KR20000069499A - 친화성 기질로서의 기름체 및 이들의 결합단백질 - Google Patents
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Abstract
혼합물로부터 표적분자를 분리하는 방법을 기재하고 있다. 상기 방법은 원하는 표적 분자에 대한 선택적이고 비공유적 결합을 위한 친화성 매트릭스로서 기름체들과 이에 결합하는 단백질을 사용하고 있다. 기름체 단백질은 원하는 표적분자에 대해 특이성을 가는 리간드에 유전적으로 융합될 수도 있다. 또한 천연 기름체단백질을 항체나 기름체 결합 단백질과 같은 기름체 단백질에 특이적인 리간드와 접합하여 사용할 수도 있다. 기름체와 수용액간에 밀도의 차이가 있기 때문에, 상기 방법에 의해 원하는 표적분자를 분리 및 회수할 수 있다.
Description
본 발명은 샘플에서부터 표적분자를 분리 및 정제하기 위한 친화성기질로서의 기름체와 이들의 결합단백질의 용도에 관한 것이다.
일반적인 생물공학 분야내에서, 예를 들면 살아있는 세포, 혈청 또는 배양액과 같은 복합원(complex source)에서부터 분자를 효과적으로 분리 및 정제하는 능력은 매우 중요하다. 산업 및 연구실험등에 대한 적용(예를 들면, 단백질의 정제 또는 부분적 정제에 사용된다)은 다수이며 종래의 문헌에서 잘 나타나 있다(예를 들면, R. Meadon and G. Walsh in biotechnological advances 1994, 12:pp635-646을 참조).
분자의 분리를 위해 현재 사용되는 대부분의 기술은 관심 분자의 본질적인 물리적 및 화학적 성질을 이용하는 것이다. 친화성에 근거한 정제기술은 친화성 쌍을 형성하는 두가지 분자종간에 고도로 특이적인 생물학적 인식을 이용한다는 점에서 독특하다. 친화성 쌍을 형성하는 두 물질간의 결합은 비공유결합으로 알려진 상대적으로 약한 화학적 상호작용의 결과로서 거의 모든 경우에 일어난다. 인정되고 흔히 사용되는 친화성 쌍의 몇몇은 항체 및 이들에 결합하는 항원성 물질, 핵산과 핵산에 결합하는 단백질, 지질과 지질에 결합하는 단백질, 레시틴과 탄수화물, 스트렙타비딘/바이오틴 복합체, 단백질A/이뮤노글로불린G 복합체, 및 수용체와 이들에 결합하는 분자 등이 포함된다.
일반적으로, 친화성에 근거한 정제과정에서 친화성 쌍을 형성하는 하나의 구성원은 유체상에서 불용성인 고체상 기질(substrate) 또는 매트릭스상에 고정되어 있고, 다른 하나는 상기 유체상에 존재할 것을 요구한다. 매트릭스에 결합된 친화성쌍의 분자종들을 일반적으로 리간드라고 부르며, 액체상에 수용성인 분자종을 일반적으로 표적 물질이라고 한다. 그러나, 이 정의는 엄격한 화학적 의미로 제한을 가하는 것이 아님을 주목하는 것이 중요하다. 현재 리간드 고정화 기술의 대부분은 물리적 또는 화학적 접근에 의존한다. 리간드의 물리적 고정화는 적합한 지지체에 리간드의 흡착 또는 포집(entrapment)이 관련된다. 반면에 화학적 고정화 방식의 특징은 리간드와 기질간에 강한 교차결합이나 공유결합을 형성하는데 있다. 고정화 공정의 요건은 고정화과정이 친화성 쌍의 일원이 다른 일원을 인식하는 능력에는 역효과가 없어야 한다는 것이다.
리간드 고정화를 위해 현재 이용 가능한 물리적 및 화학적 기술의 단점은 생산과정은 종종 시간이 많이 걸리고 비싸다는 것이다. 이는 주로 고정화기술이 매트릭스 물질과 리간드를 별개로 생성하고, 이어서 결합하는 단계를 필요로 하기 때문이다. 단백질을 고정화하는 또다른 방법은 미국특허번호 제 5,474,925호에 기재되어 있으며, 이는 목화나무의 섬유에서 효소를 고정화하기 위한 생물학적 생산시스템을 기재하고, 이는 생물학적으로 생산된 최초의 효소 고정화시스템이라 믿어지며 기질과 리간드를 한 단계로 생산하는 것이 가능하다고 기재하고 있다.
기질에 리간드를 고정화한 후에, 친화성 고정화 리간드와 표적 일원간에 선택적인 결합을 위해서 친화성에 기초한 다양한 정제기술이 적용될 수 있다. 종래에 알려진 친화성에 기초한 정제기술은 살포 친화성 크로마토그래피(perfusion affinity chromatography), 친화성 반발 크로마토그래피(affinity repulsion chromatography), 초확산 친화성 크로마토그래피(hyperdiffusion affinity chromatography), 친화성 침전(affinity percipitation), 막친화성 분배(membrane affinity partitioning), 친화성 향류 한외여과 친화성 침전(affinity cross-flow ultrafiltration affinity precipitation)이 있다. 대부분 광범위하게 사용된 친화성에 기초한 정제기술 즉 친화성 크로마토그래피에 있어서, 리간드를 함유하는 기질을 코팅하거나, 충진하여 크로마토그래피 칼럼안에 있다. 그 다음, 표적물질을 함유한 복합 혼합물을 상기 크로마토그래피 칼럼에 적용한다. 이상적으로는, 리간드를 특이적으로 인식하는 표적분자만이 비공유적으로 크로마토그래피 칼럼에 결합하고, 상기 샘플에 존재하는 다른 모든 분자종들은 칼럼을 그냥 통과한다.
친화성 분배에 있어서, 실질적으로 다른 밀도를 갖는 두 용액을 이용한다. 친화성 리간드를 함유하는 다른 밀도의 용액과 표적분자를 포함하는 복합 용액을 혼합한다. 혼합에 이어서, 두 개의 분리된 상을 형성하기 위해서 상기 용액을 방치한다. 분자의 크기, 전하 및 상형성 용액과의 특이적인 상호작용에 따라 두가지 상사이에 차등적으로 분자들이 분배된다. 표적 단백질에 결합된 리간드는 선택적으로 친화성 리간드를 함유하는 상으로 분배된다. 예를 들면, Coughlin 와 Baclaski는 Biotechnology Progress, 1990 6:307-309에서는, 수용액에서 이소옥탄 용액으로 아비딘(avidin)을 전달하는 이소옥탄 유기용매를 함유하는 바이오틴의 용도를 보고하고 있다. 그러나, 주로 이상(two phase) 시스템에서 선택적 분배에 적용될 수 있는 적합한 친화성 매트릭스 물질을 이용할 수 없었기 때문에, 이제까지 친화성 분배의 적용이 제한되었다. 생물공학의 산업적 개발에 있어서 중요한 인자는 생물산물의 정제이며, 정제비용은 일반적으로 전체 비용의 50%이상을 차지한다(Labrou, N. and Clonis, Y.D.의 Journal of Biotechnology 36: 95-119 (1994)). 다수의 단백질 정제단계는 칼럼 유형 분리 과정에 의존한다. 더욱 자세하게는, 칼럼 크로마토그래피나 배치형에 기초한 단백질 정제기술과 같은 대규모 고-분리 기술은 비싸다. 추가로, 오염물질이 침전된 수지 및 플럭 칼럼을 망치기 때문에, 조물질(crude material)은 칼럼크로마토그래피나 배치 분리에는 덜 적합하다. 따라서, 종종 친화성 매트릭스는 실질적으로 순도가 매우 중요한 경우, 단백질이 매우 묽은 농도로 존재하는 경우, 또는 고가치 단백질이 필요한 경우 예를 들면 진단용이나 치료용 단백질등의 경우와 같은 정제공정의 후기 단계에만 사용된다. 생물공학 공정에서 친화성 기술의 용도와 관련된 이러한 주제와 다른 주제를 Labrou, N. 및 Clonis, Y.D.가 Journal of Biotechnology 36L 95-119(1994)에서 검토하고 있다.
상기 기술에서 복합 혼합물에서부터 생물학적 산물을 분리 및 정제하는 신규하고도 경제적인 방법을 개발할 필요성이 있다. 본 발명자들은 기름체라고 알려진 세포이하수준의 기름 저장구조 및 이들의 관련 단백질이 이러한 점에서 유용하다는 것을 발견했다.
발명의 요약
본 발명은 친화성 매트릭스의 생산을 위한 다양한 용도를 갖는 신규한 생물학적 시스템에 관한 것이다. 본 발명자들은 다양한 표적분자, 예를 들면 단백질, 탄수화물, 지질, 유기분자, 핵산, 금속, 세포 및 새포분획등을 샘플로부터 분리하기 위한 친화성 매트릭스로 기름체와 이의 결합단백질을 사용할 수 있음을 알았다.
본발명에 따라서, 다음과 같은 단계로 이루어진, 샘플로부터 표적분자를 분리하기 위한 방법을 제공한다: 1) i) 표적분자와 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있는 기름체와 ii) 표적분자를 포함하는 샘플을 접촉하고; 2) 표적분자와 결합한 기름체를 샘플로부터 분리한다. 표적분자를 포함하는 샘플과 기름체를 표적분자에 기름체가 결합할 수 있는 충분한 방식으로 접촉시킨다. 바람직하게는, 기름체를 표적분자와 혼합한다. 원한다면, 추가로 표적분자를 기름체로부터 분리할 수도 있다.
일예에서, 표적분자는 기름체 또는 기름체 단백질에 친화성이 있거나 직접 결합한다. 그러한 표적분자의 예로는 기름체에 결합가능한 다른 단백질이나 항체가 포함된다.
또다른 일예에서, 기름체와 표적분자를 결합시키기 위해서 리간드 분자를 사용할 수도 있다.
일예에서, 리간드는 기름체나 기름체 단백질에 대해 본질적인 친화성을 가진다. 구체적인 예에서, 리간드는 기름체 단백질에 결합하는 항체이다. 그러한 항체는 항-IgG 항체 또는 단백질 A와 같은 리간드 항체에 대한 친화성을 갖는 표적분자를 분리하기 위해서 사용할 수도 있다. 또한 기름체 단백질과 표적분자 모두에 대해 결합 특이성을 갖는 이가 항체를 제조할 수도 있다. 표적분자에 대한 친화성을 갖는 두 번째 리간드에 기름체 단백질에 대한 항체를 융합시킬 수도 있다.
또다른 일예에서, 리간드는 기름체나 기름체 단백질에 공유결합으로 결합한다. 일예에서, 리간드는 화학적으로 컨쥬케이트(conjugated)되거나 기름체 단백질과 융합단백질로서 제조되는 단백질이다(WO 96/21029에 기재되어 있음). 후자의 경우에, 융합 단백질은 기름체로 표적화되어 발현된다. 일예에서, 기름체 단백질에 융합된 리간드는 히루딘일 수 있으며 트롬빈을 정제하기 위해서 사용될 수 있다. 또다른 예에서, 기름체 단백질에 융합된 리간드는 메탈로티오네인(metallothonein)일 수 있으며 이는 샘플로부터 카드뮴을 분리하기 위해서 사용될 수 있다. 추가의 예에서, 기름체 단백질에 융합된 리간드는 단백질A일 수 있으며 이는 이뮤노글로불린을 분리하기 위해서 사용될 수 있다. 또다른 예에서, 기름체 단백질에 융합된 리간드는 단백질에 결합된 셀룰라제일 수 있으며 이는 샘플에서부터 셀룰로스를 분리하는데 사용될 수 있다.
또다른 일예에서, 리간드는 기름체에 공유결합으로 부착될 수 있다. 예를 들면, 리간드는 바이오틴과 같은 작은 유기분자일 수 있다. 따라서, 본 발명은 리간드 분자 또는 표적분자와 같은 분자에 결합된 기름체를 포함하는 조성물을 포함한다. 일예에서, 상기 조성물은 바이오틴과 같은 리간드 분자에 공유적으로 부착된 기름체를 포함한다.
또한, 본발명은 표적분자와 결합할 수 있는 기름체를 포함하는, 샘플로부터 표적분자의 분리용 친화성 매트릭스를 포함한다. 상기 친화성 매트릭스는 추가적으로 기름체와 결합된 리간드를 포함하며, 여기서 리간드 분자는 표적분자와 결합할 수 있다.
본발명의 다른 목적, 특징 및 잇점은 다음의 상세한 설명 및 첨부된 도면으로부터 더욱 명백해질 것이다. 그러나, 상세한 설명과 실시예는 단지 예시로서 제공된 것이며, 그에 대한 다양한 변화와 변형은 본 기술분야의 당업자에게 명백할 것이다. 추가로. 본명세서에서 여러 가지 문헌, 특허공보 및 특허출원을 그 전체로서 명세서에 참고문헌으로 병합하였다.
도 1은 SEQ ID NO:1및 SEQ ID NO:2에 나타난 것과 같이, Arabidopsis thaliana의 18KDa 올레오신의 뉴클레오타이드 및 유추된 아미노산서열을 나타낸다.
도 2는 Arabidopsis 올레오신-히루딘 융합체의 서열을 나타낸다. 표시는 올레오신 게놈 서열의 일부(van Rooijen et al 1992, Plant Mol. Biol. 18:1177-1179에서 보고된 염기 1-1620), 스페이서 서열(밑줄을 그은 부분은 염기 1621-1635) 및 성숙 히루딘 변형체-2 이소형태(isoform)을 코딩하는 합성 DNA을 나타낸다. 이 융합 유전자는 Arabidopsis 올레오신(염기 1-861)과 노팔린 합성효소(synthase) 종료 서열(염기 1855-2109)의 5' 상류영역에 의해서 조절된다. 또한 상기 서열은 SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:4로 나타낸다.
도 3은 전체 올레오신-히루딘 구조물을 함유하는 pCGOBHIRT의 제조 단계의 개요를 나타낸다.
도 4는 기름체에서 올레오신-히루딘 융합 단백질의 배열(configuration)과 이의 트롬빈에 결합을 설명하는 개략적인 흐름도이다.
도 5는 올레오신-히루딘 융합체를 발현하는 구조물로서 야생형 및 4A4 기름체 매트릭스로부터 트롬빈의 NaCl용출양상을 나타낸다.
도 6은 리간드로서 항-올레오신 항체를 사용하여 항-IgG 항체에 컨주게이트된 호스래디쉬 퍼옥시다제의 정제를 나타낸다. 또한 기름체에 결합한 올레오신/항-올레오신/항-IgG 샌드위치 복합체의 구조를 예시하는 개략적인 흐름도를 나타낸다.
도 7은 리간드로서 1차 항-올레오신 항체와 복합체를 형성한 야생형 기름체에 항-IgG항체의 특이적인 결합(왼쪽)과 2차 항체와 결합하기 전에 1차 항체와 복합체를 형성하지 않은 기름체에 항-IgG 항체의 결합(오른쪽)을 나타낸다.
도 8은 올레오신-메탈로티오네인 융합체의 서열을 나타낸다. B. napus 올레오신 cDNA의 코딩서열(염기 1092-1652,van Rooijen, 1993, Ph.D. Thesis, University of Calgary), 스페이서 서열(염기 1653-1670, 밑줄로 표시), 및 사람의 메탈로티오네인 유전자 mt-II(염기 1671-1876, Varshney and Gedanu, 1984, Gene, 31:135-145)을 나타낸다. 상기 융합유전자는 Arabidopsis 올레오신 프로모터(염기 1-1072) 및 유비퀴틴 종료서열(염기 1870-2361, ubi3'; Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Biol. 31: 673-684)에 의해서 조절된다. 이 서열은 또한 SEQ ID NO:6 및 SEQ ID NO:7에서 나타낸다.
도 9는 전체 올레오신-메탈로티오네인 구조를 포함하는 pBIOOM3'의 제조에 사용된 단계의 개요를 나타낸다.
도 10은 기름체상에서 올레오신-메탈로티오네인 융합 단백질의 구조 및 카드뮴 이온의 결합을 설명하는 개략적인 흐름도이다.
도 11은 올레오신-메탈로티오네인 융합 유전자를 발현하는 구조물로 형질전환된 B. carinata 종자와 야생형 B.carinata 종자로부터 얻은 기름체 매트릭스에 대한 카드뮴의 결합(A)과 용출(B)을 나타낸다. 트랜스제닉 종자와 형질전환되지 않은 종자로부터 수확된 기름체 부분의 기름체부에 결합된 카드뮴의 퍼센트를 나타낸다. 막대는 5 복제 실험(결합) 과 3 복제 실험(용출)의 평균값을 나타낸다.
도 12는 다양한 양의 항-올레오신 IgGs로 처리한 기름체에 대한 S.aureus 세포에서 발현되는 단백질A의 결합을 나타낸다. 막대는 실시예 5에서 기재된 과정에서 얻어지는 OD600값과, 다양한 양의 IgGs(첨가된 IgG양 0㎕,3㎕ 30㎕, 100㎕)의 사용을 나타낸다.
도 13은 S.aureus 단백질 A(서열은 SEQ ID NO:8과 SEQ ID NO:9에 나타낸다) 서열의증폭에 사용된 올리고뉴클레오타이드를 나타낸다. 프라이머 DK266, 5'C TCC ATG GAT CAA CGC AAT GGT TTA TC3'(SEQ ID NO:10), NcoI 자리(이탤릭체) 및 벡터 pRITZ2T(Phamacia)내에 포함된 단백질 A유전자의 상보적 서열(밑줄을 그음)을 나타낸다. 프라이머BK267, 5'GC AAG CTT CTA ATT 슛 TAT CTG CAG GTC3'(SEQ ID NO:11), HindIII자리(이탤릭체), 종료 코돈(진한체) 및 pRIT2T(Phamacia)내에 포함된 단백질 A유전자의 일부분에 대한 상보적 서열(밑줄을 그음)을 나타낸다. PCR산물을 NcoI 및 HindIII로 분해하고 pCGNOBPGUSA(Van Rooijen and Moloney, 1995, Plant Physiol. 109:1353-1361)에 접합하고 그로부터 NcoI-GUS-HindIII단편을 제거한다.
도 14는 Arabidopsis 올레오신-단백질 A의 융합 서열(이 서열은 SEQ ID NO:12에 있고 단백질 서열은 SEQ ID NO:13과 14에 있다)을 나타낸다.
게놈 올레오신 서열의 일부(염기 1-1626, 이는 Van Rooijen 등의 1992 Plant Mol. Biol. 18:1177-1179에 보고되어 있다), 트롬빈 절단 자리를 코딩하는 스페이서 서열(염기 1627-1647, 밑줄을 그음) 및 단백질 A를 코딩하는 DNA서열(염기 1648-2437, 이탤릭체)을 나타낸다. Arabidopsis 올레오신의 5' 상류영역(염기 1-867)과 노팔린 합성효소의 종료영역(염기 2437-2700)에 의해서 발현이 조절된다.
도 15는 기름체상에서 올레오신-단백질 A의 융합 단백질구조 및 이뮤노글로불린의 결합을 나타내는 개략적인 흐름도이다.
도 16은 올레오신-단백질A의 융합 단백질을 발현하는 트랜스제닉 B.napus주에서 얻은 기름체 단백질 추출물에 대한 HRP-컨쥬게이티드 마우스 항-토끼 항체의 결합을 나타내는 웨스턴 블랏이다. HRP-컨쥬게이티드 항체로 찾은 웨스턴 블랏상에서 트랜스제닉주로부터 기름체 단백질 추출물, opa 30(3레인), opa 31(4레인), opa 34(5레인), opa 36(6레인), opa 47(7레인), opa 93(8레인)이며 모두는 올레오신-단백질 A 융합 단백질을 발현하며, 대조구는 B.napus주(레인9)에 의해서 형질전환되지 않은 것이며, 또한 단백질 A(2레인)을 발현하는 pRIT2T로 형질전환된 E.coli DH5α(2레인)과 형질전환되지 않은 E.coli DH5α을 나타낸다.
도 17은 야생형 B.napus(bn wt)와 올레오신 단백질 A 융합 단백질을 발현하는 트랜스제닉 B.napus세포주에서 분리된 기름체에 대해 IgGs의 결합과 용출을 나타낸다. 오차 막대는 4 독립적인 실험에서 얻은 결과를 나타낸다.
상기에서 언급한 바와 같이, 본 발명은 기름체와 이들의 관련 단백질을 이용하는 신규한 생물학적 친화성 매트릭스 시스템에 관한 것이다. 친화성 매트릭스는 단백질, 탄수화물, 지질, 핵산, 세포 및 세포기관, 금속 및 이온들을 포함하는 구체적인 표적을 샘플로부터 고효율로 분리하는데 적합하다.
본 발명은 1) ⅰ) 표적 분자와 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있는 기름체와 ii)표적분자를 포함하는 샘플을 접촉시키고, 2) 표적분자에 결합된 기름체를 샘플로부터 분리하는 것으로 이루어지는, 샘플로부터 표적분자를 분리하는 방법을 제공한다. 기름체가 표적분자에 결합할 수 있는 충분한 방식으로 표적분자를 함유하는 샘플과 기름체를 접촉시킨다. 바람직하게는, 기름체를 표적분자와 혼합한다. 표적분자와 기름체 모두에 결합할 수 있는 리간드 분자를 사용함으로써 표적분자와 기름체의 간접적인 결합을 효과적으로 한다. 따라서 리간드는 기름체와 표적분자의 다리역할을 하거나 결합을 하도록 한다. 원한다면, 표적분자를 기름체와 리간드로부터 추가로 분리할 수 있다.
친화성 매트릭스의 각 성분을 다음에서 차례대로 설명한다.
표적분자
"표적(target)"이란 용어는 본명세서에서 생물학적 혼합물과 같은 샘플로부터 분리, 정제하기를 원하는 분자를 말한다. 이러한 기술은 리간드를 얻을 수 있는 어떠한 표적, 또는 기름체나 기름체 단백질에 직접적으로 결합할 수 있는 어떠한 표적에도 사용할 수 있다. 가능한 리간드/표적쌍은 다음이 포함되며 이에 한정되는 것은 아니다: 단백질 서브유니트/서브유니트 조합, 항체/항원, 수용체 단백질/신호분자, 핵산 결합 단백질/핵산; 레시틴/탄수화물; 지질 결합 단백질/지질; 이온결합단백질/이온; 및 표적 에피토프에 결합하는 리간드/세포나 세포기관. 표적은 어떠한 자연원에서부터 얻을 수 있으며 화학적으로 합성할 수도 있다. 만약 표적이 단백질이나 핵산과 같은 거대분자라면, 박테리아, 이스트, 식물, 곤충, 포유동물들과 같은 적합한 어떠한 발현시스템을 사용하여 재조합 형태로 생산할 수 있다.
리간드
"리간드(ligand)"라 함은 본명세서에서 표적분자 및 기름체나 기름체 단백질(다음에서 설명할 것임) 모두와 결합할 수 있는 분자를 말한다. "결합하는(associate with)"라 함은 본명세서에서 기름체나 표적분자에 리간드가 공유결합 또는 비공유결합으로 결합한 모두를 포함한다. 예를 들면, 리간드분자는 기름체에 공유적으로 결합하고 표적분자(기타 등등)에 비공유적으로 결합할 수 있으며, 또는 리간드는 기름체와 표적분자 모두에 비공유적으로 결합할 수 있다. 리간드는 기름체나 기름체 단백질과 표적분자를 연결할 수 있는 어떠한 분자일 수 있으며, 단백질, 핵산, 탄수화물 또는 작은 유기분자를 포함할 수 있다. 리간드는 기름체와 결합하는 첫 번째 분자와 표적분자와 결합하는 두 번째 분자로 이루어질 수 있으며, 여기서 첫 번째 분자와 두 번째 분자는 서로간에 결합한다.
이 기술에 사용된 친화성 리간드인 단백질은 위에서 열거한 것과 같이 리간드 쌍으로 알려진 자연적으로 존재하는 것에서 유래될 수 있다. 또는, 세포나 생물체로부터 추출되거나, 화학적으로 합성되거나, 조합된 펩타이드 서열, 항체 또는 발현된 DNA서열로 이루어지는 라이브러리에서 생산된 단백질을 선별함으로써 리간드를 얻을 수 있다.
일예에서, 리간드는 기름체나 기름체 단백질에 본질적인 친화성을 가진다. 예를 들면, 리간드는 기름체 단백질에 대한 친화성을 갖는 항체와 같은 단백질일 수 있다. 또한 리간드는 기름체나 기름체 단백질에 대한 본질적인 친화성을 갖는 단백질이외의 분자일 수 있다. 기름체나 기름체 단백질에 결합할 수 있는 그러한 리간드는 표적분자와 결합할 수 있는 두 번째 분자와 결합할 수 있다. 예를 들면, 리간드 분자는 아비딘에 컨주케이트된 항체일 수 있고 샘플로부터 바이오틴을 정제하기 위해서 사용될 수 있다.
또다른 예에서, 리간드는 기름체와 기름체 단백질에 화학적이나 재조합 수단에 의해서 공유적으로 결합한다. 융합체나 컨쥬게이트를 제조하기 위한 화학적 방법은 본 기술분야에서 알려져 있으며 리간드-기름체 단백질 융합체를 제조하기 위해서 사용될 수 있다. 리간드와 기름체를 접합시키기 위한 방법은 표적분자에 대한 리간드의 결합능을 방해하지 않으면서 기름체 단백질에 리간드를 접합시킬 수 있어야 한다. 일예에서, 리간드는 기름체에 공유적으로 부착될 수 있는 바이오틴과 같은 작은 유기분자일 수 있다. 샘플로부터 아비딘을 분리하기 위해서 바이오틴화된 기름체를 사용할 수 있다. 또한 본발명은 바이오틴화된(biotinylated) 기름체와 같이 변형된 기름체를 친화성 매트릭스로 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 리간드나 표적분자와 같은 분자에 부착된 기름체로 이루어지는 조성물을 포함한다.
바람직한 예에서, 리간드는 단백질이고 본 기술분야에서 잘 알려진 기술을 사용하여 기름체 단백질에 접합할 수 있다. 두 단백질을 접합하는데 사용될 수 있는 교차링커는 수백가지가 있다(예들들면, "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", 1991, Shang Wong, CRC Press, Ann Arbor를 참조). 일반적으로 리간드에 삽입되거나 이용가능한 반응성 작용기에 근거하여 크로스링커(cross linker)를 선택한다. 추가로, 반응성 작용기가 없다면 광반응성 크로스링커를 사용할수 있다. 일예에서, 리간드와 기름체 단백질상이에 스페이서를 포함하는 것이 바람직할 수도 있다. 본 기술분야에서 교차결합을 위한 시약으로는 동일한 이작용기(homobifunctional) 작용제: 글루탈알데히드, 디메틸아디피미데이트 및 비스(디아조벤지딘)과 다른 이작용기(heterobifunctional) 작용제: m-말레이미도벤조일-N-히드록시석시니미드 및 설포-m-말레이미도벤조일-N-히드록시석시니미드가 포함된다.
재조합 DNA 기술을 사용하여 리간드 단백질-기름체 단백질 융합체를 제조할 수 있다. 이러한 경우에 리간드를 코딩하는 DNA서열을 기름체 단백질을 코딩하는 DNA서열에 융합하여, 그 결과로 리간드-기름체 단백질 융합 단백질(아래에서 매우 자세힌 논의될 것이다)을 발현하는 키메릭 DNA 분자가 된다. 재조합 융합 단백질을 제조하기 위해서는, 리간드를 코딩하는 DNA서열을 알거나 입수할 수 있어야 한다. 단백질의 리간드의 결합 도메인을 코딩하는 서브서열을 안다면 리간드의 전체 서열을 이용할 필요는 없다. 따라서, 리간드는 문제의 구체적인 리간드 단백질로의 결합도메인이거나 완전한 서열을 포함할 수도 있다. 원하는 리간드의 DNA서열이 알려져 있다면, 올리고뉴클레오타드 합성기로 이 유전자를 화학적으로 합성할 수도 있다. 또는, 표지된 상보적 DNA서열로서 탐침하여 상기 유전자를 포함하는 게놈 라이브러리나 cDNA로부터 상기 리간드 유전자를 운반하는 클론을 얻을 수도 있다. 유전자-특이적 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 PCR를 사용하여 라이브러리로부터 상기 유전자를 특이적으로 증폭할 수도 있다. 만약 원하는 리간드의 DNA 서열이 알려져 있지 않다면, 단백질의 N-말단에서 부분적인 아미노산서열을 얻을 수 있다(matsudaira 1987, J. Biol. Chem. 262:10035-10038). 이 아미노산 서열에서 유추된 DNA서열에 근거하여 표지된 프로브를 합성하여 상술한 바와 같이 게놈 라이브러리나 cDNA를 스크리닝하는데 사용할 수 있다. 단백질 리간드에 대한 항체나 표적 단백질을 프로브로 사용하여 cDNA 발현 라이브러리에서부터 상기 유전자를 운반하는 클론을 동정할 수도 있다.
표적을 프로브로 하여 단백질 혼합물을 탐침함으로써 리간드를 찾을 수도 있다. 표적을 지지체 매트릭스에 고정하여 세포와 조직에서 추출되거나 화학적으로 합성된 단백질을 스크리닝하는데 사용할 수 있다. 리간드 단백질과 고정화된 표적간에 결합에 이어서, 매트릭스를 용액에서 분리하고 세척한다. 그후에 매트릭스에서부터 단백질 리간드를 용출하고 상술한 바와 같이 서열을 결정한다. 또는, 조합 펩타이드 서열(Smith, 1985; Science 228:1315-1317) 또는 항체 레퍼토리(Griffiths et al., 1994, EMBO J. 13:3245-3260, Nissim et al., 1994, EMBO J. 13: 692-698)로 이루어진 것과 같은 파지 디스플레이(phage display)에 의해 생산된 재조합 단백질 라이브러리를 고정화된 작용제로 스크리닝할 수 있다. 이 경우에, 단백질 리간드와 표적간에 결합에 의해 비결합 단백질을 코딩하는 크고 복합적인 파지집단에서부터 리간드를 발현하는 파지를 분리 및 회수할 수 있다. 발현된 cDNA라이브러리로부터 리간드를 동정하기 위해서 이스트(yeast)에 대한 것(Fields and Sternglanz, 1994; Trends Genet. 10:286-292)과 같은 두-하이브리드 시스템을 사용될 수 있다. 여기서, 표적 단백질을 코딩하는 서열 및 DNA결합 단백질을 코딩하는 서열사이에 유전자 융합을 제조한다. 이러한 구조물을 포함하는 세포를 전사활성자의 서열에 융합된 상기 서열을 가지는 cDNA라이브러리에서 얻은 구조물로 형질전환시킨다. cDNA에서 유래된 리간드와 표적 단백질을 결합함으로써 리포터 유전자의 전사를 가능하게 한다. 그런 다음 리간드를 발현하는 클론을 회수한다.
기름체에 대한 리간드를 특이적으로 발견하기 위해서, 완전한 또는 부분적인 올레오신 단백질을 상기 방법중 어느 것에서 표적분자로 사용할 수 있다. 또는, 단백질 추출물, 합성 펩타이드, 또는 파지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하기 위해서 완전한 기름체를 사용할 수도 있다. 이 경우에, 상기 기름체는 표적과 고정화 매트릭스모두로 작용할 것이다. 이러한 접근법을 사용함으로써, 더 다양한 리간드를 찾을 수 있다; 올레오신뿐만 아니라 기름체에 존재하는 다른 에피토프에 대한 친화성을 갖는 리간드를 찾을 수 있다.
기름체 및 기름체 단백질
기름체는 저장된 트리아실글리세라이드를 캡슐화하는 작은 구형의 세포기관이다. 많은 식물에서 에너지 저장소로 사용된다. 기름체가 대부분의 식물이나 여러 가지 조직에서 발견되지만, 직경이 마이크론에서 수 마이크론 크기인 기름 종자에 특히 풍부하다. 기름체는 포스포리피드의 1/2 유니트에 의해서 둘러싸여 있고 기름체 단백질이라 알려진 독특한 유형의 단백질에 파묻혀 있는 트리아실글리세라이드로 이루어진다. "기름체(oil body)" 또는 "기름체들(oil bodies)"란 본명세서에서 사용하는 바와 같이, 완전한 구조체에 존재하는 어떠한 또는 모든 트리아실글리세라이드, 포스포리피드 또는 단백질을 포함한다. "기름체 단백질(oil body protein)"이라 함은 본명세서에 사용되는 바와 같이, 기름체에 자연적으로 존재하는 단백질을 의미한다. 식물에서, 지배적인 기름 단백질을 "올레오신"이라 한다. 옥수수, 평지T. 당근 및 면화를 포함하는 많은 식물원에서 올레오신을 클론닝하고 서열을 분석하였다. 올레오신 단백질은 3개의 도메인으로 이루어진다; 단백질의 두 말단, 즉 N-말단과 C-말단은 주로 친수성이고 기름체의 표면에 있어 세포질쪽으로 노출되어 있으며, 반면에 고도로 소수성인 올레오신의 중앙핵은 세포막과 트리글리세라이드내에서 단단히 고정되어 있다. 여러 가지 종에서 유래된 올레오신은 아미노산 서열의 상당한 보존성을 나타내는 단백질의 작은 패밀리를 나타내며, 특히 단백질의 중앙부분에서 아미노산의 보존성을 나타낸다. 각각의 종내에서, 작은 수의 여러 가지 이소형태가 존재한다.
개개의 종에서 유래된 기름체들은 대개 일정한 형태의 크기와 밀도를 나타내며, 크기와 밀도는 단백질/포스포리피드/트리아실글리세라이드 정확한 조성물에 부분적으로 의존적이다. 결론적으로, 이들이 현탁된 액체에서 다른 밀도로부터 간단하고도 빨리 분리될 수 있다. 예를 들면, 매질의 밀도가 기름체의 것보다 큰 수용성 매질에서는, 이들은 중력이나 적용된 원심력의 영향하에서 뜨게 될 것이다. 밀도가 기름체보다 낮은 95% 에탄올에서, 동일한 조건에서 가라앉게 될 것이다. 또한, 크기로 분별하는 방법에 의해서 용액이나 현탁액에 존재하는 액체나 다른 고형물로부터 기름체를 분리할 수 있다. 예를 들면, B.napus에서 유래된 기름체는 약 0.5㎛로 최소이므로, 막공의 크기가 이들 직경보다 작은 막필터를 사용하여 더 작은 성분을 분리할 수도 있다.
본 발명의 기름체는 종자 식물에서 얻는 것이 바람직하고, 다음 그룹의 식물종에서 얻는 것이 더욱 바람직하다: 탈레 크레스(Arabidopsis thatliana), 평지씨(Brassica spp.), 대두(Glycine max), 해바라기(Helianthus annuus), 기름야자나무(Elaeis guineeis), 면화씨(Gossypoum spp.), 땅콩(Arachis hypogaea), 코코넛(Cocus nucifera), 캐스터(Ricinus communis), 잇꽃(Carthamus tinctorius), 겨자(Brassica spp. and Sinapis alba), 고수풀(Coriandrum sativum), 아마씨/아마(linum uoitatissimum), 및 옥수수(Zea mays). 식물을 재배하고 본 분야의 기술분야에서 잘 알려진 농작물 재배 기술을 이용하여 종자를 생산한다. 종자를 수확한 후에 종자외피등과 같은 외부물질을 예를 들면 체로 걸려 제거한 후에, 종자를 건조하는 것이 바람직하며, 이어서 기계적인 압착, 빻기, 또는 파쇄하여 처리한다. 원심분리와 같은 기름체 부분과 수용성 부분간의 밀도차이를 이용하는 분리기술이나, 막여과와 같은 크기에 기초한 분리기술, 또는 양자를 조합하여 파쇄된 종자부분으로부터 종자부분을 얻는다. 일반적으로, 5배 부피의 차가운 수용성 완충액에서 완전히 종자를 빻는다. 아세톤 또는 디에틸에테르와 같은 강한 유기용매는 기름체를 파괴하므로 완충액 조성물이 강한 유기용매를 고농도로 함유하지 않는다면, 다양한 완충액 조성물을 사용할 수 있다. 다름에 기재된 것과 같이 세척을 용이하게 하기 위해서 분쇄 완충액의 밀도를 0.4-0.6M 수크로스를 첨가하여 증가시킬 수 있다. 또한 분쇄 완충액은 일반적으로 0.5M NaCl을 함유하여 기름체 표면에 완전히 결합되지 않은 수용성 단백질을 제거하는 것을 돕는다.
분쇄한 다음, 균질액을 원심분리하여 펠렛 입자와 불용성물질, 종자의 수용성 성분을 포함하는 수용성상, 및 결합된 단백질을 갖는 기름체로 이루어지는 표면층이 된다. 기름체 층을 표면에서 걷어내서 신선한 1배 부피의 분쇄 완충액으로 완전히 재현탁시킨다. 후속의 세척단계에서 오염물을 효과적으로 제거하기 위해서 가능한한 완전하게 기름체의 집합체를 분해하는 것이 중요하다. 재현탁된 기름체 조성물을 더 낮은 밀도를 갖는 부유 용액(예, 물, 수용성 완충액)하에서 층을 만들고 다시 원심분리하여 기름체와 수용액 상을 분리한다. 이러한 세척 과정을 적어도 3회 반복한 후에, 겔 전기영동으로 수용성 오염 단백질이 충분히 없다고 인정된다. 모든 수용액상을 제거할 필요는 없으며, 만약 그렇게 하려면 최종 수용액 조성물에 50mM Tris-HCL pH 7.5를 첨가하고 pH 2.0으로 낮추거나 pH 10으로 올린다. 기름종자에서 기름체를 분리하는 프로토콜은 Murphy, D. J. and Cummins I., 1989, Phytochemistry, 28L 20623-2069; 와 Jacks, T.J.등의 1990, JAOCS, 67L 353-361에 있다. 바람직한 프로토콜은 본 명세서의 실시예 1에 자세히 기재되어 있다.
또한 식물에서 유래된 기름체이외의 기름체도 본발명에 사용할 수 있다. 식물 기름체 및 올레오신과 기능적으로 동등한 시스템이 박테리아에서 기술되어 있고(Pieper-Furst et al., 1994, J. Bacteriol. 176L4328), 조류에서(Rossler, P.G., 1988, J. Physiol.(London)24L 394-400) 및 곰팡이에서(Ting, J. T. et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:3699-3706)에 기재되어 있다. 이들 생명체에서 유래된 기름체이외에, 본 기술분야의 전문가에 의해서 다른 생물세포에서 발견될 수 있는 것도 또한 본발명에 따라 사용할 수 있다.
친화성 매트릭스
상술한 바와 같이, 본 발명은 샘플에서부터 표적분자를 정제하기 위한 신규한 친화성 매트릭스 시스템을 제공한다. 일예에서, 친화성 매트릭스는 샘플에 있는 표적분자에 결합할 수 있는 기름체을 포함한다. 이러한 예에서, 표적분자를 기름체 단백질에 결합할 수 있는 항체일 수 있다. 또다른 예에서, 친화성 매트릭스는 기름체나 기름체 단백질에 결합할 수 있으며 표적분자에 친화성을 갖는 리간드 및 기름체나 기름체 단백질을 포함한다. 이러한 예에서, 리간드는 기름체나 기름체 단백질에 공유적으로나 비공유적으로 결합할 수 있다(이전에 상술함)
본 발명의 장점은 기름체와 비공유적인 결합에 이어서 기름체의 분리를 함으로써 샘플로부터 표적물질을 정제하거나 제거할 수 있다는 것이다. 다수의 다른 기름체-리간드 배합을 사용할 수 있다. 트롬빈에 대한 히루딘 또는 메탈로티오네인에 대한 중금속등과 같이 특이한 리간드 단백질에 대해 본질적인 친화성이 없는 표적물질을 올레오신에 융합된 리간드를 함유하는 기름체로 정제 또는 분리할 수 있다. 또는, 올레오신에 융합된 것에 상보적인 리간드 또는 기름체-특이적 리간드에 표적물질을 융합함으로써 기름체 친화성 매트릭스로 표적 단백질을 분리 또는 정제할 수도 있다. 원한다면, 정제과정에서 표적 단백질로부터 리간드의 단백질 분해적(proteolytic) 제거를 가능하게 하도록 리간드와 표적 단백질간에 프로테아제 인식자리 또는 화학적 절단 자리를 가공할 수도 있다. 이가 단일 사슬 항체 리간드에서 리간드중 제 1 도메인은 기름체에 친화성을 가지고 다른 도메인(들)은 표적분자에 대한 친화성을 갖는 것과 같은 다가 리간드를 제조할 수 있다. 이러한 경우에, 기름체나 포적분자는 리간드에 공유적으로 융합된 필요는 없다. 또한 표적에 대한 매트릭스의 친화성을 증가시키기 위해 리가드의 연쇄체를 사용할 수 있으며, 표적에 대한 친화성을 조절하는 것이 바람직한 조건이라면 이를 위해 리간드의 서열을 돌연변이시킬 수 있다. 추가로, 다른 유형의 표적을 동시에 제거/회수하기 위하여 여러 가지 리간드의 혼합물을 융합할 수도 있다. 여러 가지 유형의 표적간에 또는 표적과 기름체 친화성 매트릭스간에 연결을 형성하기 위하여 여러 가지 리간드가 융합체를 형성할 수 있다. 또한 폴리히스티딘 서열간에 Zn2+ 연결과 같이 리간드간에 또는 리간드와 표적서열간에 연결을 형성함으로써 친화성 매트릭스에 대한 결합을 달성할 수 있다.
기름체 친화성 매트릭스가 정제도구로서의 매력적인 용도에 관련된 몇가지 잇점이 있다. 위에서 기술한 여러 가지 배열을 통해 가능한 디자인의 유동성으로 인해, 구체적 표적에 대한 요건을 최상으로 만족시키기 위해 매트릭스를 제조할 수 있다. 리간드의 정제와 고정화가 불필요하기 때문에, 종자에서 자연적인 생물학적 과정의 일부로서 매트릭스를 제조하는 것은 비용이 매우 절감된다. 올레오신-리간드 융합의 경우에, 세포내에서 올레오신의 표적화의 결과로 기름체상에 리간드가 고정화되며, 기름체-특이적 리간드가 복합 혼합물에 존재하는 매트릭스에 자연적으로 결합할 것이다. 매트릭스상에 자연적으로 리간드가 고정화됨은 또한 표적에 대한 리간드의 친화성을 저해할 수도 있는 화학적 교차결합에 대한 요건을 제거할 수 있다는점에서 장점이 된다. 마지막으로, 기름체 친화성 매트릭스는 특히 대규모 조작엣 유일하고 매력적인 정제 방법을 제공한다. 묽은 현탁액으로서 부류를 통해 매트릭스를 분리하는 능력으로 인해 입자 오염물의 방해량이 될 수 있을 것을 함유하는 조물질에 사용할 수 있다. 이러한 오염물의 존재는 정제공정중 초기단계에 적용이 제한되는 칼럼이나 배치 현탁액에 적용된 종래의 고체 매트릭스를 방해하거나 더럽힐 수 있다.
이전에 언급한 바와 같이, 본 발명의 일예에서 리간드 단백질 서열을 기름체 단백질에 유전적으로 융합한다. 이러한 유전적 융합체를 제조하기 위해서, 기름체 단백질-리간드 융합 단백질을 코딩하고, (1) 융합 단백질을 기름체로 표적화하기에 충분한 부분의 기름체 단백질을 코딩하는 DNA서열과 (2)표적분자의 결합을 제공하기에 충분한 기름체 단백질의 부분을 코딩하는 DNA서열로 이루어지는 키메릭 DNA서열을 제조한다. 일반적으로 기름체 단백질의 N-말단과 소수성 핵이 융합 단백질을 기름체로 표적화에 충분하다는 것을 발명자들이 결정했다. 더욱 자세하게는, 식물 Arabidopsis thaliana 아미노산 2 내지 123(SEQ ID NO:1에 나타냄)에서 유래된 올레오신이 이러한 측면에 충분하다.
리간드는 올레오신의 N-말단이나 C-말단에 융합할 수 있다. 또한 리간드와 올레오신간에 내부의 융합을 제조하거나, 두 올레오신 단배질사이에 리간드를 융합하는 것도 가능하다. 리간드에 융합된 기름체 단백질을 코딩하는 키메릭 DNA 서열을 적합한 벡터에 감염시켜 식물을 형질전환하는데 사용하였다. 두 유형의 벡터가 일반적으로 사용된다. 첫 번째 유형의 벡터는 유전공학 및 구조물의 조합을 위해서 사용되며 일반적으로 pUC패밀리의 벡터에서 발견되는 뼈대구조로 이루어져서 E.coli와 같은 쉽게 조작할 수 있고 유지될 수 있는 그램 음성 박테리아에서 복제할 수 있다. Ti 및 Ri플라스미드로 분류되는 두 번째 유형의 벡터는 DNA 전달기능이 있어 Agrobacterium-매개 형질전환에 의해서 상기 구조물을 식물체로 전달하고 게놈에 안정하게 삽입되게 하는 경우에 사용된다.
5'에서 3' 방향으로, 전형적인 구조물은 식물에서 발현(바람직하게는 종자-특이적 발현)을 지시가능한 프로모터를 갖는 완전한 조절영역, 단백질 코딩영역, 및 식물에서 기능적인 전사종결신호를 함유하는 서열로 이루어진다. 구조물을 포함하는 상기 서열은 자연적, 합성의 또는 양자의 조합일 수 있다. 35-s CaMV 프로모터(Rothstein et al., 1987; Gene 53:153-161)와 같은 비-종자 특이적 프로모터와 파세올린 프로모터(Sengupta-Gopalan et al., 1985; RNAS USA 82: 3320-3324)나 Arabidopsis 18kDa 올레오신 프로모터(Van Rooijen et al., 1992; Plant Mol. Biol. 18:1177-1179)와 같은 종자 특이적 프로모터가 사용될 수 있다. 프로모터에 추가하여, 조절영역은 리보솜 결합자리를 포함하여 식물에서 전사체의 번역을 가능하게 하며, 또한 하나 이상의 인핸서(enhancer) 서열, 예를 들면 AMV 리더(Jobling and Gehrke 1987; Nature 325L 622-625)를 포함하여 산물의 발현을 증가시킨다.
상기 구조물의 코딩영역은 일반적으로 올레오신에 융합된 리간드을 코딩하고 번역 종료 코돈으로 끝나는 서열로 이루어진다. 올레오신 서열은 어떠한 DNA서열 또는 이들의 부분, 천연 또는 합성이고, 기름체에서 안정하게 발현하고 기름체로 올바르게 표적화할 수 있는 단백질을 코딩하기에 충분한 서열이다. 상기 서열의 특징에 대한 자세한 설명은 Moloney, 1993; PCT Patent Appl. WO 93/21320에 기재되어 있으며 이 문헌을 본명세서에 참고문헌으로 병합하였다. 상기 서열은 또한 인트론도 포함한다. 리간드-코딩 영역은 차례로 상기에서 기재한바와 같이 동정된 리간드 서열이 어떠한 독립적으로나 조합으로 이루어져 있다. 바람직하게는 프로테아제나 효소 인식자리를 리간드와 표적 단백질간에 가공하여 정제과정에서 표적단백질로부터 리간드를 단백질분해로 제거할 수 있다.
전사 종결 신호를 포함하는 영역은 노팔린 합성효소 종결서열과 같은 식물에서 기능적인 어떠한 서열을 포함할 수 있으며, 추가로 산물의 발현을 증가시키기 위해 인핸서 서열을 포함할 수도 있다.
구조물(construct)의 다양한 구성성분을 종래의 방법으로 접합하여 일반적으로 pUC-기초한 벡터에 삽입한다. 그런 다음, 이 구조물을 Agrobaterium벡터로 도입하고 이어서 다음에 간략히 기술한 형질전환 방법 의해서 숙주 식물에 도입할 수 있다.
DNA를 숙주세포에 도입하기 위해서 다양한 기술을 이용 가능하다. 예를 들면, 일반적인 Agrobacterium 벡터를 사용하여 담배와 같은 쌍떡잎식물, 및 B.napus와 같은 유성종(油性種)에서 유래된 숙주세포에 상기 키메릭 DNA구조물을 도입할 수 있다; moloney등의 1989, (Plant Cell Rep., 8:238-242) 또는 Hinchee 등의 1988, (Bio/Technol., 6:915-922)에 기재된 형질전환 프토코콜에 의해서; 또는 본 기술분야의 전문가에게 알려진 다른 기술에 의해서. 예를 들면, 식물세포의 형질전환을 위한 T-DNA의 사용은 광범위하게 연구되고 있으며 다음문헌에 기재되어 있다;EPA serial No. 120,516; Hoekema etlal, 1985(Chapter V, In: The Binary Plant Vector System Offset-drukkeij Kanters B.V., Alblasserdam); Knuf, et al., 1983, (Genetic Analysis of Host Range Expression by Agrobacterium, P. 145, In Molecular Genetics of the Bacteria-Plant Interation, Puhler, A ed., Springer-Verlag, NY); 및 An et al., 1985, (EMBO J., 4:277-284). 편리하게도, 외식편을 A. tumefaciens나 A.fhizugenes로 배양하여 전사 구조물이 식물세포로 전달되게 할 수 있다. Agrobacterium을 이용한 형질전환에 이어서, 식물세포를 선별을 위한 적합한 배지에 분산시키고, 캘러스(callus), 슈트(shoot) 및 궁극적으로 묘목을 회수한다. Agrobaterium 숙주는 T-DNA를 식물세포로 전달하는데 필요한 vir 유전자를 포함하는 플라스미드를 가지고 있다. 주입과 일렉트로포레이션(electroporation)을 위해서, 암(arm)이 없는 Ti-플라스미드(종양 유전자, 특히 T-DNA 영역이 없는 것)을 식물세포에 도입할 수 있다. 비-Agrobacterium 기술의 용도는 본명세서에서 기술된 구조물의 용도를 다양한 외떡잎과 쌍떡잎 식물과 다른 생물체에서 형질전환과 발현을 가능하게 한다. 이러한 기술은 Agrobacterium 형질전환시스템에서 가공하기 어려운 종에 특히 유용하다. 유전자 전달을 위한 다른 기술에는 바이오리스틱(Sanford, 1988, Trends in Biotech., 6:299-302), 일렉트로포레이션(Fromm et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:5824-5828; Riggs and Bates, 1986, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 83: 5602-5606) 또는 PEG-매개 DNA 섭취(Potrykus et al., 1985, Mol. Gen. Genet., 199:169-177)이 포함된다.
예를 들면, B. napus에 구체적인 적용을 함에 있어서, 재조합 DNA 구조물을 수용하는 숙주세포는 일반적으로 Molony 등의 (1989, Plant Cell Rep., 8:238-242)에 기재된 것과 같은 쌍떡잎 잎꼭지에서 유래될 것이다. 상업적인 기름 종자를 사용하는 다른 예에는 대두 외식(explant)에서 떡잎 형질전환(Hinchee et al., 1988, Bio/Technology, 6:915-922) 및 면화의 줄기 형질전환(Umbeck et al., 1981, Bio/Technology, 5: 263-266)이 포함된다.
형질전환에 이어서, 세포 예를 들면 잎 디스크를 선택배지에서 배양한다. 일단 슈트가 나타나기 시작하면, 이를 절단하여 뿌리 배지 위에 둔다. 충분한 뿌리가 생긴 후에 상기 식물을 토양에 이전한다. 추정 형질전환된 식물을 마커(marker)의 존재하에 테스트한다. 적합한 프로브, 예를 들면 A. thaliana 올레오신 유전자를 사용하여 게놈 DNA에 서던블랏을 행하여 원하는 서열이 숙주세포의 게놈에 인테그레이션이 일어나는지 확인했다.
일반적으로 발현 카세트를 식물세포에서 선택하기 위한 표시자(marker)를 접합하였다. 편리하게는, 표시자는 제초제, 예를 들면, 포스피노트리신이나 글리포세이트, 더욱 구체적으로는 카나미이신, G418, 블레오마이신, 히그로마이신, 클로암페니콜 등과 같은 항셍제에 대한 내성일 수 있다. 사용된 구체적인 표시자는 도입된 재조합 DNA가 없는 세포에 비해 형질전환된 세포를 선택할 수 있는 것이다. 상기에서 기재된 대로 제조된 발현카세트에 있는 융합 펩타이드는 성장중인 종자(developing seed)에서 적어도 우세하게 발현된다. 따라서, 종래의 방법으로 재배된 형질전환된 식물은 종자를 갖는다. 예를 들면, McCormick et al, (1986, Plant Cel Report, 5:81-84)를 참조하라. 종자배와 같이 전사가 일어날 것이 예상되는 조직에서 분리한 RNA로 적합한 유전자 프로브을 사용하여 노덧 블랏을 수행할 수 있다. 그런 다음 전사체의 크기를 융합단백질 전사체에 대한 예상 크기와 비교할 수 있다.
그 다음, 종자에서 기름체 단백질을 분리하고 융합 펩타이드가 발현되는지를 결정하기 위해 분석한다. 예를 들면, SDS-PAGE로 분석한다. 융합 펩타이드의 올레오신 부분에 대한 항체를 사용하여 융합 펩타이드를 탐지한다. 그런 다음, 얻어진 융합 펩타이드의 크기를 융합 펩타이드의 예측된 크기와 비교한다.
트랜스제닉 식물을 교차 또는 자가로 2 세대 이상으로 재배하고, 재조합 단백질의 생산을 포함하는 원하는 표현형으로 식물 및 균주의 확인을 가능하게 한다. 재조합 단백질을 생산하는 식물, 균주 또는 세포주의 동형 접합체가 재조합 특성의 계속적인 유전을 보장하는 것이 바람직하다. 동형접합체 식물을 선택하는 방븝은 식물 육종 분야에서 전문가에게 잘 알려져 있으며 자가수분, 선택, 꽃밥 및 소포자 배양을 반복하는 것을 포함한다. 반수체 세포나 조직을 형질전환하고 이어서 반수체 묘목의 재생한 다음, 다수의 알려진 수단(예, 콜키친이나 다른 미소관 파괴제)으로 이배체 식물로 전환함으로써 동형접합체 식물을 얻을 수 있다.
친화성 매트릭스를 사용하여 표적분자를 분리하는 방법
상기한 바와 같이, 본 발명은 상기 기술한 기름체 단백질과 몇몇의 경우에 리간드를 사용하며 샘플로부터 표적분자를 분리하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에서, 원하는 표적분자를 함유하는 샘플과 기름체를 혼합하고 리간드와 표적과의 상호작용결과로 기름체와 표적간에 비공유결합이 형성된다. 원심분리 후에, 기름체와 친화성-결합 표적을 수용액상에서 분리하고 최초 샘플에 있는 오염물질로부터 표적을 효과적으로 정제한다. 세척단계를 반복함으로써 남아있는 오염물의 제거를 확실히 한다.
표적을 기름체에 부착한 후에, 각각의 리간드-표적 쌍에 대해 실험적으로 결정된 조건하에서 표적을 용출할 수도 있다. 적절한 용출액으로 결합된 매트릭스를 처리하고 원심분리함으로써 수용액상에 있는 정제된 표적을 회수할 수 있다. 만약 표적이 프로테아제 인식 자리를 함유하는 리간드-단백질 융합체라면, 리간드를 제거하기 이해서 적절한 프로테아제로 처리할 수도 있다. 그런 다음 기름체 친화성 매트릭스를 다시 적용하거나 종래의 단백질 정제방법으로 자유 리간드를 표적단백질로부터 분리할 수 있다.
친화성 매트릭스의 화학적 및 물리적 특성은 적어도 두가지 방식으로 다양하다. 첫째, 다른 식물종은 다른 기름 조성물을 가진 기름체를 함유한다. 예를 들면, 코코넛은 라우린산 기름(C12)이 많음 반면에, 몇몇 Brassica spp.에는 에루신산 기름(C22)이 풍부하다. 더욱이, 기름체와 관련된 단백질로 종간에 다양하다. 두 번째, 본 기술분야의 전문가에게 잘 알려진 육종과 유전공학 기술, 또는 이들의 조합기술을 적용함으로써 기름의 상대적인 양을 구체적인 식물종내에서 변화시킬 수 있다. 이러한 기술들은 기름 합성에 관련된 대사경로를 조절하는 효소의 상대적인 활성을 변화시키는 것을 목표로 한다. 이러한 기술의 적용을 통해, 복합된 세트의 여러 가지 기름을 가진 종자를 얻을 수 있다. 예를 들면, 육종노력은 에루신산의 함량이 낮은 평지씨(Canola)(Bestor, T.H, 1994, Dev.Genet. 15:458)개발을 가져왔으며, 또한 이중결합의 수와 위치가 변화된 기름을 갖는 식물주, 지방산 사슬길이의 변화 및 바람직한 작용기를 유전공학에 의해서 제조하였다(Topfer et al., 1995, Science, 268: 681-685). 본 기술분야의 전문가가 유사한 접근법을 tkdydgkadmfhTJ 현재 이용가능한 기름체원을 확장할 수 있다. 다양한 기름 조성물의 결과로 기름체 부의 다양한 물리적 및 화학적 특성이 생길 것이다. 따라서 기름체의 원료로서 여러 가지 종이나 식물주에서부터 기름종자나 이의 혼합물을 선택함으로써 다른 성질 및 점도를 갖는 기름체 매트릭스의 다양한 레퍼토리를 얻을 수 있다.
기름체 친화성 매트릭스의 적용
수 개의 단백질에 대한 기름체 친화성 매트릭스을 가공하는 것이 가능하므로, 기름체에 기초한 친화성 매트릭스의 다양한 용도를 계획한다. 박테리아, 곰팜이, 식물 및 동물 모두는 이온, 금속, 핵산, 당, 지질 및 다른 단백질과 같은 작용제와 특이적으로 작용할 수 있는 단백질을 함유한다. 기름체 기술을 사용하여 이러한 작용제를 고정화될 수 있다.
리간드 분자를 통해 직접적으로나 간접적으로 기름체 단백질에 결합할 수 있는 어떠한 표적분자를 분리하는데 기름체 단백질 친화성 매트릭스를 사용할 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하여 샘플로부터 분리할 수 있는 표적분자의 예로는 단백질, 펩타이드, 유기 분자, 지질, 탄수화물, 핵산, 세포, 세포 단편, 바이러스 및 금속이 포함된다. 특히, 발명자들은 치료적 단백질(예, 트롬빈), 항체, 금속(예, 카드뮴), 탄수화물(예, 셀룰로스), 유기분자(예, 바이오틴), 및 세포(예, 박테리아 세포)을 분리하기 위해 본발명의 친화성 매트릭스를 사용할 수 있음을 밝혔다.
또한 세포의 혼합체로부터 의학적 대상이나 산업적 세포를 분리하기 위해서 사용할 수도 있다. 예를 들면, 혈액세포의 하위 집단이며 골수이식과 간세포(stem cell) 유전자치료법에 사용되는 조혈 간세포를 기름체에 기초한 친화성기술을 사용하여 다른 혈액세포로부터 분리할 수 있다. 재조합 DNA 기술에서, 재조합 DNA를 성공적으로 도입된 세포, 즉 형질전환된 세포라고 알려진 세포를 재조합 DNA을 획득하지 못한 세포로부터 분리하고 구별하는 것이 필요하다. 재조합 DNA의 부분이 기름체에 기초한 친화성 리간드에 상보적인 세포 표면 단백질을 발현하는 경우에, 형질전환되지 않은 세포로부터 형질전환된 세포를 분리하기 위해서 기름체를 사용할 수 있다. 또한 엽록체와 미토콘드리아와 같은 세포기관을 다른 세포성 물질에서부터 분리하기 위해서 기름체 친화성 기술을 사용할 수도 있다. 또한 복합 혼합물에서 바이러스 입자를 분리하기 위해서도 사용할 수 있다.
이온에 특이적으로 결합하는 프로세틱 그룹(prothetic group)을 함유한 메탈로단백질로 알려진 일군의 단백질을 고정화할 수 있다. 메탈로단배질의 예로는 철에 결합하는 헤모글로빈, 칼슘에 결합하는 파르발부민 및 아연이나 다른 금속이온에 결합하는 메탈로티오네인이 포함된다. 실험실이나 산업 공정에서부터 금속 폐기물로 오염된 물일 수 있는 흐르는 물질의 흐름에서부터 금속을 제거하기 위해서 기름체를 사용할 수 있다. 실시예4는 이러한 적용을 자세히 예시하고 있다. 단백질이 생물학적으로 고정화되고(bioimmobilize) 생물학 개선(bioremediation) 전략으로 사용되는 다른 예로는 인, 질산염 및 페놀을 폐수로부터 제거하는 것을 포함한다. 부분적으로 이러한 접근은 박테리아의 생물학적 개선의 실제적인 한계와 예상된 한계를 극복할 수 있다. 몇가지 예에서, 표적화합물에서 기름체 매트릭스를 분리하기 위해 친화성 분배기술에 의존하는 것이 실제적이지 않거나 불필요할 수도 있다. 이러한 예에서, 안정한 고체 표면상에 기름체를 고정화할 수 있으며, 이 표면은 평편한 표면이나 칼럼의 표면일 수 있다. 그 다음 친화성 리간드를 포함하는 용액을 기름체가 고정된 표면위로 흘리면 거기서 선택적인 친화성 결합이 일어난다. 고정화된 기름체를 파이프나 연못에 사용하여 생물학적 개선을 도울 수 있다.
다음의 실시예는 기름체가 친화성 매트릭스로 사용될 수 있는 다양한 시스템을 예시하고 있다. 다음의 실시예는 단지 예시로서 기재된 것이지 본 발명을 이에 한정하려는 것은 아니다.
실시예1
트롬빈의 정제
다음의 예는 트롬빈의 정제를 위한 기름체 친화성 매트릭스를 사용을 예시한다. 트롬빈은 혈액 응고에서 중추적인 역할을 하는 세린 프로테아제이다. 이는 피브리노겐을 절단하여 혈액딱지의 기초를 형성하도록 중합하는 피브린 단량체를 생산한다(Fenton 1981; Ann. N.Y. Acad. Sci. 370:468-495). 알파-트롬빈은 디설파이드 연결로 연결된 36 잔기(A 사슬)과 259 잔기(B사슬)인 두 개의 폴리펩타이드로 이루어진다(Degen et al., 1983; Biochemistry 22: 2087-2097). 약용 거머리 Hirudo medicinalis의 타액선에서 발견되는 히루딘은 매우 특이적이며 강력한 트롬빈 억제제이다. 이의 저해는 알파-트롬빈 사슬의 특정부분에 히루딘이 비-공유적으로 결합한 결과이다(Stone and Hofsteenge 1986; Biochemistry 25; 4622-4628).
고정화된 리간드는 18KD의 Arabidopsis 올레오신(기름체 단백질)에 융합된 히루딘의 이소형태로 이루어진다(Van Rooijen et al., 1992; Plant Mol. Biol. 18:1177-1179). 상기 구조물의 발현은 18KD의 Arabidopsis 올레오신 프로모터에 의해서 조절된다(Van Rooijen et al., 1994; Plant Mol. Biol. 18:1177-1179). 올레오신-히루딘 융합체의 서열은 도 2 및 SEQ ID NO:3에 나타나 있다.
올레오신-히루딘 구조물
Brassica napus 올레오신 유전자에 대해 보고된 서열에 기초하여 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 고안하여(Murphy et al. 1991, Biochim. Biophy. Acta 1088:86-94), PCR방법으로 B. napus 게놈 DNA로부터 얻은 단편을 증폭하는데 사용했다. 이 단편을 프로브로 사용하여 15kbp 삽입체를 운반하는 클론을 EMBL3 Arabidopsis게놈 라이브러리에서부터 동정하고 분리했다. 전체 올레오신 코딩서열, 인트론 및 5'상류영역의 840 bp을 함유하는 삽입체로부터 단편을 증폭하는데 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용했다. 번역 종료 코돈을 제거하고 단편의 5'말단에 PstI 및 3'말단에 SalI과 PvuI인식자리를 도입하도록 프라이머를 고안했다. 상기 단편을 말단을 채우고 플라스미드 벡터 pUC19의 SmalI자리로 접합하였다. 플라스미드 pBI121(Clontech)로부터 얻은 SalI-EcoRI단편은 노팔린 합성효소 종료인자를 포함하며, 이 단편을 삽입하여 pOBILT을 제조하였다.
보고된 서열정보(Harvey et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:1084-1088)에 기초하였으나 B.napus와 Arabidopsis코돈 사용법을 사용하여 합성 히루딘 변형체 2(HV2) 서열을 합성하였다. 5'말단과 3'말단 각각에 PvuI과 SalI자리를 갖는 단편이 되도록 고안한 4개의 중복되는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 상기 서열을 증폭하였다. 이 단편을 pUC19플라스미드 벡터의 SmalI 자리에 접합하여 pIIIR을 제조하였다. pHIR으로부터 PvuI-SAlI단편을 pUCOBILT의 올레오신과 종료서열사이에 삽입하여 올레오신 코딩영역과 프레임내 융합을 하여 pUCOBHIRT를 제조하였다. 전체 구조물을 pBluescript KS+(pBIOBHIRT)에 서브클로닝한 후에, 35-S CaMV 프로모터의 조절하에 네오마이신 포스포트랜스퍼라제을 운반하는 플라스미드 pCGN1559(McBride and Summerfelt, 1990, Plant Mol. Biol. 14:269-276)의 PstI자리로 삽입하였다(pCGOBHIRT). 이 플라스미드를 Agrobacterium tumefaciens로 도입하였다. 이 플라스미드의 제조는 도 3에 나타내고 있다.
형질전환과 재생
Agrobacterium 및 식물의 형질전환 과정은 이전에 기술되었다. Agrobacterium tumefaciens를 일렉트로포레이션을 사용하여 상기 구조물로 형질전환 시킨다(Dower et al., 1988; Nucl. Acids. Res. 16:6127-6145). Brassica napus의 떡잎외식을 상기 형질전환된 박테리아로 형질전환 시킨후에, Moloney 등의(1989; Plant Cell Report 8: 238-242) 식물재생방법으로 식물을 재생시킨다. 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 분석으로 먼저 트랜스제닉 식물을 동정하고 이어서 노던 블랏 및 이뮤노블랏 분석으로 올레오신-히루딘 발현을 확인하였다.
기름체의 제조
대조식물(형질전환되지 않은 식물) 또는 올레오신-히루딘 융합체를 발현하는 트랜스제틱 식물에서 얻은 종자를 5배 찬 분쇄 완충액(50mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.4 M 수크로스 및 0.5M NaCl)에서 고속도 폴리트론을 사용하여 균질화하였다. 균질물을 30분 동안 약 10 xg로 원심분리하여, 입자물질을 제거하고 수용성 종자 단백질을 다량으로 함유하는 수용액상에서부터 기름체를 분리하였다. 금속 숟가락으로 상등액의 표면에서 기름체를 걷어내고 새 분쇄완충액 1 부피에 두었다. 후속 단계에서 효율적으로 세척하기 위해서, 기름체를 완전히 재분산시키는 것이 중요하다. 이는 저속도의 폴리트론으로 분쇄 완충액에서 기름체를 재현탁함으로써 달성되었다. 주사기를 이용하여, 재현탁된 기름체를 5배의 찬 50mM Tris-HCl, pH 7.5로 아래에 층을 형성하고 상기한 바와 같이 원심분리하였다. 그 다음에, 다시 기름체를 제거하고 3회 세척하여 남아있는 오염성 수용성 종자 단백질을 제거하였다. 최종 세척된 기름체 조성물을 1배의 찬 50mM Tris-HCl pH 7.5에서 재현탁하고 폴리트론으로 재분산한 다음, 친화성 매트릭스로서 사용할 준비가 되었다.
트롬빈의 친화성 정제
도 4에서 올레오신-히루딘 융합 단백질을 사용하는 트롬빈 정제를 개략적으로 나타낸다. 트롬빈의 결합을 측정하기 위해서, 올레오신-히루딘 융합 단백질을 발현하는 트랜스제닉 Brassica napus 종자(4A4 seed)(Parmenter et al., Plant Molecular Biology (1995) 29: 1167-1180) 및 야생형 Brassica napus cv Westar 종자로부터 친화성 매트릭스를 제조하였다. 상기 양 매트릭스에 대한 토롬빈의 결합을 측정하였다. 종자로부터 세척된 기름체를 제조하는 과정은 상기에서 기술한 바와 같다.
0 내지 1 유니트인 활성도를 갖는 트롬빈을 함유하는 용액을 500μl 결합완충액(50 mM Tris-HCl pH 7.5); 0.1% (w/v)BSA)에 있는 10μl의 고정된 양의 친화성 매트릭스(전체 건조 종자 10 mg에서부터 제조됨; 전체 기름체 단백질의 100μl에 상응)와 혼합했다. 그런 다음, 기름체 현탁액을 얼음상에서 30분간 반응시키고 4℃에서 15분간 14,000rpm으로 원심분리 하였다. 기름체하에 완충액('하등액'(下等液, unternatant)라 함)을 결합되지 않은 자유 트롬빈을 포함하는 것을 피하주사를 이용하여 회수하고, 다음과 같이 트롬빈 활성을 분석하였다. 전체 250μl의 하등액을 700μl의 결합 완충액에 첨가하고 37℃에서 예열하였다. 상기 하등액t에 50μl의 1 mM 트롬빈 기질 N-p-토실-gly-pro-arg-p-니트로아닐리드(Sigma사)을 첨가한 후에, 405 나노미터에서 광학밀도의 변화를 3분간 스펙트로포터미트로 모니터하였다. 알려진 농도의 트롬빈을 함유하는 트롬빈 샘플 세트를 사용하여 만들어진 표준 커브를 이용하여 분석 혼합물에 있는 트롬빈이 농도를 결정하였다. 이러한 분석으로 얻은 수치로 다음의 가정으로 결합된 트롬빈의 농도를 계산하였다:
자유 트롬빈 농도에 대한 결합된 트롬빈 농도의 비율을 결합된 트롬빈의 농도 함수로서 도표화하였다(Scatchard plot). 이러한 도표로부터 친화성 매트릭스의 분해상수를 다음의 표준 과정(Scatchard, G. Ann. N.Y. Acad. Sci. (1949) 57: 660-672) 및 Ka=1/Kd라는 가정하에 계산하였다. 친화성 매트릭스의 분해상수는 야생형에 대해 3.22 X 10-7m이고 4A4 기름체에 대해 2.80 X 10-8이다.
매트릭스로부터 결합된 트롬빈의 회수를 측정하기 위해서 NaCl 구배를 사용하였다. 올레오신-히루딘 기름체 매트릭스에 결합된 트롬빈의 용출 양상을 야생형 기름체 매트릭스에 결합한 트롬빈의 양상과 비교하였다.
트랜스제닉 Brassica napus 종자(4A4 seed)로부터 기름체의 제조(Parmenter et al., Plant Molecular Biology (1995) 29: 1167-1180) 및 야생형 Brassica napus cv Westar 종자로부터 기름체의 제조를 위한 과정은 상기한 바와 동일하다. 매트릭스에 트롬빈을 결합하는 과정은 상기한 바와 동일하나, 다만 100㎕의 기름체를 사용하여 0.5 유니트의 트롬빈에 결합하였다. 기름체 현탁액을 30분간 얼음에 둔후에, 4℃, 14,000rpm에서 15분간 원심분리 하였다. 하등액을 결합되지 않은 트롬빈 활성도를 측정하였다. 기름체 매트릭스를 결합 완충액에서 재현탁시키고 이에 최종농도를 0.05M이 되게 NaCl을 첨가하였다. 얼음상에서 기름체 현탁액을 30분간 두는 것으로 시작하여 상기 과정을 5회 반복하여 단계적으로 NaCl농도를 증가시켰다. 사용된 최종 NaCl 농도는 0.05M, 0.1M, 0.2M, 0.3M, 0.4M 및 0.6M이었다. 트롬빈 분석에서 NaCl의 농도는 150 mM로 일정하게 유지하였다. 도 5는 야생형 기름체와 4A4 기름체를 사용하였을 때, 얻어진 용출 양상을 나타낸다.
실시예2
이가(bivalent) 리간드로서 항체의 사용
항체는 특이한 에피토프 및 이뮤노글로불린(IgGs)에 대한 친화성을 갖는 다른 항체나 단백질(예들 들면, Staphylococcus aureus 단백질 A) 모두에 대해 친화성에 의해서 이가 리간드로서 사용될 수 있다. 본 실시예에서, 다클론성 항-올레오신 항첵, 리간 리간드로서 작용하며 항-올레오신 항체에 대한 토끼에서 생성된 항체가 표적으로 작용한다. 도 6에서 이 실시예에 대한 개략적 설명을 제공하고 있다.
실시예 1에 기재된 방법에 따라 야생형 Brassica napus cv Westar 종자 5g에서부터 기름체를 제조하였다. 그런 다음, 100 mM 글리신(pH 2.5)으로 2회 기름체를 세척하고, 결합완충액(50 mM Tris-HCl, pH 7.5)에서 2회 세척하여 중성화하고, 결합완충액 5ml에서 재현탁하였다.
세척된 기름체 조성물 150㎕ 분획량을 항-올레오신 항체(리간드 항체)를 함유하는 토끼 혈청 500㎕와 혼합하고, 결합완충액으로 1:10으로 희석하였다. 상기 기름체 현탁액을 완전히 혼합하고 교반하면서 4℃에서 1시간동안 반응시켰다. 그런후에, 결합 완충액 1ml로 3회 세척하여 기름체 현탁액으로부터 결합하지 않은 리간드 항체를 제거하였다. 탐지 표지로서 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)(Sigma)가 컨쥬게이트된 항-토끼 IgG 항체(표적분자)를 함유하고 결합 완충액에서 1:500으로 희석한 형청 500㎕을 혼합하였다. 이 현탁액을 항-올레오신 항체 결합에 사용된 것과 동일한 조건하에서 혼합하고 반응시켰다. 대조구로서, 이전에 리간드 항체가 결합되지 않은 기름체와 표적분자를 반응시켰다. 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해서 두 가지 샘플을 1ml의 결합완충액으로 4회 세척하였다. 결합 완충액을 사용하여, 600 nm에서 스펙트로포토미터로 샘플의 혼탁도를 측정하여 결정된 것과 같이 기름체의 농도에 대해 상기 샘플을 평형화했다. 결합된 표적 항체를 분석하기 위해서, 기름체 5㎕를 함유한 샘플을 0.01% 과산화수소에서 색깔측정 기질인 HRP 테트라메틸벤지딘 1ml와 혼합하고 실온에서 10분간 반응시켰다. 1M H2SO4의 500㎕를 첨가하여 반응을 종료시키고 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 세척후에 남아 있는 결합되지 않은 표적 항체의 존재를 보정하기 위해서, 최종 세척부분의 5㎕을 분석하였다. 대조구 및 리간드가 결합된 기름체에 대해 얻어진 결과를 도 7에서 나타냈다.
실시예 3
올레오신-특이적 리간드의 사용
올레오신-특이적 리간드의 사용은 재조합 표적 단백질의 정제를 위한 항체 또는 유전적으로 가공된 올레오신 융합 단백질의 사용에대한 대안을 나타낸다. 이 경우에, 표적 단백질을 올레오신-특이적 리간드에 융합되고 형질전환 되지 않은 종자의 기름체에 존재하는 내재성 올레오신이 보완성 리간드-친화성 매트릭스로 작용하였다.
올레오신 융합체를 발현하는 트랜스제닉주에 대한 요건을 제거하는 것에 더하여, 모든 내재성 올레오신이 현재 결합에 참여하고 있기 때문에 이러한 접근은 친화성 매트릭스의 전체 능력을 증가시킨다.
올레오신 단백질로 스크리닝한 펩타이드 파지 디스플레이 라이브러리에서부터 올레오신-특이적 리간드를 동정하고 분리할 수 있다. 올레오신의 중앙 도메인의 매우 큰 소수성으로 인해 기름체로부터 제거될 때 단백질의 응집과 침전이 발생하기 때문에, 이러한 도메인이 없는 변이 단백질을 스크리닝에 사용할 수도 있다. 올레오신의 친수성 부분만(즉 N-말단과 C-말단)이 세포질로 노출되기 때문에, 이것은 리간드의 효능에는 거의 영향이 없다. 따라서, 이것이 리간드의 결합에 이용 가능한 유일한 영역이다. 일단 분리되면, 정제를 설명하기 위해서 리간드는 흔한 리포터 단백질, 녹색 형광 단백질(GFP)(Prasher, 1995, Trends Genet. 11:320-323)에 융합될 수 있다.
올레오신 중심 도메인의 제거
상기에서 기술한 Arabidopsis 올레오신에 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 B.napus cDNA 라이브러리로부터 얻은 유전자를 증폭할 수 있다(van Rooijen 1993, Ph.D. Thesis, University of Calgary). 별개의 반응으로 각각 N-말단 및 C-말단 올레오신 도메인에 대한 서열을 증폭하기 위하여, N-말단 62 아미노산 과 C-말단 55 아미노산을 코딩하는 프라이머 측면 서열을 사용할 수도 있다. 추가로, N-말단 도메인의 5' 말단에 대한 프라이머는 이하에서 기술하는 바와 같이 융합 단백질을 절단할 수 있는 트롬빈 인식 자리를 포함한다. 얻어진 단편을 박테리아의 발현 벡터 pEZZ 18 (Pharmacia)에 접합하였다. 이 벡터는 페리플라즘(periplasm)으로 단백질을 분비하기 위한 시그널 펩타이드, 단백질의 정제를 용이하도록 단백질 A에서 유래된 합성 IgG 결합 도메인을 코딩하는 서열, 그리고 하류의 다수 클로닝 자리(multiple cloning site)를 포함한다.
올레오신-특이적 리간드의 동정 및 분리
펩타이드 파지 디스플레이 라이브러리를 증폭하고, 농축하여 1012tdu/ml농도로 저장하였다. 티올-절단 링커(S-S 바이오틴, Pierce)를 사용하여 정제된 변이 올레오신 단백질을 바이오틴화하고 크기 배타적 크로마토그래피을 사용하여 정제하였다. 2 ml에 5 X 1011tdu을 함유하는 펩타이드 파지 디스플레이 라이브러리를 50 nM의 바이오틴화된 단백질로 스크리닝하였다. 스트렙타비딘-코팅 파라마드네틱 비드를 사용하여 변이 올레오신 단백질에 결합된 파지를 회수하였다. 세척후에, 디설파이드 결합을 절단하는 디티오트레이톨 50mM을 첨가하여 용출하였다. 용출된 파지를 충분한 로그-파지 F+ E.coli로 배양하였다. 감염된 세포를 깔아서 파지 농도와 잇따른 증폭에서 사용된 남아 있는 세포을 측정하고 스크리닝하였다. 3-4승 크기로 용출된 파지를 집적배양한 다음, 각 파지를 선택하고 직접적인 ELISA로 변이 올레오신에 결합하는 것에 대해서 테스트하였다. 항-파지 항체(Crosby and Schorr, 1995, In Annual Review of Cell Biology)를 사용하여 파지에 의한 결합을 탐지한다. 결합을 하는 파지로부터 단일사슬 DNA를 분리하여 펩타이드-코딩 서열을 결정하였다.
올레오신-특이적 리간드의 친화성 정제
GFP를 코딩하는 gfp 10(Prasher et al., 1992, Gene 111:229-233)에 대한 서열의 프레임내 상류에 상기에서 기술한대로 분리된 올레오신 리간드에 대한 서열을 융합하고 이 구조물을 박테리아 발현벡터 pKKK233(Pharmacia)에 접합하였다. 리간드-GFP융합체를 발현하도록 유도된 세포를 초음파를 사용하여 수용성 단백질을 추출하고, 50 mM Tris-HCl pH 7.5에서 10 mg/ml농도로 맞추었다.
형질전환되지 않은 식물의 종자에서 상기에서 기술한 대로 준비한 기름체 2 ml을 20 ml의 단백질 용액에 혼합하였다. 이 혼합물을 4℃에서 30분간 교반하면서 반응시켜 결합시킨 후에, 원심분리하여 기름체와 수용성 부분을 분리하였다. 508 nm의 파장에서 형광 스텍트로플루오로미터을 사용하여 기름체를 제거한 후에 수용성 부분에 남아 있는 GFP의 양을 결정하고, 최초 박테리아 추출물에 있는 것과 비교하였다. 결합된 GFP의 양을 계산하여 매트릭스의 능력을 결정하였다.
기름체를 pH 7.5 50 mM Tris-HCl 20 ml로 두 번 세척하고, 동일한 완충액 2 ml에서 재현탁하고, 20개의 100㎕로 나누었다. NaCl 농도가 0-1 M에서 여러 가지 분획량까지, pH 2-10 범위에서 용액 1 ml을 첨가함으로써 리간드-FGP융합 단백질의 용출 조건을 결정하였다. 혼합하고 4℃에서 30분간 반응시킨 후, 기름체를 제거하고 수용성 부분을 모았다. 수용성 부분에 있는 리간드-GFP 융합 단백질의 양을 형광 스펙트로포토미터로 측정하였다.
실시예 4
중금속 이온의 제거
다음의 실시예는 복합 용액에서 비-단백질 표적의 제거/회수를 위한 기름체의 이용을 설명하는 것이다. 이 실시예을 위해, 메탈로티오네인/Cd++ 리간드 상을 사용하였다. 그러나 피토킬라틴과 같은 다른 금속 결합 단백질(Rauser, 1990; Ann. Rev. Biochem; 59: 61-86)과 Cu++와 Zn++을 또한 사용할 수 있다.
올레오신-메탈로티오네인 융합
유전자의 5' 및 3' 말단 각각에 NotI 과 NcoI자리를 제조하기 위해서 고안된 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용한 PCR로서, B. napus cDNA 라이브러리로(van Rooijen 1993, Ph.D. Thesis, University of Calgary)부터 올레오신 유전자를 증폭하였다. 얻어진 단편을 분해하고 pGN의 NotI/NcoI자리에 삽입하여 플라스미드 poleGN을 만들었다. 유전자의 3'말단에서 유일한 NotI을 제조하기 위해 고안된 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 사람의 메탈로티오네인 유전자, mt-II(Varshney and Gedamu, 1984, Gene, 31: 135-145)을 증폭하였다. 얻어진 PCR산물을 pBluescript KS+의 블런트-말단 EcoRV자리로 서브클로닝하여 pBSMTC를 제조하였다. 이 플라스미드로부터 mt-II 유전자를 잘라내고 poleGN의 NcoI/KpnI 자리로 서브클로닝하여 GUS-NOS을 대체시켜 pOLEMTC를 제조하였다. pOLEMTC의 773 염기 올레오신-MT융합체를 NotI분해로 잘라내고 올레오신 프로모터(oleP; Van Fooiuen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18:1177-1179)와 P.crispsum ubi4-2 유전자 말단(ubi3'; Kawallect et al., 1993, Plant Mol. Biol. 21:673-684)사이에 polePN3'의 유일한 NotI자리로 삽입하여 pOOM3'을 제조하였다. 정확한 방향으로 융합이 되었는지를 확인한 후에, pOOM3'을 KpnI으로 절단하여 oleP-oleMT-ubi3'삽입체를 방출하였다. 이 발현 카세트를 2성분 벡터 pCGN1559의 KpnI자리에 삽입하여 최종 구조물 pBIOOM3'을 생산하였다. 올레오신-메탈로티오네인 융합체의 서열을 도 8과 SEQ ID NO:6에 나타냈다. 플라스미드 pBIOOM3'의 구조를 도 9에 나타냈다.
형질전환과 재생
실시예 1에 기재된 형질전환과 재생 프로토콜을 사용하여 형질전환과 올레오신-메탈로티오네인 융합체를 발현한느 트랜스제닉 B. carinata 식물체를 제조하였다.
기름체의 제조
실시예 1에 기재된 트랜스제닉 B.carinata 종자와 대조 식물로부터 세척된 기름체를 제조하였다.
기름체 친화성 매트릭스를 사용하여 용액에서부터 Cd++의 제거
용액상이 카드뮴이온에 결합하는 올레오신-메탈로티오네인의 용도는 도 10에 개략적으로 나타냈다.
0.01μ Ci/ml109Cd를 함유하는 10 mM Tris-HCl pH 7.2에 있는 10 M CdCl2용액을 제조하였다.
이 CdCl2용액 1 ml을 올레오신-메탈로티오네인 융합 단백질을 발현하는 종자에서 제조된 세척된 기름체(1.6 mg 기름체 단백질) 100㎕과 혼합하고 1시간동안 22℃에서 반응하였다. 수용액상으로부터 기름체를 분리하기 위해서 10,000 xg에서 5분간 원심분리 후에, 10mM Tris-HCl, pH 7.2의 1ml로 2회 세척하고, 기름체 부분에 결합된 남아있는109CD++의 양을 감마-계측기(Cobra auto-gamma, Canberra Packard, Canada)를 사용하여 결정하였다. 매트릭스에 Cd의 비특이적 결합을 탐지하고 바로잡기 위해서 형질전환 되지 않은 종자로부터 얻은 기름체로 동일한 실험을 수행하였다.
1 ml의 100 mM 글리신(pH=3.0) 완충액으로 기름체 부분을 혼합함으로써 기름체 메탈로티오네인 친화성 매트릭스로부터 Cd++이온을 용출하였다(Pazirandeh et al., 1995; Appl. Microbiol. Biotech. 43: 1112-1117). 10,000 xg에서 기름체 부분을 제거하고 상기한 바와 같이 결합된 Cd++에 대해서 분석하였다. 도 11은 친화성 매트릭스에 대한 Cd++의 결합과 용출을 나타낸다.
실시예 5
전체 세포의 분리
다음의 실시예는 전체 세포를 고정화할 수 있는 기름체의 능력을 설명한 것이다. 박테리아 세포 분리의 가능한 용도는 진단용이다. 또한 목적 세포가 상대적으로 적은 수로 존재하는 복합 세포 혼합물로부터 림프구나 스템 세포와 같은 독특한 진핵세포를 분리하는 것도 바람직하다.
단백질 A를 이용하여 기름체에 Staphylococcus aureus의 결합
표백제에서 B.napus vs Westar의 종자 표면을 멸균하고, 헹구고, 분쇄완충액에서 막자와 모르타르로 분쇄하였다(50 mM Tris pH 7.5, 0.4M 수크로스, 및 100 mM 글리신). 미라클로드(Miracloth)를 통과하여 멸균 15 ml Corex 튜브로 상기 균질액을 여과한다. 여과된 균질액을 10.000 xg에서 10분간 4℃에서 원심분리 하였다. 기름체 부분을 제거하고 50 mM Tris pH 7.5 및 0.4 수크로스에서 재현탁하고, 동일한 완충액으로 2회 세척하였다. 1 ml기름체의 분획을 1.5ml 에펜도르프 튜브로 이동하여 16,000 xg에서 10분간 실온에서 원심분리 하였다. 50mM Tris pH 7.5 및 0.4 M 수크로스로 5-6회 펠렛이 관찰되지 않을 때까지 기름체를 세척하였다.
항-올레오신이 코팅된 기름체에 S.aureus의 결합
포르말린에 고정된 S.aureus 세포(Sigma, P-7155)를 50mM Tris-HCl,pH 7.5로 3-4회 세척하고 재현탁 하였다. 세척된 기름체(300㎕)와 S.aureus를 항-올레오신 IgGs (50㎕)을 다양한 양으로 하여 혼합하였다. 2시간동안 실온에서 혼합하고 반응한 후에, 16,000xg, 5분간, 실온에서 혼합물을 원심분리 하였다. 기름체 부분과 하등액을 조심스럽게 제거하고 세포 펠렛을 1 ml의 50mM Tris pH 7.5으로 2회 세척하였다. 오일 잔류물을 제거하기 위해서 튜브벽을 티슈로 닦아냈다. 이어서, 세포 펠렛을 1 ml의 물에 재현탁하고 OD600을 측정하였다. 도 12는 기름체 S.aureus 혼합물에 존재하는 항-IgGs농도가 증가함에 따라 세포펠렛에 존재하는 세포의 양이 감소함을 나타낸다.
Staphylococcus aureus 두 균주의 차별적인 결합
S.aureus두 균주의 차별적인 결합을 설명하기 위해서, 이 실험에서 기름체인 친화성 매트릭스를 사용하였다. 하나는 IgG에 결합하는 표면항원 단백질 A를 발현하고 다른 하나는 단백질 A가 없는 포르말린에 고정된 S.aureus균주를 Sigma사에서부터 상업적으로 구입할 수 있다. 동일한 OD550을 갖는 두 S.aureus의 묽은 용액을 준비할 수 있었다. 이들 분취량 각각에 항-올레오신 항체가 혼합된 기름체 또는 형질전환되지 않은 식물에서 얻은 대조구 기름체을 첨가할 수 있었다. 적절한 온도에서 적절한 시간동안 반응시킨 후에, 샘플을 원심분리하여 박테리아 세포가 결합되지 않은 펠렛으로 하고 기름체 부분을 분리하였다. 기름체를 붓고, 회전하여 OD550을 측정하였다. 펠렛을 재현탁하고, 하등액의 OD550를 결정할 수 있었다. 단백질 A 및 기름체를 발현하는 S.aureus를 함유하는 샘플만이 항-올레오신 항체와 복합체를 형성하고, 기름체에 대한 이들 세포의 비율을 측정할 것이다. 추가로, 기름체 부분의 pH를 낮춤으로써 기름체에 대한 세포의 결합을 설명할 수 있었다. 원심분리에 이어서, 기름체로부터 세포의 방출을 펠렛의 존재 및/또는 펠렛의 재현탁시에 OD550의 증가로 알 수 있다.
E.coli Staphylococcus aureus의 분리
특이적인 항생제 내성을 갖는 E.coli 균주를 다양한 양으로 하여 살아있는 S.aureus와 혼합할 수 있었다. 대조 항체 및 항-올레오신 항체와 복합체를 형성하는 기름체와 함께 상기 혼합된 박테리아 샘플을 회전하였다. 적절한 온도 및 적절한 시간동안 반응시킨 후에, 기름체를 세척하고 하등액 및 기름체를 직접적으로 측정하고, 이를 S.aureus성장용 혈액 아가 및 E.coli성장용 LB배지상에 깔았다. 콜로니 형성 유니트의 특정을 통해 집적 및 실제 분리를 확인하였다.
복합 혼합물에서 저농도로 존재하는 병원균의 동정
진단목적으로, 낮은 숫자로 사람이나 동물조직을 침범하는 박테리아나 바이러스 병원균을 농축하는 것이 종종 바람직하다. 기름체 친화성 매트릭스를 사용하여 이러한 병원균을 농축하고, 이어서 동정 및 특징화하였다.
표적 단백질이나 수용체와 상호작용에 의해 종종 병원균은 사람이나 동물 세포에 특이적으로 결합한다. 올레오신을 사람이나 동물의 단백질 리간드에 융합하여 재조합 기름체를 병원체 고정화에 사용하였다. 본 기술분야에서 알려진 사람 단백질과 병원체 기원간에 단백질 복합체 형성의 예로는 다음이 포함된다; S. aureus 단백질 클럽핑 인자 A(clf-A)에 결합하는 사람 피브리노겐이나 피브린의 특이한 도메인(Mcdevitt et al. 1995; Mol. Microbiol. 16; 895-907); 요도나 장관 병원체 E.coli가 결합하는 사람의 부패 촉진 인자(DAF)(Movicki et al. 1993; J. of Experim. Med. 178: 2115-2121); 종양세포주 Caco-2에서 발현되고 28kD klebsiella pneumoniae fimbria 단백질 KPF-28에 독특하게 결합하는 사람 세포 리간드(Di Maetino et al., 1996; Infect. and Immun. 64: 2263-2266); S. pyrogenes 아드히젼 (단백질 F)에 특이적으로 결합하는 사람의 세포외 매트릭스 피브로넥틴 특이적 도메인(Ozeri et al., 1996; EMBO J. 15: 989-998).
실시예 6
작은 유기분자의 분리
이 실시예는 용액으로부터 작은 유기분자를 제거/회수하는데 기름체 친화성 매트릭스의 사용방법을 설명한다. 실시예로, 작은 유기분자, 즉 바이오틴을 리간드로서아비딘으로 정제한다.
아비딘 리간드의 제조
아비딘은 조류에 의해서 합성되는 단백질이며, 다수의 카르복실라제에 대한 천연 보조인자(co-factor)인 바이오틴에 대해 매우 높은 친화성을 나타낸다. 본 기술분야의 전문가에 알려진 표준방법을 사용하여 항-올레오신 항체에 정제된 아비딘(Sigma사로부터 구입가능)을 화합적으로 컨쥬게이트한다. 이 접근방법으로 친화성에 기초한 바이오틴 제거를 설명하기에 적합한 이가 아비딘 리간드를 제조할 것이다. 혹은, 올레오신-아비딘 유전자 융합을 사용할 수도 있다. 닭(Gallus gallus)에서 아비딘을 코딩하는 유전자를 동정하고 이의 서열을 결정하였다(Beattie et al., 1987, Nucl acids Res. 15:3595-3606). 아비딘 유전자 서열에 기초하여, 유전잘르 화학적으로 합성하거나 PCR을 이용하여 합성하고, 실시예 4에서 기술한 대로 B.napus 올레오신(van Rooijen, 1993, Ph.D. Thesis, University of Calgary)에 융합시킨다. 박테리아의 바이오틴 결합단백질의 동족체인 스트렙타비딘을 사용할 수도 있다.
기름체의 제조
실시예 1에 기재된 대로 대조 식물 및/또는 트랜스제닉 식물의 종자로부터 세척된 기름체를 제조하였다.
이가 아비딘-올레오신 리간드의 결합
항-올레오신 항체의 결합 및 결합되지 않은 리간드의 제거는 실시예 3에 기재되어 있다.
용액으로부터 바이오틴의 제거
아비딘과 컨쥬게이티된 항-올레오신 항체와 결합된 기름체의 일정량과 아는 농도의 바이오틴을 함유한 용액을 혼합하였다. 결합한 후에, 상기 혼합물을 원심분리하여 기름체와 수용액 부분을 분리하였다. 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)에 컨쥬게이트된 항-바이오틴 항체를 사용하는 경쟁적 ELISA에 의해 수용액 부분에 남아있는 바이오틴의 양을 결정하였다. 다음의 가정으로 결합된 바이오틴의 양을 계산할 수 있다.
얻어진 값으로부터, 실시예 2에서 기재된 대로 분해 상부를 결정하였다. 대조구로서, 아비딘이 결합되지 않은 항-올레오신 항체에 결합된 기름체로서 동일한 실험을 수행하였다. 원한다면, 과량의 2-(4'-히드록시벤젠)벤조산(HABA)을 사용하여 경쟁적 용출로 기름체-아비딘 매트릭스로부터 바이오틴을 방출할 수 있었다. 또한 바이오틴에 대해 낮은 친화성을 갖는 유전공학으로 처리된 아비딘 변이체을 사용하여 용출을 도울 수 있다. 이러한 변이체는 박테리아의 바이오틴 결합 단백질 동족체인 스트렙타비딘에 대해 설명되고 있다(Chikoti et al., 1995; Bio/Technol. 13:1198-1204).
실시예 7
탄수화물의 분리
다음의 실시예는 복합 생물학적 혼합물로부터 탄수화물을 회수하는 기름체 매트릭스의 용도를 설명한다. 이 실시예에서, 발명자들은 기름체에 고정화된 셀룰라제가 셀룰로스에 결합할 수 있음을 설명하고 있다.
올레오신-셀룰로스 결합 도메인의 융합
Cellulomona fimi에 의해서 생산되는 수개의 셀룰로스는 불연속적인 셀룰로스 결합 도메인(CBDs)을 함유한다. 이러한 CBDs가 셀룰라제의 촉매 도메인에서 단백질 가수분해 절단이나 유전적 조작에 의해 분리되었을 때에도 독립적으로 셀룰로스에 결합한다. 플라스미드 pUC18-CBDPT는 베타-1,4-글루카나제의 CBD을 코딩하는 단편을 포함하고 있으며(Gilkes et al., 1992, J of Biol. Chem. 267: 6743-6749), 올레오신-CBD 유전자 융합을 제조하는데 사용될 수 있었다. 혹은, C. fimi의 다른 셀룰라제또는 다른 근원으로부터의 셀룰라제의 CBDs을 사용할 수 있었다. B.napus의 올레오신을 cDNA라이브러리에서 분리하였으며(van Rooijen, 1993, Ph.D. Thesis, Universtiy of Calgary), 이 올레오신 유전자를 PCR 방법으로 pGN에 클로닝하여 실시예 4에 기재된 대로 pOLEGN을 생성하였다. 본 기술분야의 전문가에게 알려진 표준 분자적 기술로 올레오신 유전자와 CBD 유전자간에 프레임내의 융합을 했다. 최종 구조물은 올레오신의 바로 하류에 번역적으로 융합된 CBD 도메인을 포함한다.
형질전환과 재생
식물에 융합 유전자를 도입하기 위해서, 이분계 벡터(binary vector), 예를 들면 pCGN1559에 융합 유전자를 서브클로닝하였다. 올레오신-CBD 융합체를 발현하는 트랜스제닉 식물을 실시예1에서 기재된 대로 제조하였다.
기름체 제조
실시예 1에 기재된 대로 대조 야생형 식물과 트랜스제닉 식물의 종자에서 세척된 기름체를 제조하였다.
기름체 친화성 매트릭스를 사용하여 용액으로부터 셀룰로스의 제거
기름체 친화성 매트릭스에 대한 셀룰로스의 결합을 측정하기 위해서, 야생형과 트랜스제틱 식물체의 기름체의 결합능력을 비교하였다. 셀룰로스를 다양한 범위로 포함한 적절한 완충용액과 기름체를 혼합하였다. 적절한 온도 및 적절한 시간동안 기름체 현탁액을 반응시켰다. 원심분리하여, 하등액을 회수하고 셀룰로스 농도에 대해 분석하였다. 결합된 셀룰로스 농도와 자유 셀룰로스 농도를 다음의 가정하에 계산할 수 있다:
자유 셀룰로스 농도에 대한 결합된 셀룰로스의 농도의 비율을 결합된 셀룰로스의 농도의 함수로서 도표화하였다. 실시예 2에 자세히 기술된 대로 이 도표로부터 다음의 표준 방법으로 분해상수를 계산할 수 있었다(Scatchard, G. Ann. N. Y. Acad. Sci. (1949) 57: 660-672).
실시예 8
핵산의 분리
다음의 실시예는 단일사슬 핵산에 결합하는데 기름체를 사용하는 방법을 기술하고 있다.
단일사슬 핵산의 분리
단일사슬 핵산을 포착하는 방법은 진단, 예를 들면 식물 바이러스 질병에 사용되거나, 발현되는 유전자의 분획 스크리닝을 위한 혼성화 반응과 같은 용액에서 선택적으로 단일사슬 핵산만을 제거할 필요가 있는 연구에서 사용될 수도 있다. 올레오신을 단일사슬 DNA나 RNA에 결합하는 단백질 또는 이들의 특이적인 도메인과 융합할 수 있어, 동정이나 추가적인 증폭을 위한 단일사슬 핵산의 포획에도 사용될 수 있다. 단일사슬 핵산에 결합하는 잘 특징화된 단백질은 다음을 포함한다: Agrobacterium의 Ti 플라스미드 Vir E2 단백질(Zupan et al., 1995, Plant Physiol. 107:1041-1047); 담배 모자이크 바이러스(TMV) 이동 단백질 P30(Citovsky et al., 1990: Cell 60: 637-647; Vaigmann et al., 1994 Proc Natl. Acad. Sci (USA) 91:1433-1437); Cauliflower Mosaic Virus coat protein(Thompson et al., 1993; J. Gen. Virol. 74L 1141-1148) 및 E.coli Rec A 및 단일사슬 결합 단백질(SSB)(Radding , 1999, J. Biol. Chem. 266: 5355-5358).
실시예 9
재조합 단백질의 분리
다음의 실시예는 추가로 재조합 표적분자의 정제용 기름체 친화성 매트릭스의 용도를 설명하고 있다. 이 실시예를 위해서, IgG/단백질 A 리간드 쌍을 선택했다. 사용된 구조물을 18kDa Arabidopsis 올레오신에 융합된 단배질 A 도메인으로 구성된다(van Rooijen et al., 1992; Plant Mol. Biol. 18:1177-1179). 올레오신-단백질 A 융합 단백질을 함유하는 기름체를 분리하여 호스래디쉬 퍼옥시다제에 컨쥬게이트된 토끼-항-마우스 IgGs의 특이적 결합을 설명한다. 기름체상에서 올레오신-단백질 A 융합체의 배열 및 융합체에 대한 IgG의 결합을 도 15에 나타냈다.
올레오신-단백질 A 융합
보고된 서열정보(pRIT2T, 단백질 A 유전자 융합 벡터; Pharmacia)에 기초하여 IgG에 결합할 수 있는 단백질을 코딩하는 합성 단백질 A 서열을 합성하고, PCR를 통해 증폭하였다. 클로닝을 용이하게 하도록, PCR에 사용된 각 프라이머는 단백질A-특이적 서열에 대한 5' 제한 효소자리를 함유하였다. 역방향 프라이머(즉, 안티센스 방향에서의 프라이머)도 또한 코딩서열에 이어서 번역종료코돈을 함유했다. 도 13은 단백질 A에 대한 PCR프라이머의 상대적인 위치를 보여준다. (단백질 A서열과 프라이머 서열은 또한 각각 SEQ ID NO:10 및 SEQ ID NO:11에 나타냈다) 번역 종료 코돈이 제거된 코딩서열(인트론이 있는 것)과 867 bp 상류 프로모터 영역으로 이루어진 Arabidopsis 올레오신 유전자을 운반하는 pUC19플라스미드에 상기 얻어진 단편을 접합하였다. 상기 구조물의 3'말단은 노팔린 합성효소 전사 종결인자를 함유하고 있다. 엔도프로테아제 트롬빈에 대한 인식서열을 코딩하는 스페이서 서열을 올레오신 코딩 서열의 바로 아래에 삽입하였다. 이 스페이서 서열과 전사 종결인자사이에 단백질 A유전자 서열을 삽입하였다. 최종 발현 구조물에서, 올레오신과 단백질 A 코딩영역이 동일한 리딩 프레임내에서 융합되었다. 그런 다음, 완전한 구조물(도 14 및 SEQ ID NO:12)을 pUC19플라스미드로부터 잘라내서 35S CaMV프로모터의 조절하에 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 운반하는 식물형질전환벡터 pCGN1559(McBride and Summerfelt, 1990, Plant Mol. Biol. 14:269-276)에 서브클로닝하였다. 얻어진 플라스미드를 Agrobacterium(균주 EHA 101)에 도입하였다.
형질전환과 재생
실시예 1에 기재된 대로 식물을 형질전환시키고 재생하였다. 처음에 네오마이신 포스포트랜스퍼라제을 사용하여 트랜스제닉 식물을 동정하고 이어서 이뮤노블랏 분석을 통해 단백질 A 융합체의 발현을 확인하였다.
기름체의 제조
올레오신-단백질 A 융합체를 발현하는 트랜스제닉 B.napus 및 B.carinata주의 기름체를 실시예 1에 기재된 방법으로 제조하였다.
올레오신-단백질 A융합체의 IgG에 결합
올레오신-단백질 A융합 단백질을 발현하는 트랜스제닉 B.napus주에서 얻은 기르체 단백질 추출물(20μg/분획량)을 폴리아크릴아미드 전기영동을 한 후에, 표준 방법에 따라서 PVDF막으로 전달하였다. HRP-컨주게이트 마우스 항-토끼 항체로 상기 막을 탐침하여 실험실 매뉴얼에 기재된 항체 설명대로 과정으로 본다(harlow and lane, 1988, Cold Spring Harbor). 도 16에서, 염색된 PVDF막을 보여준다. 테스트한 6개 트랜스제닉 B.napus의 모든 단백질 추출물에서 50kDa 단백질(올레오신-단백질 A 융합 단백질의 예측된 분자량은 48,801 Da임)을 특이적으로 탐지하였다. 형질전환도지 않은 대조 식물은 HRP활성을 나타내지 않으나, 30kDa 단백질(예상된 분자량은 29,652 Da)이 단백질 A를 코딩하는 pRIT2T로 형질전환된 박테리아 용해물에서 존재하나 형질전환되지 않은 용해물에서는 탐지되지 않았다.
올레오신-단백질 A 융합 단백질에 대한 IgGs의 결합과 용출
실시예 1에 기재된 대로 올레오신-단백질 A를 발현하는 구조물로 형질전환된 B.napus 및 야생형 B.napus로부터 세척된 기름체 (10 mg/ml 단백질)을 제조하였고, 10mM Tris-HCl pH 8.0에서 현탁하였다. 1배의 2㎕(±34 μg)의 HRP-컨쥬게이트 토끼 항-마우스 항체(Sigma, cat no A9044)를 세척된 기름체 조성물 500㎕에 첨가하고, 이 현탁액을 실온에서 1시간동안 반응시키고 4℃에서 하룻밤을 두었다. 그런 다음, 샘플을 16.000xg에서 15분간 원심분리하여 하등액을 제거하였다. 이어서, 500㎕의 10mM Tris-HCl pH 8.0에서 막자로 기름체를 완전히 재현탁하였다. Tris-HCl에서 이 세척단계를 4회 반복하였다(이후부터 이를 세척된 기름체 조성물이라 함). 세척된 기름체 조성물의 5㎕ 분획량을 5회 세척한 후에 HRP활성을 분석하였다.
HRP 분석 믹스 1 ml(9.8 ml의 0.1 M NaOAc, 0.2 ml의 DMSO에 있는 2.5mg/ml트리메틸벤지딘, 4㎕의 H2O2)에 세척된 기름체 조성물을 1㎕ 첨가함으로써 HRP분석을 수행하고, 실온에서 5분간 상기 혼합물을 반응시켰다. 그런 다음, 0.5ml의 1M H2SO4를 첨가하여 반응을 종료시켰다. 이 샘플을 0.22 μm의 필터로 여과한 후에 OD450'을 스펙트로포토미터로 측정하였다.
기름체로부터 IgGs를 용출하기 위해서, 세척된 기름체 조성물을 100 mM 글리신 pH 3.0에서 재현탁하고 16,000 xg에서 15분간 원심분리하고, 실온에서 30분간 반응시켰다. 500㎕의 10mM Tris-HCl pH 8.0에서 중성화한 후에, 기름체 부분과 용출액 부분 모두를 HRP활성에 대해 상술한 바와 같이 분석하였다. 야생형 및 올레오신-단백질 A 융합체를 발현하는 트랜스제닉 B.napus의 기름체에 대한 IgGs의 결합과 용출을 도 17에서 예시하였다.
모든 간행물, 특허 및 특허출원이 구체적 및 개별적으로 그 전체로서 참고문헌으로 병합됨을 나타낸 것과 동일한 정도로 그 전체를 참고문헌으로 본명세서에 병합하였다.
Claims (36)
1) 표적분자가 기름체에 결합하도록 하도록 (ⅰ) 기름체와 (ⅱ) 표적분자를 포함하는 샘플을 접촉하고,
2) 표적분자가 결합된 기름체를 상기 샘플로부터 분리하는 것으로 이루어지는, 샘플로부터 표적분자를 분리하는 방법.
제 1항에 있어서, 추가로 기름체 및 표적분자와 결합할 수 있는 리간드 분자를포함하는 방법.
제 2항에 있어서, 상기 리간드 분자가 상기 기름체에 공유적으로 부착된 것인 방법.
제 3항에 있어서, 상기 리간드 분자가 기름체에 있는 기름체 단백질에 공유적으로 부착된 것인 방법.
제 2항에 있어서, 상기 리간드는 두 분자로 이루어져 있고, 첫번째 분자는 기름체에 결합하고 두 번째 분자는 표적분자와 결합하며 상기 첫 번째 분자와 두 번째 분자가 서로 결합하는 것인 방법.
제 5항에 있어서, 상기 첫 번째와 두 번째 리간드 분자가 서로 컨쥬게이트(conjugate)된 것인 방법.
제 4항에 있어서, 상기 리간드 분자가 단백질인 방법.
제 7항에 있어서, 상기 단백질 리간드가 기름체 단백질과의 융합 단백질인 방법.
제 1항 내지 8항중 어느 한항에 있어서, 상기 표적분자는 단백질, 펩타이드, 유기분자, 지질, 탄수화물, 핵산, 세포, 세포기관, 세포 구성성분, 바이러스, 금속, 금속 이온 및 이온으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
제 8항에 있어서, 상기 리간드 분자가 히루딘이고 표적분자는 트롬빈인 방법.
제 8항에 있어서, 상기 리간드 분자가 단백질 A이고 표적분자는 이뮤노글로불린인 방법.
제 8항에 있어서, 상기 리간드 분자가 메탈로티오네인이고 표적분자는 카드뮴인 방법.
제 8항에 있어서, 상기 리간드 분자가 셀룰로스 결합 단백질이고 표적분자는 셀룰로스인 방법.
제 8항에 있어서, 상기 리간드 분자가 핵산 결합 단백질이고 표적분자는 핵산인 방법.
제 14항에 있어서, 상기 리간드는 단일사슬 DNA 결합 단백질 또는 RNA 결합단백질이고 표적분자는 단일사슬 핵산 분자인 방법.
제 2항에 있어서, 상기 리간드는 기름체 또는 기름체 단백질에 결합하는 항체인 방법.
제 16항에 있어서, 상기 표적분자는 리간드 항체에 결합할 수 있는 세포, 세포 기관, 또는 세포구성성분인 방법.
제 16항에 있어서, 상기 세포는 Staphylococcus aureus인 방법.
제 16항에 있어서, 상기 리간드는 기름체와 표적에 모두 결합하는 이가 항체인 방법.
제 6항에 있어서, 상기 리간드는 아비딘에 컨쥬게이트된 항체이고 표적분자는 바이오틴인 방법.
제 4항, 7항, 8항, 9항, 10항, 11항, 12항, 13항, 14항 및 15항중 어느 한항에 있어서, 상기 기름체 단백질이 올레오신인 방법.
제 21항에 있어서, 상기 올레오신은 평지씨(Brassica spp.), 대두(Glycine max), 해바라기(Helianthus annuus), 기름야자나무(Elaeis guineeis), 코코넛(Cocus nucifera), 캐스터(Ricinus communis), 잇꽃(Carthamus tinctorius), 겨자(Brassica spp. and Sinapis alba), 고수풀(Coriandrum sativum), 아마씨/아마(linum uoitatissimum), 탈레 크레스(Arabidopsis thaliana) 및 옥수수(Zea mays)로 이루어진 군에서 선택되는 식물로부터 유래된 것인 방법.
제 1항 내지 22항중 어느 한항에 있어서, 단계 1)에서 상기 기름체와 샘플을 혼합한 다음, 약 1분 내지 약 24시간동안 반응하는 방법.
제 23항에 있어서, 상기 혼합된 기름체와 샘플을 약 4 ℃내지 실온의 범위에서 반응시키는 방법.
제 1항 내지 24항중 어느 한항에 있어서, 단계 2)에서 상기 표적분자가 결합된 기름체가 원심분리, 부유(floatation) 또는 크기 배제(size exclusion)에 의해서 샘플로부터 분리되는 방법.
제 1항 내지 25항중 어느 한항에 있어서, 추가로 3) 기름체로부터 표적분자를 분리하는 단계가 포함되는 방법.
제 26항에 있어서, 상기 표적분자가 적합한 조건하에 용출에 의해서 분리되는 방법.
제 1항 내지 27항중 어느 한항에 있어서, 상기 기름체는 평지씨(Brassica spp.), 대두(Glycine max), 해바라기(Helianthus annuus), 기름야자나무(Elaeis guineeis), 코코넛(Cocus nucifera), 캐스터(Ricinus communis), 잇꽃(Carthamus tinctorius), 겨자(Brassica spp. and Sinapis alba), 고수풀(Coriandrum sativum), 아마씨/아마(linum uoitatissimum), 탈레 크레스(Arabidopsis thaliana) 및 옥수수(Zea mays)로 이루어진 군에서 선택되는 식물로부터 유래된 것인 방법.
분자와 결합된 기름체로 이루어지는 조성물.
제 29항에 있어서, 상기 분자는 유기분자, 지질, 탄수화물, 핵산, 세포, 세포기관, 세포 구성성분, 바이러스, 금속, 금속이온, 및 이온으로 이루어진 군에서 선택된 표적분자인 조성물.
제 30항에 있어서, 추가로 표적분자 및 기름체와 결합하는 리간드분자를 포함하는 조성물.
제 29항에 있어서, 상기 분자가 리간드 분자인 조성물.
제 31항 또는 32항에 있어서, 상기 리간드 분자가 기름체에 공유적으로 부착된 조성물.
제 33항에 있어서, 상기 리간드가 바이오틴인 조성물.
표적분자에 결합할 수 있는 기름체로 이루어지는, 샘플로부터 표적분자를 분리하는데 사용되는 친화성 매트릭스.
(a) 기름체와 (b)상기 기름체에 결합하는 리간드 분자로 이루어지며, 상기 리간드 분자는 표적분자에 결합할 수 있는 것인, 샘플로부터 표적분자를 분리하는데 사용되는 친화성 매트릭스.
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