的蛋白質成份。「油體蛋白質」指與油 體天然相關的蛋白質。油體蛋白質若衍生自植物，亦稱「油 伊紅」。油伊紅從許多植物源，包含榖類、油菜籽、胡蘿 蔔、棉等，繁殖和序列。油伊紅蛋白質呈現包括三個領域·· 蛋白質的兩端，即N -和C -終端，大部份親水性，並位 於對溶細胞劑的油體表面，而油伊紅的高度疏水性中心芯 部則牢靠固定在隔膜和三_基甘油酯內。來自不同種類的 油伊紅代表小群蛋白質，顯示有相當的氨基酸序列保存， 尤其在蛋白質的中央區內。個別種類中會存在少數不同的 異型。 來自個別種類的油體顯示粗略均勻尺寸和密度，部份 視正確蛋白質/磷脂/三醯基甘油酯組成物而定。結果， 可從懸浮於其中的不同密度之液體，簡單而且快速分離， 例如在密度較油體爲大的水性媒質內，會在重力或應用離 心力的影響下浮動。在密度較油體爲低的95 %乙醇內，會 在同樣情況下沉析。油體亦可利用根據尺寸分餾的方法， 從液體和溶液或懸浮液內存在的其他固體分離。例如，來 自B. napus的油體直徑最少約0.5μιη，因此可用細胞尺寸 較此直徑爲小的隔膜過濾器，從較小成份分離。 本發明油體由種子植物製得爲佳，更好是包括油茶籽 (Brassica spp.)、大豆（Glycine max)、向日葵（Helianthus 一 14 一 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再mN:頁) 太 訂

589322 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ____B7__ 五、發明説明（10 ) 上重複至少三次，然後初用凝膠電泳測得，油體視爲充分 不含污染的可溶性蛋白質9不一定除去全部水相，於最後 製劑可添加水或50mM Tris-HCl pH 7.5，可視需要將pH 值降至pH 2或提高到pH 10。從油籽分離油體的程序，可 參見 D.J. Murphy 和 I. Cummins, 1 989，《細胞化學》28 : 2063-2069 ；以及 T.J. Jacks 等人 1 990，JAOCS，67 ： 3 53-361，較佳程序見本案實施例1。 親和性母質 本發明優點是標的物質可從樣品經由與油體的非共價 關聯，接著分離油體，而精製或除去。可有許多不同的油 體-配位基形態。水蛭素對凝血酵素，或重金屬對金屬硫 因等等，對特定配位基蛋白質具備固有親和性之標的，可 以含有配位基熔合於油伊紅的油體，加以精製或分離。另 外，蛋白質標的亦可利用標的熔合於油體-特定配位基， 或與熔合於油伊紅相輔的配位基，而以油體親和性母質精 製或分攤。如有需要，蛋白酵素認識位置或化學裂解位置， 可在配位基和標的蛋白質之間工程化，使在精製過程中， 配位基可從標的蛋白質以蛋白質分解方式除去。亦可構成 多價配位基，諸如雙價單鏈抗體，其中配位基之一領域對 油體具有親和性，另一領域顯示對標的之親和性，在此情 況下，油體或標的分子均不需共價熔合於配位基。又，配 位基的Concatamers可用來提高母質對標的之親和性，或 配位基的序列可視情況需要突變，以調變對標的之親和 性。再者，不同配位基的混合物可熔合以同時回收/除去 一 16 — 本紙張凡度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再 本頁)

589322 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（18 ) 人等確定。一般而言 > 油體蛋白質的N -終端和疏水性芯 部，足以提供熔合蛋白質標的於油體。尤其是對衍自 Arabidopsis thaliana植物的油伊紅而言，在此方面，氨基 酸2至123 (如ID序列1號所示）即足夠。 配位基可熔合於油伊紅的N -和/或C -終端，亦可 在配位基和油伊紅間構成內部熔合，或將配位基熔合在二 油伊紅蛋白質之間，對熔合於配位基的油體蛋白質編碼的 交移DNA序列，可感染於適當病媒內，用於植物轉型。例 行上採用二種病媒。第一種病媒用於基因工程和構造總 成，典型上包含例如pUC族病媒所見架構，得以容易操作 方式重複，並維持大腸桿菌等格蘭姆氏陰性菌。第二種病 媒以Ti和Ri質體爲典型，特定DN A轉移功能，且用在需 將構造引進植物時，可藉草原桿菌屬（Agrobacterium)調解 轉型穩定整合於其基因組內。 典型的構造在V至3'方向包含，可在植物內指導表現 (尤指種籽特定表現）的促進劑所完成調整區、蛋白質入碼 區，以及含有在植物內轉錄終止信號功能之序列。包括構 造的序列可爲天然或合成，或其任何組合。 非種籽特定促進劑，諸如35-S CaMV促進劑（Rothstein 等人，1 987;《基因》53: 1 53- 1 6 1 )，和種籽特定促進劑， 諸如腰豆蛋白促進劑（Sengupta-Gopalan等人，1 985 ; PNAS USA 82 ： 3 3 2 0 - 3 3 2 4 )或 Arabido p sis 1 8 kD a 油伊紅 (VanRooijen等人，1992 ; Plant Mol. Biol. 18 ： 1 1 77-1 1 79) 促進劑均可用。除促進劑外，調整區含核酸糖小體結合位 (請先閲讀背面之注意事項再mN:頁) 訂

本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS )八4規格（2!0X297公釐） 589322 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（19 ) 置，使轉錄在植物內轉譯，並可含一種或以上的增進劑序 列，諸如AMV引導體（Jobling和Gehrke 1 987 ;《自然》 3 25 : 622-625)，以提高生成物的表現。 構造的入碼區典型上包括的序列，將‘框內熔合的酡位 基入碼於油伊紅，以轉譯性終結同本生物結束。油伊紅的 序列可包括任何DNA序列或其一部份，無論天然或合成， 足以將可正確標的於和穩定表現在油體上的蛋白質編碼。 此種序列的特徵詳細說明，以前已載於Moloney，1 993 ; 世界專利（PCT)申請案W0 93/213 20，於此列入參考。序列 亦可含有introns，配位基編碼區從而可包括任何上述單獨 或組合配位基序列。如有需要，蛋白酵素或化學認識位置 可在配位基和標的蛋白質之@實現，使得精製過程中，配 位基可從標的蛋白質以蛋白分解方式除去。 含有轉錄終結信號的區域，可包括植物內的任何功能 序列，諸如藍伊紅合成終結序列，另外可含增進劑系列， 以提高生成物表現。 構造的各種成份使用習知方法結紮在一起，典型上進 入pUC質病媒內。此構造即可使用下述轉型程序之一，引 進草原桿菌屬病媒內，隨後進入宿主植物內。 將DNA引進宿主細胞內可各種技術可用。例如交移性 DNA構造可使用標準草原桿菌屬病媒引進雙子葉植物，例 如煙草，和油質種類，諸如B. napus，所得宿主細胞內； 利用轉型程序，諸如Moloney等人，1 989 (Plant Cell Rep.， 8 : 238-342)或 Hinehee 等人，1 988 (Bio/Technol.，6 : 915· —19 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項 — —^^1 再IPr本頁

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589322 經濟部中央橾準局貝工消費合作社印製 A7 B7_ 五、發明説明（20 ) 922)所述，或專家所知其他技術爲之。例如，使用T-DNA 於植物細胞的轉型受到密集研究，並充分記載於EPA案號 1205 1 6 ; Hoekema等人，1 985(《二元植物病媒系統》內第 五章，Kanters Β· V·平版印刷，Alblasserdam) ; Knauf 等人， 1983(《利用草原桿菌屬表現的宿主範圍之基因分析》第 245頁，在《細菌—植物互動之分子遘傳學》，A· Puhler 編，Springer出版社，紐約）；以及An等人，1 985 (EMBO J·， 4 ： 277-284)。爲 了方便，移植可用 A· Tumefaciens 或 A· thizogenes培養，使轉錄構造移到植物細胞。使用草原桿 菌屬轉型後—植物細胞分散於適當媒質內，以供選擇，隨 即結痂、發芽，最後樹苗復甦。草原桿菌屬宿主可停泊質 體，包括T-DN A移至植物細胞所必要的病毒基因。爲了注 射和electroporation(詳後），可將無害的Ti質體(缺乏腫瘤 基因，尤其是T-DNA區）引進植物細胞內。 使用非草原桿菌屬技術，得以用到上述構造，在各種 單子葉和雙子葉植物以及其他生物內，獲得轉型和表現。 此等技術特別有用於草原桿菌屬轉型系統內棘手的品種。 基因轉移的其他技術包含biolistics (Sanford，1 988,《生物 科技趨勢》6 ： 299-302)，electroporation (Fromm 等人， 1 985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 ： 5824-5828 ； Riggs 和 Bates，1986，Proc. Natl. Acad· Sci· USA，83 : 5602- 5606)，或 PEG 突變之 DNA 攝取（Potrykus 等人，1985，Nol· Gen. Genet., 19 9 ： 169- 177) 〇 在諸如對B. napus的特殊應用中，標的在於接受重組 -20 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再頁)

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589322 A7 B7 五、發明説明（21 ) DNA構造的宿主細胞，典型上如Moloney等人（丨989, Plant CellRep·，8 : 238-242)所述，由子葉之葉炳衍生。使用商 業化油籽的其他例，包含在大豆移植中的子葉轉型 (Hinchee 等人，1 988, Bio/Technology，6 ： 91 5-922)，以及 棉之幹莖轉型（umbeck 等人，1981，Bio/Technology，5 : 263-266) 〇 轉型後，例如呈葉園片的細胞，即在犟擇性媒質內生 長。一旦開始發芽，即切除，放在生根媒質上。生根充分 後，植物移至土壤。假想轉型植物即試驗識別劑的存在。 使用適當測試劑，例如A. Thaliana油伊紅基音，對基因組 DNA進行南方斑點，顯示已發生所需序列整合於宿主細胞 基因組內。 表現卡匣通常結合於識別劑，以供在植物細胞內選 擇。爲方便起見，識別劑可對例如phosphonothricin或 glyphosate等除草劑，或尤其是康納黴素、G418 、 bleomycin、hygronyein、chloramphenicol 等抗生素具有 抵抗性。採用的特殊識別劑，可爲得以選擇轉型細胞，與 缺乏引進重組DNA的細胞可以媲美。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 上述構成的表現卡匣內之熔合肽，至少在發展的種籽 內優先表現。因此，按照習用方式成長的轉型植物，可以 使種籽定型。例如參見McCormick等人（1 98 6，《植物細胞 報告》5: 81-84)。使用具有從預料會發生轉錄的組織所 單離的RNA，諸如種籽胚芽之適當基因測試劑，可進行北 方斑點。轉錄大小即可與熔合蛋白質轉錄之預計大小比 -21 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589322 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（24 ) 動物，都含有蛋白質，可與離子、金屬、核酸、糖類、類 脂物和其他蛋白質等劑特殊互動。此等用劑可以使用油體 技術加以固定。 油體蛋白質親和性母質可用來分離任何標的分子，可 直揆或間接透過配位基分子結合於油體蛋白質。使用本發 明方法從樣品單離標的分子之例，包含蛋白質、肽、有機 分子、類脂物、碳水化合物、核酸、細胞、細胞斷片、病 毒和金屬，特別是本發明人等已表明本發明親和性母質可 用來分離治療蛋白質（諸如凝血酵素）、抗體、金屬（諸如 鎘）、碳水化合物（諸如纖維素）、有機分子（諸如生物素）， 以及細胞（諸如細菌細胞）。 油體親和性母質亦可用來從細胞的混合群數分離工業 上或醫藥上有用的細胞。例如造血幹細胞（爲血液細胞的副 群數，用於骨髓移植和幹細胞基因治療），即可用油體基礎 的轆和性技術，從其他血液細胞分離。在箪組DNA技術中， 常需將成功引進重組DNA的細胞（稱爲轉型細胞），從無法 要求重組DNA的細胞分辨和分離。只要部份重組DNA表 現細胞表面蛋白質，與油體基礎的親和性配位基相輔，即 可利用油體從牵轉型細胞分離轉型細胞。油體親和性技術 亦可用於從其他細胞材料分離葉綠質小粒和線粒體等細胞 小器官。 亦可將稱爲金屬蛋白質的蛋白質類（含有特別結合離 子的彌補基）固定。金屬蛋白質例有結合離子的血紅素、結 合鈣的小清蛋白，以及結合鋅和其他金屬離子的蛋白質， —2 4 一 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格（210 X 297公釐）~" (請先閲讀背面之注意事項 N! 再本頁)

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2 2 3 9 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（25 ) 即金屬硫因。設想油體可用來從流動材料流，可能是來自 貪驗室和工業製法的廢金屬所污染水，清除金屬。下述實 施例4進一步說明此應用。可以生物固定和在生物治療策 略中採用蛋白質的其他實施例，包含從廢液流除去磷酸 鹽、硝酸鹽和酚類。過去，此項策略可以克服細菌生物治 療的真實或感知的限制。在某些例中依賴親和性隔離技 術，從標的化合物分離油體母質，不切實際或沒有必要。 在此等例中，設想油體可固定在平坦表面或管柱表面之固 體惰性表面上。含親和性配位基的溶液即可通過塗有固定 油體的表面，於此發生選擇性的親和性結合。設想固定油 體可用在管內或池內，有助生物治療。 以下實施例用來說萌油體用做親和性母質的各種系 統。須知下列實施例旨在說明而非限制。 實施例 凝血酵素的精製 以下實施例證明油體親和性母賛用於精製凝血酵素， 凝血酵素是一種絲氨酸蛋白酵素，扮演血液凝結的中央角 色。將纖維蛋白原分裂，生成纖維素單體，會聚合形成血 凝塊的基礎（Fenton 1981 ; Ann· N.Y. Acad· Sci. 370 : 468-495)。α -凝血酵素是由二硫化物橋接的：±種聚肽鏈 36(A —鏈）和2 59(B —鏈）所構成，參見Degen等人1 983 ; 《生物化學》 22 : 2087-2097 。在醫療水蛭（Hirndo medicinalis)的唾液腺發現的水蛭素，爲凝血酵素極爲特別 和潛在的抑制劑。抑制是水蛭素對〇(-凝血酵素鏈特殊部 —2 5 — 請 先 閲 面 之 注 項 本 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589322 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（2ό ) 份產生非共價結合的結果（81〇1^和11(^16€1^6 1986;《生物 化學》25 : 4622-4628)。 固定化配位基包括溶合於18 kDa Arabidopsis油伊紅 (油體蛋白質）的水蛭素典型（Van Rooijen等人，1 992 ; Plant Mol· Biol. 1 8 : 1 1 77- 1 1 79)。構造的表現是利用 Arabidopsis 18 kDa油伊紅促進劑調整（an Rooijen等人， 19 94 ; Plant Mol. Biol· 18 : 1177-1179)，油伊紅一水蛭 素熔合的序列見於圖2和ID序列3號。 油伊紅-水蛭素構浩 寡核苷酸原始質是基於Brassica napus油伊紅基因的 報告序列而設計（Murphy 等人，1991 Biochin Biophys，Acta· 1 088: 86-94)，用來放大從B.Napus基因組DNA通過PCR 的斷片。使用此斷片爲測試劑，帶有l5kbp插入物的同本 生物，可由EMBL 3 Arabidopsis基因組庫檢定和單離。寡 核苷酸原始質用來從含有全部油伊紅入碼序列和intron， 加上5'上游區的840基對，將斷片放大。原始質的設計在 於消除轉譯停止授符碼，在斷片的5'末端引進Pst I限制 內核酸酵素認識位置，在V末端引進Sal I接著Ρνιι I位 置。斷片在末端充填，並結紮於質體病媒PUC19的Sma I 位置。來自質體pBI (Clontech)的Sal I - EcoR I斷片， 包括藍伊紅合成酵素終端劑序列，即插入以發生pOBILT。 合成水蛭素變镰2(HV2)序列，是根據所載序列資料合 成（Harvey 等人，1986，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 ·· 1084-1088)，但採用 B. napus 和 Arabidopsis 授符碼用法。 一 26 — ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) 一 (請先閲讀背面之注 事項再 ▼本頁) 、^τ

589322 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 __B7__五、發明説明（2々） 序列是使用四個重疊寡核苷酸原始質（設計成分別在Y和 3'末端造成擁有ΡνιιΙ和Sail位董之斷片）放大。此斯片係 結紮於pUC 19質體病媒的Sma I位置，以發生pHIR。來 自pHIR的Pvu I — Sal I即插入油伊紅與終端劑序列間的 pUCOBILT內，形成與油伊紅入碼區在框內熔合，得 pUCOBHIRT。全部構造即副繁殖入pBluescript KS + (pBIOBHIRT)內，再進入 pCGN 1 559 質體（McBride 和 Summerfelt，1 990，Plant Mol· Biol. 14 : 269_276)的 Pst I 位置，在35-S CaMV促進劑（pCGOBHIRT)控制下，帶有新 黴素磷轉移酵素。此質體即引進發腫草原桿菌內。此質體 之製造見圖3。 轉型和再生 草原桿菌屬和植物的轉型程序已如前述。發腫草原桿 菌以上述構造透過electroporation轉型（Dower等人， 1 988 ； Nucl. Acids Res. 16 ： 6127-6145)。轉型的細菌即 用來將Brassica napus的子葉類移植轉型，接著按照 Moloney等人的方法進行植物再生（1989, Plant Cell Reports 8 : 238-242)。基因轉變植物起先使用新黴素磷轉移酵素 檢定，隨即以透過北方免疫斑點分析測得油伊紅-水蛭素 熔合表現確認。 油體之製造 對照組（非基因樊化）植物或表環油伊紅-水蛭素熔合 的基因變化植物之種籽，在5倍容量的冷磨緩衝液（50mM Tris-HCl，pH 7.5, 0.4M 蔗糖和 0.5M NaCl)內勻化，使用高 -27 - 請 先 閲 讀 背 面 之 注 意 事 項 rt 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 589322 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（28 ) 速操作的polytron爲之。勻化物以大約1〇 X g離心30分 鐘，除去粒狀物，並從含大量可溶性種籽蛋白質的水相， 分離油體。油體是以金屬刮鏟從上澄清表面清除，放入1 容量的新研磨緩衝液內。爲了在隨後步驟內達成有效洗 淨，重要的是要確保油體徹底再分散。此係以低速操作的 polytron，將油體在研磨緩衝液內徐徐再勻化所完成。使 用注射筒，令再魅浮油體在5倍容量的冷50mM Tris-HCl， pH 7.5下小心分層，按上述離心。在離心後，再除去油體， 洗淨程序重複三次，除去污染可溶性種籽蛋白質的殘渣。 最後，洗過的油體製劑再懸浮於1容暈的冷50mM Tris-HCl pH 7.5內，以polytron再分觳，即備妥用做親和性母質。 凝血酵素的親和性精製 凝血酵素使用油伊紅-水蛭素熔合蛋白質精製，如圓 4簡示。爲了評估凝血酵素的結合，從表現油伊紅-水蛭 素熔合蛋白質的基因變化Brassica napus種籽（4A4種籽 (Parmenter等人《植物分子生物學>(1995) 29 : 1 167-1 1 80) 和野生Brassica napus cv westar種好，製備親和性母質， 評估凝血酵素對二種母質的結合，從種籽製造洗淨油體的 程序，與上述相同。含凝血酵素活性範圍在0和1單位間 的溶液，與 500μ/結合緩衝液（50mM Tris^HCUpH 7.5) ; 0.1 %(w/v) BSA)內的10μ〖固定量親和性母質（由總共10毫克 乾種籽；相當於大約l〇〇Mg的總共油體蛋白質）混合。油體 懸浮液在水上培育30分鐘，在4 °C以14000 rpm離心15分 鐘。含未結合的游離凝血酵素之油體下方緩衝液（稱「下厣 一 2 8 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再！PN：頁)

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589322 A7 ____;_B7__ 五、發明説明（29) 液使用皮下針回收，按下述鑑定凝血酵素活性，於700μ/ 結合緩衝液共添加25 Ομ彳的下層液，預溫至37 °C。於下層 液添加50μβ的ImM凝血酵素基材N —對甲苯磺醯一 gly -pro — arg —對硝基醯替苯胺（Sigma)後，以分光光度測量 方式監視405nm光學密度3分鐘。使用含已知凝血酵素濃 度的一組凝血酵素樣品構成之標準曲線，用來決定凝血酵 素在檢定混合物內之濃度。由此等鑑定所得數值，用來計 算結合凝血酵素的濃度，假設： 結合凝血酵素=總共凝血酵素-游離凝血酵素 結合凝血酵素濃度對游離凝血酵素之比，做爲結合凝 血酵素濃度的函數描圓（Scatchard圓）。按照標準程序由圓 算出親和性母質的解離常數（Scatchard，G· Ann· Ν·Υ· Acad· Sci. (1949) 57 : 660-67 2)，假設 Ka= 1/Kd，親和性母質 的解離常數對野生型爲3.22X 10_7m，對4A4油體爲2.60 X 10'8m 〇 爲評估從母賀回收結合凝血酵素，採用NaCl梯度。結 合於油伊紅-水蛭素油體母質的凝血酵素之洗提形態，與 結合於野生型油體母質之凝血酵素形態比較。由野生型 Brassica napu$ cv Westar種好製造野生型油體，以及由 Brassica napixs 4A4種籽製造油伊紅一水蛭素油體之程序 (Parmenter等人，《植物分子生物學》（1995) 29 : 1 1 67- 1180)，與上述一致。凝血酵素結合於母質的程序已如上 述。惟使用1〇〇μ彳份暈的油體結合0.5單位的凝血酵素。 油體懸浮液留在冰上30分鐘，再在4 °C和14000 rpm離心 -29 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 請 先 閱 讀 背 Λ 之 注 項 I 本 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589322 A7 B7 五、發明説明（30 ) 15分鏵。下層被檢定（未結合）凝血酵素活性。油體母質再 懸浮於結合緩衝液內，其中加NaCl至蕞後濃度爲0.05M。 油體懸浮液開始在冰上培育30分鐘，重複程序5次，逐步 提高NaCl濃度。所用蕞後NaCl濃度爲0·05Μ，0·1Μ，0·2Μ， 0·3Μ，0,4Μ，0·6Μ。凝血酵素檢定中的NaCl濃度在150mM 保持一定。圖5表示使用野生型油體和4A4油體所得洗p 形態。 實施例2 使用抗體爲雙價配位基 抗體可用做雙價配位基，因其對特殊抗原決定機和其 他抗體均有親和性，或對免疫球蛋白（IgGs)具有親和性的 蛋白質（例如金黃色葡萄球菌蛋白質A)。在此例中，多繁 殖抗油伊紅抗體，用做雙價配位基，而兔體內對於抗油伊 紅抗體生成的抗體，則用做標的P此例如圖6簡示。 油體是按照實施例1所雄程序，由5克野生型Brassica napus cv Wrstar種籽製成。油體隨即用100mM甘氣酸（pH 2.5)洗二次，透過結合緩衝液（5〇111]^1'1：^11(：10117.5)內洗 淨二次中和，再懸浮於5毫升結合緩衝液內。洗後油體製 劑的150μ〖份量，與含抗油伊紅抗體（配位基抗體），以結 合緩衝液稀釋1 : 10的500μ〖兔血清合併。油體懸浮液徹 底混合，在4 °C攪拌下培育1小時。培育後，透過1毫升結 合緩衝液洗三次，從油體懸浮液除去未結合配位基抗體。 油體再合併500μ〖血清，在結合緩衝液內稀釋1 : 500， 含抗兔IgG抗體（標的抗體），與辣根過氧化物酵素（HRP) 一 30 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐> ' (請先閲讀背面之注意事項再 ▲ II 本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589322 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ____B7 _五、發明説明（31 ) 共軛，做爲檢測標誌（Sigma)。此項懸浮液在抗油伊紅抗體 結合所用同樣條件下混合和培育。一如對照組，擦的抗體 以原先未結合於配位基抗體的油體培育。二樣品隨即用1 毫升結合緩衝液洗四次，除去未結合抗體。使用結合緩衝 液，以分光光度測量方式在600nm測量樣品濁度確定，樣 品相對於油體濃興平衡。爲檢定結合標的抗體，取含5 μ， 油體的樣品，與1毫升HRP比色基材四甲基聯苯胺，在0.01 %適氧化氫內混合，於室溫反應10分鐘。添加5 00μ〖的1Μ H2S04停止反應，測定在45〇nm的吸收。利用檢定5μ^的 最後洗液部份，校正洗淨後殘留未結合標的抗體的存在。 對照組和配位基結合油體製劑所得結果，列於圖7。 實施例3 使用油伊紅-特定配位基 使用油伊紅-特定配位基代表使用抗體或以基因方式 實施的油伊紅熔合蛋白質，以精製重組標的蛋白質之變化 例。在此情況下，標的蛋白質熔合於油伊紅-特定配位基， 而非基因變化種籽的油體上呈現的內生油伊紅，則用做相 輔配位基-親和性母質。除不需表現油伊紅熔合的基因變 化線外，此項措施可提高親和性母貧的總體容量，因爲所 有內生油伊紅如今均可參予結合。 油伊紅-特定配位基可由油伊紅蛋白質篩檢的肽嗜菌 體顯示劑庫檢定和單離。由於油伊紅中央領域的極端疏水 性，會造成蛋白質從油體除去時的凝聚和沉析，缺此領域 的突變蛋白質即可用於篩檢。對配位基功效的效果少，因 -31 - 請 先 閲 讀 背 之 注 意 事 項 Η 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 589322 A7 ___B7_ 五、發明説明（32 ) 爲只有油伊紅的親水性部份才暴露於細胞漿（即N-和C -終端）。因此，係可結合於配位基的唯一區域。一旦單離後， 配位基郎可熔合於琿常記錄體蛋白質、綠色螢光蛋白質 (GFP)(Prasher，1 995，Trends Genet，11 : 320-323)，以證 實精製。 除去油伊紅中央領域 上述特別供Arabidopsis油伊紅基因用的寡核苷酸原 始質，可用來從B. Napus cDNA庫放大油伊紅基因（Van Rooijen 1993, Calgary大學博士論文）。對N -終端62氨基 酸和C -終端55氨基酸編碼的原始質側腹序列，可用來放 大分開反應中N-和C-終端油伊紅領域之序列。另外， N -終端領域的5'末端用原始質，含有凝血酵素認識位置 用之序列，使熔合蛋白質按下述裂解。所得斷片結紮於細 菌表現病媒pEZZ18(Pharmucia)的Smal位置內。此病媒含 有對信號肽編碼之序列，使蛋白質分泌入核外漿內，而衍 生自蛋白質A的合成IgG結合領域，方便蛋白質在多次繁 殖位置下游的精製。 油伊紅削除構造之表現和精製 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 帶有削除突變構造的病媒，使用標準方法和選擇的轉 型體，引入大腸桿菌內。轉型細菌的培養基可藉添加ImM IPTG，誘發表現合成蛋白質A -突變油伊紅熔合蛋白質。 被誘發細胞可製粒和再懸浮於5mMMgS04內，造成核外漿 隔膜透過滲透衝擊而溶解。溶解的細胞經離心，而含有分 泌蛋白質的上層液，即加載於含IgG偶合Sepharose的管柱 一 32 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇χ297公釐） 589322 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（33 ) 上。洗淨除去未結合蛋白質後，管柱加載緩衝液，含50mM Tris-HCl，pH 7.5, 150mM NaCl 和 1.0 U/ml 精製半凝血酵素 (Sigma)，將突给油伊紅從合成蛋白質A裂解〇在37 χ：培 育4小時後，將管柱排放，令洗提液通過肝磷脂偶合的 Sepharose，除去凝血酵素。由此管柱回收含突變油伊紅蛋 白質的洗提液，藉凝P電泳，接著以Coomassie藍R250染 色，檢驗蛋白質的純度。 發生肽組合庫 按照Scott和Smith方法（1 990,《科學》299 : 386- 3 90)，可發生隨機肽駔合庫。簡言之，PCR用來放大含有 變性序列（NNK)6的合成DNA斷片，其中N代表脫氧核苷酸 G，A，T，C之等量混合物，而K代表脫氧核苷酸G和T之等 貴混合物。變性序列爲六聚物肽編碼：其中代表20種氨基 酸和琥珀停止授符碼的每種可能組合。PCR生成物結紮於 絲狀嗜菌體fUSE的基因III序列內，所得嗜菌體粒透過 electroporation引進大腸桿菌內。 油伊紅-特定配位基的檢定和單離 嗜菌體顯示劑庫在l〇12tdu/ml份量內放大、濃縮和 儲存。精製的突變油伊紅蛋白質利用硫赶裂解性連結劑（S - S生物素，Pierce)加以生物素化，並利用尺寸排除層析 法精製。2毫升內含5X l〇Htdu的肽嗜菌體顯示劑庫份 量，以50πΜ濃度的生物素化蛋白質篩檢。結合突變油伊 紅蛋白質的嗜菌體，使用鏈卵白素塗佈的順磁性粒回收。 洗淨律，嗜菌體藉添加5ΟιιΜ二硫代蘇氨醇洗提，裂解二 一 33 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再IPk本頁)

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2 2 3 9 A7 B7 五、發明説明（34 ) 請 先 閲 讀 背 面 之 注 意 事 項 硫化物鏈。洗辑的嗜菌體郎以過量log-phaseF +大膜桿菌 培育。被感染細胞的份量弄成平板，決定嗜菌體標度，其 餘細胞用於接續次數的放大和筛檢。洗提過的嗜菌體以3-4 倍數洗提，選用個別嗜菌體，並試驗直接以ELISA結合於 突變油伊紅。藉嗜菌體結合，是使用抗嗜菌體抗體探測 (Cro by和Schorr，1995，《細胞生物學年度回顧》），從顯示 結合和測得肽編碼序列的嗜菌體，單離出單一檫準DNA。 以油伊紅-特定配位基之親和性精製 按上述單離的油伊紅配位基之序列，在對GFP編碼的 gfp 10 (Prasher 等人，1?92,《基因 > 111 : 229-233)用序 列，和結紮於細菌表現病媒PKK 233 (Pharmacia)內的構造 上游，熔合於框內，可溶性蛋白質透過誘_表現配位基-GFP熔合的細胞聲波降解法萃取，並在50mM Tris-HCl，pH 7.5內調至濃度10 mg/ml。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 取20毫升蛋白質溶液，與按上述由非基因變化植物的 種籽所製成的2毫升油體混合。混合物在4 °C攪拌培育30 分鐘，容許結合，並離心分離油體和可溶性分部。除去油 體後，留在可溶性分部內的GFP量，利用螢光分光測量術， 在波長50 8nm測量，與原有細菌萃取物比較。計算結合GFP 量，決定母質的容量。

油體在20毫升5〇]^]^丁1^-11(：1，？117.5內洗兩次，於2 毫升同樣緩衝液內再懸浮，分成20份1 00μ〖，添加pH 2_ 10範圍的1毫升溶液，在0-1M不同份量的NaCl濃度內， 測定配位基- GFP熔合蛋白質的洗提條件，混合並在4 °C -34 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589322 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ___B7_五、發明説明（35 ) 培育30分鐘後，除去油體，收集可溶性分部。可溶性分部 內的配位基- GFP熔合蛋白質量，利用螢光分光計測量。 實施例4 除去重金屬離子 下述寅施例證明利用油體親和性母質，從複合物溶液 回收/除去非蛋白質標的。爲此實施例，使用金屬硫因/ Cd + +配位基對偶。然而，其他金屬結合蛋白質，諸如植物 蜜合劑（Rauser，1990 ; Ann.Rev.Biochem ; 59 : 61-86)， 以及含Cu + +和Zii + +的金屬離子，亦可用。 油伊紅-金屬硫因熔合 取自B. Napus cDNA庫的油伊紅基因（Van Rooijen， 1 993, Calgary大學的博士論文），透過PCR，以寡核苷酸 原始質放大，設計成分別在基因的Y和V末端產生Not I 和NC〇 I位置。所得斷片經消化，放入PGN的Not I/Nco I 位置，產生質體poleGN。人體金屬硫因基因mt-Π (Varshney 和Gedamu，1984,《基因》3 1 : 1 35- 1 45)，使用寡核苷酸 原始質放大，在基因的V末端產生獨特Not I位置。所得 PCR生成物副繁殖入pBluescript KS +的鈍端EcoRV位 置。mt-II基因再從此質體切除，副繁殖於poleGN的Nco Ι/Κρη I位置內，取代GUS-NOS區域，發生pOLEMTC。 pOLEMTC的7 73基礎油伊紅—MT熔合，以Not I消化切 除，插入油伊紅促進劑（oleP ; VanRoOijen等人，1992，Plant Mol. Biol· 18 : 1177-1179)和 Ρ· Crispum ubi 4-2 基因終止 劑（ubi 3, ； Kawalleck 等人，1 993，Plant Mol. Biol· 21 : 一 35 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項

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589322 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（3ό ) 673k684)間的polePN3f之獨特NotI位置，以發生pOOM 3'，測得熔合在正確導向後，ρΟΟΜ3'以ΚρηΙ消化，釋出 oleP_oleMT-ubi 3'插入劑。此表現卡匣即插入二病媒pCGN 1 559的Κρη I位置，產生最後構造p^IOOB V，油伊紅— 金屬硫因熔合的序列如圖8和ID序列6號所示，質體 ρΒ100Μ3'的構造如圖9所示。 轉埜和再生 表現油伊紅-金屬硫因熔合的基因變化B. carinata植 物，使用實施例1所述轉型和再生程序產生。 油體製備 由實施例1所述基因變化和對照植物的B. carinata種 籽，製備洗過的抑體。 使用油體親和性母質從溶液除去Cd + + 使用油伊紅-金屬硫因熔合，在溶液內結合鎘離子， 如圖1 0簡示。 製備 10MM Tris-HCl，pH 7.2 內含 0.01 pci/ml109Cd 的 10 μπι CdCl2溶液。此CdCl2溶液1毫升份童，與由表現油 伊紅-金属硫因熔合蛋白質的種籽所製成1〇〇μ彳洗過油體 (I·6毫東油體蛋白質）徹底混合，在22 °C培育1小時。爲5' 在1 0,000 X g離心，從水相分離油體，並於1毫升的10mM Tris-HCl，pH 7·2洗二次，使用伽瑪計數器（Cobra自動伽 瑪，加拿大Canberra Packard公司製品），測量結合在油 體分部的其餘1()9Cd + +量，以得自非基因變化種籽的油體進 行相同實驗，檢定和校正Cd離子對母質的非特定結合。 一 36 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） " (請先閲讀背面之注意事項

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589322 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 五、發明説明（3 7 ) 利用油體分部與1毫升lOOmM甘氨酸（ΡΗ = 3·0)緩衝液 混合，由油體金屬硫因親和性母質，洗提Cd + +離子 (Pazirardeh 等人，1 995 ； AppL Microbiol Biotechn 43 ·· 1112-1117)。在1〇,〇〇〇 χ 分鐘後，除去油體分部， 按上述檢定結合Cd + +儺子。圓11表示Cd結合以及由親和 性母質洗提。 實施例5 分離全細朐 以下實施例說明油體將查細胞固定化的能力。使用細 菌細胞分離之一潛力，在於診斷上的利用。也需要從有益 的細胞型含量較低的細胞複合混合物，分離淋巴細胞和幹 細胞等獨特真核細胞。 金黃色葡萄球菌藉蛋白質A結合於油體 爲此實施例，取表現蛋白質A做爲表面抗原的金黃色 葡萄球菌，與多繁殖抗油伊紅抗體變化量的油體混合。 油體之製備 取B. Napus cv Westar的種好在漂白中表面殺菌，淋 洗並在研磨緩衝液（5〇mM Tris pH 7.5; 0·4Μ蔗糖和100mM 甘氨酸）內，以研缽和杵槌研磨，句化物通過Miracloth過 濾入無菌15毫升Corex管內。過濾後的勻化物再以10,〇〇〇 X g，於4 °C離心1〇分鐘。除去油體分部，再懸浮於5 OmM 1^3卩117.5和〇.4]^蔗糖內，使用同樣緩衝液洗二次。取1 毫升油體份量，移至15毫升0?611(1〇1^管，以16000X g 在室溫離心10分鐘。油體在50mM Tris PH 7·5和〇.41^蔗 一 37 - (請先閲讀背面之注意事項

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) M規格（210x297公釐） 589322 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（38 ) 糖洗5-6次，直至看不到微粒。 金黃色葡萄球菌細胞結合於抗油伊紅塗佈之油體 甲醛水溶液固定的金黃色葡萄球菌細胞（彡igma，P-7 155)，在5〇111]^1'1^-11(：1?117.5內洗3-4次，再懸浮。洗 過的油體（3 00μ〇和金黃色葡萄球菌細胞，與不同量的抗油 伊紅IgGs(5(^〇混合。在室溫混合和培育2小時後，混合 物在室溫，以16,000 X g離心5分鐘。小心除去油體分部 和下層液，細胞小粒在1毫升mM Tris-HCl pH 7.5內洗二 次，管壁以組織擦拭，除去油跡。其次，排放的細胞小粒 再懸浮於1毫升水中，测定〇D6。。。圓12爲代表性實驗， 顯示隨油體-金黃色葡萄球菌混合物內抗IgGs存在濃度 提高，細胞小粒內存在的細胞暈即遞減。 金黃色葡萄球菌二種株之微分結合 在此實驗中，採用油體親和性母質，證明今黃色葡萄 球菌二菌株的微分結合。由Sigma公司可得甲醛水溶液固 定的金黃色葡萄球菌菌株，一表現IgG結合表面抗原蛋白 質內，另一缺蛋白質A。可調製OD55〇相等的二種金黃色 葡萄球菌之稀釋份量。於各份量可添加未轉型植物的對照 油體，或與抗油伊紅抗體混合的油體。在適當溫度培育適 當時間後，樣品可離心出未結合細菌細胞小粒，並分離油 體分部。油體可以傾析、旋渦，並測量〇D55〇 。小粒可再 懸浮，並可測量下層液的〇〇5 5〇。預料只有含表現蛋白質A 的金黃色葡萄球菌菌株τ以及與抗油伊紅抗體錯合的油體 之樣品，才能看到此等細胞分餾成油體分部。降低油體分 3 8 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X：297公釐) " (請先閲讀背面之注意事項

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589322 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（39 ) 部的pH，亦可進一步證明細胞對油體的結合。離心之後， 由小粒的存在和/或小粒再懸浮時〇D55。增加，可以證明 從油體釋出細胞。 從大腸桿菌分離金黃色葡萄球菌 有活力的金黃色葡萄球菌菌株，可與具有特殊抗生素 抵抗性的大腸桿菌菌株細胞變化量混合。混合細菌樣品可 與對照抗體，以及與抗油伊紅抗體錯合的油體渦流。在適 當溫度培育適當長時間後，油體可洗淨，下層液和油體可 直接滴定，選擇性植在血液瓊脂上供金黃色葡萄球菌成 長，並植在LB板上供大腸桿菌成長。所得增濃或實際分 離，可藉估計繁殖形成單位而決定。 錯合混合物內以低濃度存在的病原之檢定 爲了診斷目的，往往需將以低數量侵襲人體或動物祖 織的細菌或病毒的病原濃縮。油體親和性母質可用來增濃 此等病原，使其隨後可加以檢定和鑑別。 病原往往特別透過接受體或表面蛋白質的互動，而結 合於人體或動物細胞。油伊紅可熔合於人體或動物蛋白質 配位基，而重組油體可用來固定病原。在人體蛋白質與前 案已知病原起源間所形成蛋白質錯合物之形成例，包含人 體嫌維素原或纖維蛋白特殊領域，結合於金黃色葡萄球菌 蛋白質凝集因數A(clf-A)(MtDevitt等人，1995 ; Mol. Microbiol 16 ; 895-907);人體衰竭加速因數（DAT)，結合 泌尿和腸管道病原大腸桿菌（Nowicki等人，1993，[ of Experim， Med· 178 : 2115-2121);人體細胞配位基，表 一 39 — 本紙•張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） "" (請先閲讀背面之注意事項

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589322 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ____B7 _五、發明説明（40 ) 現在癌細胞線Caco-2，並獨特結合於28 kD肺炎克氏桿菌 擻蛋白質 KPF-28 (Di Maretino 等人，1996 ; Infact and Immun 64 : 2263-2266)，以及人體細胞外的母質fibronectin 特殊領域，特別與釀膿鏈球菌adhesin(蛋白質F)鏵合（Ozeri 等人，1996 ; EMBO J. 1 5 : 989-998)。 實施例6 小有機分子的分離 此黉施例說明如何使用油體親和性母質，從溶液回收 /除去小有機分子。舉例而言，小有機分子生物素可用卵 白素爲配位基加以精製。 卵白素配位基之構成 卵白素是由鳥類品種合成的蛋白質，顯示對生物素的 極高親和性，對許多羧基酵素有天然輔因素。精製卵白素 的製劑（Sigma公司有售），可用精於此道之士所知的標準程 序，以化學方式共飯於抗油伊紅抗體。此項措施會生成雙 價卵白素配位基，適於證明根據親和性除去生物素。另外， 可利用油伊紅一卵白素碁因熔合。對雞（Gallus gallus)的蛋 白素編碼之基因已經檢定，其序列也已測定（Beattie等人， 1 987,《核酸研究> 1 5 : 3 595-3606)。根據序列，可以化 學方式或透過PCR合成卵白素用基因，並按實施例4所述 溶合於 B. napus 油伊紅（Van Rooijen，1993，Calgary 大學博 士論文），亦可用鏈卵白素，一種類似細菌生物素結合蛋白 質。 油體準備 —4 0 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) " (請先閲讀背面之注意事項 本頁) 、?Τ

589322 A7 B7 五、發明説明（41 ) 如實施例1所述，由基因變化植物和/或對照植物的 種籽，製備洗過的油體。 擊僭卵白素-油伊紅配位基之結合 抗油伊紅抗體的結合，和除去未結合配位基，詳見實 施例3。 從溶液除去生物素 含已知濃度生物素的溶液，可與固體量油體組合，此 油體與抗油伊紅抗體錯合，而後者與卵白素共轭。結合後， 混合物可經離心，分離油體和水性分部，留在水性分部內 的生物素量，係使用與辣根過氧化物酵素（HRP)共軛的抗 生物素抗體，利用競爭性ELISA測定。結合生物素量可以 計算，假設： 結合生物素=總共生物素-游離生物素 由所得數值，可按實施例2所述測定解離常數。可用 結合於未與卵白素共轭的抗油伊紅抗體之油體，進行同樣 實驗做爲對照。如有需要，可透過競爭性洗提，使用過量 2 — (4'—羥基苯）苯甲酸（HABA)，從油體一卵白素母質釋 出生物素。亦可採用對生物素親和性較低的基因工程突變 卵白素，幫助洗提。此種突變種已就來自細菌的類似生物 素結合蛋白質，鏈卵白素加以說明（Chilkoti等人，1 995 ; Bio/Technol 13 ： 1 1 98-1204) 〇 實施例7 碳水化合物之分離 以下實施例說明利用油體母質，從錯合物生物混合物 一 41 一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項 _▲1· 本頁 、1Τ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589322 A7 B7 五、發明説明（42 ) 回收碳水化合物。在此實施例中，本發明人等證明油體固 定的木纖維質酵素，可以結合纖維素。 油伊紅-纖維素結合領域熔合 由糞肥纖維單胞細菌產生的若干種木纖維質酵素，含 有分開的纖維素結合領域（CBDS)。此等CBDs個別結合於 纖維素，即使是利用蛋白質分解或朞因作業，從_素的催 化性領域分離。質體pUC18 - CBDPT含有爲β - 1，4 —葡 糖酵素的CBD入碼的斷片（Gilkes等人，1 992,《生物化學會 誌》267 : 6743-6749)，可用來構成油伊紅一 CBD基因熔 合。對CBD領域編碼的DNA斷片，可用適當限制酵素或使 用PCR，從PUC18 — CBDPT單離。另外可用來自糞肥纖 維單胞菌的其他木纖維質酵素之CBDs，或來自其他來源 的木纖維質酵素。來自從cDNA庫單離的B. napus之油伊 紅基因（Van Rooijen，1 993，Calgpy大學博士論文），使用 PCR在pGN內繁殖，並生成質體pOLEGN，如實施例4所 述。在油伊紅基因與CBD基因間的框內基因熔合，可用精 於此道之士公知的標準分子技術發生。最後構成包括CBD 領域，以轉移方式熔合在油伊紅正下游。 轉型和再生 爲將熔合基因構成引進植物內，要在諸如pCGN 1559 等二元病媒內副繁殖。按實施例1所述，即可發生表現油 伊紅-CBD熔合的基因變化植物。 油體製備 從基因變化型和對照野生型植物的種籽，可按實施例 —42 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項v

Pr本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589322 A7 B7 五、發明説明（43 ) 1所述，製備洗過的油體。 使用油體親和性母質從溶液除去纖維素 爲了評估纖維素對油體親和性母質的結合，將野生型 和棊因變化植物的油體加以比較。油體可與含纖維素濃度 範圍的適當緩衝溶液混合。油體懸浮液即可在適當溫度培 育適當長的時間。離心時，可回收下餍液，並檢定纖維素 濃度。結合纖維素和游離纖維素的濃度可以計算，假設： 結合纖維素=總共纖維素-游離纖維素 結合纖維素濃度對游離纖維素濃度之比，可以結合纖 維素的濃度爲函數描圖。按照標準程序（〇.8^〇^1^以，八1111· Ν·Υ· Acad. Sci. (1949) 57 : 660-672)，可由描圖算出解離 常數，詳見實施例2。 實施例8 核酸之分離 以下實施例說採明採用油體結合單股（SS)核酸的方 法。 分離單股核酸 捕集SS核酸的方法可用於診斷，諸如植物病毒疾病， 或用於需從溶液選擇性除去未再煆煉SS核酸之研究應 用。諸如供微分篩檢表現基因的雜交反應。油伊紅可與SS DNA或RNA結合蛋白質或其特定領域熔合，並可用於捕集 SS核酸，以供識別或進一步放大。充分檢定的SS核酸結 合蛋白質包含：草康桿菌Ti質體Vir E2蛋白質（Ziipan等人 1 995,《植物生理學》1 07 : 1041-1047);煙草鑲嵌病毒 一 43 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） " (請先閲讀背面之注意事項 .J·! 本頁 I. I訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589322 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（44) (TMV)運動蛋白質P30 (Citorsky等人，1990 ;《細胞》60 : 637-647 ； Waigmaun 等人，1994，Proc. Natl. Acad. Sci· (USA) 91 : 1433-1437);花椰菜鑲嵌病毒膜蛋白（Thompson 等人，1 99 3, J· Gen· Virol 74 : 1141-114 8)，以及大腸桿菌 Rec A 和單股結合（SSB)蛋白質（Radding，1991，J. Biol. Chem. 266 ： 53 55-53 58) 〇 實施例9 童組蛋白質之分離 以下實施例進一步證明利用油體親和性母寶於精製重 組標的蛋白質。爲此實施例選用IgG /蛋白質A配位基對 偶。所用構成包含蛋白質A領域，熔僉於18kDa Arabidopsis 油伊紅（Van Rooijen 等人，1 992 ; Plant Mol. Biol· 18 : 11 77-1179)，將含油伊紅—蛋白質A熔合蛋白霞的油體分 離，用來證明共輛於辣根過氧化物酵素（HRP)的兔抗鼠IgGs 之結合。油伊紅-蛋白質A熔合在油體上的形態，以及IgG 對溶合之結合，如圖15所示。 油伊紅-蛋白質A熔合 對可結合於IgG的蛋白質編碼之合成蛋白質A序列， 根據報告的序列資訊（pRITZT，蛋白質A基因熔合病媒； Pharmacia)合成，透過PCR放大。PCR內所用各原始質， 含有對蛋白質A特定序列的限制位置V，以便利繁殖。反 逆原始質（即反意識方向的原始質），亦在入碼序列後含有 轉譯授符碼。圓13表示PCR原始質相對於蛋白質A序列的 位置（蛋白質A序列和原始質序列亦分別列於ID序列8 -44 - (請先閲讀背面之注意事項^^^本頁)

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589322 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（45) 號，ID序列10號和ID序列11號內）。所得斷片結紮於帶 有ArabidopsiS油伊紅基因的pUC19質體內，包括867 bp 上游促進劑區，接著是入碼區（其相關intron)，由此除去轉 錄停止授符碼。構成的V末端含有藍伊紅合成酵素_释終 止劑。對內_白酵率凝血酵素用認識序列編碼的隔體序 列，加在油伊紅入碼序列之正下游。蛋白質A基因序列引 進於此隔體序列與終止劑序列之間。在最後表現構成中， 油伊紅和蛋白質A入碼區熔合於同樣閱讀區。整個楢成（圖 14和ID序列12號）即從pUC19質體切除，副繁殖於植物轉 型病媒 pCGN 1559 (McBride 和 Summer felt，1 990, Plant Mol· Biol. 14 : 269-2 76)，帶有新黴素磷轉移酵素塞因，在35S CaMV促進劑控制下。所得質體引進草原桿菌屬（菌株EH A 101)。 轉型和再生 植物按實施例1所述轉型和再生。基因變化植物先用 新黴素鱗轉移酵素評鑑加以檢定，隨即透過免疫斑點分 析，由蛋白質A熔合的表現確認。 油體的製備 得自基因變化B· napus和B. ca^inata線表現油伊紅— 翬白質A熔合的油體，按實施例1所述程序製備。 油伊紅-蛋白質A熔合對IgG之結合 得自各種基因變化B. napus線表現油伊紅一蛋白質A 熔合蛋白質的油體蛋白質萃取物（2(^g/份量），經聚丙烯醯 胺凝膠電泳，隨即遵照標準程序轉移到PVDF隔膜。隔膜 一 45 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項

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589322 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（46 ) 再以HRP共軛的鼠抗兔抗體探測，並按照實驗室手冊 (Haflow 和 “ne，1 988, Cold Spring Habor)在《抗體》內所 概略程序可視化。圓16表示染色的PVDF隔膜。50 kDa 蛋白質（油伊紅-蛋白質A熔合蛋白質的預計分子質量： 48,801 Da)，在進行試驗的全部6條基因變化B.napus線之 蛋白質萃取物內特別檢定。未轉型對照植物未顯示HRP活 性，而30 kDa蛋白質（預計分子寶量29652 Da)存在於以 PRIT2T編碼蛋白質A轉型的細菌溶化物內，在未轉型溶化 物內測不出來。 IgGs結合和洗提於含油伊紅-蛋白質A熔合蛋白質之 油體 按實施例1所述，以表現油伊紅-蛋白質A熔合蛋白 質的構成轉型之野生型B· Napus和碁因變化型B. napus， 製婦洗過的油體（10 mg/ml蛋白質），並懸浮於lOmM Tris-HClpH8.0內。於500μ〖洗過的油體製備，添加容量2μ〇 土 3 4pg)的HRP共軛兔抗鼠抗體（Sigma公司，猫無Α9044)，懸 浮液在室溫培育1小時，或在4 °C過夜。樣品再以16,000 X g離心15分鐘，除去下層液。隨後，使用研杵把油體徹 底再懸浮於 500μ，10mM Tris-HCl pH 8.0。在 Tris-HC| 內 之此項洗淨步驟重複4次（稱爲洗過的油體製劑）。從洗過 油體製劑的5μ彳份量，洗第5次，再評鑑HRP活性。 於1毫升HRP評鑑混合物（9.8毫升0.1Μ NaOAc，在 DMSO內0.2毫升2.5 mg/ml三甲基聯苯胺，4μ^ Η20;)，添 加1μ<洗過油體製劑，進行HRP評鑑，混合物在室溫培育 一 4 6 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 (請先閲讀背面之注意事項

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589322 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7___B7_ 五、發明説明（47) 5分鐘。樣品透過〇·22μπι濾材過濾，隨即以分光光度計測 量 OD45(/s。 爲從油體洗提IgGs，將洗過油體製劑再懸浮於lOOmM 甘氨酸pH3*0，並以1 6,000 X g離心I5分鐘，在室溫培育 3Q，。在 500μ，ΙΟΟιμΜ Tris-HCl ρΗ8·0 內中和後，油體分 部和洗提液均按上述評鑑HRP活性。IgGs對得自野生型Β· Napus和表現油伊紅蛋白質Α熔合的基因變化Β· napiis之 結合和洗提，如圖17所示。所有出版品、專利和專利申請案在此全文列入參考， 至個別出跛品、專利或專利申請案特別和個別載明全文列 入參考的同樣程度。序列一覽表 (1) 一般資訊 (i)申請人 (A) 姓名：Sem Biosys遺傳學公司 (B) 門牌：西北區/ 14街609號 (C) 城市：Calgary(D) 州名：Alherta (E) 國家：加拿大 (F) 郵遞區號：T2N 2A1(G) 電話號碼：（403)220-5 161(H) 傳真號碼：（403)220-0704一 4 7 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項

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589322 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（48 ) (A) 姓名：Moloney, Maurice (B) 門牌：西北區 Edgebrook Cave 34號 (C) 城市：Calgary (D) 州名：Alberta (E) 國家：加拿大 (F) 郵遞區號：T3A 5N5 (A) 姓名：Boothe，Joseph (B) 門牌：西北區第6大道332號302室 (C) 城市：Calgary (D) 州名：Alherta (E) 國家：加拿大 (F) 郵遞區號：T2E 0L9 (A) 姓名：Rooijen，Gijs van (B) 門牌：西北區 Bearspaw Drive 3223 號 (C) 城市：Calgary (D) 州名：Alherta (E) 國家：加拿大 (F) 郵遞區號：T2L 1T1 (ii) 發明名稱：油體和做爲親和性母質之相關蛋白質 (iii) 序列數：14 (iv) 通訊址 (A)收信者：Berspkin & Parr 一 4 8 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589322 A7 B7 五、發明説明（49 ) (B) 門牌：國王西街40號 (C) 城市：Toronto (D) 州名：Ontario (E) 國家：加拿大 (F) 郵遞區號：M5H 3 Y2 (v) 電腦閱讀表 (A) 媒體型：磁碟片 (B) 電腦：IBM PC相容性

(C) 操作系統：PC-DOS/MS-DOS (D) 軟體：專利解碼# 1.0，版型# 1.30 (vi) 現時申請資料 (A) 申請案號 (B) 申請曰 (C) 分類 (vii) 前案資料 (A) 申請案號：美國08/767,026 (B) 申請日：1 997年12月16日 (viii) 代理人資訊 (A) 姓名：Gravelle，Micheline (B) 註冊號碼：40,261 (C) 檔案編號：9369-050 (ix) 通訊資料 (A) 電話：（41 6)364-73 1 1 (B) 傳真：（416)361-1398 —49 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再本頁)

2 3 9 8 5 A7B7 五、發明説明（5〇 ) (2)ID序列1號 (i) 序列特徵 (A) 長度：522基礎對偶 (B) 型式：核酸 (C) 股型：單 (D) 形態：線型 (ii) 分子型：cDNA (vi)來源 (A)生物：取自Arabidopsis Thaliana的油伊紅 (ix)特點 (A) 名 / 鍵：CDS (B) 位置：1 .·522 (xi)序列說明：ID序列1號 (請先閲讀背面之注意事項

本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ATG GCG GAT ACA GCT AGA GGA ACC CAT CAC GAT ATC ATC GGC AGA GAC 48 Met Ala Asp Thr Ala Arg Gly Thr His His Asp lie lie Gly Arg Asp 1 5 10 15 CAG TAC CCG ATG ATG GGC CGA GAC CGA GAC CAG TAC CAG ATG TCC GGA 96 Gin Tyr Pro Met Met Gly Arg Asp Arg Asp Gin Tyr Gin Met Ser Gly 20 25 30 CGA GGA TCT GAC TAC TCC AAG TCT AGG CAG ATT GCT AAA GCT GCA ACT 144 Arg Gly Ser Asp Tyr Ser Lys Ser Arg Gin lie Ala Lys Ala Ala Thr 35 40 45 GCT GTC ACA GCT GGT GGT TCC CTC CTT GTT CTC TCC AGC CTT ACC CTT 192 Ala Val Thr Ala Gly Gly Ser Leu Leu Val Leu Ser Ser Leu Thr Leu 50 55 60 GTT GGA ACT GTC ATA GCT TTG ACT GTT GCA ACA CCT CTG CTC GTT ATG 240 Val Gly Thr Val lie Ala Leu Thr Val Ala Thr Pro Leu Leu Val lie 65 70 75 80 TTC AGC CCA ATC CTT GTC CCG GCT CTC ATC ACA GTT GCA CTC CTC ATC 288 Phe Ser Pro lie Leu Val Pro Ala Leu lie Thr Val Ala Leu Leu lie 85 90 95 ACC GGT TTT CTT TCC TCT GGA GGG TTT GGC ATT GCC GCT ATA ACC GTT 336 Thr Gly Phe Leu Ser Ser Gly Gly Phe Gly lie Ala Ala lie Thr Val 100 105 110 一 5 0 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

589322 A7 B7 五、發明説明（5l ) TTC TCT TGG ATT TAC AAG TAC GCA ACG GGA GAG CAC CCA CAG GGA TCA Phe Ser Trp lie Tyr Lys Tyr Ala Thr Gly Glu His Pro Gin Gly Ser 115 120 125 GAC AAG TTG GAC AGT GCA AGG ATG AAG TTG GGA AGC AAA GCT CAG GAT Asp Lys Leu Asp Ser Ala Arg Met Lys Leu Gly Ser Lys Ala Gin Asp 130 135 140 CTG AAA GAC AGA GCT CAG TAC TAC GGA CAG CAA CAT ACT GGT GGG GAA Leu Lys Asp Arg Ala Gin Tyr Tyr Gly Gin Gin His Thr Gly Gly Glu 145 150 155 160 CAT GAC CGT GAC CGT ACT CGT GGT GGC CAG CAC ACT ACT TAA His Asp Arg Asp Arg Thr Arg Gly Gly Gin His Thr Thr * 165 170 384 432 480 522 (請先閲讀背面之注意事項 (2)ID序列2號資料 (i)序列特徵 (A) 長度 (B) 型式 (C) 形態 (ii)分子型 174氨基酸 氨基酸 線型 蛋白質 (xi)ID序列2號之序列說明

Met Ala Asp Thr Ala Arg Gly Thr His 1 5

本頁)

，1T lie Gly Arg Asp 15 Gin Met Ser Gly 30 Lys Ala Ala Thr 45 Ser Leu Thr Leu

His Asp lie 10 Asp Gin Tyr

經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Gin Tyr Pro Met Met Gly 20 Arg Gly Ser Asp Tyr Ser 35 Ala Val Thr Ala Gly Gly 50 Val Gly Thr Val lie Ala 65 70 Phe Ser Pro lie Leu Val 85 Thr Gly Phe Leu Ser Ser 100 Phe Ser Trp lie Tyr Lys 115

Arg Asp Arg 25 Lys Ser Arg 40 Ser Leu Leu 55 Leu Thr Val Pro Ala Leu

Gly Gly Phe 105 Tyr Ala Thr 120

Gin He Ala Val Leu Ser 6G Ala Thr Pro 75 He Thr Val 90 Gly He Ala Gly Glu His

Leu Leu Val lie 80 Ala Leu Leu lie 95 Ala lie Thr Val 110 Pro Gin Gly Ser 125 51 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 589322 A7 B7 五、發明説明（52

Asp Lys Leu Asp Ser Ala Arg Met Lys Leu Gly Ser Lys Ala Gin Asp 130 135 140 Leu Lys Asp Arg Ala Gin Tyr Tyr Gly Gin Gin His Thr Gly Gly Glu 145 150 155 160 His Asp Arg Asp Arg Thr Arg Gly Gly Gin His Thr Thr ★ 165 170 (2)ID序列3號資料 (i)序列特徵

2115基礎對偶 核酸 單 線型 cDNA 經濟部中央標準局員工消費合作社印裂 (A) 長度： (B) 型式： (C) 股型： (D) 形態： (Π)分子型： (vi)來源 (A)生物：油伊紅-水蛭素熔合 (ix)特點 (A) 名 / 鏈：CDS (B) 位置：862·.1215 (ix)特點 (A) 名 / 鏈：CDS (B) 位置：1456··1833 (xi)ID序列3號之序列說明 52 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項

本I)

589322 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（53 ) CTATACCCAA CCTCGGTCTT GGTCACACCA GGAACTCTCT GGTAAGCTAG CTCCACTCCC 60 CAGAAACAAC CGGCGCCAAA TTGCCGGAAT TGCTGACCTG AAGACGGAAC ATCATCGTCG 120 GGTCCTTGGG CGATTGCGGC GGAAGATGGG TCAGCTTGGG CTTGAGGACG AGACCCGAAT 180 CGAGTCTGTT GAAAGGTTGT TCATTGGGAT TTGTATACGG AGATTGGTCG TCGAGAGGTT 240 TGAGGGAAAG GACAAATGGG TTTGGCTCTG GAGAAAGAGA GTGCGGCTTT AGAGAGAGAA 300 TTGAGAGGTT TAGAGAGAGA TGCGGCGGCG ATGACQGGAG GAGAGACGAC GAGGACCTGC 360 ATTATCAAAG CAGTGACGTG GTGAAATTTG GAACTTTTAA GAGGCAGATA GATTTATTAT 420 TTGTATCCAT TTTCTTCATT GTTCTAGAAT GTCGCGGAAC AAATTTTAAA ACTAAATCCT 480 AAATTTTTCT AATTTTGTTG CCAATAGTGG ATATGTGGGC CGTATAGAAG GAATCTATTG 540 AAGC-CCCAAA CCCATACTGA rnhrinrrhh δ W W · ·^ · Μ 齡· Γν^ΦΦΓ'ΠΦΦΦΦ ^ ·泰 w · GCGTTTTATG TTTCGGTTCG 600 ATGCCAACGC CACATTCTGA GCTAGGCAAA AAACAAACGT GTCTTTGAAT AGACTCCTCT 660 CGTTAACACA TGCAGCGGCT GCATGGTGAC GCCATTAACA CGTGGCCTAC AATTGCATGA 720 TGTCTCCATT GACACGTGAC TTCTCGTCTC CTTTCTTAAT ATATCTAACA AACACTCCTA 780 CCTCTTCCAA AATATATACA CATCTTTTTG ATCAATCTCT CATTCAAAAT CTCATTCTCT 840 CTAGTAAACA AGAACAAAAA A ATG GCG GAT ACA GCT AGA GGA ACC CAT CAC 891

Met Ala Asp Thr Ala Arg Gly Thr His His · 15 10 GAT ATC ATC GGC AGA GAC CAG TAC CCG ATG ATG GGC CGA GAC CGA GAC 939

Asp lie lie Gly Arg Asd Gin Tyr Pro Met Met Gly Arg Asp Arg Asp 15 20 25 CAG TAC CAG ATG TCC GGA CGA GGA TCT GAC TAC TCC AAG TCT AGG CAG 987

Gin Tyr Gin Met Ser Gly Arg Gly Ser Asp Tyr Ser Lys Ser Arg Gin 30 35 40 ATT GCT AAA GCT GCA ACT GCT GTC ACA GCT GGT GGT TCC CTC CTT GTT 1035 lie Ala Lys Ala Ala Thr Ala Val Thr Ala Gly Gly Ser Leu Leu Val 45 50 55 CTC TCC AGC CTT ACC CTT GTT GGA ACT GTC ATA GCT TTG ACT GTT GCA 1083

Leu Ser Ser Leu Thr Leu Val Gly Thr Val lie Ala Leu Thr Val Ala 60 65 70 ACA CCT CTG CTC GTT ATC TTC AGC CCA ATC CTT GTC CCG GCT CTC ATC 1131

Thr Pro Leu Leu Val lie Phe Ser Pro lie Leu Val Pro Ala Leu lie 75 80 85 9〇 ACA GTT GCA CTC CTC ATC ACC GOT TTT CTT TCC TCT GGA GGG TTT GGC 1179

Thr Val Ala Leu Leu lie Thr Gly Phe Leu Ser Ser Gly Gly Phe Gly 95 100 l〇5 一 53 — ^氏張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公嫠1 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

589322 A7B7 五、發明説明（54 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ATT GCC GCT ΑΤΑ ACC GTT TTC TCT TGG ATT TAC AAG TAAGCACACA 1225 lie Ala Ala lie Thr Val Phe Ser Trp lie Tyr Lys 110 115 TTTATCATCT TACTTCATAA TTTTGTGCAA TATGTGCATG CATGTGTTGA GCCAGTAGCT 1285 «· TTGGATCAAT TTTTTTGGTC GAATAACAAA TGTAACAATA AGAAATTGCA AATTCTAGGG 1345 AACATTTGGT TAACTAAATA CGA.^ATTTGA CCTAGCTAGC TTGAATGTGT CTGTGTATAT 1405 CATCTATATA GGTAAAATGC TTGGTATGAT ACCTATTGAT TGTGAATAGG TAC GCA 1461 Tyr Ala 1 ACG GGA GAG CAC CCA CAG GGA TCA GAC AAG TTG GAC AGT GCA AGG ATG 1509 Thr Gly Glu His Pro Gin Gly Ser Asp Lys Leu. Asp Ser Ala Arg Met 5 10 15 AAG TTG GGA AQC AAA GCT CAG GAT CTG AAA GAC AGA GCT CAG TAC TAC 1557 Lys Leu Gly Ser Lys Ala Gin Asp Leu Lys Asp Arg Ala Gin Tyr Tyr 20 25 30 GGA CAG CAA CAT ACT GGT TGG GAA CAT GAC CGT GAC CGT ACT CGT GGT 1605 Gly Gin Gin His Thr Gly Trp Glu His Asp Arg Asp Arg Thr Arg Gly 35 40 45 50 GGC CAG CAC ACT ACT GCG ATC GAA GGG AGA ATC ACT TAC ACT GAC TGT 1653 Gly Gin His Thr Thr Ala He Glu Gly *Arg He Thr Tyr Thr Asp Cys 55 60 65 ACT GAA TCT GGA CAG AAC CTC TGT CTC TGT GAA GGA TCT AAC GTT TGT 1701 Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys 70 75 80 GGA AAG GGA AAC AAG TGT ATC CTC GGA TCT AAC GGA AAG GGA AAC CAG 1749 Gly Lys Gly Asn Lys Cys lie Leu Gly Ser Asn Gly Lys Gly Asn Gin 85 90 95 TGT GTT ACT GGA GAA GGA ACT CCA AAC CCA GAA TCT CAC AAC AAC GGA 1797 Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Asn Pro Glu Ser His Asn Asn Gly 100 105 110 GAC TTC GAA GAA ATC CCT GAA GAA TAC CTC CAG TAA GTCGACTCTA 1843 Asp Phe Glu Glu lie Pro Glu Glu Tyr Leu Gin * 115 120 125 GACGGATCTC CCGATCGTTC AAACATTTGG CAATAAAGTT TCTTAAGATT GAATCCTGTT 1903 GCCGGTCTTG CGATGATTAT CATATAATTT CTGTTGAATT ACGTTAAGCA TGTAATAATT 1963 AACATGTAAT GCATGACGTT ATTTATGAGA TGGGTTTTTA TGATTAGAGT CCCGCAATTA 2023 TACATTTAAT ACGCGATAGA AAACAAAATA TAGCGCGCAA ACTAGGATAA ATTATCGCGC 2083 GCGGTGTCAT CTATGTTACT AGATCGGAAT TC 2115 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

訂 一 5 4 —本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 589322 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（55 ) (2)ID序列4號資料 (i) 序列特徵(A) 長度：118氨基酸 (B) 型式：氨基酸 (D)形態：線型 (ii) 分子型：蛋白質 (xi)ID序列4號之序列說明 Met Ala Asp Thr Ala Arg Gly Thr His His Asp lie lie Gly Arg Asp 1 5 10 15 Gin Tyr Pro Met Met Gly Arg Asp Arg Asp Gin Tyr Gin Met Ser Gly 20 25 30 Arg Gly Ser Asp Tyr Ser Lys Ser Arg Gin lie Ala Lys Ala Ala Thr 35 40 45 Ala Val Thr Ala Gly Gly Ser Leu Leu Val Leu Ser Ser Leu Thr Leu 50 55 60 Val Gly Thr Val lie Ala Leu Thr Val Ala Thr Pro Leu Leu Val lie 65 70 75 80 Phe Ser Pro lie Leu Val Pro Ala Leu lie Thr Val Ala Leu Leu lie 85 90 95 Thr Gly Phe Leu Ser Ser Gly Gly Phe Gly lie Ala Ala lie Thr Val 100 105 no Phe Ser Trp lie Tyr Lys 115 (2)ID序列5號資料 (i)序列特徵(A) 長度：126氨基酸 (B) 型式：氨基酸 (D)形態：線型 (Π)分子型：蛋白質 (xi)ID序列5號之序列說明 一 55 一 (請先閲讀背面之注意事項

本頁) 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589322 A7 B7 五、發明説明（56 )

Tyr Ala Thr Gly Glu His Pro Gin Gly Ser Asp Lys Leu Asp Ser Ala 1.5 10 15 Arg Met Lys Leu Gly Ser Lys Ala Gin Asp Leu Lys Asp Arg Ala Gin 20 25 30 Tyr Tyr Gly Gin Gin His Thr Gly Trp Glu His Asp Arg Asp Arg Thr 35 40 45 Arg Gly Gly Gin His Thr Thr Ala He Glu Gly Arg 工le Thr Tyr Thr 50 55 60 Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn 65 70 75 80 Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys lie Leu Gly Ser Asn Gly Lys Gly 85 90 95 Asn Gin Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Asn Pro Glu Ser His Asn 100 105 110 Asn Gly Asp Phe Glu Glu lie Pro Glu Glu Tyr Leu Gin * 115 120 125 (請先閲讀背面之注意事項 -J·— 本頁 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (2)ID序列6號資料 (i) 序列特徵 (A) 長度：2366基礎對偶 (B) 型式i核酸 (C) 股型：單 (D) 形態：線型 (ii) 分子型：cDNA (vi)來源 (A)生物：油伊紅-金屬硫因熔合 (ix)特點 (A) 名 / 鏈：CDS (B) 位置：1092··1856 (xi)ID序列6號之序列說明 56 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I 訂

589322 A7 B7 五、發明説明（57 ) GAGCTCAAAT ACGATCTGAT ACTGATAACG TCTAGATTTT TAGGGTTAAA GCAATCAATC 60 ACCTGACGAT TCAAGGTGGT TGGATCATGA CGATTCCAGA AAACATCAAG CAAGCTCTCA 120 AAGCTACACT CTTTGGGATC ATACTGAACT CTAACAACCT CGTTATGTCC CGTAGTGCCA 180 GTACAGACAT CCTCGTAACT CGGATTATGC ACGATGCCAT GGCTATACCC AACCTCGGTC 240 TTGGTCACAC CAGGAACTCT CTGGTAAGCT AGCTCCACTC CCCAGAAACA ACCGGCGCCA 300 AATTGCCGGA ATTGCTGACC TGAAGACGGA ACATCATCGT CGGGTCCTTG GGCGATTGCG 360 GCGGAAGATG GGTCAGCTTG GGCTTGAGGA CGAGACCCGA ATCGAGTCTG TTGAAAGGTT 420 GTTCATTGGG ATTTGTATAC GGAGATTGGT CGTCGAGAGG TTTGAGGGAA AGGACAAATG 480 GGTTTGGCTC TGGAGAAAGA GAGTGCGGCT TTAGAGAGAG. AATTGAGAGG TTTAGAGAGA 540 GATGCGGCGG CGATGACGGG AGGAGAGACG ACGAGGACCT GCATTATCAA AGCAGTGACG 600 TGGTGAAATT TGGAACTTTT AAGAGGCAGA TAGATTTATT ATTTGTATCC ATTTTCTTCA 660 TTGTTCTAGA ATGTCGCGGA ACAAATTTTA AAACTAAATC CTAAATTTTT CTAATTTTGT; 720 TGCCAATAGT GGATATGTGG GCCGTATAGA AGGAATCTAT TGAAGGCCCA AACCCATACT 780 GACGAGCCCA AAGGTTCGTT TTGCGTTTTA TGTTTCGGTT CGATGCCAAC GCCACATTCT 840 GAGCTAGGCA AAAAACAAAC GTGTCTTTGA ATAGACTCCT CTCGTTAACA CATGCAGCGG 900 CTGCATGGTG ACGCCATTAA CACGTGGCCT ACAATTGCAT GATGTCTCCA TTGACACGTG 960 ACTTCTCGTC TCCTTTCTTA ATATATCTAA CAAACACTCC TACCTCTTCC AAAATATATA 1020 CACATCTTTT TGATCAATCT CTCATTCAAA ATCTCATTCT CTCTAGTAAA CAGGATCCCC 1080 CTCGCGGCCG C ATG GCG GAT ACA GCT AGA ACC CAT CAC GAT GTC ACA AGT 1130 Met Ala Asp Thr Ala Arg Thr His His Asp Val Thr Ser 15 10 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 CGA GAT CAG TAT CCC CGA GAC CGA GAC CAG TAT TCT ATG ATC GGT CGA 1178 Arg Asp Gin Tyr Pro Arg Asp Arg Asp Gin Tyr Ser Met lie Gly Arg 15 20 25 GAC CGT GAC CAG TAC TCT ATG ATG GGC CGA GAC CGA GAC CAG TAC AAC 1226 Asp Arg Asp Gin Tyr Ser Met Met Gly Arg Asp Arg Asp Gin Tyr Asn 30 35 40 45 ATG TAT GGT CGA GAC TAC TCC AAG TCT AGA CAG ATT GCT AAG GCT GTT 1274 Met Tyr Gly Arg Asp Tyr Ser Lys Ser Arg Gin lie Ala Lys Ala Val 50 55 60 ACC GCA GTC ACG GCG GGT GGG TCC CTC CTT GTC CTC TCC AGT CTC ACC 1322 Thr Ala Val Thr Ala Gly Gly Ser Leu Leu Val Leu Ser Ser Leu Thr 65 70 75 CTT GTT GGT AdT GTC ATT GCT TTG ACT GTT GCC ACT CCA CTC CTC GTT 1370 Leu Val Gly Thr Val lie Ala Leu Thr Val Ala Thr Pro Leu Leu Val 80 85 90 一 57 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 589322 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（5 8 ) ATC TTT AGC CCA ATC CTC GTG CCG GCT CTC ATC ACC GTA GCA CTT CTC 1418 lie Phe Ser Pro lie Leu Val Pro Ala Leu lie Thr Val Ala Leu Leu 95 100 105 ATC ACT GGC TTT CTC TCC TCT GGT GGG TTT GCC ATT GCA GCT ATA ACC 1466 lie Thr Gly Phe Leu Ser Ser Gly Gly Phe Ala lie Ala Ala lie Thr 110 115 120 125 GTC TTC TCC TGG ATC TAT AAG TAC GCA ACG GGA GAG CAC CCA CAG GGG 1514

Val Phe Ser Trp lie Tyr Lys Tyr Ala Thr Gly Glu His Pro Gin Gly 130 135 140 TCA GAT AAG TTG GAC AGT GCA AGG ATG AAG CTG GGA ACC AAA GCT CAG 1562

Ser Asd Lvs Leu Aso Ser Ala Arg Met Lys Leu Gly Thr Lys Ala Gin * * 145 ^ 150 ； 155 GAT ATT AAA GAC AGA GCT CAA TAC TAC GGA CAG CAA CAT ACA GGT GGT 1610

Asp lie Lys Asp Arg Ala Gin Tyr Tyr Gly Gin Gin His Thr Gly Gly 160 165 170 GAG CAT GAC CGT GAC CGT ACT CGT GGT GGC CAG CAC ACT ACT CTC GTT 1658

Glu His Asp Arg Asp Arg Thr Arg Gly Gly Gin His Thr Thr Leu Val 175 180 185 CCA CGA GGA TCC ATG GAT CCC AAC TGC TCC TGT GCC GCC AGT GAC TCC 1706

Pro Arg Gly Ser Met Asp Pro Asn Cys Ser Cys Ala Ala Ser Asp Ser 190 195 200 205 TGC ACC TGC GCC GGC TCC TGC AAG TGC AAA GAG TGC AAA TGC ACC TCC 1754

Cys Thr Cys Ala Gly Ser Cys Lys Cys Lys Glu Cys Lys Cys Thr Ser 210 215 220 TGC AAG AAA AGC TGC TGC TCC TGC TGT CCT GTG GGC TGT GCC AAG TGT 1802

Cys Lys Lys Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Val Gly Cys Ala Lys Cys 225 230 235 GCC CAG GGC TGC ATC TGC AAA GGG GCG TCG GAC AAG TGC AGC TGC TGT 1850

Ala Gin Gly Cys 工le Cys Lys Gly Ala Ser Asp Lys Cys Ser Cys Cys 240 245 · 250 GCC TGA GCGGCCGCGA GGGCTGCAGA ATGAGTTCCA AGATGGTTTG TGACGAAGTT 1906

Ala * 255 AGTTGGTTGT TTTTATGGAA CTTTGTTTAA GCTTGTAATG TGGAAAGAAC GTGTGGCTTT 1966 GTGGTTTTTA AATGTTGGTG AATAAAGATG TTTCCTTTGG ATTAACTAGT ATTTTTCCTA 2026 TTGGTTTCAT GGTTTTAGCA CACAACATTT TAAATATGCT GTTAGATGAT ATGCTGCCTG 2086 CTTTATTATT TACTTACCCC TCACCTTCAG TTTCAAAGTT GTTGCAATGA CTCTGTGTAG 2146 TTTAAGATCG AGTGAAAGTA GATTTTGTCT ATATTTATTA GGGGTATTTG ATATGCTAAT 2206 GGTAAACATG GTTTATGACA GCGTACTTTT TTGGTTATGG TGTTGACGTT TCCTTTTAAA 2266 CATTATAGTA GCGTCCTTGG TCTGTGTTCA TTGGTTGAAC AAAGGCACAC TCACTTGGAG 2326 ATGCCGTCTC CACTGATATT TGAACAAAGA ATTCGGTACC 2366 一 58 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、?! 589322 A7B7 五、發明説明（59 ) (2)ID序列7號資料 (i)序列特徵 (A)長度：255氨基酸 (B)型式：氨基酸 (D)形態：線型 (ii)分子型：蛋白質 (xi)ID序列7號之序列說明

Met Ala Asp Thr Ala Arg Thr His His Asp Val Thr Ser Arg Asp Gin 15 10 15

Tyr Pro Arg Asp Arg Asp Gin Tyr Ser Met lie Gly Arg Asp Arg Asp 20 25 30

Gin Tyr Ser Met Met Gly Arg Asp Arg Asp Gin Tyr Asn Met Tyr Gly 35 40 45

Arg Asp Tyr Ser Lys Ser Arg Gin lie Ala Lys Ala Val Thr Ala Val 50 55 60

Thr Ala Gly Gly Ser Leu Leu Val Leu Ser Ser Leu Thr Leu Val Gly 65 70 75 80

Thr Val lie Ala Leu Thr Val Ala Thr Pro Leu Leu Val lie Phe Ser 85 90 95

Pro lie Leu Val Pro Ala Leu lie Thr Val Ala Leu Leu lie Thr Gly 100 105 110

Phe Leu Ser Ser Gly Gly Phe Ala lie Ala Ala lie Thr Val Phe Ser 115 120 125

Trp lie Tyr Lys Tyr Ala Thr Gly Glu His Pro Gin Gly Ser Asp Lys 130 135 140

Leu Asp Ser Ala Arg Met Lys Leu Gly Thr Lys Ala Gin Asp lie Lys 145 150 155 160 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項本頁)

Asp Arg Ala Gin Tyr Tyr Gly Gin Gin His Thr Gly Gly Glu His Asp 165 170 175

Arg Asp Arg Thr Arg Gly Gly Gin His Thr Thr Leu Val Pro Arg Gly 180 185 190

Ser Met Asp Pro Asn Cys Ser Cys Ala Ala Ser Asp Ser Cys Thr Cys 195 200 205

Ala Gly Ser Cys Lys Cys Lys Glu Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys 210 215 220

Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Val Gly Cys Ala Lys Cys Ala Gin Gly 225 230 235 240

Cys lie Cys Lys Gly Ala Ser Asp Lys Cys Ser Cys Cys Ala * 245 250 255 -59 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589322 A7B7 五、發明説明（6〇 ) (2)ID序列8號資料 (i) 序列特徵 (A) 長度：804基礎對偶 (B) 型式：核酸 (C) 股型：單 (D) 形態：線型 (ii) 分子型：cDNA (vi)來源 (A) 生物：蛋白質A原始質 (ίχ)特點 (Α)名 / 鏈：CDS (B) 位置：5··796 (xi)ID序列8號之序列說明 (請先閲讀背面之注意事項^^|^本頁)

··丨訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 CTCC ATG GAT CAA CGC ΑΛΤ GGT TTT ATC .CAA AGO CTT AAA GAT GAT CCA 49 Met Asp Gin Arg Asn Gly Phe lie. Gin Ser Leu Lys Asp Asp Pro 15 10 15 AGC CAA AGT GCT AAC GTT TTA GGT GAA GCT CAA AAA CTT AAT GAC TCT 97 Ser Gin Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gin Lys Leu Asn Asp Ser 20 25 30 CAA GCT CCA AAA GCT GAT GCG CAA CAA AAT AAC TTC AAC AAA GAT CAA 145 Gin Ala Pro Lys Ala Asp Ala Gin Gin Asn Asn Phe Asn Lys Asp Gin 35 40 45 CAA AGC GCC TTC TAT GAA ATC TTG AAC ATG CCT AAC TTA AAC GAA GCG 193 Gin Ser Ala Phe Tyr Glu lie Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala 50 . 55 60 CAA CGT AAC GGC TTC ATT CAA AGT CTT AAA GAC GAC CCA AGC CAA AGC 241 Gin Arg Asn Gly Phe lie Gin Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gin Ser 65 70 75 ACT AAC GTT TTA GGT GAA GCT AAA AAA TTA AAC GAA TCT CAA GCA CCG 289 Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gin Ala Pro 80 85 90 95 AAA GCT GAT AAC AAT TTC AAC AAA GAA CAA CAA AAT GCT TTC TAT GAA 337 Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gin Gin Asn Ala Phe Tyr Glu 100 105 110

一 6 0 — 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589322 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（Η ATC TTG AAT ATG CCT AAC TTA AAC GAA GAA CAA CGC AAT GGT TTC ATC 385 lie Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gin Arg Asn Gly Phe lie 115 120 125 CAA AGC TTA AAA GAT GAC CCA AGC CAA AGT GCT AAC CTA TTG TCA GAA 433

Gin Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gin Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu 130 135 140 GCT AAA AAG TTA AAT GAA TCT CAA GCA CCG AAA GCG GAT AAC AAA TTC 481

Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gin Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe 145 150 155 AAC AAA GAA CAA CAA AAT GCT TTC TAT GAA ATC TTA CAT TTA CCT AAC 529

Asn Lys Glu Gin Gin Asn Ala Phe Tyr Glu lie Leu His Leu Pro Asn 160 165 170 175 TTA AAC GAA GAA CAA CGC AAT GGT TTC ATC CAA AGC CTA AAA GAT GAC 577

Leu Asn Glu Glu Gin Arg Asn Gly Phe lie Gin Ser Leu Lys Asp Asp 180 185 190 CCA AGC CAA AGC GCT AAC CTT TTA GCA GAA GCT AAA AAG CTA AAT GAT 625

Pro Ser Gin Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp 195 200 205 GCT CAA GCA CCA AAA GCT GAC AAC AAA TTC AAC AAA GAA CAA CAA AAT 673

Ala Gin Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gin Gin Asn 210 215 220 GCT TTC TAT GAA ATT TTA CAT TTA CCT AAC TTA ACT GAA GAA CAA CGT 721

Ala Phe Tyr Glu lie Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gin Arg 225 230 235 AAC GGC TTC ATC CAA AGC CTT AAA GAC GAT CCG GGG AAT TCC CGG GGA 769

Asn Gly Phe lie Gin Ser Leu Lys Asp Asp Pro Gly Asn Ser Arg Gly 240 245 250 255 TCC C-TC GAC CTG CAG ATA ACA AAT TAG AAGCTTGC 804

Ser Val Asp Leu Gin lie Thr Asn * 260 (2)ID序列9號資料 (i)序列特徵 (請先閲讀背面之注意事項f r本頁) (xi)ID序列9號之序列說明 (A) 長度 (B) 型式 (D)形態 (Π)分子型 264氨基酸 氨基酸 線型 蛋白質 61 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589322 A7 B7 五、發明説明（62 ) 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製

Met Asp Gin Arg Asn Gly Phe lie Gin Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser 15 10 15 Gin Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gin Lys Leu Asn Asp Ser Gin 20 25 30 Ala Pro Lys Ala Asp Ala Gin Gin Asn Asn Phe Asn Lys Asp Gin Gin 35 40 45 Ser Ala Phe Tyr Glu lie Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gin 50 55 60 Arg Asn Gly Phe lie Gin Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gin Ser Thr 65 70 75 80 Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gin Ala Pro Lys 85 90 95 Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gin Gin Asn Ala Phe Tyr Glu lie 100 105 110 Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gin Arg Asn Gly Phe lie Gin 115 120 125 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gin Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu Ala 130 135 140 Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gin Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn 145 150 155 160 Lys Glu Gin Gin Asn Ala Phe Tyr Glu lie Leu His Leu Pro Asn Leu 165 170 175 Asn Glu Glu Gin Arg Asn Gly Phe lie Gin Ser Leu Lys Asp Asp Pro 180 185 190 · Ser Gin Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala 195 200 205 Gin Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gin Gin Asn Ala 210 215 220 Phe Tyr Glu lie Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gin Arg Asn 225 230 235 240 Gly Phe lie Gin Ser Leu Lys Asp Asp Pro Gly Asn Ser Arg Gly Ser 245 250 255 Val Asp Leu Gin He Thr Asn * 260 (2)ID序列l〇號資料 ⑴序列特徵 (A)長度：27基礎對偶 (B)型式：核酸 一 6 2 — 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項 -▲1·本頁 訂 589322 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（63 ) (C) 股型：單 (D) 形態：線型 (ii)分子型：cDNA (vi)來源 (A)生物：原始質Bk 266 (xi)ID序列10號之序列說明 CTCCATGGAT CAACGCAATG GTTTATC (2)ID序列11號資料 (i) 序列特徵 (A) 長度：29基礎對偶 (B) 型式：核酸 (C) 股型：單 (D) 形態：線型 (ii) 分子型：cDNA (vi)來源 (A)生物：原始質Bk 267 (xi)ID序列11號之序列說明 GCAAGCTTCT AATTTGTTAT CTGCAGGTC (2)ID序列12號資料 (i)序列特徵 (A) 長度：2709基礎對偶 (B) 型式：核酸 (C) 股型：單 (D) 形態：線型 -63 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項

•本頁) 訂

589322 經濟部中央揉準局員工消費合作社印裝

A7 _____B7 五、發明説明（64 )(Π)分子型：DNA(基因組）(ix)特點 (A) 名 / 鏈：CDS(B) 位置·· 868··1220 (ix)特點 (A) 名 / 鏈：CDS(B) 位置：1462..2436 (xi)ID序列12號之序列說明 CCATGGCTAT ACCCAACCTC GGTCTTGGTC ACACCAGGAA CTCTCTGGTA AGCTAGCTCC ACTCCCCAGA AACAACCGGC GCCAAATTGC CGGAATTGCT GACCTGAAGA CGGAACATCA TCGTCGGGTC CTTGGGCGAT TGCGGCGGAA GATGGGTCAG CTTGGGCTTG AGGACGAGAC CCGAATCGAG TCTGTTGAAA GGTTGTTCAT TGGGATTTGT ATACGGAGAT TGGTCGTCGA GAGGTTTGAG GGAAAGGACA AATGGGTTTG GCTCTGGAGA AAGAGAGTGC GGCTTTAGAG AGAGAATTGA GAGGTTTAGA GAGAGATGCG GCGGCGATGA CGGGAGGAGA GACGACGAGG ACCTGCATTA TCAAAGCAGT GACGTGGTGA AATTTGGAAC TTTTAAGAGG CAGATAGATT TATTATTTGT ATCCATTTTC TTCATTGTTC TAGAATGTCG CGGAACAAAT TTTAAAACTA AATCCTAAAT TTTTCTAATT TTGTTGCCAA TAGTGGATAT GTGGGCCGTA TAGAAGGAAT CTATTGAAGG CCCAAACCCA TACTGACGAG CCCAAAGGTT CGTTTTGCGT TTTATGTTTC GGTTCGATGC CAACGCCACA TTCTGAGCTA GGCAAAAAAC AAACGTGTCT TTGAATAGAC TCCTCTCGTT AACACATGCA GCGGCTGCAT GGTGACGCCA TTAACACGTG GCCTACAATT GCATGATGTC TCCATTGACA CGTGACTTCT CGTCTCCTTT CTTAATATAT CTAACAAACA CTCCTACCTC TTCCAAAATA TATACACATC TTTTTGATCA ATCTCTCATT CAAAATCTCA TTCTCTCTAG TAAACAAGAA CAAAAAA ATG GCG GAT ACA GCT AGA GGA ACC Met Ala Asp Thr Ala Arg Gly Thr 1 5 CAT CAC GAT ATC ATC GGC AGA GAC CAG TAC CCG ATG ATG GGC CGA GAC (請先閲讀背面之注意事項

本頁) 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 891 939 訂

64 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589322 A7B7 五、發明説明（65 ) His His Asp lie lie Gly Arg Asp Gin Tyr Pro Met Met Gly Arg Asp 10 15 20 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 CGA GAC CAG TAC CAG ATG TCC GGA CGA GGA TCT GAC TAC TCC AAG TCT 987 Arg Asp Gin Tyr Gin Met Ser Gly Arg Gly Ser Asp Tyr Ser Lys Ser 25 30 35 40 AGG CAG ATT GCT AAA GCT GCA ACT GCT GTC ACA GCT GGT GGT TCC CTC 1035 Arg Gin 工le Ala Lys Ala Ala Thr Ala Val Thr Ala Gly Gly Ser Leu 45 50 55 CTT GTT CTC TCC AGC CTT ACC CTT GTT GGA ACT GTC ATA GCT TTG ACT 1083 Leu Val Leu Ser Ser Leu Thr Leu Val Gly Thr Val lie Ala Leu Thr 60 65 70 GTT GCA ACA CCT CTG CTC GTT ATC TTC AGC CCA ATC CTT GTC CCG GCT 1131 Val Ala Thr Pro Leu Leu Val lie Phe Ser Pro lie Leu Val Pro Ala 75 80 85 CTC ATC ACA GTT GCA CTC CTC ATC ACC GGT TTT CTT TCC TCT GGA GGG 1179 Leu lie Thr Val Ala Leu Leu lie Thr Gly Phe Leu Ser Ser Gly Gly 90 95 100 TTT GGC ATT GCC GCT ATA ACC GTT TTC TCT TGG ATT TAC AA 1220 Phe Gly lie Ala Ala lie Thr Val Phe Ser Trp lie Tyr 105 110 115 GTAAGCACAC ATTTATCATC TTACTTCATA ATTTTGTGCA ATATGTGCAT GCATGTGTTG 1280 AGCCAGTAGC TTTGGATCAA TTTTTTTGGT CGAATAACAA ATGTAACAAT AAGAAATTGC 1340 AAATTCTAGG GAACATTTGG TTAACTAAAT ACGAAATTTG ACCTAGCTAG CTTGAATGTG 1400 TCTGTGTATA TCATCTATAT AGGTAAAATG CTTGGTATGA TAC.CTATTGA TTGTGAATAG 1460 G TAC GCA ACG GGA GAG CAC CCA CAG GGA TCA GAC AAG TTG GAC AGT 1506 Tyr Ala Thr Gly Glu His Pro Gin Gly Ser Asp Lys Leu Asp Ser 1 5 10 15 GCA AGG ATG AAG TTG GGA AGC AAA GCT CAG GAT CTG AAA GAC AGA GCT 1554 Ala Arg Met Lys Leu Gly Ser Lys Ala Gin Asp Leu Lys Asp Arg Ala 20 25 30 CAG TAC TAC GGA CAG CAA CAT ACT GGT GGG GAA CAT GAC CGT GAC CGT 1602 Gin Tyr Tyr Gly Gin Gin His Thr Gly Gly Glu His Asp Arg Asp Arg .35 40 45 ACT CGT GGT GGC CAG CAC ACT ACT CTC GTT CCA CGA GGA TCC ATG GAT 1650 Thr Arg Gly Gly Gin His Thr Thr Leu Val Pro Arg Gly Ser Met Asp 50 55 60 CAA CGC AAT GGT TTT ATC CAA AGC CTT AAA GAT GAT CCA AGC CAA AGT 1698 Gin Arg Asn Gly Phe lie Gin Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gin Ser . 65 70 75 GCT AAC GTT TTA GGT GAA GCT CAA AAA CTT AAT GAC TCT CAA GCT CCA 1746 Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gin Lys Leu Asn Asp Ser Gin Ala Pro 80 85 90 95 AAA GCT GAT GCG CAA CAA AAT AAC TTC AAC AAA GAT CAA CAA AGC GCC 1794 Lys Ala Asp Ala Gin Gin Asn Asn Phe Asn Lys Asp Gin Gin Ser Ala 100 105 110 TTC TAT GAA ATC TTG AAC ATG CCT AAC TTA 7UVC GAA GCG CAA CGT AAC 1842 一 65 一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項

本頁)

、1T 589322 A7 B7 五、發明説明（66 ) Phe Tyr Glu lie Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gin Arg Asn 115 120 125 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 GGC TTC ATT CAA AGT CTT AAA GAC GAC CCA AGC CAA AGC ACT AAC GTT 1890 Gly Phe 工le Gin Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gin Ser Thr Asn Val 130 135 140 TTA GGT GAA GCT AAA AAA TTA AAC GAA TCT CAA GCA CCG AAA GCT GAT 1938 Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gin Ala Pro Lys Ala Asp 145 150 155 .AAC AAT TTC AAC AAA GAA CAA CAA AAT GCT TTC TAT GAA ATC TTG AAT 1986 Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gin Gin Asn Ala Phe Tyr Glu lie Leu Asn 160 165 170 175 ATG CCT AAC TTA AAC GAA GAA CAA CGC AAT GGT TTC ATC CAA AGC TTA 2034 Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gin Arg Asn Gly Phe lie Gin Ser Leu 180 185 190 AAA GAT GAC CCA AGC CAA AGT GCT AAC CTA TTG TCA GAA GCT AAA AAG 2082 Lys Asp Asp Pro Ser Gin Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys 195 200 205 TTA AAT GAA TCT CAA GCA CCG AAA GCG GAT AAC AAA TTC AAC AAA GAA 2130 Leu Asn Glu Ser Gin Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu 210 215 220 CAA CAA AAT GCT TTC TAT GAA ATC TTA CAT TTA CCT AAC TTA AAC GAA 2178 Gin Gin Asn Ala Phe Tyr Glu lie Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu 225 230 235 GAA CAA CGC AAT GGT TTC ATC CAA AGC CTA AAA GAT GAC CCA AGC CAA 2226 Glu Gin Arg Asn Gly Phe lie Gin Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gin 240 245 · 250 255 AGC GCT AAC CTT TTA GCA GAA GCT AAA AAG CTA AAT GAT GCT CAA GCA 2274 Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gin Ala 260 265 270 CCA AAA GCT GAC AAC AAA TTC AAC AAA GAA CAA CAA AAT GCT TTC TAT 2322 Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gin Gin Asn Ala Phe Tyr 275 280 285 GAA ATT TTA CAT TTA CCT AAC TTA ACT GAA GAA CAA CGT AAC GGC TTC 2370 Glu lie Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gin Arg Asn Gly Phe 290 295 300 ATC CAA AGC CTT AAA GAC GAT CCG GGG AAT TCC CGG GGA TCC GTC GAC 2418 lie Gin Ser Leu Lys Asp Asp Pro Gly Asn Ser Arg Gly Ser Val Asp 305 310 315 CTG CAG ATA ACA AAT TAG AAGCTTGCAT GCCTGCAGGT CGATCGTTCA 2466 Leu Gin lie Thr Asn * 320 325 AACATTTGGC AATAAAGTTT CTTAAGATTG AATCCTGTTG CCGGTCTTGC GATGATTATC 2526 ATATAATTTC TGTTGAATTA CGTTAAGCAT GTAATAATTA ACATGTAATG CATGACGTTA 2586 TTTATGAGAT GGGTTTTTAT GATTAGAGTC CCGCAATTAT ACATTTAATA CGCGATAGAA 2646 AACAAAATAT AGCGCGCAAA CTAGGATAAA TTATCGCGCG CGGTGTCATC TATGTTACTA 2706 GAT 2709 一 6 6 一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項

•本頁)

，^T

589322 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（67 ) (2)ID序列13號資料(i) 序列特徵 (A) 長度：117氨基酸(B) 型式：氨基酸 (D)形態：線型(Π)分子型：蛋白質 (xi)ID序列13號之序列說明 Met Ala Asp Thr Ala Arg Gly Thr His His Asp He He Gly Arg Asp 15 10 15 Gin Tyr Pro Met Met Gly Arg Asp Arg Asp Gin Tyr Gin Met Ser Gly 20 25 30 Arg Gly Ser Asp Tyr Ser Lys Ser Arg Gin lie Ala Lys Ala Ala Thr 35 40 45 Ala Val Thr Ala Gly Gly Ser Leu Leu Val Leu Ser Ser Leu Thr Leu 50 55 60 Val Gly Thr Val lie Ala Leu Thr Val Ala Thr Pro Leu Leu Val lie 65 70 75 80 Phe Ser Pro lie Leu Val Pro Ala Leu lie Thr Val Ala Leu Leu lie 85 90 95 Thr Gly Phe Leu Ser Ser Gly Gly Phe Gly lie Ala Ala lie Thr Val 100 105 110 Phe Ser Tro lie Tyr 115(2)IP序列14號資料 (〇序列特徵 (A) 長度：325氨基酸(B) 型式：氨基酸 (D)形態：線型(ii) 分子型：蛋白質(xi)ID序列14號之序列說明 一 6 7 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項

▼本頁)

589322 A7 B7 五、發明説明（68 )

Tyr Ala Thr Gly Glu His Pro Gin Gly Ser Asp Lys Leu Asp Ser Ala 15 10 15

Arg Met Lys Leu Gly Ser Lys Ala Gin Asp Leu Lys Asp Arg Ala Gin 20 25 30 (請先閲讀背面之注意事項

Tyr Tyr Gly Gin Gin His Thr Gly Gly Glu His Asp Arg Asp Arg Thr 35 40 45

Arg Gly Gly Gin His Thr Thr Leu Val Pro Arg Gly Ser Met Asp Gin 50 55 60

Arg Asn Gly Phe lie Gin Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gin Ser Ala 65 70 75 80

Asn Val Leu Gly Glu Ala Gin Lys Leu Asn Asp Ser Gin Ala Pro Lys 85 90 95

Ala Asp Ala Gin Gin Asn Asn Phe Asn Lys Asp Gin Gin Ser Ala Phe 100 105 110

Tyr Glu 工le Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gin Arg Asn Gly 115 120 125

Phe lie Gin Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gin Ser Thr Asn Val Leu 130 135 140

Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gin Ala Pro Lys Ala Asp Asn 145 150 155 160 訂

Asn Phe Asn Lys Glu Gin Gin Asn Ala Phe Tyr Glu lie Leu Asn Met 165 170 175

Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gin Arg Asn Gly Phe lie Gin Ser Leu Lys 180 185 190

Asp Asp Pro Ser Gin Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu 195 200 205

Asn Glu Ser Gin Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gin 210 215 220

Gin Asn Ala Phe Tyr Glu lie Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu 225 230 235 240

Gin Arg Asn Gly Phe lie Gin Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gin Ser 245 250 255 經濟部中央梂準局員工消費合作社印製

Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gin Ala Pro 260 265 * 270

Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gin Gin Asn Ala Phe Tyr Glu 275 280 285 lie Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gin Arg Asn Gly Phe lie 290 295 300

Gin Ser Leu Lys Asp Asp Pro Gly Asn Ser Arg Gly Ser Val Asp Leu 305 310 315 320

Gin lie Thr Asn * 325 一 68 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

Claims (1)

1. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589322 Λ8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 金屬離子，以及離子者。 10·如申請專利範圍第8項之方法，其中配位基分子爲 水蛭素，而標的分子爲凝血酵素者。 11·如申請專利範圍第8項之方法，其中配位基分子爲 蛋白質A，而標的分子爲免疫球蛋白者。 12·如申請專利範圍第8項之方法，其中配位基分子爲 金屬硫因，而標的分子爲鎘者。 I3·如申請專利範圍第8項之方法，其中配位基分子爲 纖維素結合蛋白質，而標的分子爲纖維素者。 I4·如申請專利範圍第8項之方法，其中配位基分子爲 核酸結合蛋白質，而標的分子爲核酸者。 1S·如申請專利範圍第14項之方法，其中配位基爲單 股DNA結合蛋白質或RN A結合蛋白質，而標的爲單股核 酸分子者。 I6·如申請專利範圍第2項之方法，其中配位基爲結合 於油體（oil bodies)或油體（〇ii bodies)蛋白質之抗體者。 17·如申請專利範圍第項之方法，其中標的爲細胞、 細胞小器官，或可結合配位基抗體之細胞成份者。 18·如申請專利範圍第1<5項之方法，其中細胞爲金黃 色葡萄球菌者。 19·如申請專利範圍第16項之方法，其中配位基係結 合於油體（oil bodies)和標的二者之雙價抗體者。 2〇·如申請專利範圍第6項之方法，其中配位基係共軛 於卵白素Z抗體’而標的分子爲生物素者。 一 70— 本紙張尺度適用中國i家標準（CNS ) A4規公4 j --- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -5'口 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 589322 Λ8 B8 C8 D8 _ 六、申請專利範圍 • 21.如申請專利範圍第4項之方法，其中油體（oil bodies)蛋白質爲油伊紅者。 2 2.如申請專利範圍第21項之方法，其中油伊紅係衍 生於選自下列之植物··油菜籽（Brassica SPP·)、大豆 (Glycine max)、向日葵（Helianthus annuus)、油棕櫚 (Elaeis guineeis)、椰子（Coens uncifera)、蓖麻（Ricinus communis)、紅花（Cart hamus tinclorius)、芥菜（Brassica spp·和 Sinapis alba)、胡荽（Coriandrum sativum)、亞麻仁 / 亞麻（Linum usitatissimum)、thale cress(Arabidopsis thaliana)和玉米（Zea mays)者。 23·如申請專利範圍第1項之方法，其中在步驟（1)內， 將油體（oil bodies)與樣品混合，再培育 1分鐘至 24 小時者。 24·如申請專利範圍第23項之方法，其中混合之油體 (oil bodies)和樣品係在 4°C至ν·室溫的溫度範圍培育 者。 25·如申請專利範圍第1項之方法，其中與標的分子締 合之油體（oil bodies)，係在步驟（2)內利用離心、浮動或尺 寸排斥法，從樣品分離者。 26·如申請專利範圍第1項之方法，又包括（3)從油體 (oil bodies)分離標的分子者。 27·如申諝專利範圍第26項之方法，其中標的分子係 在適當條件下，利用洗提分離者。 28·如申諝專利範圍第1項之方法，其中油體（〇ii -71 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210父297公羡1 -- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -0. 訂 589322 Λ8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 bodies)係由下列植物所得，包含油菜籽（Brassica spp.)、 大豆（Glycine max)、向日葵（Helianthus annuus)、油棕櫚 (Elaeis guineeis)、椰子（Cocus uncifera)、蓖麻（Ricinus communis)、糸工花（Carthamus tinclorius)、芥菜（Brassica spp·和 Sinapis alba)、胡荽（Coriandrum sativum)、亞麻仁 / 亞麻（Linum usitatissimum)、thale cress(Arabidopsis tha丨iana)和玉米（Zea mays)者。 29·—種組成物，包括與標的分子締合之如申請專利範 圍第1項之油體（oil bodies)，其中標的分子係選自包含有 機分子、類脂物、碳水化合物、核酸、細胞、細胞器官、細 胞分部、病毒、金屬、金屬離子和離子之分子者◊ 30·—種組成物，包括與標的分子締合之如申請專利範 圍第1項之油體（oil bodies)，其中標的係經由配位基分子 與油體（oil bodies)締合，其中標的分子係選自包含有機分 子、蛋白質、肽、類脂物、碳水化合物、核酸、細胞、細胞 器官、細胞分部、病毒、金屬、金屬離子和離子之分子者。 31·如申請專利範圍第30項之組成物，其中配位基分 子係共價附著於油體（oil bodies)者。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 32·如申請專利範圍第30項之組成物，其中配位基係 生物素者。 —72 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）