JPH02250900A

JPH02250900A - エクオリン標識した特異的結合タンパク質の精製法

Info

Publication number: JPH02250900A
Application number: JP6986289A
Authority: JP
Inventors: Shuhei Yoshino; 修平善野; Satoshi Inoue; 敏井上
Original assignee: Chisso Corp
Current assignee: JNC Corp
Priority date: 1989-03-22
Filing date: 1989-03-22
Publication date: 1990-10-08

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（技術の分野）本発明は、エクオリン標識した特異的結合タンパク質の
精製法に関する。

（従来の技術とその問題点）発光蛋白エクオリンは、米国ワシントン州フライデーハ
ーバ−島近郊の海洋に生息する発光オワンクラゲより単
離されたカルシウム結合タンパク賞である。エクオリン
は、自然界においてはタンパク質部分のアポエクオリン
と、基質部分であるセレンテラジンが、分子状酸素を介
して複合体を形成しており、この複合体にカルシウムが
結合することにより発光することを特徴とする。この発
光を利用してカルシウム濃度を測定することができる。

本発明者は組換えＤＮＡの手法を用いて、発光オワンク
ラゲよりアポエクオリンのｃＤＮ＾をクローニングし、
その１次構造を決定した（特開昭６ｌ−１３５５８６）
、、次いで、このｃＤＮ＾を用いて大腸菌を宿主とし、
その菌体内及び菌体外でのアポエクオリンの生産に成功
した（特願昭６０−２４１０２５９．８ｌ−２４９０９
８）　、さらに、機能遺伝子と結合したエクオリン遺伝
子を作成し、その融合タンパク質の生産に成功した（特
願昭６２−１９６０３１）　、また、エクオリンの発光
を利用した金属の検出方法を開発した（特願昭６ｌ−１
０３８４９）　、そして、特異的結合タンパク質の遺伝
子と結合したエクオリン遺伝子を作成し、その融合タン
パク質の生産に成功した（特願昭６３−３０８４２４）
　。

該発明は特異的結合タンパク質と融合したエクオリンを
用いた検出技術への応用を実証した報告である。

ところで、エクオリンの有用性は当業者に予測され得る
処であり、エクオリンを特異的結合タンパク質を介して
標的物に結合せしめることにより、標的物を特異的に発
光で検出することができる。ここで、特異的結合とは抗
原抗体反応、＃未反応、レセプターへの特異的結合、核
酸とタンパク質の特異的結合等を利用した結合である。

そして、特異的結合能を有するタンパク質と融合したエ
クオリンは、上述した機能から診断薬等の検査薬として
有用であることは自明である。

本発明者は上述の技術的事情にかんがみ、研究の結果、
組換えＤＮＡの手法により生産されてなる抗体結合能を
有するタンパク質と融合したエクオリンの高純度な精製
を可能にすることができた。

以上の説明から明らかなように、本発明の目的はエクオ
リン活性を保持した特異的結合能を有するタンパク質の
Ｐｉ！製法、エクオリン標識した抗体結合タンパク質の
精製法およびエクオリン標識したプロティンＡの精製法
を提供することである。

（問題を解決するための手段）本発明は、下記　＋１）〜（３）の構成を有する。

（１）エクオリン標識された融合タンパク質を集菌し、
超音波破砕し、該被破砕物を遠心して得られた上清（細
胞抽出液）をアフィニティ・カラム・クロマトグラフィ
ー処理して溶出後分画し分離して得られたアフィニティ
精製エクオリン標識プロティンＡを濃縮した後、ゲル濾
過・カラム・クロマトグラフィー処理し、エクオリン活
性なフラクションを分画して分離し、かくして得られた
ゲル濾過精製エクオリン標識プロティンＡを分画し、分
離して濃縮することを特徴とするエクオリン標識された
特異的結合タンパク質の精製法。

（２）エクオリン標識された抗体結合タンパク質を集菌
し、超音波破砕し、該被破砕物を遠心して得られた上清
（細胞抽出液）をアフィニティ・カラム・クロマトグラ
フィー処理して溶出後分画し分離して得られたアフィニ
ティ精製エクオリン標識抗体結合プロティンＡを濃縮し
た後、ゲル濾過・カラム・クロマトグラフィー処理し、
エクオリン活性なフラクションを分画して分離し、かく
して得られたゲル濾過精製エクオリン標識抗体結合プロ
ティンＡを分画し、分離して濃縮することを特徴とする
エクオリン標識された抗体結合タンパク質の精製法。

（３）エクオリン標識されたプロティンＡを集菌し、超
音波破砕し、該被破砕物を遠心して得られた上溝（細胞
抽出液）をアフィニティ・カラム・クロマトグラフィー
処理して溶出復号画し分離して得られたアフィニティ精
製エクオリン標識プロティンＡを濃縮した後、ゲル濾過
・カラム・クロマトグラフィー処理し、エクオリン活性
なフラクションを分画して分離し、かくして得られたゲ
ル濾通精製エクオリン標識プロティンＡを分画し、分離
して濃縮することを特徴とするエクオリン標識されたプ
ロティンＡの精製法。

本発明の構成と効果につき以下に詳述する。

本発明はエクオリン活性を保持した特異的結合能を有す
るタンパク質と融合したエクオリンに係る精製法による
ものであり、例えば後述の実施例に示す方法で行うこと
ができる。

本発明を添付図面によって説明すると、第１図はエクオ
リン標識した特異的結合タンパク質の精製工程図（フロ
ーシート）を示す、エクオリン融合タンパク貿生産菌を
公知の条件で培養した後、集菌し、その菌体な超音波で
破砕し、細胞抽出液を調製する。その細胞抽出液をアフ
ィニティ・カラム・クロマトグラフィーにより分画し、
該融合タンパク質を分離する０本操作は、特異的な吸着
を利用しており、目的物の純度アップに効果的である０
次にその両分をゲル濾過カラム・クロマトグラフィーに
より分画し、サイズにより該融合タンパク質を分離する
０本操作は膜などの巨大分子に巻ぎ込まれた該融合タン
パク質の除去に効果的である。さらに、目的とする両分
を逆相）ＩＰＬＣにより分画し、疎水性により、該融合
タンパク質を分離する０本操作は、より高純度な標品の
調製に効果的である。

第２図は、（実施例の試料の）　ＩｇＧセルロース・カ
ラム・クロマトグラフィーの結果を示す、実線は２８０
ｎｓの吸光度、黒丸はエクオリン活性を表わす。

第３図は、スーパーローズ１２・カラム・クロマトグラ
フィーの結果を示す、実線は２８０ｎ■の吸光度、黒丸
はエクオリン活性を表わす。

第４図は、ワコーシルＳＣ４・カラム・クロマトグラフ
ィーの結果を示す、実線は２８０ｎｍの吸光度、点線は
アセトニトリルの割合を表わす。

上述のようにして得られた高純度精製エクオリン標識プ
ロティンＡを検査薬等の用途に用いる場合、直接的に抗
体を発光で検出でき、また、間接的に抗原を検出するこ
とも可能である。すなわち、エクオリンで標識した特異
的結合タンパク質を用いることにより、その特異的結合
の結果として、種々の物質を特異的に発光で検出するこ
とが可能になる。

（発明の効果）本発明のエクオリン活性を保持した特異的結合能を有す
るタンパク質と融合したエクオリンのＦ＃復製法有用性
は、当業者に自明である。該融合タンパク質のもつ特異
的結合能と発光能を利用することにより、発光の有無を
用いた検出法に応用できる。

上記の開示により、当業者は特許請求された本発明を実
施できる。しかし、この技術の理解を増すために本発明
に重要なエクオリン活性を有するプロティンＡと融合し
たエクオリンの精製に使われる手順を以下に明らかにす
る。

〔実施例〕

実施例１［エクオリン標識プロティンＡの細胞抽出液の
調製］エクオリン標識プロティンＡ生産菌（ｐ＾＾Ｑｌ／ＪＭ
８３株、特願昭１ｉ３−３０８４２４号）の−２０℃グ
リセロール・ストック２０μｍをＬ−ｂｒｏｔｈ　　（
１％トリプトン、０，５％酵母エキス、０．５％ＮａＣ
Ｉ）　　１０ｓｊ！に摂取し、　２００ｍｇ／■１アン
ピシリンをｌＯμｊｔ添加した後、３７℃にて１晩娠遣
培養した。この培養液を遠心チューブに移し、　１Ｇ、
ＯＯＯｒｐｍ、　　４℃、２分間遠心し、沈殿（菌体）
を集めた。１０分の１容量の３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣ
Ｉ（ｐＨ７，６）、　１０５Ｍ　ＥＤＴ＾バッファーに
て懸濁した後、菌体を超音波破砕した。　Ｉｓ、ＯＯＯ
ｒｐｍ。

４℃、　２０分間遠心し、その上清をエクオリン標識プ
ロティンＡの細胞抽出液とした。エクオリン活性及びタ
ンパク量の測定を行なったところ、エクオリン活性は１
２．７Ｘ　１Ｇ’　ｒ、１．ｕ、／＋＋４、タンパク買
置は１４．４＋ｅｇ／ｍｕ、比活性は８．８２ｘ　１０
’　ｒ、１．ｕ、７ｍｇであった。

実施例２［アフィニティ精製エクオリン標識プロティン
Ａの調製］エクオリン標識プロティＡ細膓抽出液２０ＩＩＩｌをＩ
ｇＧセファロース６ＦＦ　（１，５φＸ４．５ｃｍ、フ
ァルマシア社製）によるアフィニティ・クロマトグラフ
ィーにかけた。　５０５Ｍ　ＴＲｌ５−ＨＣＩ（ｐＨ７
，６）、　１５０ｍＭＮａＣ１，０，０５％　Ｔｗｅｅ
ｎ２０バッファー１００ｍＪ２、次し）で５ｍＭ酢酸ア
ンモニウム（ｐ）１５．０）バッファー２０會ａにて順
次洗浄した。吸着及び洗浄の流速は２■Ｘ／■Ｉｎ、フ
ラクションは１０ｓｊ！ずつ分取した。

溶出は０．１ＭグリシンＨＣＩ　（ｐＨ３，ｏ）バッフ
ァーで行ない、流速は０．２１ｆｔ　７ｍ１口とし、フ
ラクションは１ｓ１ずつ分取した。

溶出後のピークを、アフィニティ絹製エクオリン欅識プ
ロティンＡとした。エクオリン活性及びタンパク量の測
定を行なったところ、溶出後、１５番目のフラクション
が最も比活性が高く１、ｌＩＸ　ＩＱ’ｒ、１．ｕ、７
ｍｇであった。１）〜３９番目までのフラクションに対
してエクオリン活性回収率は１２．２％であった。フラ
クションＮｏ、１５は、細胞抽出液に対して、比活性が
１２．６倍上昇したことになる。

第２図に示すように、本操作は粗精製標品からの目的物
の分離、精製に効果的である。抗体・プロティンＡ以外
の特異的結合を利用するアフィニティ・クロマトグラフ
ィーに関しても有用であることは言うまでもない。

実施例３［ゲル濾過精製エクオリン標識プロティンＡの
調製］アフィニティ絹製エクオリン標識プロティンＡを２７％
アンモニア水にてｐＨ７〜８に調節した後、コンセント
レータ−（商品名セントリコン３０、ブレース・ジャパ
ン社製）にて濃縮した。

濃縮したアフィニティ精製エクオリン標識プロティンＡ
、５（１４１は、５ｕｐｅｒｏｓｅ１２　（１φ×３０
ｃ園ファルマシフアルマシアるゲル濾過クロマトグラフ
ィーにかけられた。５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７
，６）、　１５０ｍＭ　ＮａＣ１，バーツフｙ−１２″
、流速０．２ｍｊ！／ｗｉｎ、　　クラクションは０．
４ｍｆＬずつ分取した。エクオリ活性として活性なクラ
クションをゲル濾過精製エクオリン標識プロティンＡと
した。

種々の試料について、エクオリン活性及びタンパク量の
測定を行なったところ、アフィニティ精製の濃縮標品の
エクオリン活性は、２１．４Ｘ　１０ａｒ、１．ｕ、／
ｓｆｔ、タンパク量は６ｔｉ、ＯＢ／ｍｆｌ、比活性は
３．２４ｘ　１０’ｒ、１．ｕ、７ｍｇであった。３３
番目のフラクションが最も比活性が高く、２．５３ｘ　
１０’　ｒ、１．ｕ／ｍｇであった。比活性は、ゲル濾
過分画前に比べて　７．８倍上昇した。

３１〜３６番目のフラクションに対して、エクオリン活
性回収率は９０．９％であった。

第３図に示すように、本操作は、アフィニティ精製漂品
に混在する目的物の分解産物及び含有物の除去に効果的
である。

実施例４［ＨＰＬＣ精製エクオリン標識プロティンの調
製］ゲル濾過精製エクオリン標識プロティンＡ（フラクショ
ンＮｏ、３３）　１００μｍ２をＷａｋｏｓ目５Ｃ４（
４，６φｘｌＯ（１膳膳）による逆相ＨＰＬＣにかけた
。溶媒としては０．１％トリフルオロ酢酸、水／アセト
ニトリル系で行ない、流速は０．８ｍ１ｌ　／−１ｎと
した。主要ピーク部分を分取し、濃縮後エクオリン活性
を測定したところ、エクオリン活性回収率は２１．６％
であった。

′！Ｊ４図に示すように、本操作は、ゲル濾過操作にて
分離できなかった不純物の除去に効果的である。

実施例６［タンパク質の定量］タンパク質の定量は、クマジー・ブリリアント・ブルー
を用いた色素結合法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ｍ、Ｍ、　（
１９７６）１＾ｎａ１．ＢＩｏｃｈｅｍｙ７２．２４８
）で行つた。すなわち、市販品のプロティンアッセイキ
ット■を用いて行なった。・適当に希釈した試料２４−
１に染色液０．６ｍＪｌ加えて、混合後、１５分後に５
９５ｎｓの吸光度を測定した。スタンダードとしてはウ
シ・ｒグロブリンを用いた。

実施例５［エクオリン活性の測定］反応液２００μβ中に３０ｍＭ丁ｒｉｓ−Ｈｃｌ　（ｐ
Ｈ７，６）、１０■Ｍ　ＥＤＴ＾（ｐＨ７，５）　ＩＩ
衝液、１■ｇ／謹１セレンテラジン１μｍ、２−メルカ
プトエタノール４μぶ、試料液を含む。

４℃に一晩放置した後、反応液の一部をルミフォトメー
ター（ＴＤ−４０００、ラボサイエンス社）のキュベツ
ト中に移し、３０朧Ｍ　ＣａＣｌ２を　１００μ！注入
し、その発光量を測定した。

【図面の簡単な説明】

第１〜４図は、本発明の説明図である。第１図は、エクオリン標識プロティンＡの精製工程図（
フローシート）である。第２図は、アフィニティ（ＩｇＧセフ１０−ス）クロマ
トグラフィーの結果を示し、第３図は、ゲル濾過（スー
パーロース１２）クロマトグラフィーの結果を示し、第
４図は、逆相高速液体（ワコーシル５Ｃ４）クロマトグ
ラフィーの結果を示す。第１図以上

Claims

【特許請求の範囲】

（１）エクオリン標識された融合タンパク質を集菌し、
超音波破砕し、該被破砕物を遠心して得られた上清（細
胞抽出液）をアフィニティ・カラム・クロマトグラフィ
ー処理して溶出後分画し分離して得られたアフィニティ
精製エクオリン標識プロテインＡを濃縮した後、ゲル濾
過・カラム・クロマトグラフィー処理し、エクオリン活
性なフラクションを分画して分離し、かくして得られた
ゲル濾過精製エクオリン標識プロテインＡを分画し、分
離して濃縮することを特徴とするエクオリン標識された
特異的結合タンパク質の精製法。
（２）エクオリン標識された抗体結合タンパク質を集菌
し、超音波破砕し、該被破砕物を遠心して得られた上清
（細胞抽出液）をアフィニティ・カラム・クロマトグラ
フィー処理して溶出後分画し分離して得られたアフィニ
ティ精製エクオリン標識抗体結合プロテインＡを濃縮し
た後、ゲル濾過・カラム・クロマトグラフィー処理し、
エクオリン活性なフラクションを分画して分離し、かく
して得られたゲル濾過精製エクオリン標識抗体結合プロ
テインＡを分画し、分離して濃縮することを特徴とする
エクオリン標識された抗体結合タンパク質の精製法。
（３）エクオリン標識されたプロテインＡを集菌し、超
音波破砕し、該被破砕物を遠心して得られた上清（細胞
抽出液）をアフィニティ・カラム・クロマトグラフィー
処理して溶出後分画し分離して得られたアフィニティ精
製エクオリン標識プロテインＡを濃縮した後、ゲル濾過
・カラム・クロマトグラフィー処理し、エクオリン活性
なフラクションを分画して分離し、かくして得られたゲ
ル濾過精製エクオリン標識プロテインＡを分画し、分離
して濃縮することを特徴とするエクオリン標識されたプ
ロテインＡの精製法。