ES2259193T3 - Cuerpos oleosos y proteinas asociadas como matrices de afinidad. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la separación de una molécula diana de una muestra que comprende las etapas siguientes: 1) poner en contacto (i) cuerpos oleosos con (ii) una muestra que contiene la molécula diana para permitir que la molécula diana se asocie con los cuerpos oleosos, en el que la molécula diana y los cuerpos oleosos están asociados mediante una molécula de ligando; 2) separar los cuerpos oleosos asociados con la molécula diana de la muestra; y 3) separar la molécula diana de los cuerpos oleosos.

Description

Cuerpos oleosos y proteínas asociadas como matrices de afinidad.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la utilización de cuerpos oleosos y a sus proteínas asociadas como matrices de afinidad para la separación y purificación de moléculas diana de muestras.

Antecedentes de la invención

Dentro del campo general de la biotecnología, la capacidad para separar y purificar eficazmente moléculas de fuentes complejas, tales como células vivas, suero sanguíneo o caldo de cultivo de fermentación, es de importancia crítica. Las aplicaciones en industria y en laboratorios de investigación (en los que, por ejemplo, se utilizan proteínas purificadas o parcialmente purificadas) son numerosas y bien documentadas en la bibliografía anterior. Véase, por ejemplo, R. Meadon y G. Walsh en Biotechnological Advances 1994, 12: págs. 635-646.

La mayoría de las técnicas empleadas actualmente para la separación de moléculas se capitaliza en las propiedades físicas y químicas innatas de la molécula de interés. Las tecnologías de purificación basadas en la afinidad son únicas porque aprovechan el reconocimiento biológico muy específico entre dos especies moleculares que forman un par de afinidad. La unión de las dos entidades del par de afinidad se produce en casi todos los casos como resultado de interacciones químicas relativamente débiles, conocidas como enlaces no covalentes. Algunos pares de afinidad reconocidos en la técnica y utilizados normalmente comprenden anticuerpos y sus sustancias antigénicas de fijación, proteínas de fijación a ácidos nucleicos y ácidos nucleicos, proteínas de fijación a lípidos y lípidos, lectinas y carbohidratos, complejos estreptavidina/biotina, complejos proteína A/inmunoglobulina G y receptores y sus moléculas de fijación.

En general, los procesos de purificación basados en la afinidad requieren que un elemento de par de afinidad esté inmovilizado en un sustrato o matriz sólido que es insoluble en el fluido en el cual reside el otro elemento del par. La especie molecular del par de afinidad fijado a la matriz se denomina generalmente ligando, mientras que el elemento soluble líquido se denomina generalmente elemento diana. Sin embargo, es importante advertir que estas definiciones no imponen ninguna restricción en un sentido químico estricto. La gran mayoría de técnicas de inmovilización del ligando actuales se basan en métodos físicos o químicos. La inmovilización física del ligando implica la adsorción o compresión del ligando a un soporte adecuado, mientras que el modo químico de inmovilización se caracteriza por la formación de reticulaciones fuertes o de enlaces covalentes entre el ligando y la matriz. Es un requisito que la inmovilización se realice de tal modo que la capacidad de los elementos del par de afinidad para reconocerse entre sí no esté afectada desfavorablemente por el procedimiento de inmovilización.

Una desventaja de las técnicas físicas y químicas disponibles actualmente para inmovilizar los ligandos es que los procesos de producción son frecuentemente prolongados y costosos. Esto es debido principalmente al hecho de que las técnicas de inmovilización requieren la producción separada del material de la matriz y los ligandos, que en la etapa posterior deben acoplarse. Un modo alternativo de proteínas de inmovilización se describe en la patente US nº 5.474.925 que documenta un sistema de producción biológico para la inmovilización de enzimas en la fibra de las plantas de algodón. Esta patente da a conocer lo que se cree que es el primer sistema de inmovilización de enzimas producido biológicamente y permite la producción en una etapa de la matriz y el ligando.

Tras la inmovilización del ligando en la matriz, puede emplearse una variedad de técnicas de purificación basadas en la afinidad para realizar la fijación selectiva entre el ligando inmovilizado por afinidad y el elemento diana. Las técnicas de purificación basadas en la afinidad conocidas en la técnica anterior comprenden la cromatografía por afinidad de perfusión, la cromatografía de repulsión por afinidad, la cromatografía por afinidad de hiperdifusión, la precipitación por afinidad, la división por afinidad de la membrana, la ultrafiltración por afinidad en flujo cruzado y la precipitación por afinidad. En la técnica de purificación basada en afinidad más extensamente utilizada, la cromatografía por afinidad, una matriz que contiene un ligando se recubre en el interior de una columna cromatográfica, o se empaqueta en la misma. Una mezcla compleja que contiene el elemento diana se aplica a continuación a la columna cromatográfica. Teóricamente, solamente las moléculas diana que reconocen específicamente al ligando se fijan de modo no covalente a la columna cromatográfica, mientras que todas las demás especies moleculares presentes en la muestra pasan a través de la columna.

En la división por afinidad, se emplean dos soluciones de densidades sustancialmente diferentes. La solución compleja que contiene el elemento diana se mezcla con una solución de una densidad diferente que contiene el ligando de afinidad. Después del mezclado, se dejan sedimentar las soluciones para permitir la formación de dos fases separadas. Las moléculas tienden a repartirse diferencialmente entre las fases dependiendo de su tamaño, carga e interacciones específicas con las soluciones formadoras de fases. La proteína diana fijada al ligando se reparte selectivamente en la fase que contiene el ligando de afinidad. Por ejemplo, Coughlin y Baclaski en Biotechnology Progress, 1990 6:307-309 describieron la utilización de la solución orgánica de isooctano que contiene biotina para transferir la avidina desde una solución acuosa hasta la solución de isooctano. Sin embargo, hasta el momento las aplicaciones de reparto de afinidad han sido limitadas debido principalmente a la falta existente de disponibilidad de sustancias de la matriz de afinidad adecuadas que puedan emplearse en el reparto específico en sistemas de dos fases.

Un factor importante para el desarrollo comercial de la biotecnología es la purificación de bioproductos que asciende normalmente al 50% o más de los costes totales (Labrou, N. y Clonis, Y.D. en el Journal of Biotechnology 36: 95-119 (1994)). Muchas etapas de purificación de proteínas se basan en procedimientos de separación en columna. En particular, las técnicas de separación a gran escala tales como las técnicas de purificación de proteínas basadas en la cromatografía en columna o en discontinuo son costosas. Además, el material en bruto es menos adecuado para la cromatografía en columna o las separaciones discontinuas, ya que los contaminantes pueden ensuciar las resinas sedimentadas y bloquear las columnas. Por esta razón, las matrices de afinidad se emplean con frecuencia solamente en una etapa posterior de los procesos de purificación donde la pureza sustancial es crítica, donde las proteínas están presentes en concentraciones sumamente diluidas o donde se necesitan proteínas de gran valor, por ejemplo, en el diagnóstico y proteínas terapéuticas. Éstos y otros tópicos relacionados con la utilización de la tecnología de afinidad en los procesos biotecnológicos han sido estudiados por Labrou, N. y Clonis, en el Journal of Biotechnology 36: 95-119 (1994).

Existe necesidad en la técnica de desarrollar métodos nuevos y económicos para la separación y purificación de productos biológicos de mezclas complejas.

Los presentes inventores han descubierto que las estructuras subcelulares de almacenamiento de aceite, conocidas como cuerpos oleosos, y sus proteínas asociadas son útiles a este respecto.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un nuevo sistema biológico versátil para la producción de matrices de afinidad. Los presentes inventores han descubierto que los cuerpos oleosos y sus proteínas asociadas pueden utilizarse como matrices de afinidad para la separación de una amplia variedad de moléculas diana tales como proteínas, carbohidratos, lípidos, moléculas orgánicas, ácidos nucleicos, metales, células y fracciones celulares en una muestra.

Según la invención, se proporciona un método para la separación de una molécula diana de una muestra que comprende: 1) poner en contacto (i) los cuerpos oleosos que pueden asociarse, ya sea directa o indirectamente, con la molécula diana con (ii) una muestra que contiene la molécula diana para permitir que la molécula diana se asocie con los cuerpos oleosos, en el que la molécula diana y los cuerpos oleosos se asocian mediante una molécula de ligando; 2) separar los cuerpos oleosos asociados a la molécula diana de la muestra; y 3) separar la molécula diana de los cuerpos oleosos. Los cuerpos oleosos y la muestra que contiene la molécula diana se ponen en contacto de un modo suficiente que permita a los cuerpos oleosos asociarse con la diana. Preferentemente, los cuerpos oleosos se mezclan con la diana.

Se utiliza una molécula de ligando para asociar la molécula diana con los cuerpos oleosos.

En una forma de realización, el ligando presenta afinidad natural por los cuerpos oleosos o la proteína con cuerpo oleoso. En una forma de realización específica, el ligando es un anticuerpo que se fija a la proteína con cuerpo oleoso. Dicho anticuerpo puede utilizarse para separar dianas que posean afinidad por el anticuerpo del ligando tales como los anticuerpos anti-igG o la proteína A. Puede prepararse también un anticuerpo bivalente que presente especificidades de fijación tanto para la proteína con cuerpo oleoso como para la diana. El anticuerpo contra la proteína con cuerpo oleoso puede fusionarse también a un segundo ligando que presente afinidad por la diana.

En otra forma de realización, el ligando se une mediante enlaces covalentes a los cuerpos oleosos o a la proteína con cuerpo oleoso. En una forma de realización, el ligando es una proteína que está conjugada químicamente o producida como proteína de fusión con la proteína con cuerpo oleoso (como se describe en el documento WO 96/21029). En este último caso, la proteína de fusión se dirige a los cuerpos oleosos y se expresa en ellos. En un ejemplo, el ligando fusionado a la proteína del cuerpo oleoso puede ser la hirudina y puede utilizarse para purificar la trombina. En otro ejemplo, el ligando fusionado a la proteína del cuerpo oleoso puede ser la metalotioneína y puede utilizarse para separar el cadmio de una muestra. En un ejemplo adicional, el ligando fusionado a la proteína del cuerpo oleoso puede ser la proteína A y puede utilizarse para separar las inmunoglobulinas. En otro ejemplo asimismo, el ligando fusionado a la proteína del cuerpo oleoso puede ser la proteína que se fija a la celulosa y puede utilizarse para separar la celulosa de una muestra.

En otra forma de realización, el ligando puede estar unido por enlaces covalentes a los cuerpos oleosos. Por ejemplo, el ligando puede ser una molécula orgánica pequeña tal como la biotina. Pueden utilizarse cuerpos oleosos biotinilados para separar la avidina de una muestra.

La presente invención comprende también cuerpos oleosos modificados para su utilización como matriz de afinidad.

La presente invención comprende también una matriz de afinidad para su utilización en la separación de una molécula diana de una muestra, que comprende cuerpos oleosos que pueden asociarse a la molécula diana. La matriz de afinidad incluye una molécula de ligando asociada a los cuerpos oleosos, en la que la molécula de ligando es capaz de asociarse a la molécula diana.

Otros objetivos, características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y de los dibujos adjuntos. Debe entenderse, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos asociados se proporcionan únicamente a título ilustrativo.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Nucleótido y secuencia de aminoácidos deducida de la oleosina de 18 KDa de Arabidopsis thaliana como se muestra en la SEC. ID nº:1 y SEC. ID nº:2.

Figura 2. Secuencia de una fusión oleosina-hirudina de Arabidopsis. Se indica una porción de la secuencia genómica de oleosina (desde la base 1 hasta 1620 como se describe en van Rooijen et al. 1992, Plant Mol. Biol. 18: 1177-1179), una secuencia separadora (bases 1621 a 1635, subrayadas) y la secuencia de ADN sintético que codifica la isoforma variante 2 de hirudina madura (bases 1636-1833, en cursiva). Esta fusión génica está regulada por la zona 5' corriente arriba de la oleosina (bases 1 a 861) de Arabidopsis y la secuencia de terminación de la nopalina sintetasa (bases 1855 a 2109). La secuencia se presenta también en la SEC. ID nº:3 y en la SEC. ID nº:4.

Figura 3. Esquema de las etapas empleadas en la construcción de pCGOBHIRT, que contiene el montaje complejo de oleosina-hirudina.

Figura 4. Diagrama esquemático que ilustra la configuración de la proteína de fusión oleosina-hirudina en el cuerpo oleoso y la fijación de la trombina.

Figura 5. Perfiles de elución en NaCl de la trombina de las matrices del cuerpo oleoso natural y 4A4 transformadas con un montaje que expresa una fusión de oleosina-hirudina.

Figura 6. Purificación de un anticuerpo anti-IgG conjugado con peroxidasa de rábano picante utilizando un anticuerpo antioleosina como ligando. Diagrama esquemático que ilustra la configuración del complejo en sandwich oleosina/antioleosina/anti-IgG ligado a un cuerpo oleoso.

Figura 7. Ilustra la fijación específica de anticuerpos anti-IgG a cuerpos oleosos naturales acomplejados con anticuerpos antioleosina primarios como ligando (izquierda) y la fijación de anticuerpos anti-IgG a cuerpos oleosos que no estaban acomplejados con los anticuerpos primarios antes de la fijación con los anticuerpos secundarios (derecha).

Figura 8. Secuencia de una fusión oleosina-metalotioneína. Se indican la secuencia de codificación de un ADNc de oleosina de B. napus (bases 1092 a 1652, van Rooijen, 1993, Ph.D. Thesis, University of Calgary), una secuencia separadora (bases 1653 a 1670, subrayadas) y el gen mt-II de metalotioneína humana (bases 1671 a 1876, Varshney y Gedamu, 1984, Gene, 31: 135-145)). La fusión génica está regulada por el activador de la oleosina de Arabidopsis (bases 1 a 1072) y la secuencia de terminación de la ubiquitina (bases 1870 a 2361, ubi3'; Kawalleck et al., 1993, Plant. Mol. Biol. 21: 673-684). La secuencia se muestra también en la SEC. ID nº:6 y en la SEC. ID nº:7.

Figura 9. Esquema de las etapas empleadas en la construcción de pBIOOM3', que contiene el montaje complejo de oleosina-metalotioneína.

Figura 10. Diagrama esquemático que ilustra la configuración de la proteína de fusión oleosina-metalotioneína en el cuerpo oleoso y la fijación de los iones cadmio.

Figura 11. Ilustra la fijación (A) y elución (B) del cadmio a una matriz con cuerpo oleoso de semillas de B. carinata naturales y de semillas de B. carinata transformadas con un montaje que expresa la fusión génica de la metalotioneína y oleosina. Se presenta el porcentaje de cadmio unido a la fracción de cuerpo oleoso de una fracción de cuerpo oleoso recogida en semillas transgénicas y no transformadas. Las barras representan los valores medios de 5 experimentos duplicados (fijación) y 3 duplicados (elución).

Figura 12. Ilustra la fijación de la proteína A, que se expresa en las células de S. Aureus, a los cuerpos oleosos tratados con cantidades variables de las IgG antioleosina. Las barras representan las lecturas de la D.O._{600} obtenidas siguiendo los procedimientos descritos en el Ejemplo 5 y utilizando cantidades variables de las IgG (0 \mul, 3 \mul, 30 \mul, 100 \mul de IgG añadida).

Figura 13. Cebadores de oligonucleótidos utilizados para ampliar la secuencia de la proteína A de S. aureus (la secuencia se muestra también en la SEC. ID nº:8; la secuencia de la proteína se muestra también en la SEC. ID nº:9). Se indican el cebador BK266, 5'C TCC ATG GAT CAA CGC AAT GGT TTA TC 3'(SEC. ID nº:10), una secuencia NcoI (en cursiva) y una secuencia idéntica a una porción del gen de la proteína A contenido en el vector pRITZ2T (Pharmacia) (subrayado). Se indican el cebador BK267, 5' GC AAG CTT CTA ATT TGT TAT CTG CAG GTC 3' (SEC. ID nº:11), una secuencia HindIII (en cursivas), un codón de terminación (negrita) y una secuencia complementaria con un fragmento del gen de la proteína A contenido en pRIT2T (Pharmacia) (subrayado). El producto de PCR se digirió con NcoI y HindIII y se ligó en pCGNOBPGUSA (Van Rooijen y Moloney, 1995, Plant Physiol. 109: 1353-1361) a partir del cual se ha extraído el fragmento NcoI-GUS-HindIII.

Figura 14. Secuencia de una fusión oleosina-proteína A de Arabidopsis (la secuencia se muestra también en la SEC. ID nº:12 y la secuencia de la proteína se muestra también en la SEC. ID nº:13 y 14). Se indican un fragmento de la secuencia genómica de la oleosina (desde la base 1 a la 1626, como describe van Rooijen et al., 1992 Plant Mol. Biol. 18: 1177-1179), una secuencia separadora que codifica una secuencia de escisión de la trombina (bases 1637 a 1647, subrayadas) y la secuencia de ADN que codifica la proteína A (bases 1648 a 2437, en cursiva). La expresión está regulada por la zona 5' corriente arriba de Arabidopsis de la oleosina de Arabidopsis (bases 1 a 867) y la zona del terminador de nopalina sintetasa (bases 2437 a 2700).

Figura 15. Diagrama esquemático que ilustra la configuración de la proteína de fusión oleosina-proteína A en el cuerpo oleoso y la fijación de la inmunoglobulina.

Figura 16. Transferencia Western que ilustra la fijación de los anticuerpos anticonejo de ratón conjugados con HRP contra extractos de proteína con cuerpo oleoso obtenidos a partir de las líneas transgénicas de B. napus que expresan las proteínas de fusión oleosina-proteína A. En una transferencia Western sondada con un anticuerpo conjugado con HRP se muestran los extractos de proteína con cuerpo oleosos de las líneas transgénicas, opa 30 (banda 3), opa 31 (banda 4), opa 34 (banda 5), opa 36 (banda 6), opa 47 (banda 7), opa 93 (banda 8), expresando todas una proteína de fusión oleosina-proteína A y una línea de referencia no transformada de B. napus (banda 9), así como los lisados de DH5\alpha de E. coli transformados con pRIT2T que expresa la proteína A (banda 2) y DH5\alpha de E. coli no transformada (banda 1).

Figura 17. Ilustra la fijación y la elución de las IgG a los cuerpos oleosos aislados de B. napus natural (bn wt) y una línea transgénica de B. napus, que expresan fusiones de oleosina y proteína A. Las barras de error representan los resultados de 4 experimentos independientes.

Descripción detallada de la invención

Tal como se mencionó anteriormente en la presente memoria, la presente invención se refiere a un nuevo sistema de matriz con afinidad biológica que emplea cuerpos oleosos y a sus proteínas asociadas. La matriz de afinidad es adecuada para la separación muy eficaz de dianas específicas, que comprenden proteínas, carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos, células y orgánulos subcelulares, metales e iones, procedentes de una muestra.

La presente invención proporciona un procedimiento según la reivindicación 1.

Los cuerpos oleosos y la muestra que contiene la molécula diana se ponen en contacto de un modo suficiente que permita a los cuerpos oleosos asociarse con la diana. Preferentemente, los cuerpos oleosos se mezclan con la diana. La asociación indirecta de los cuerpos oleosos con la diana puede efectuarse utilizando una molécula de ligando que puede asociarse tanto con los cuerpos oleosos como con la molécula diana. El ligando sirve por consiguiente de puente o unión de los cuerpos oleosos con la molécula diana.

A continuación se exponen a su vez cada uno de los componentes de la matriz de afinidad.

Dianas

La expresión "diana" tal como se utiliza en la presente memoria indica una molécula deseada que se necesita para purificar, aislar o separar de una muestra tal como una muestra biológica. Esta tecnología es adecuada para su utilización prácticamente con cualquier diana para la cual pueda obtenerse un ligando o con cualquier diana que pueda asociarse o unirse directamente con un cuerpo oleoso o con una proteína con cuerpo oleoso. Los posibles pares ligando/diana comprenden pero no se limitan a: subunidad de proteínas/asociaciones de subunidades, anticuerpos/antígenos, proteína receptora/moléculas señal, proteínas que se unen a ácidos nucleicos/ácidos nucleicos; lectinas/carbohidratos; proteínas que se unen a lípidos/lípidos; proteínas de fijación a iones/iones y ligandos a epítopos de superficie/células u orgánulos subcelulares. La diana puede obtenerse de cualquier fuente natural o puede sintetizarse químicamente. Si la diana es una macromolécula tal como una proteína o ácido nucleico puede también producirse en forma recombinante utilizando cualquier sistema de expresión adecuado tales como bacterias, levaduras, plantas, insectos, mamíferos, etc.

Ligandos

La expresión "ligando" utilizada en la presente memoria indica una molécula que es capaz de asociarse tanto con la molécula diana como con los cuerpos oleosos o con la proteína con cuerpo oleoso (expuesta a continuación). La expresión "asociarse con" tal como se utiliza en la presente memoria comprende tanto un enlace covalente como no covalente del ligando a los cuerpos oleosos de la molécula diana. Por ejemplo, la molécula de ligando puede unirse con enlace covalente a los cuerpos oleosos y asociarse con enlace no covalente con la diana (y viceversa), o el ligando puede asociarse con enlace no covalente tanto con los cuerpos oleosos como con la molécula diana. El ligando puede ser cualquier molécula que pueda formar un puente con los cuerpos oleosos o con la proteína con cuerpo oleoso y las moléculas diana y puede comprender una proteína, ácido nucleico, carbohidrato o una pequeña molécula orgánica. El ligando puede estar compuesto por dos moléculas, una primera molécula que se asocia con los cuerpos oleosos y una segunda molécula que se asocia con la diana, en el que la primera molécula y la segunda molécula se asocian entre sí.

Las proteínas de ligando de afinidad utilizadas para esta metodología pueden proceder de pares de ligandos naturales y conocidos tales como los relacionados anteriormente. Por otra parte, el ligando puede obtenerse cribando las proteínas extraídas de células u organismos, sintetizados químicamente o producidos en los bancos compuestos por secuencias peptídicas combinatorias, anticuerpos o secuencias expresadas de ADN.

En una forma de realización, el ligando posee afinidad natural por los cuerpos oleosos o por la proteína con cuerpo oleoso. Por ejemplo, el ligando puede ser una proteína tal como un anticuerpo, que presente afinidad por la proteína con cuerpo oleoso. El ligando puede ser también una molécula distinta a una proteína que presente afinidad natural por el cuerpo oleoso o la proteína con cuerpo oleoso. Dichos ligandos, capaces de fijarse a los cuerpos oleosos o a la proteína con cuerpo oleoso, pueden asociarse con una segunda molécula que puede unirse a la molécula diana. Por ejemplo, la molécula de ligando puede ser un anticuerpo conjugado con avidina y puede utilizarse para purificar la biotina de una muestra.

En otra forma de realización, el ligando está unido covalentemente a los cuerpos oleosos o a la proteína con cuerpo oleoso por medios químicos o recombinantes. Los medios químicos para preparar fusiones o conjugados son conocidos en la materia y pueden utilizarse para preparar una fusión del ligando con la proteína con cuerpo oleoso. El método utilizado para conjugar el ligando y el cuerpo oleoso debe ser capaz de unir el ligando con una proteína con cuerpo oleoso sin interferir con la capacidad del ligando para fijar la molécula diana. En un ejemplo, el ligando puede ser una molécula orgánica pequeña tal como biotina que está acoplada por enlace covalente a los cuerpos oleosos. Los cuerpos oleosos biotinilados pueden utilizarse para separar la avidina de una muestra. La presente invención también comprende cuerpos oleosos modificados tales como los cuerpos oleosos biotinilados para su utilización como matrices de afinidad. Por consiguiente, la presente invención incluye una composición que comprende cuerpos oleosos acoplados a una molécula, tal como un ligando o una molécula diana.

En una forma de realización preferida, el ligando es una proteína y puede estar conjugado con la proteína con cuerpo oleoso utilizando técnicas bien conocidas en la materia. Existen varios centenares de reticuladores disponibles que pueden conjugar dos proteínas. (Véase por ejemplo "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", 1991, Shans Wong, CRC Press, Ann Arbor). El reticulador se selecciona generalmente basándose en los grupos funcionales reactivos disponibles o insertados en el ligando. Además, si existen grupos no reactivos puede utilizarse un reticulador fotoactivable. En determinados casos puede ser deseable incluir un separador entre el ligando y la proteína con cuerpo oleoso. Los agentes reticulantes conocidos en la técnica comprenden los agentes homobifuncionales: glutaraldehído, dimetiladipimidato y bis(diazobencidina) y los agentes heterobifuncionales: m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida y sulfo-m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida.

También puede prepararse una fusión de la proteína del ligando con la proteína del cuerpo oleoso utilizando técnicas de ADN recombinante. En tal caso una secuencia de ADN que codifica el ligando se fusiona a una secuencia de ADN que codifica la proteína del cuerpo oleoso, produciendo una molécula de ADN híbrida que expresa una proteína de fusión del ligando con la proteína del cuerpo oleoso (discutida con mayor detalle a continuación). Para preparar una proteína de fusión recombinante, la secuencia del ADN que codifica el ligando debe conocerse o poderse obtener. Poderse obtener significa que una secuencia de ADN suficiente para codificar el ligando de la proteína puede deducirse de la secuencia conocida de aminoácidos. No es necesario utilizar la secuencia del gen completa del ligando con la condición de que una subsecuencia que codifica el dominio de fijación del ligando de la proteína se conozca. Por consiguiente, el ligando puede incluir la secuencia completa de la proteína del ligando específico en cuestión o el dominio de fijación de la misma.

Si la secuencia del ADN del ligando deseado es conocida, el gen puede sintetizarse químicamente utilizando un sintetizador de oligonucleótidos. Por otra parte, el clon que lleva el gen del ligando puede obtenerse a partir del ADNc o de bancos genómicos que contengan el gen sondando con una secuencia de ADN complementaria marcada. El gen puede también ampliarse específicamente a partir del banco que utiliza cebadores de oligonucleótidos específicos para el gen y la PCR. Si la secuencia de ADN del ligando deseado no es conocida, entonces puede obtenerse una secuencia de aminoácidos parcial por secuenciado N-terminal de la proteína (Matsudaira 1987; J. Biol. Chem. 262: 10035-10038). Las sondas marcadas pueden sintetizarse basándose en las secuencias de ADN deducidas de esta secuencia de aminoácidos y utilizarse para cribar bancos de ADNc o genómico como se describió anteriormente. El clon que lleva el gen puede también identificarse a partir de un banco de expresión de ADNc sondando con anticuerpos producidos contra el ligando de la proteína o con la proteína diana.

Los ligandos pueden asimismo descubrirse sondando mezclas de proteínas con la diana. La diana puede inmovilizarse en una matriz del soporte y utilizarse para identificar las proteínas extraídas de las células y tejidos o sintetizadas químicamente. Tras la fijación entre la proteína del ligando y la diana inmovilizada, la matriz se separa de la solución y se lava. El ligando de la proteína se eluye posteriormente de la matriz y se determina la secuencia como se describió anteriormente. Por otra parte, los bancos de proteínas recombinantes producidos por exposición al fago, tales como los compuestos por secuencias peptídicas combinatorias (Smith, 1985; Science 228: 1315-1317) o repertorios de anticuerpos (Griffiths et al., 1994, EMBO J. 13: 3245-3260, Nissim et al., 1994, EMBO J. 13: 692-698) pueden cribarse con la diana inmovilizada. En este caso, la unión entre el ligando de la proteína y la diana permitiría la separación y recuperación del fago que expresa el ligando de la población compleja y grande de fagos que codifican proteínas sin enlace. Un sistema de dos híbridos tal como éste en levaduras (Fields y Sternglanz, 1994; Trends Genet. 10: 286-292) pueden también utilizarse para identificar un ligando a partir de un banco de ADNc expresado. Obsérvese que se construye una fusión génica entre la secuencia que codifica la proteína diana y la de la proteína que se une al ADN. Las células que contienen este montaje se transforman con los montajes procedentes del banco de ADNc donde las secuencias se han fusionado a las de un activador de transcripción. La fijación entre los ligandos procedentes del banco de ADNc con la proteína diana permite que se produzca la transcripción de un gen informador. Los clones que expresan el ligando se recuperan a continuación.

Para dejar al descubierto específicamente un ligando a los cuerpos oleosos, puede utilizarse una proteína oleosina completa o parcial como diana en cualquiera de los métodos anteriores. Como alternativa, puede ser posible emplear cuerpos oleosos intactos para cribar los extractos proteicos, péptidos sintéticos o bancos de exposición al fago. En este caso, el cuerpo oleoso serviría tanto de diana como de matriz de inmovilización. Utilizando este método, puede descubrirse una variedad más amplia de ligandos; que presentan afinidad no solamente por las oleosinas, sino por otros epítopos presentes en los cuerpos oleosos.

Cuerpos oleosos y proteínas del cuerpo oleoso

Los cuerpos oleosos son pequeños orgánulos subcelulares esféricos, que encapsulan los triacilglicéridos acumulados, una reserva de energía utilizada por muchas plantas. Aunque se encuentran en la mayoría de las plantas y en diferentes tejidos, son particularmente abundantes en las semillas de las que se extrae aceite donde oscilan en tamaño desde por debajo de una micra a unas pocas micras de diámetro. Los cuerpos oleosos están compuestos por triacilglicéridos rodeados por una media membrana de fosfolípidos y embebidos de un único tipo de proteína conocido como una proteína del cuerpo oleoso. La expresión "cuerpo oleoso" o "cuerpos oleosos" como se utiliza en la presente memoria comprende todos los componentes de triacilglicérido, fosfolípido o proteína presentes en la estructura completa. La expresión "proteína del cuerpo oleoso" tal como se utiliza en la presente memoria significa una proteína que está presente en la naturaleza en un cuerpo oleoso. En las plantas, las proteínas del cuerpo oleoso predominantes se denominan "oleosinas". Se han clonado y secuenciado oleosinas a partir de muchas fuentes vegetales incluyendo el maíz, colza, zanahoria y algodón. La proteína oleosina parece que está compuesta por tres dominios; los dos extremos de la proteína, los terminales en N y C, son en gran medida hidrófilos y están situados en la superficie del cuerpo oleoso expuestos al citosol mientras que el núcleo central muy hidrófobo de la oleosina está anclado firmemente en la membrana y el triacilglicérido. Las oleosinas de diferentes especies representan una pequeña familia de proteínas que presenta una considerable conservación de la secuencia de aminoácidos, particularmente en la zona central de la proteína. En cada especie, puede existir un pequeño número de isoformas diferentes.

Los cuerpos oleosos de cada especie presentan un tamaño aproximadamente uniforme y una densidad que depende en parte de la composición exacta de la proteína/fosfolípido/triacilglicérido. Como resultado pueden separarse fácil y rápidamente de los líquidos de densidades diferentes en los que están en suspensión. Por ejemplo, en medios acuosos donde la densidad es mayor que la de los cuerpos oleosos, flotan bajo la influencia de la gravedad o de la fuerza centrífuga aplicada. En etanol al 95% donde la densidad es menor que la de los cuerpos oleosos, sedimentarán en las mismas condiciones. Los cuerpos oleosos pueden también separarse de los líquidos y de otros sólidos presentes en soluciones o suspensiones por métodos que fraccionan basándose en el tamaño. Por ejemplo, los cuerpos oleosos de B. napus son de un diámetro mínimo de aproximadamente 0,5 \mum y por esta razón pueden separarse de componentes más pequeños utilizando un filtro de membrana con un tamaño de poro menor que este diámetro.

Los cuerpos oleosos de la presente invención se obtienen preferentemente a partir de una planta con semillas y más preferentemente del grupo de especies vegetales que comprenden: oruga (Arabidopsis thaliana), colza (Brassica spp.), soja (Glycine max), girasol (Helianthus annuus), palma de aceite (Elaeis guineeis), semilla de algodón (Gossypium spp.), cacahuete (Arachis hypogaea), coco (Cocus nucifera), ricino (Ricinus communis), cártamo (Carthamus tinctorius), mostaza (Brassica spp. y Sinapis alba), cilantro (Coriandrum sativum), linaza/lino (Linum usitatissimum) y maíz (Zea mays). Las plantas se cultivan y se deja que produzcan semillas utilizando prácticas de cultivo agrícola bien conocidas por los expertos en la materia. Una vez recogidas las semillas y retirados los materiales extraños tales como piedras o cáscaras de semillas, por ejemplo mediante cribado, las semillas se secan preferentemente y se procesan posteriormente mediante prensado mecánico, molienda o machacado. La fracción del cuerpo oleoso puede obtenerse a partir de la fracción de semilla machacada por acumulación basada en técnicas de separación que aprovechan las diferencias de densidad entre la fracción del cuerpo oleoso y la fracción acuosa, tal como centrifugación, o utilizando técnicas de separación basadas en la exclusión por tamaño, tales como filtración en membrana o una combinación de ambas. Normalmente, las semillas se muelen completamente en cinco volúmenes de un tampón acuoso frío. Se puede emplear una amplia variedad de composiciones de tampón, siempre que no contengan grandes concentraciones de disolventes orgánicos fuertes tales como acetona o éter dietílico, ya que estos disolventes pueden alterar los cuerpos oleosos. La densidad de la solución del tampón de molienda puede aumentarse mediante adición de sacarosa del 0,4 al 0,6 M para facilitar el lavado como se describe a continuación. El tampón de molienda puede contener también típicamente NaCl 0,5 M para ayudar a separar las proteínas solubles que no están unidas íntegramente a la superficie del cuerpo oleoso.

Tras la molienda, el homogeneizado se centrifuga produciendo un sedimento de materia en partículas e insoluble, una fase acuosa que contiene componentes solubles de la semilla y una capa superficial compuesta de cuerpos oleosos con sus proteínas asociadas. La capa del cuerpo oleoso es desnatada de la superficie y resuspendida completamente en un volumen de tampón de molienda reciente. Es importante que los agregados de los cuerpos oleosos se disocien tan completamente como sea posible para asegurar la eliminación eficaz de los contaminantes en las etapas de lavado posteriores. La preparación de los cuerpos oleosos resuspendidos se estratifica bajo una solución de flotación de densidad más baja (p. ej. agua, tampón acuoso) y se centrifuga, otra vez, separando el cuerpo oleoso y las fases acuosas. Este procedimiento de lavado se repite normalmente por lo menos tres veces, después de lo cual los cuerpos oleosos se supone que están suficientemente exentos de proteínas solubles contaminantes lo cual se determina por electroforesis en gel. No es necesario eliminar toda la fase acuosa y hasta la preparación final puede añadirse agua o Tris-HCl 50 mM pH 7,5 y si se desea el pH puede reducirse a pH 2 o aumentarse hasta pH 10. Los protocolos para el aislamiento de los cuerpos oleosos a partir de semillas de aceite están disponibles en Murphy, D.J. y Cummins I., 1989, Phytochemistry, 28: 2063-2069; y en Jacks, T.J. et al., 1990, JAOCS, 67: 353-361. Un protocolo preferido se detalla en el ejemplo 1 de la presente memoria.

Pueden también utilizarse en la presente invención otros cuerpos oleosos además de los procedentes de vegetales. Un sistema equivalente funcionalmente a los cuerpos oleosos vegetales y oleosinas ha sido descrito en las bacterias (Pieper-Fürst et al., 1994, J. Bacteriol. 176: 4328), algae (Rossler, P.G., 1988, J. Physiol. (Londres, 24: 394-400) y hongos (Ting, J.T. et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 3699-3706). Los cuerpos oleosos de estos organismos, así como los que puedan ser descubiertos en otras células vivas por un experto en la materia, pueden emplearse según la presente invención.

Matrices de afinidad

Como se mencionó anteriormente en la presente memoria, la presente invención proporciona un nuevo sistema de matriz de afinidad para la purificación de una molécula diana a partir de una muestra. La matriz de afinidad comprende cuerpos oleosos y un ligando que está asociado a los cuerpos oleosos y presenta afinidad por una molécula diana. En dicha forma de realización, el ligando puede estar unido por enlace no covalente o covalente a los cuerpos oleosos (como se describió anteriormente).

Una ventaja de la presente invención consiste en que las sustancias diana pueden purificarse o separarse de las muestras mediante asociación no covalente con los cuerpos oleosos seguida de separación del cuerpo oleoso. Son posibles numerosas configuraciones diferentes de cuerpo oleoso-ligando. Las dianas con afinidad intrínseca por proteínas de un ligando específico tal como la hirudina por la trombina o los metales pesados por la metalotioneína, pueden purificarse o separarse con cuerpos oleosos que contengan este ligando fusionado a una oleosina. Como alternativa, también puede purificarse o separarse una proteína diana con una matriz de afinidad al cuerpo oleoso fusionando la diana a un ligando específico del cuerpo oleoso o a un ligando complementario al fusionado a una oleosina. Si se desea, puede modificarse genéticamente una secuencia de reconocimiento de proteasa o una secuencia de escisión química entre el ligando y la proteína diana que permita la eliminación proteolítica del ligando de la proteína diana en el transcurso de la purificación. Puede construirse también un ligando multivalente, tal como un anticuerpo de una sola cadena bivalente, en el que un dominio del ligando presente una afinidad por un cuerpo oleoso y el otro o los otros dominios presenten afinidad por la diana. En este caso, ni el cuerpo oleoso ni la molécula diana necesitan estar fusionados por enlace covalente a un ligando. Además, pueden utilizarse concatámeros de ligandos para aumentar la afinidad de una matriz por una diana, o puede mutarse la secuencia de un ligando para modular la afinidad por una diana cuando dichas condiciones sean deseables. Además, pueden fusionarse mezclas de ligandos diferentes para recuperar o separar diferentes tipos de dianas simultáneamente. Pueden construirse asimismo fusiones entre ligandos diferentes para formar puentes entre diferentes tipos de dianas o entre dianas y la matriz de afinidad del cuerpo oleoso. La fijación a la matriz de afinidad también puede conseguirse formando puentes entre el ligando o el ligando y las secuencias de la diana, tales como los iones Zn^{++} que forman el puente las secuencias de polihistidina.

Existen varias ventajas relacionadas con la utilización de las matrices de afinidad del cuerpo oleoso que las hacen atractivas como herramientas para purificación. La flexibilidad en el diseño que es posible mediante las diferentes configuraciones descritas anteriormente, permite construir una matriz que reúna los mejores requisitos para una diana específica. Además, la producción de la matriz como parte de un proceso biológico natural en las semillas es sumamente eficaz en relación al coste, ya que la purificación e inmovilización del ligando no son necesarias. En el caso de las fusiones oleosina-ligando, el ligando está inmovilizado en el cuerpo oleoso como resultado del direccionamiento de la oleosina en el interior de la célula mientras que los ligandos específicos del cuerpo oleoso se asociarán de forma natural con la matriz mientras esté presente en las mezclas complejas. La inmovilización natural del ligando en la matriz también puede presentar ventajas porque elimina el requisito de la reticulación química que puede poner en peligro la afinidad del ligando por la diana. Por último, las matrices de afinidad por el cuerpo oleoso ofrecen una única y atractiva opción de purificación particularmente para operaciones a gran escala. La capacidad para separar la matriz por flotación como una suspensión flotante permite que sea empleada con un material en bruto que contiene lo que de otro modo podrían ser cantidades prohibitivas de partículas contaminantes. La presencia de estos contaminantes ensuciará y bloqueará con frecuencia las matrices sólidas convencionales aplicadas en columnas o en suspensiones discontinuas limitando su utilización a las etapas iniciales del proceso de purificación.

Como se mencionó anteriormente, en una forma de realización de la invención, las secuencias de la proteína del ligando están fusionadas genéticamente a la proteína del cuerpo oleoso. Para preparar dichas fusiones genéticas, se prepara una secuencia de ADN híbrido que codifica una proteína de fusión del ligando con la proteína del cuerpo oleoso y consta de (a) una secuencia de ADN que codifica un fragmento suficiente de una proteína del cuerpo oleoso que proporcione direccionamiento de la proteína de fusión a los cuerpos oleosos y (b) una secuencia de ADN que codifica un fragmento suficiente de la proteína del ligando que proporcione el enlace de la diana. Los inventores han determinado que, en general, el terminal N y el núcleo hidrófobo de una proteína del cuerpo oleoso son suficientes para proporcionar el direccionamiento de la proteína de fusión a los cuerpos oleosos. En particular, para las oleosinas procedentes de los aminoácidos 2 al 123 de la planta Arabidopsis thaliana (tal como se muestra en la SEC. ID nº:1) son suficientes a este respecto.

El ligando puede estar fusionado al extremo del terminal N y/o C de la oleosina. También es posible construir una fusión interna entre el ligando y la oleosina o fusionar el ligando entre dos proteínas de oleosina. La secuencia del ADN híbrido que codifica una proteína del cuerpo aceite fusionada a un ligando puede ser transfectada en un vector adecuado y utilizada para transformar una planta. Dos tipos de vectores se emplean habitualmente. El primer tipo de vector se utiliza para la modificación genética y el ensamblaje de montajes y consta típicamente de un eje central tal como el hallado en la familia pUC de vectores, que permite la replicación en bacterias gram negativas tales como E. coli manipuladas y mantenidas fácilmente. El segundo tipo de vector tipificado por los plásmidos Ti y Ri, especifica las funciones de transferencia del ADN y se utilizan cuando se desea introducir los montajes en la planta y que se integren de forma estable en su genoma mediante la transformación mediada por Agrobacterium.

Un montaje típico, en la dirección de 5' a 3', está constituido por una zona reguladora completa con un activador capaz de dirigir la expresión en las plantas (preferentemente la expresión específica de la semilla), una zona que codifica la proteína y una secuencia que contiene una señal operativa de terminación de la trascripción en las plantas. Las secuencias que comprenden el montaje pueden ser naturales o sintéticas o cualquier combinación de las mismas.

Pueden utilizarse tanto los activadores específicos no de semillas, tales como el activador 35-S CaMV (Rothstein et al., 1987; Gene 53: 153-161) y los activadores específicos de semillas tal como el activador de faseolina (Sengupta-Gopalan et al., 1985; PNAS USA 82: 3320-3324) o los activadores de oleosina de 18 kDa de Arabidopsis (Van Rooijen et al., 1992; Plant Mol. Biol. 18: 1177-1179). Además del activador, la zona reguladora contiene una secuencia que se fija al ribosoma que permite la traducción de los transcritos en las plantas y puede también contener una o más secuencias potenciadoras, tal como la principal AMV (Jobling y Gehrke 1987; Nature 325: 622-625) para aumentar la expresión del producto.

La zona de codificación del montaje normalmente estará compuesta por secuencias que codifican un ligando fusionado en el marco a una oleosina y que finalizan en un codón de terminación de la traducción. La secuencia para la oleosina puede esta compuesta por cualquier secuencia de ADN, o una parte de la misma, natural o sintética, suficiente para codificar una proteína que puede ser dirigida correctamente a un cuerpo oleoso y expresarse de forma estable en el mismo. Una descripción detallada de las características de dicha secuencia ha sido descrita anteriormente en Moloney, 1993; PCT Patent Appl. WO 93/21320. La secuencia puede también incluir intrones. La zona de codificación del ligando puede estar comprendida a su vez por alguna de las secuencias individuales, o una combinación de las mismas, identificadas como se describió anteriormente. Si se desea, puede modificarse genéticamente una proteasa o una secuencia de reconocimiento químico entre el ligando y la proteína diana que permita la eliminación proteolítica del ligando de la proteína diana en el transcurso de la purificación.

La zona que contiene la señal de terminación de la trascripción puede comprender cualquier secuencia operativa en las plantas tal como la secuencia de terminación de nopalina sintetasa y además puede incluir secuencias de potenciador para aumentar la expresión del producto.

Los diversos componentes del montaje se ligan utilizando métodos convencionales, típicamente en un vector a base de pUC. Este montaje puede introducirse a continuación en un vector de Agrobacterium y posteriormente en las plantas anfitrionas, utilizando uno de los procedimientos de transformación esbozados a continuación.

Para la introducción del ADN en las células huésped están disponibles varias técnicas. Por ejemplo, los montajes de ADN híbrido pueden introducirse en las células huésped obtenidas a partir de plantas dicotiledóneas, tales como el tabaco, y especies oleaginosas, tales como B. napus utilizando vectores normales de Agrobacterium. Mediante un protocolo de transformación tal como el descrito por Moloney et al., 1989, (Plant Cell Rep., 8: 238-242) o Hinchee et al., 1988, (Bio/Technol., 6: 915-922); u otras técnicas conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, la utilización de T-ADN para la transformación de células vegetales ha sido objeto de un estudio extenso y está ampliamente descrita en EPA nº de serie 120.516; Hoekema et al., 1985, (capítulo V, en: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B.V., Alblasserdam); Knauf, et al., 1983, (Genetic Analysis of Host Range Expression by Agrobacterium, pág. 245, en Molecular Genetics of the Bacteria-Plant Interaction, Puhler, A. ed., Springer-Verlag, NY); y An et al., 1985, (EMBO J., 4: 277-284). En la práctica, pueden cultivarse explantes con A. tumefaciens o A. rhizogenes para permitir la transferencia del montaje de transición a las células vegetales. Después de la transformación que utiliza Agrobacterium las células vegetales se dispersan en un medio apropiado para la selección, posteriormente se recogen los callos, brotes y finalmente los plantones. El anfitrión de Agrobacterium albergará un plásmido que comprende los genes vir necesarios para la transferencia del T-ADN a las células vegetales. Por inyección y electroporación (véase a continuación) pueden introducirse en la célula vegetal los plásmidos Ti desactivados (que carecen de los genes tumorales, particularmente de la zona T-ADN).

El empleo de técnicas sin Agrobacterium permite la utilización de los montajes descritos en la presente memoria para obtener la transformación y expresión en una amplia variedad de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas y en otros organismos. Estas técnicas son especialmente útiles para las especies que son intratables en un sistema de transformación de Agrobacterium. Otras técnicas para la transferencia génica comprenden la biolística (Sanford, 1988, Trends in Biotech., 6: 299-302), electroporación (Fromm et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 5824-5828; Riggs y Bates, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5602-5606) o absorción de ADN mediada por PEG (Potrykus et al., 1985, Mol. Gen. Genet., 199: 169-177).

En una aplicación específica, tal como para B. napus, las células huésped destinadas a recibir los montajes del ADN recombinante procederán normalmente de los peciolos de cotiledóneas tal como describe Moloney et al., (1989, Plant Cell Rep., 8: 238-242). Otros ejemplos que utilizan semillas aceitosas comerciales comprenden la transformación del cotiledón en explantes de soja (Hinchee et al., 1988. Bio/Technology, 6: 915-922) y la transformación del tallo del algodón (Umbeck et al., 1981, Bio/Technology, 5: 263-266).

Después de la transformación, las células, por ejemplo en forma de discos foliares, se cultivan en un medio selectivo. Una vez comienzan a salir los brotes, se extirpan y se colocan en un medio para enraizado. Una vez se han formado suficientes raíces, las plantas se transplantan al suelo. Se prueba la presencia de un marcador en las supuestas plantas transformadas. Se realiza la transferencia Southern en el ADN genómico utilizando una sonda apropiada, por ejemplo un gen de oleosina de A. thaliana, para demostrar que se ha producido la integración de las secuencias deseadas en el genoma de la célula huésped.

El casete de expresión normalmente estará unido a un marcador para la selección en las células vegetales. En la práctica, el marcador puede ser la resistencia a un herbicida, p. ej. fosfinotricina o glifosato, o más particularmente a un antibiótico, tal como kanamicina, G418, bleomicina, higromicina, cloranfenicol o similares. El marcador concreto empleado puede ser el que permita la selección de las células transformadas en comparación con las células que carecen del ADN recombinante introducido.

El péptido de fusión en el casete de expresión construido como se describió anteriormente, se expresa por lo menos preferentemente en las semillas en desarrollo. Por consiguiente, las plantas transformadas cultivadas según los métodos convencionales, se dejan para la siembra. Véase, por ejemplo, McCormick et al. (1986, Plant Cell Reports, 5: 81-84). La transferencia Northern puede realizarse utilizando una sonda génica apropiada con ARN aislado del tejido en el que es de esperar que se produzca la transcripción, tal como en un embrión de semilla. El tamaño de los transcritos puede compararse entonces con el tamaño previsto para el transcrito de la proteína de fusión.

A continuación se aíslan de la semilla las proteínas con cuerpos oleosos y se analizan análisis para determinar que el péptido de fusión se ha expresado. Los análisis pueden ser por ejemplo por SDS-PAGE. El péptido de fusión puede detectarse utilizando un anticuerpo contra la fracción de oleosina del péptido de fusión. El tamaño del péptido de fusión obtenido puede compararse a continuación con el tamaño previsto de la proteína de fusión.

Dos o más generaciones de plantas transgénicas pueden cultivarse y cruzarse o autocruzarse para permitir la identificación de las plantas y cepas con las características fenotípicas deseadas incluyendo la producción de proteínas recombinantes. Puede ser deseable asegurar la homozigosidad de las plantas, cepas o líneas que producen proteínas recombinantes para asegurar la herencia continuada del rasgo recombinante. Los métodos de selección de plantas homozigóticas son bien conocidos por los expertos en la materia de cultivo de plantas e incluyen el autocruzamiento periódico y la selección y el cultivo de anteras y microsporas. Pueden obtenerse también plantas homozigóticas por transformación de células o tejidos haploides seguida de regeneración de los plantones diploides convertidos posteriormente en plantas diploides por cualquiera de los numerosos medios conocidos (p. ej.: tratamiento con colchicina u otros agentes microtubulares destructores).

Método de separación de moléculas diana utilizando matrices de afinidad

Como se mencionó anteriormente en la presente memoria, la presente invención se refiere a un método de separación de una molécula diana procedente de una muestra que utiliza las proteínas con cuerpo oleoso descritas anteriormente y en algunos casos, los ligandos. En el método de la invención, los cuerpos oleosos se mezclan con una muestra que contiene la diana deseada y la interacción entre el ligando y la diana produce la asociación no covalente de la diana con el cuerpo oleoso. Después de la centrifugación, los cuerpos oleosos y la diana fijada por afinidad se separan de la fase acuosa, purificando eficazmente la diana de algunos contaminantes presentes en la muestra original. Repitiendo la etapa de lavado se asegura que cualquier contaminante restante se elimina.

Después de la fijación a los cuerpos oleosos, las dianas pueden eluirse en condiciones determinadas experimentalmente para cada par ligando-diana. El tratamiento de la matriz ligada con el eluyente apropiado y la centrifugación permite la recuperación de la diana purificada en la fase acuosa. Si la diana es una fusión ligando-proteína que contiene una secuencia de reconocimiento de la proteasa, entonces puede tratarse con la proteasa apropiada para separar el ligando. El ligando libre puede entonces separarse de la proteína diana por reaplicación de la matriz de afinidad del cuerpo oleoso o por métodos de purificación de proteínas convencionales.

Las propiedades físicas y químicas de la matriz de afinidad pueden variarse por lo menos de dos formas. En primer lugar, las diferentes especies vegetales contienen cuerpos oleosos con diferentes composiciones de aceite. Por ejemplo, el coco es rico en aceites láuricos (C12), mientras que los aceites del ácido erúcico (C22) están presentes en abundancia en alguna Brassica spp. Además, las proteínas asociadas a los cuerpos oleosos variarán entre las especies. En segundo lugar, las cantidades relativas de aceite pueden modificarse dentro de una determinada especie vegetal aplicando técnicas de cultivo y de ingeniería genética o una combinación de éstas conocidas por el especialista experto. Estas técnicas pretenden alterar las actividades relativas de las enzimas que controlan las series de reacciones metabólicas implicadas en la síntesis del aceite. Mediante la aplicación de estas técnicas, se pueden obtener semillas con una serie sofisticada de diferentes aceites. Por ejemplo, los esfuerzos en el cultivo han dado como resultado el desarrollo de una colza con un contenido en ácido erúcico bajo (Canola) (Bestor, T.H., 1994, Dev. Gen. 15: 458) y líneas vegetales con aceites con alteraciones en la posición y número de dobles enlaces, variación en la longitud de la cadena del ácido graso y la introducción de grupos funcionales deseables se han generado por ingeniería genética (Töpfer et al., 1995, Science, 268: 681-685). Utilizando métodos similares un experto en la materia podrá ampliar además en las fuentes de cuerpos oleosos disponibles actualmente. Las composiciones de aceite variables darán como resultado propiedades físicas y químicas variables de la fracción del cuerpo oleoso. Por esta razón seleccionando semillas aceitosas o mezclas de las mismas de diferentes especies o líneas vegetales como fuente para los cuerpos oleosos, puede adquirirse un amplio repertorio de matrices con cuerpo oleoso con diferentes texturas y viscosidades.

Aplicaciones de las matrices de afinidad del cuerpo oleoso

Dado que es posible modificar genéticamente matrices de afinidad del cuerpo oleoso para varias clases de proteínas, se prevén múltiples usos para las matrices de afinidad basadas en el cuerpo oleoso. Todas las bacterias, hongos, plantas y animales contienen proteínas que son capaces de interactuar específicamente con agentes tales como iones, metales, ácidos nucleicos, azúcares, lípidos y otras proteínas. Estos agentes pueden inmovilizarse utilizando una tecnología del cuerpo oleoso.

Las matrices de afinidad de la proteína con cuerpo oleoso pueden utilizarse para aislar cualquier molécula diana que pueda unirse a la proteína con cuerpo oleoso, bien directa o indirectamente mediante una molécula de ligando. Ejemplos de molécula diana que pueden aislarse a partir de una muestra que utiliza la metodología de la presente invención comprenden proteínas, péptidos, moléculas orgánicas, lípidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, células, fragmentos de células, virus y metales. En particular, los inventores han demostrado que la matriz de afinidad de la presente invención puede utilizarse para separar proteínas terapéuticas (tal como trombina), anticuerpos, metales (tal como cadmio), carbohidratos (tal como celulosa), moléculas orgánicas (tal como biotina) y células (tal como las células bacterianas).

Las matrices de afinidad del cuerpo oleoso pueden utilizarse también para separar células de interés industrial o medicinal a partir de una población mixta de células. Por ejemplo las células madre hematopoyéticas, que son una subpoblación de células sanguíneas y se utilizan en los trasplantes de médula ósea y en las terapias génicas con células madre, pueden separarse de otras células sanguíneas utilizando una tecnología de afinidad basada en el cuerpo oleoso. En la tecnología del ADN recombinante con frecuencia se requiere que las células en las que se ha introducido con éxito el ADN recombinante, conocidas como células transformadas, se distingan y se separen de las células que no pudieron conseguir el ADN recombinante. Siempre que parte del ADN recombinante expresa una proteína de la superficie celular que es complementaria del ligando de afinidad basado en el cuerpo oleoso, es posible utilizar cuerpos oleosos para separar células transformadas de células no transformadas. La tecnología de afinidad del cuerpo oleoso puede también utilizarse para separar orgánulos celulares tales como cloroplastos y mitocondrias de otro material celular. Las partículas víricas pueden separarse también de mezclas complejas.

Asimismo es posible inmovilizar una clase de proteínas conocidas como metaloproteínas, que contienen grupos prostéticos que se unen específicamente a iones. Ejemplos de metaloproteínas son la hemoglobina, que se une al hierro, la parvalbumbina que se une al calcio y la metalotioneína una proteína que se une al cinc y a otros iones metálicos. Se prevé que podrían utilizarse cuerpos oleosos para eliminar metales de las corrientes de material en circulación, los cuales pueden contaminarse por agua con el residuo de los metales procedentes de laboratorios y de procesos industriales. El ejemplo 4 proporcionado a continuación ilustra con más detalle esta aplicación. Otros ejemplos en los que las proteínas pueden inmovilizarse y emplearse en una estrategia de biodegradación comprenden la eliminación de fosfatos, nitratos y fenoles de las corrientes residuales. En parte este método puede superar las limitaciones reales o apreciadas de la biodegradación bacteriana. En determinados casos puede no ser práctico o necesario confiar en la tecnología de reparto de afinidad para separar la matriz del cuerpo oleoso del compuesto diana. En estos casos, se prevé que los cuerpos oleosos pueden inmovilizarse en una superficie inerte sólida que podría ser una superficie plana o la superficie de una columna. Una solución que contiene el ligando de afinidad puede entonces pasarse sobre la superficie recubierta con cuerpos oleosos inmovilizados con lo cual se produce la fijación por afinidad selectiva. Se prevé que los cuerpos oleosos inmovilizados pueden utilizarse en tuberías y en balsas para ayudar a la biodegradación.

Los ejemplos siguientes ilustran varios sistemas en los que los cuerpos oleosos pueden utilizarse como matrices de afinidad. Se entiende que los ejemplos dados a continuación están destinados a ser ilustrativos más bien que limitativos.

Ejemplos Ejemplo 1 Purificación de trombina

El ejemplo siguiente demuestra la utilidad de una matriz de afinidad del cuerpo oleoso para la purificación de la trombina. La trombina es una serina proteasa que desempeña una función principal en la coagulación de la sangre. Escinde el fibrinógeno para producir monómeros de fibrina que polimerizan para formar la base de un coágulo sanguíneo (Fenton 1981; Ann. N.Y. Acad. Sci. 370: 468-495). La alfa-trombina consta de dos cadenas polipeptídicas de 36 (cadena A) y 259 (cadena B) restos unidos por un puente disulfuro. Degen et al. 1983; Biochemistry 22: 208-2097). La hirudina, que se encuentra en las glándulas salivales de la sanguijuela medicinal Hirudo medicinalis, es un inhibidor muy específico y potente de la trombina. Esta inhibición es un resultado del enlace no covalente de la hirudina a partes específicas de la cadena alfa-trombina. (Stone y Hofsteenge 1986; Biochemistry 25: 4622-4628).

El ligando inmovilizado se compone de una isoforma de hirudina fusionada a la oleosina de Arabidopsis de 18 kDa (proteína con cuerpo oleoso) (Van Rooijen et al., 1992; Plant. Mol. Biol. 18: 1177-1179). La expresión del montaje está regulada por el activador de oleosina de 18 kDa de Arabidopsis (Van Rooijen et al., 1992; Plant. Mol. Biol. 18: 1177-1179). La secuencia de la fusión oleosina-hirudina se muestra en la Figura 2 y en la SEC. ID nº:3.

Montaje oleosina-hirudina

Se diseñaron cebadores de oligonucleótidos basados en la secuencia descrita para el gen con oleosina de Brassica napus (Murphy et al., 1991, Biochim. Biophys. Acta 1088: 86-94) y se utilizaron para ampliar un fragmento del ADN genómico de B. napus mediante PCR. Utilizando este fragmento como sonda, se identificó un clon que lleva una inserción de 15 kbp y se aisló a partir de un banco genómico EMBL3 de Arabidopsis. Se utilizaron cebadores de oligonucleótido para ampliar un fragmento procedente de esta inserción que contiene la secuencia de codificación de la oleosina completa y un intrón junto con 840 pares de bases de la zona corriente arriba de 5'. Los cebadores se diseñaron con el fin de eliminar el codón de terminación de la traducción y para introducir la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción PstI en el extremo 5' y un SalI seguido de una secuencia PvuI en el extremo 3' del fragmento. El fragmento se rellenó al final y se ligó en la secuencia SmaI del vector pUC19 del plásmido. Un fragmento SalI - EcoRI del plásmido pBI121 (Clontech) que comprende la secuencia del terminador nopalina sintetasa se insertó a continuación para generar pOBILT.

Se sintetizó una secuencia sintética de la variante 2 de hirudina (HV2) basándose en la información de la secuencia descrita (Harvey et al. 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 1084-1088) pero empleando el codón de B. napus y de Arabidopsis. Se amplió la secuencia utilizando cuatro cebadores de oligonucleótidos solapantes diseñados de modo que el fragmento resultante poseía las secuencias PvuI y SalI en los extremos 5' y 3' respectivamente. Este fragmento se ligó a la secuencia SmaI del vector del plásmido pUC19 para generar pHIR. El fragmento PvuI - SalI de pHIR se insertó a continuación en pUCOBILT entre las secuencias de la oleosina y del terminador para formar una fusión en el marco con la zona de codificación de la oleosina dando pUCOBHIRT. Se subclonó el montaje completo en pBluescript KS+ (pBIOBHIRT) y a continuación en la secuencia PstI del plásmido pCGN1559 (McBride y Summerfelt, 1990, Plant Mol. Biol. 14: 269-276) que lleva un gen de neomicina fosfotransferasa bajo control del activador CaMV 35-S (pCGOBHIRT). Este plásmido se introdujo en Agrobacterium tumefaciens. La preparación de este plásmido se presenta en la Figura 3.

Transformación y regeneración

Los procedimientos para la transformación de Agrobacterium y de plantas se han descrito anteriormente. Se transformó Agrobacterium tumefaciens con el montaje anterior por electroporación (Dower et al., 1988; Nucl. Acids. Res. 16: 6127-6145). Las bacterias transformadas se utilizaron a continuación para transformar los explantes de cotiledones de Brassica napus, seguido de regeneración de la planta según los métodos de Moloney et al. (1989; Plant Cell Reports 8: 238-242). La planta transgénica se identificó inicialmente utilizando un ensayo con neomicina fosfotransferasa y posteriormente se confirmó mediante la expresión de la fusión oleosina-hirudina determinada mediante transferencia Northern y análisis de inmunotransferencia.

Preparación de cuerpos oleosos

Semillas procedentes de plantas de referencia (no transgénicas) o de plantas transgénicas que expresan la fusión oleosina-hirudina se homogeneizaron en cinco volúmenes de tampón de molienda en frío (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, sacarosa 0,4 M y NaCl 0,5 M) utilizando un politrón que funciona a alta velocidad. Se centrifugó el homogeneizado a aproximadamente 10 \times g durante 30 min. para eliminar la materia en partículas y para separar los cuerpos oleosos de la fase acuosa que contenía la mayor parte de la proteína soluble de la semilla. Se desnataron los cuerpos oleosos en la superficie del sobrenadante con una espátula metálica y se colocaron en un volumen de tampón de molienda reciente. Para conseguir un lavado eficaz en las etapas posteriores, es importante asegurarse de que los cuerpos oleosos estaban completamente redispersados. Esto se realizó mediante una rehomogeneización suave de los cuerpos oleosos en tampón de molienda con el politrón que funciona a baja velocidad. Utilizando una jeringuilla, se estratificaron con cuidado los cuerpos oleosos resuspendidos por debajo de cinco volúmenes de Tris-HCl 50 mM frío, pH 7,5 y se centrifugaron como anteriormente. Tras la centrifugación, los cuerpos oleosos se separaron de nuevo y se repitió tres veces el procedimiento de lavado para eliminar las proteínas solubles de la semilla que contaminan el residuo. La preparación final del cuerpo oleoso lavado se volvió a poner en suspensión en un volumen de Tri-HCl 50 mM, pH 7,5, se redispersó con el politrón y a continuación estaba preparado para su utilización como matriz de afinidad.

Purificación por afinidad de trombina

En la Figura 4 se presenta esquemáticamente la purificación de la trombina utilizando la proteína de fusión oleosina-hirudina. Para evaluar la fijación de la trombina, se prepararon matrices de afinidad procedentes de semillas de Brassica napus transgénica que expresan la proteína de fusión oleosina-hirudina (semillas 4A4) (Parmenter et al. Plant Molecular Biology (1995) 29: 1167-1180) y de semillas Westar de Brassica napus cv natural. Se evaluó la fijación de la trombina a ambas matrices. Los procedimientos para la preparación de los cuerpos oleosos lavados procedentes de semillas fueron los mismos que los descritos anteriormente. Las soluciones que contienen un intervalo de actividades de trombina comprendido entre 0 y 1 unidades se mezclaron con 10 \mul de una cantidad fija de matriz de afinidad (preparada a partir de un total de 10 mg de semillas secas; correspondiente a aproximadamente 100 \mug de proteína con cuerpo oleoso total) en 500 \mul de tampón de fijación (Tris-HCl 50 mM (pH 7,5); BSA al 0,1% (p/v)). La suspensión del cuerpo oleoso se incubó a continuación durante 30 minutos en hielo y se centrifugó a 14.000 rpm durante 15 minutos a 4ºC. El tampón bajo los cuerpos oleosos (denominado "subnadante") que contiene la trombina libre no ligada se recuperó utilizando una aguja hipodérmica y se analizó la actividad de la trombina de la forma siguiente. Se añadió un total de 250 \mul de subnadante de 700 \mul de tampón de fijación y se precalentó a 37ºC. Tras la adición de 50 \mul de sustrato N-p-tosyl-gly-pro-arg-p-nitroanilida (Sigma) de trombina 1 mM al subnadante, se controló por espectrofotometría durante 3 minutos el cambio de densidad óptica a 405 nanómetros. Se determinó la concentración de trombina en la mezcla de análisis empleando una curva patrón que se construyó utilizando una serie de muestras de trombina que contenían concentraciones conocidas de trombina. Los valores obtenidos en estos análisis se utilizaron para calcular la concentración de trombina ligada suponiendo:

[trombina ligada] = [trombina total] - [trombina libre]

La relación de la concentración de trombina ligada a la concentración de trombina libre se representó en función de la concentración de trombina ligada (representación de Scatchard). A partir de estas representaciones se calcularon las constantes de disociación de la matriz de afinidad siguiendo procedimientos normalizados (Scatchard, G. Ann. N.Y. Acad. Sci. (1949) 57: 660-672) y suponiendo: K_{a} = 1/K_{d}. Las constantes de disociación de las matrices de afinidad fueron 3,22 \times 10^{-7}m para el tipo natural y 2,60 \times 10^{-8} m para los cuerpos oleosos 4A4.

Para evaluar la recuperación de la trombina ligada procedente de las matrices se empleó un gradiente de NaCl. El perfil de elución de la trombina ligada a las matrices de cuerpo oleoso de oleosina-hirudina se comparó con el perfil de la trombina ligada con las matrices del cuerpo oleoso natural. Los procedimientos para la preparación de los cuerpos oleosos naturales a partir de semillas Westar de Brassica napus cv natural y para la preparación de los cuerpos oleosos de oleosina-hirudina de semillas 4A4 de Brassica napus (Parmenter et al. Plant Molecular Biology (1995) 29: 1167-1180) fueron idénticos a los descritos anteriormente. Los procedimientos para la fijación de trombina a las matrices fueron como se describió anteriormente, excepto que se utilizaron 100 \mul de alícuotas de cuerpos oleosos para fijar 0,5 unidades de trombina. Las suspensiones de cuerpo oleoso se dejaron en hielo durante 3 minutos antes de la centrifugación durante 15 minutos a 4ºC y 14.000 rpm. Se determinó la actividad de la trombina (no fijada) en el subnadante. La matriz del cuerpo oleoso se volvió a poner en suspensión a continuación en tampón de fijación al que se añadió NaCl hasta una concentración final de 0,05 M. Comenzando con 30 minutos de incubación de la suspensión del cuerpo oleoso en hielo, se repitió el procedimiento cinco veces aumentando la concentración de NaCl paso a paso. Las concentraciones finales de NaCl utilizadas fueron 0,05 M, 0,1 M, 0,2 M, 0,3 M, 0,4 M y 0,6 M. Las concentraciones de NaCl en la determinación de trombina se mantuvieron constantes a 150 mM. La Figura 5 presenta los perfiles de elución obtenidos cuando se utilizaron cuerpos oleosos naturales y cuerpos oleosos 4A4.

Ejemplo 2 Utilización de anticuerpos como ligandos bivalentes

Se pueden utilizar anticuerpos como ligandos bivalentes en virtud de su afinidad tanto para los epítopos específicos como para otros anticuerpos o proteínas (por ejemplo la proteína A de Staphylococcus aureus) que presentan afinidad por las inmunoglobulinas (IgG). En este ejemplo, los anticuerpos antioleosina policlonales sirven como ligando bivalente y los anticuerpos construidos en conejos contra los anticuerpos antioleosina sirven como diana. Este ejemplo se ilustra esquemáticamente en la Figura 6.

Se prepararon cuerpos oleosos a partir de 5 g de semillas Westar de Brassica napus cv natural siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. Posteriormente se lavaron dos veces los cuerpos oleosos con glicina 100 mM (pH 2,5), se neutralizaron mediante dos lavados en tampón de fijación (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5) y se volvieron a poner en suspensión en 5 ml de tampón de fijación. Una alícuota de 150 \mul de la preparación del cuerpo oleoso lavada se combinó con 500 \mul de suero de conejo que contenía anticuerpos antioleosina (anticuerpos del ligando) y se diluyó 1:10 con tampón de fijación. La suspensión del cuerpo oleoso se mezcló intensamente y se incubó durante 1 h a 4ºC con agitación. Tras la incubación, se separaron los anticuerpos del ligando no fijados de la suspensión del cuerpo oleoso mediante tres lavados con 1 \mul de tampón de fijación. Los cuerpos oleosos se combinaron a continuación con 500 \mul de suero diluido 1:500 en tampón de fijación y que contenía anticuerpos IgG anticonejo (anticuerpos diana) conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) como marcador de detección (Sigma). Esta suspensión se mezcló y se incubó en condiciones idénticas a las utilizadas para la fijación del anticuerpo antioleosina. Como referencia, se incubaron anticuerpos diana con los cuerpos oleosos que no se habían fijado anteriormente a los anticuerpos del ligando. Ambas muestras se lavaron posteriormente cuatro veces con 1 ml de tampón de fijación para eliminar los anticuerpos no ligados. Utilizando el tampón de fijación, se igualaron las muestras con respecto a la concentración de los cuerpos oleosos determinada midiendo por espectroscopía la turbidez de la muestra a 600 nm. Para determinar el anticuerpo diana fijado, las muestras que contenían 5 \mul de los cuerpos oleosos se mezclaron con 1 ml del HRP sustrato colorimétrico de tetrametilbencidina en peróxido de hidrógeno al 0,01% y se hicieron reaccionar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se interrumpieron las reacciones mediante la adición de 500 \mul de H_{2}SO_{4} 1 M y se determinó la absorbancia a 450 nm. Las correcciones de la presencia de anticuerpo diana residual, no ligado que quedaron después del lavado se hicieron analizando 5 \mul de la fracción de lavado final. Los resultados obtenidos para las preparaciones de referencia y del cuerpo oleoso fijado al ligando se publican en la Figura 7.

Ejemplo 3 Utilización de ligandos específicos de oleosina

La utilización de un ligando específico de oleosina representa una alternativa a la utilización de un anticuerpo o de proteínas de fusión de oleosina modificadas genéticamente para la purificación de proteínas diana recombinantes. En este caso, la proteína diana se fusiona al ligando específico de la oleosina y las oleosinas endógenas presentes en los cuerpos oleosos de semillas no transgénicas sirven como matriz complementaria de afinidad al ligando. Además de eliminar el requisito de una línea transgénica que expresa una fusión de oleosina, este método aumenta la capacidad global de la matriz de afinidad, ya que todas las oleosinas endógenas pueden ahora participar en el enlace.

Los ligandos específicos de oleosina pueden identificarse y aislarse a partir de un banco de despliegue del fago peptídico cribado con la proteína oleosina. Dado que la hidrofobia extrema del dominio central de la oleosina puede producir acumulación y precipitación de la proteína cuando se separa de los cuerpos oleosos, puede utilizarse para el cribado una proteína mutante que carece de este dominio. Esto tiene un pequeño efecto sobre la eficacia del ligando, ya que solamente las fracciones hidrofílicas de la oleosina se exponen al citoplasma (es decir, los terminales N y C). Por consiguiente éstas son las únicas zonas disponibles para el enlace a un ligando. Una vez aislado, el ligando puede fusionarse a una proteína indicadora común, la proteína verde fluorescente (GFP) (Prasher, 1995, Trends Genet. 11: 320-323), para demostrar la purificación.

Eliminación del dominio central de la oleosina

Los cebadores de oligonucleótidos específicos para el gen con oleosina de Arabidopsis descritos anteriormente pueden utilizarse para ampliar un gen con oleosina a partir de un banco de ADNc de B. napus (van Rooijen 1993, Ph.D. Thesis, University of Calgary). Los cebadores que flanquean las secuencias que codifican los 62 aminoácidos N-terminales y los 55 aminoácidos C-terminales, pueden utilizarse para ampliar las secuencias para los dominios N- y C-terminales respectivos de oleosina en reacciones independientes. Además, el cebador para el extremo 5' del domino N-terminal contiene una secuencia para que una secuencia de reconocimiento de la trombina permita la escisión de la proteína de fusión como se describe a continuación. El fragmento resultante se ligó en la secuencia SmaI del vector de expresión bacteriano pEZZ 18 (Pharmacia). Este vector contiene secuencias que codifican un péptido con señal para la secreción de proteínas en el periplasma y los dominios de fijación de IgG sintéticos procedentes de la proteína A para facilitar la purificación de proteínas, corriente abajo de la secuencia de clonación múltiple.

Expresión y purificación del montaje de deleción de oleosina

El vector que lleva el montaje mutante de deleción se introduce en E. coli utilizando métodos normalizados y los transformadores seleccionados. Un cultivo de bacterias transformadas puede ser inducido a expresar la proteína de fusión sintética proteína A-oleosina mutante mediante la adición de IPTG 1 mM. Las células inducidas pueden sedimentarse y volverse a poner en suspensión en MgSO_{4} 5 mM que produce la lisis de la membrana periplásmica por choque osmótico. Las células lisadas se centrifugan y el sobrenadante que contiene la proteína segregada se carga en una columna que contiene sefarosa acoplada a IgG. Después del lavado para eliminar la proteína no ligada, la columna se carga con un tampón que contiene Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM y 1,0 U/ml de trombina bovina purificada (Sigma) para escindir la oleosina mutante de la proteína A sintética. Tras la incubación a 37ºC durante 4 h, se purga la columna y se pasa el eluído a través de una columna de sefarosa acoplada a heparina para eliminar la trombina. El eluído de esta columna, que contiene la proteína oleosina mutante, se recupera y purifica de la proteína examinada por electroforesis en gel seguida de tinción con Coomassie azul R250.

Generación de un banco combinatorio de péptidos

Puede generarse un banco de combinaciones al azar de péptidos según los métodos de Scott y Smith (1990; Science 249: 386-390). En resumen, se utiliza la PCR para ampliar un fragmento de ADN sintético que contiene la secuencia degenerada (NNK)_{6}; en la que "N" representa una mezcla igual de desoxinucleótidos G, A, T y C y K representa una mezcla igual de los desoxinucleótidos G y T. La secuencia degenerada codifica péptidos hexámeros entre los que están representados casi una posible combinación de los 20 aminoácidos y del codón de terminación ambar. El producto de la PCR se liga en la secuencia del gen III del bacteriófago fUSE filamentoso y el fagómido resultante se introduce en E. coli por electroporación.

Identificación y aislamiento de los ligandos específicos de oleosina

Los bancos de despliegue del fago del péptido se amplían, se concentran y se almacenan en alícuotas de 10^{12} tdu/ml. La proteína oleosina mutante purificada se biotinila utilizando un marcador escindible por tiol (S-S biotina, Pierce) y se purifica mediante cromatografía por exclusión de tamaño. Las alícuotas del banco de despliegue del fago del péptido que contienen 5 \times 10^{11} tdu en dos ml se criban con la proteína biotinilada a una concentración de 50 nM. Los fagos que forman el puente con la proteína oleosina mutante se recuperan utilizando perlas paramagnéticas recubiertas de estreptavidina. Después del lavado, los fagos se eluyen por adición de ditiotreitol 50 mM que escinde el enlace disulfuro. Los fagos eluidos se incuban a continuación con un exceso de F+ E. coli en fase log. Las alícuotas de las células infectadas se colocan en placas para determinar el título del fago y las células restantes se utilizan en rondas sucesivas de ampliación y cribado. Después del enriquecimiento del fago eluido en 3 a 4 órdenes de magnitud, los fagos individuales se seleccionan y se analiza el enlace a la oleosina mutante por ELISA directo. El enlace por el fago se detecta utilizando anticuerpos antifago (Crosby y Schorr, 1995, en Annual Review of Cell Biology). Se aísla el ADN de una sola cadena del fago que presenta el enlace y se determina la secuencia que codifica el péptido.

Purificación por afinidad con ligandos específicos de oleosina

La secuencia para un ligando de oleosina aislada como se describió anteriormente se fusiona al marco corriente arriba de la secuencia para gfp10 (Prasher et al., 1992, Gene 111: 229-233) que codifica GFP y se liga el montaje al vector pKK233 (Pharmacia) de expresión bacteriana. Se extrae la proteína soluble mediante exposición a ultrasonidos de las células producidas para expresar la fusión ligando-GFP y se ajusta a una concentración de 10 mg/ml en Tris-HCl 50 mM, pH 7,5.

Se mezclan veinte ml de la solución de proteína con 2 ml de cuerpos oleosos preparados como se describió anteriormente, procedentes de semillas de plantas no transgénicas. Se incuba la mezcla a 4ºC durante 30 min con agitación para permitir el enlace y a continuación se centrifuga para separar los cuerpos oleosos y la fracción soluble. La cantidad de GFP que permanece en la fracción soluble después de la separación de los cuerpos oleosos se determina por espectrofluorometría de fluorescencia a una longitud de onda de 508 nm y se compara con la del extracto bacteriano original. Se calcula la cantidad de GFP ligada para determinar la capacidad de la matriz.

Se lavan los cuerpos oleosos dos veces en 20 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 se vuelven a poner en suspensión en 2 ml del mismo tampón y se dividen en 20 alícuotas de 100 \mul. Las condiciones para la elución de la proteína de fusión ligando-GFP se determinan añadiendo 1 ml de soluciones cuyo pH está comprendido entre 2 y 10 y en la concentración de NaCl entre 0 y 1 M a diferentes alícuotas. Tras el mezclado e incubación a 4ºC durante 30 min, se separaran los cuerpos oleosos y se recogen las fracciones solubles. Se determina la cantidad de proteína de fusión ligando-GFP en la fracción soluble por espectrometría de fluorescencia.

Ejemplo 4 Eliminación de los iones metálicos pesados

El ejemplo siguiente demuestra la utilidad de las matrices de afinidad del cuerpo oleoso para la recuperación/elimi-
nación de las dianas de material no proteico de las soluciones complejas. Para la finalidad de este ejemplo se utilizó el par del ligando metalotioneína/Cd^{++}. Sin embargo podrían utilizarse también otras proteínas con enlace metálico tales como fitoquelatinas (Rauser, 1990; Ann. Rev. Biochem.; 59: 61-86) e iones metálicos incluyendo Cu^{++} y Zn^{++}.

Fusión oleosina-metalotioneína

Un gen con oleosina procedente de un banco de ADNc de B. napus (van Rooijen 1993, Ph.D. Thesis, University of Calgary) se amplió por PCR con cebadores de oligonucleótidos diseñados con el fin de crear las secuencias NotI y NcoI y los extremos 5' y 3' del gen respectivamente. El fragmento resultante se digirió y se colocó en las secuencias NotI/NcoI de pGN para dar el plásmido poleGN. Se amplió el gen con metalotioneína humano, mt-II (Varshney y Gedamu, 1984, Gene, 31: 135- 145) utilizando cebadores de oligonucleótidos diseñados para crear una secuencia NotI única en el extremo 3' del gen. El producto de PCR resultante se subclonó en la secuencia EcoRV del extremo truncado de pBluescript KS+ para formar pBSMTC. El gen mt-II se escindió a continuación de este plásmido y se subclonó en las secuencias NcoI/KpnI de poleGN sustituyendo la zona GUS-NOS para generar pOLEMTC. La fusión oleosina-MT de 773 bases de pOLEMTC se escindió con digestión de NotI y se insertó en la única secuencia NotI de polePN3' entre el activador de oleosina (oleP; Van Rooijen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 1177-1179) y el gen terminador ubi4-2 de P. crispum (ubi3'; Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Biol. 21: 673-684) para generar pOOM3'. Tras la fusión se determinó que estaba en la orientación correcta, se digirió pOOM3' con KpnI para liberar la inserción oleP-oleMT-ubi3'. Este casete de expresión se insertó en la secuencia KpnI del vector binario pCGN1559 para dar el montaje final pBIOOM3'. La secuencia de la fusión oleosina-metalotioneína se presenta en la Figura 8 y la SEC. ID nº:6. La construcción del plásmido pB100M3' se presenta en la Figura 9.

Transformación y regeneración

Se crearon plantas transgénicas B. carinata que expresan la fusión oleosina-metalotioneína utilizando los protocolos de transformación y regeneración descritos en el Ejemplo 1.

Preparación del cuerpo oleoso

Se prepararon cuerpos oleosos lavados procedentes de semillas de B. carinata de plantas transgénicas y de referencia tal como se describe en el Ejemplo 1.

Eliminación de Cd^{++} de la solución utilizando una matriz de afinidad del cuerpo oleoso

En la Figura 10 se presenta esquemáticamente la utilización de la fusión oleosina-metalotioneína para ligar los iones de cadmio en solución.

Se preparó una solución de CdCl_{2} 10 \muM en Tris-HCl 10 mM, pH 7,2 que contenía 0,01 \muCi/ml de ^{109}Cd. Una alícuota de 1 ml de esta solución de CdCl_{2} se mezcló intensamente con 100 \mul de cuerpos oleosos lavados (1,6 mg de proteína con cuerpo oleoso) preparados a partir de semillas que expresan la proteína de fusión oleosina-metalotioneína y se incubaron a 22ºC durante 1 h. Después de centrifugación durante 5' a 10.000 \times g para separar los cuerpos oleosos de la fase acuosa y de 2 lavados en 1 ml de Tris-Cl 10 mM, pH 7,2, se determinó la cantidad de ^{109}Cd^{++} que queda ligada a una fracción de cuerpo oleoso utilizando un contador gamma (Cobra auto-gamma, Canberra Packard, Canadá). Se realizó un experimento idéntico con los cuerpos oleosos procedentes de semillas no transgénicas para detectar y corregir el enlace no específico de los iones Cd a la matriz.

Se eluyeron los iones Cd^{++} de la matriz de afinidad de metalotioneína del cuerpo oleoso mezclando la fracción del cuerpo oleoso con 1 ml de tampón de glicina 100 mM (pH = 3,0) (Pazirandeh et al., 1995; Appl. Microbiol. Biotechn. 43: 1112-1117). Después de la centrifugación durante 5 min a 10.000 \times g, se eliminó la fracción del cuerpo oleoso y se analizaron los iones Cd^{++} ligados como anteriormente. La Figura 11 presenta el enlace de Cd y la elución de la matriz de afinidad.

Ejemplo 5 Separación de células completas

El ejemplo siguiente ilustra la capacidad de los cuerpos oleosos para inmovilizar células completas. Un potencial para la utilización de la separación de las células bacterianas se basa en la utilidad para diagnósticos. También resulta deseable separar células eucarióticas únicas tales como los linfocitos y las células madres de mezclas complejas de células donde el tipo de célula de interés está presente en números relativamente bajos.

Fijación de Staphylococcus aureus a los cuerpos oleosos por la proteína A

Para la finalidad de este ejemplo, se mezclaron células S. aureus, que expresan la proteína A como antígeno de superficie con los cuerpos oleosos con cantidades variables de anticuerpos antioleosina policlonales.

Preparación de cuerpos oleosos

Se esterilizó la superficie de semillas Westar de B. napus cv en blanqueador, se enjuagaron y se machacaron con una mano de mortero en tampón de molienda (Tris 50 mM pH 7,5, sacarosa 0,4 M y glicina 100 mM). Se filtró el homogeneizado a través de Miracloth en tubos esterilizados Corex de 15 ml. El homogeneizado filtrado se centrifugó a continuación a 4ºC durante 10 min a 10.000 \times g. Se separó la fracción de cuerpos oleosos y se volvió a poner en suspensión en Tris 50 mM pH 7,5 y sacarosa 0,4 M y se lavó dos veces utilizando el mismo tampón. Se transfirieron alícuotas de cuerpos oleosos de 1 ml a tubos Eppendorf de 1,5 ml y se centrifugaron a temperatura ambiente durante 10 min a 16.000 \times g. Los cuerpos oleosos se lavaron en Tris 50 mM pH 7,5 y sacarosa 0,4 M 5 a 6 veces más hasta que no se observó sedimento visible.

Fijación de células S. aureus a cuerpos oleosos recubiertos con antioleosina

Se lavaron células de S. aureus (Sigma, P-7155) fijadas en formalina 3 a 4 veces en Tris-Cl 50 mM y se volvieron a poner en suspensión. Los cuerpos oleosos lavados (300 \mul) y las células de S. aureus se mezclaron con cantidades variables de IgG antioleosina (50 \mul). Después del mezclado e incubación a temperatura ambiente durante 2 h, se centrifugaron las mezclas a temperatura ambiente a 16.000 \times g durante 5 min. Se separaron con cuidado la fracción de cuerpos oleosos y el subnadante y se lavó el sedimento celular dos veces en 1 ml de Tris-Cl 50 mM, pH 7,5. Se rascaron las paredes del tubo con un tejido para eliminar los vestigios de aceite. Posteriormente se volvieron a poner en suspensión los sedimentos celulares purgados en 1 ml de agua y se determinó la DO_{600}. La Figura 12 es un experimento representativo que presenta la disminución de la cantidad de células presentes en el sedimento celular a medida que aumenta la concentración de anti-IgG presente en la mezcla de S. aureus del cuerpo oleoso.

Fijación diferencial de dos cepas de Staphylococcus aureus

En este experimento se emplea una matriz de afinidad del cuerpo oleoso para demostrar la fijación diferencial de dos cepas de Staphylococcus aureus. Las cepas de S. aureus fijadas en formalina, una que expresa la proteína A del antígeno de superficie que se une a IgG y otra que carece de proteína A, están comercializadas por Sigma. Se pueden preparar alícuotas diluidas de ambas cepas de S. aureus de igual DO_{550}. A cada una de estas alícuotas pueden añadirse cuerpos oleosos de referencia procedentes de plantas no transformadas o cuerpos oleosos mezclados con anticuerpos antioleosina. Después de la incubación durante un periodo de tiempo apropiado a una temperatura apropiada, las muestras se pueden centrifugar para sedimentar las células bacterianas no ligadas y separar la fracción del cuerpo oleoso. Los cuerpos oleosos pueden decantarse, agitarse y se puede determinar la DO_{550}. Los sedimentos se pueden volver a poner en suspensión y puede determinarse la DO_{550} del subnadante. Se prevé que únicamente en la muestra que contiene la proteína A que expresa la proteína de S. aureus y el cuerpo oleoso que forma complejo con anticuerpos antioleosina, se observará el fraccionamiento de estas células con la fracción del cuerpo oleoso. La fijación de estas células al cuerpo oleoso puede demostrarse además reduciendo el pH de la fracción del cuerpo oleoso. Después de la centrifugación para liberar las células de los cuerpos oleosos puede demostrarse la presencia de un sedimento y/o un aumento en la DO_{550} en la resuspensión del sedimento.

Separación de Staphylococcus aureus de E. coli

Una cepa viable de S. aureus puede mezclarse con cantidades variables de células de una cepa de E. coli con resistencia específica a los antibióticos. La muestra bacteriana mezclada puede fijarse con los anticuerpos de referencia y con los cuerpos oleosos que han formado complejos con anticuerpos antioleosina. Tras la incubación durante un periodo apropiado de tiempo y a una temperatura apropiada los cuerpos oleosos pueden lavarse y el subnadante y los cuerpos oleosos pueden valorarse directamente y colocarse selectivamente en placas en agar-agar con sangre para cultivo de S. aureus y en placas LB para cultivo de E. coli. El enriquecimiento o la separación existente obtenida puede determinarse mediante una estimación de las unidades formadoras de colonias.

Identificación de patógenos presentes en bajas concentraciones en una mezcla compleja

Con objeto de diagnóstico con frecuencia es deseable concentrar los patógenos bacterianos o víricos que invaden los tejidos humanos o animales en bajas cantidades. Puede utilizarse una matriz de afinidad con cuerpo oleoso para enriquecer estos patógenos, de modo que puedan identificarse y caracterizarse posteriormente.

Los patógenos se unen con frecuencia específicamente a las células humanas o animales mediante la interacción con un receptor o una proteína de superficie. La oleosina puede fusionarse al ligando de la proteína humano o animal y los cuerpos oleosos recombinantes pueden emplearse para inmovilizar los patógenos. Ejemplos de formación de los complejos proteicos formados entre las proteínas de orígenes humano y patógeno conocidos en la técnica anterior comprenden el fibrinógeno humano o los dominios específicos de la fibrina que se unen al factor A que aglomera la proteína de S. aureus (clf-A) (McDevitt et al. 1995; Mol. Microbiol. 16: 895-907); el factor acelerante de la caries humana (DAF) al que se une el E. coli patógeno de los tubos urinario e intestinal (Nowicki et al. 1993; J. Of Experim. Med. 178: 2115-2121); un ligando celular humano que se expresa en la línea celular de carcinoma Caco-2 y que se une exclusivamente a la proteína KPF-28 de la franja de Klebsiella pneumoniae de 28 kD (Di Maretino et al., 1996; Infect. and Immun. 64: 2263-2266) y los dominios específicos de fibronectina de la matriz extracelular humana que forman complejos específicamente con la adhesina (proteína F) de Streptococcus pyrogenes (Ozeri et al., 1996; EMBO J. 15: 989-998).

Ejemplo 6 Separación de moléculas orgánicas pequeñas

Este ejemplo describe cómo puede utilizarse una matriz de afinidad del cuerpo oleoso para la recuperación/elimi-
nación de moléculas orgánicas pequeñas en solución. A título de ejemplo, se purifica la molécula orgánica pequeña, biotina, utilizando avidina como ligando.

Construcción de ligandos de avidina

La avidina es una proteína sintetizada por las especies aviares y presenta una afinidad sumamente alta por la biotina, un cofactor natural para muchas carboxilasas. Las preparaciones de avidina purificada (comercializadas por Sigma) pueden conjugarse químicamente con anticuerpos antioleosina utilizando procedimientos normalizados conocidos por los expertos en la materia. Este método proporciona un ligando de avidina bivalente adecuado para demostrar la afinidad basada en la eliminación de la biotina. Por otra parte, puede utilizarse la fusión génica oleosina-avidina. Se ha identificado el gen que codifica la avidina en pollos (Gallus gallus) y se ha determinado su secuencia (Beattie et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 3595-3606). Basándose en la secuencia el gen para avidina puede sintetizarse químicamente o mediante la PCR y fusionarse a la oleosina de B. napus (van Rooijen, 1993, Ph.D. Thesis, University of Calgary) como se describe en el ejemplo 4. Puede emplearse también estreptavidina, análogo bacteriano de la proteína que se une a la biotina.

Preparación de cuerpos oleosos

Se preparan cuerpos oleosos lavados a partir de semillas de plantas transgénicas y/o de plantas de referencia como se describe en el ejemplo 1.

Fijación del ligando bivalente avidina-oleosina

La fijación de los anticuerpos antioleosina y la eliminación del ligando no unido será como se detalla en el ejemplo 3.

Eliminación de la biotina de la solución

Las soluciones que contienen concentraciones conocidas de biotina pueden combinarse con una cantidad fija de cuerpos oleosos que han formado complejos con anticuerpos antioleosina conjugados con avidina. Después de la fijación, se centrifuga la mezcla para separar los cuerpos oleosos y la fracción acuosa. La cantidad de biotina que queda en la fracción acuosa se determina mediante ELISA competitivo utilizando anticuerpos anti-biotina conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP). La cantidad de biotina ligada puede calcularse suponiendo:

[biotina ligada] = [biotina total] - [biotina libre]

De los valores obtenidos, pueden determinarse las constantes de disociación como se describe en el ejemplo 2. Como referencia, puede realizarse un experimento idéntico con cuerpos oleosos ligados a anticuerpos antioleosina que no se han conjugado con avidina. Si se desea, la biotina puede liberarse de la matriz cuerpo oleoso-avidina por elución competitiva utilizando un exceso de ácido 2-(4'-hidroxibenceno)benzoico (HABA). La elución puede ayudarse también empleando un mutante de avidina modificado genéticamente que presente una afinidad menor por la biotina. Dichos mutantes han sido descritos para los análogos de biotina que se unen a la proteína de las bacterias, estreptavidina (Chilkoti et al., 1995; Bio/Technol. 13: 1198-1204).

Ejemplo 7 Separación de carbohidratos

El ejemplo siguiente describe la utilidad de las matrices con cuerpo oleoso para la recuperación de carbohidratos de mezclas biológicas complejas. En este ejemplo los inventores demuestran que la celulasa inmovilizada por el cuerpo oleoso es capaz de unirse a la celulosa.

Fusión del dominio de fijación a la oleosina-celulosa

Varias celulasas producidas por la bacteria Cellulomonas fimi contienen dominios discretos de fijación a la celulosa (CBD). Estos CBD se unen independientemente a la celulosa aun cuando se separen por escisión proteolítica o manipulación genética del domino catalítico de la enzima. El plásmido pUC18-CBDPT contiene un fragmento que codifica el CBD de la beta-1,4-glucanasa (Gilkes et al., 1992, Journal of Biol. Chem. 267: 6743-6749) y puede utilizarse para construir una fusión génica oleosina-CBD. Un fragmento de ADN que codifica el dominio CBD puede aislarse de pUC18-CBDPT utilizando las enzimas de restricción apropiadas o utilizando la PCR. Como alternativa, pueden utilizarse las CBD de otras celulasas de C. Fimi o las celulasas de otras procedencias. Un gen con oleosina de B. Napus aislado de un banco de ADNc (van Rooijen, 1993, Ph.D. Thesis, University of Calgary) se clonó en pGN utilizando la PCR y dando el plásmido pOLEGN como se describe en el ejemplo 4. Una fusión génica en el marco entre el gen con oleosina y el gen con CBD puede generarse utilizando técnicas moleculares normalizadas conocidas por los expertos en la materia. El montaje final comprende el dominio de CBD fusionado en la traducción inmediatamente corriente abajo de la oleosina.

Transformación y regeneración

Para introducir el montaje del gen de fusión en las plantas, se subclona en un vector binario, tal como pCGN2559. Se generan plantas transgénicas que expresan la fusión oleosina-CBD como se describe en el ejemplo 1.

Preparación de cuerpos oleosos

Se pueden preparar cuerpos oleosos lavados a partir de semillas de plantas naturales transgénicas y de referencia tal como se describió en el ejemplo 1.

Eliminación de la celulosa de una solución utilizando una matriz de afinidad con cuerpo oleosos

Para evaluar la fijación de la celulosa a la matriz de afinidad con cuerpo oleoso, se comparan las capacidades de fijación de los cuerpos oleosos de plantas naturales y transgénicas. Los cuerpos oleosos pueden mezclarse con soluciones apropiadamente tamponadas que contienen un intervalo de concentraciones de celulosa. La suspensión del cuerpo oleoso puede incubarse a continuación durante un periodo de tiempo apropiado y a una temperatura apropiada. En la centrifugación, puede recuperarse el subnadante y analizarse las concentraciones de celulosa. Las concentraciones de celulosa ligadas y las de celulosa libre pueden calcularse suponiendo:

[celulosa ligada] = [celulosa total] - [celulosa libre]

La relación de la concentración de celulosa ligada a la concentración de celulosa libre puede representarse en función de la concentración de celulosa ligada. A partir de estas representaciones pueden calcularse las constantes de disociación siguiendo los procedimientos normalizados (Scatchard, G. Ann. N. Y. Acad. Sci. (1949) 57: 660-672) y como se detalla en el ejemplo 2.

Ejemplo 8 Separación de ácidos nucleicos

El ejemplo siguiente describe un método en el que se emplean cuerpos oleosos para unir ácidos nucleicos de una sola cadena (SS).

Aislamiento de ácidos nucleicos de una sola cadena

Un método de captura de ácidos nucleicos SS puede utilizarse en diagnósticos, tal como de una enfermedad vírica vegetal o de aplicaciones para investigación en las que se necesite eliminar selectivamente ácidos nucleicos SS no rehibridados de soluciones tales como en las reacciones de hibridación para la identificación diferencial de genes expresados. Las oleosinas pueden fusionarse con proteínas que se fijan a ADN SS o a ARN o a los dominos específicos de las mismas que pueden utilizarse para atrapar ácidos nucleicos SS para su identificación o ampliación ulterior. Las proteínas que se unen a ácidos nucleicos SS bien caracterizados comprenden: la proteína Vir E2 del plásmido Ti agrobacteriano (Zupan et al., 1995, Plant Physiol. 107: 1041-1047); la proteína P30 de desplazamiento del virus del mosaico del tabaco (TMV) (Citovsky et al., 1990; Cell 60: 637-647; Waigmann et al., 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 91: 1433-1437); proteína de la envoltura del virus del mosaico de la coliflor (Thompson et al., 1993; J. Gen. Virol. 74: 1141-1148) y las proteínas de unión de RecA de E. coli y de una sola cadena (SSB) (Radding, 1991 J. Biol. Chem. 266:5355-5358).

Ejemplo 9 Separación de proteínas recombinantes

El ejemplo siguiente demuestra además la utilidad de una matriz de afinidad del cuerpo oleoso para la purificación de proteínas diana recombinantes. Para el objeto de este ejemplo, se ha seleccionado el par de ligando IgG/proteína A. El montaje empleado consiste en un dominio de proteína A que se fusionó con la oleosina de Arabidopsis de 18 kDa (Van Rooijen et al., 1992; Plant Mol. Biol. 18: 1177-1179). Se aislaron y utilizaron cuerpos oleosos que contienen proteínas de fusión oleosina-proteína A para demostrar la unión específica de las IgG conejo-antirratón conjugadas con la peroxidasa de rábano picante (HRP). En la Figura 15 se presenta la configuración de la fusión oleosina-proteína A en el cuerpo oleoso y la fijación de IgG a la fusión.

Fusión oleosina-proteína A

Se sintetizó una secuencia de proteína A sintética que codifica una proteína capaz de unirse a IgG basándose en la información de la secuencia descrita (pRIT2T, vector de la fusión génica de la proteína A; Pharmacia) y se amplió por PCR. Cada cebador utilizado en la PCR contenía secuencias de restricción 5' en la secuencia específica para la proteína A para facilitar la clonación. El cebador complementario (es decir, el cebador en la dirección de la cadena complementaria) contenía asimismo un codón de terminación de la traducción a continuación de la secuencia de codificación. La Figura 13 presenta la posición de los cebadores de PCR correspondientes con la secuencia de la proteína A (la secuencia de la proteína A y las secuencias del cebador se presentan también por separado en las SEC. ID nº:8, SEC. ID nº:10 y SEC. ID nº:11 respectivamente). El fragmento resultante se ligó en un plásmido pUC19 que lleva el gen con oleosina de Arabidopsis compuesto por una zona activadora corriente arriba de 867 bp seguida de una zona de codificación (que está relacionada con el intrón) a partir de la cual se ha eliminado el codón de terminación de la traducción. El extremo 3' del montaje contiene el terminador de la trascripción de la nopalina sintetasa. Una secuencia separadora que codifica una secuencia de reconocimiento para la trombina de la endoproteasa se incorporó inmediatamente corriente abajo de la secuencia de codificación de la oleosina. La secuencia del gen con proteína A se introdujo entre esta secuencia separadora y la secuencia del terminador. En el montaje de la expresión final las zonas de codificación de la oleosina y de la proteína A se fusionaron en el mismo marco de lectura. El montaje completo (Figura 14 y SEC. ID nº:12) se escindió a continuación del plásmido pUC19 y se subclonó en el vector pCGN1559 de transformación de la planta (McBride y Summerfelt, 1990, Plant Mol. Biol. 14: 269-276) que lleva un gen de neomicina fosfotransferasa bajo el control de un activador de 35S CaMV. El plásmido resultante se introdujo en Agrobacterium (cepa EHA101).

Transformación y regeneración

Se transformaron y regeneraron plantas como se describe en el ejemplo 1. Las plantas transgénicas se identificaron inicialmente utilizando un análisis con neomicina fosfotransferasa y se confirmaron posteriormente mediante la expresión de fusiones de proteína A mediante análisis de inmunotransferencia.

Preparación de cuerpos oleosos

Los cuerpos oleosos procedentes de las líneas transgénicas de B. napus y B. carinata que expresan la fusión oleosina-proteína A se prepararon siguiendo el procedimiento descrito en el ejemplo 1.

Fijación de las fusiones oleosina-proteína A a IgG

Los extractos de la proteína con cuerpo oleoso (20 \mug/alícuota) de varias líneas transgénicas de B. napus que expresan las proteínas de fusión oleosina-proteína A se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida y se transfirieron posteriormente a una membrana de PVDF siguiendo procedimientos normalizados. Se sondó a continuación la membrana con un anticuerpo anticonejo de ratón conjugado con HRP y se observó siguiendo el procedimiento esbozado en el manual de laboratorio Antibodies (Harlow y Lane, 1988, Cold Spring Harbor). En la Figura 16 se presenta la membrana de PVDF teñida. Se detectó específicamente una proteína de 50 kDa (masa molecular prevista de la proteína de fusión oleosina-proteína A: 48.801 Da) en los extractos proteicos de las seis líneas de B. napus transgénicas analizadas. Las plantas de referencia no transformadas no presentaron actividad por HRP, mientras que la proteína de 30 kDa (masa molecular prevista de 29.652 Da) estaba presente en el lisado bacteriano transformado con la proteína A que codifica pRIT2T y no detectable en el lisado no transformado.

Fijación y elución de las IgG a cuerpos oleosos que contienen proteínas de fusión oleosina-proteína A

Se prepararon cuerpos oleosos lavados (10 mg/ml de proteína) de la línea de B. napus natural y B. napus transgénica transformada con un montaje que expresa una proteína de fusión oleosina-proteína A descrita en el ejemplo 1 y se pusieron en suspensión en Tris-Cl 10 mM, pH 8,0. Se añadió un volumen de 2 \mul (\pm34 \mug) de anticuerpos antirratón de conejo conjugados con HRP (Sigma, nº de cat. A9044) a 500 \mul de la preparación de cuerpos oleosos lavados y se incubó la suspensión durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4ºC. A continuación se centrifugaron las muestras durante 15 min a 16.000 \times g y se eliminó el subnadante. Posteriormente, los cuerpos oleosos se volvieron a poner en suspensión completamente en 500 \mul de Tris-Cl 10 mM, pH 8,0 utilizando una mano de mortero. Esta etapa de lavado en Tris-Cl se repitió 4 veces (denominada en lo sucesivo preparación de cuerpos oleosos lavados). Se lavó una quinta vez una alícuota de 5 \mul de la preparación de cuerpos oleosos lavados y a continuación se analizó la actividad de HRP.

Se realizaron análisis de HRP añadiendo 1 \mul de la preparación de cuerpos oleosos lavados a 1 ml de la mezcla de análisis de HRP (9,8 ml de NaOAc 0,1 M, 0,2 ml de 2,5 mg/ml de trimetilbenzidina en DMSO, 4 \mul de H_{2}O_{2}) e incubando la mezcla durante 5 min a temperatura ambiente. Se interrumpió la reacción a continuación añadiendo 0,5 ml de H_{2}SO_{4} 1 M. Se filtraron las muestras a través de un filtro de 0,22 \mum y se determinaron posteriormente las DO_{450} por espectrofotometría.

Para eluir las IgG procedentes de los cuerpos oleosos, la preparación lavada de cuerpos oleosos se volvió a poner en suspensión en glicina 100 mM, pH 3,0 y se centrifugó durante 15 min a 16.000 \times g y se incubó durante 30' a temperatura ambiente. Después de la neutralización en 500 \mul de Tris-Cl 100 mM, pH 8,0, tanto en la fracción de cuerpos oleosos como en el eluido se analizó la actividad por HRP como anteriormente. En la Figura 17 se ilustran la fijación y elución de las IgG a los cuerpos oleosos en B. napus natural y B. napus transgénico que expresan una fusión de oleosina-proteína A.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: SemBioSys Genetics Inc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 609-14 Street, N.W.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Calgary

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Alberta

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Canadá

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: T2N 2A1

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TELÉFONO Nº.: (403) 220-5161

\vskip0.500000\baselineskip

(H)

TELEFAX Nº.: (403) 220-0704

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Moloney, Maurice

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 34 Edgebrook Cove N.W.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Calgary

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Alberta

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Canadá

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: T3A 5N5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Boothe, Joseph

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: nº 302, 332 6^{th} Avenue N.W.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Calgary

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Alberta

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Canadá

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: T2E 0L9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Rooijen, Gijs Van

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 3223 6^{th} Bearspaw Drive N.W.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Calgary

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Alberta

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Canadá

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: T2L 1T1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Cuerpos oleosos y proteínas asociadas como matrices de afinidad

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 14

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

REMITENTE: BERESKIN & PARR

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 40 King Street West

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Toronto

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Notario

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Canadá

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: M5H 3Y2

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

LISTADO DESCIFRABLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA INFORMÁTICO: Patentin Release nº 1.0, Versión nº 1.30

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/767.026

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 16-DIC-1997

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Gravelle, Michelin

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 40.261

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

REFERENCIA/NÚMERO DE ETIQUETA: 9369-050

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: (416) 364-7311

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: (416) 361-1398

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 522 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Oleosina de Arabidopsis Thaliana

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

PROPIEDADES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1..522

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:

1

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 174 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:

2

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2115 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Fusión Oleosina - Hirudina

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

PROPIEDADES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 862..1215

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

PROPIEDADES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1456..1833

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:

3

4

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 118 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:

5

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 126 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2366 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Fusión Oleosina - Metalotioneína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

PROPIEDADES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1092..1856

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

7

8

9

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 255 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 804 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Cebadores de proteína A

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

PROPIEDADES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 5..796

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 264 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Cebador Bk 266

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCCATGGAT CAACGCAATG GTTTATC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Cebador Bk267

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCAAGCTTCT AATTTGTTAT CTGCAGGTC

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2709 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

PROPIEDADES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 868..1220

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

PROPIEDADES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1462..2436

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

15

16

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 117 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 325 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 14:

19

Claims (27)

1. Procedimiento para la separación de una molécula diana de una muestra que comprende las etapas siguientes:

1)

poner en contacto (i) cuerpos oleosos con (ii) una muestra que contiene la molécula diana para permitir que la molécula diana se asocie con los cuerpos oleosos, en el que la molécula diana y los cuerpos oleosos están asociados mediante una molécula de ligando;

2)

separar los cuerpos oleosos asociados con la molécula diana de la muestra; y

3)

separar la molécula diana de los cuerpos oleosos.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la molécula de ligando está unida por enlace covalente a los cuerpos oleosos.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que la molécula de ligando está unida por enlace covalente a una proteína con cuerpo oleoso en los cuerpos oleosos.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el ligando está constituido por dos moléculas, una primera molécula que se asocia con los cuerpos oleosos y una segunda molécula que se asocia con la diana, en el que las primera y segunda moléculas se asocian entre sí.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que la primera y segunda moléculas de ligando están conjugadas entre sí.

6. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que la molécula de ligando es una proteína.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que el ligando proteico es una proteína de fusión con la proteína con cuerpo oleoso.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la molécula diana se selecciona de entre el grupo constituido por proteínas, péptidos, moléculas orgánicas, lípidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, células, orgánulos celulares, componentes celulares, virus, metales, iones metálicos e iones.

9. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que la molécula del ligando es la hirudina y la molécula diana es la trombina.

10. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que la molécula del ligando es la proteína A y la molécula diana es la inmunoglobulina.

11. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que la molécula del ligando es la metalotioneina y la molécula diana es el cadmio.

12. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que la molécula del ligando es una proteína de fijación a la celulosa y la molécula diana es la celulosa.

13. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que la molécula del ligando es una proteína de fijación al ácido nucleico y la molécula diana es un ácido nucleico.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que el ligando es una proteína de fijación al ADN de una sola cadena o una proteína de fijación al ARN y la diana es una molécula de ácido nucleico de una sola cadena.

15. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el ligando es un anticuerpo que se une al cuerpo oleoso o a una proteína con cuerpo oleoso.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que la diana es una célula, orgánulo celular o componente celular capaz de unirse al anticuerpo del ligando.

17. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que la célula es Staphylococcus aureus.

18. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que el ligando es un anticuerpo bivalente que se une tanto al cuerpo oleoso como a la diana.

19. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que el ligando es un anticuerpo conjugado con la avidina y la molécula diana es la biotina.

\newpage

20. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, en el que la proteína con cuerpo oleoso es una oleosina.

21. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que la oleosina procede de una planta seleccionada de entre el grupo constituido por colza (Brassica spp.), soja (Glycine max), girasol (Helianthus annuus), palma de aceite (Elaeis guineensis), coco (Cocus nucifera), ricino (Ricinus communis), cártamo (Carthamus tinctorius), mostaza (Brassica spp. y Sinapis alba), cilantro (Coriandrum sativum), linaza/lino (Linum usitatissimum), oruga (Arabidopsis thaliana) y maíz (Zea mays).

22. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que en la etapa 1) los cuerpos oleosos y la muestra se mezclan y a continuación se incuban durante aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente 24 horas.

23. Procedimiento según la reivindicación 22, en el que los cuerpos oleosos y la muestra mezclados se incuban en un intervalo de temperatura comprendido entre aproximadamente 4ºC y aproximadamente la temperatura ambiente.

24. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en el que los cuerpos oleosos asociados a la molécula diana se separan de la muestra en la etapa (2) por centrifugación, flotación o exclusión por tamaño.

25. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en el que la molécula diana se separa por elución en condiciones apropiadas.

26. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, en el que los cuerpos oleosos se obtienen de entre el grupo de plantas constituido por colza (Brassica spp.), soja (Glycine max), girasol (Helianthus annuus), palma de aceite (Elaeis guineesis), coco (Cocus nucifera), ricino (Ricinus communis), cártamo (Carthamus tinctorius), mostaza (Brassica spp. y Sinapis alba), cilantro (Coriandrum sativum), linaza/lino (Linum usitatissimum), oruga (Arabidopsis thaliana) y maíz (Zea mays).

27. Utilización de cuerpos oleosos que están asociados con una molécula de ligando como matrices de afinidad para separar una molécula diana de una muestra, en la que la molécula de ligando es capaz de asociarse con la molécula diana.