CN117042791A - 碱性磷酸酶多肽及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明的特征在于包含可溶性碱性磷酸酶的药物组合物，其用于治疗骨矿化病症诸如低磷酸酯酶症(HPP)及其症状。所述多肽包含可溶性碱性磷酸酶(sALP)或其片段，其来源于天然存在的碱性磷酸酶(ALP)。

Description

碱性磷酸酶多肽及其使用方法

序列表

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背景技术

低磷酸酯酶症(HPP)是一种罕见的遗传性骨骼疾病，对于最严重的疾病形式的发病率为每100,000名新生儿中有1人患有这种疾病。这种病症通常是由编码组织非特异性碱性磷酸酶(TNSALP)的基因的功能丧失突变引起的。HPP表现出一系列显著的症状和严重程度，从牙齿过早脱落到子宫内几乎完全没有骨矿化。HPP的表现在受试者之间显著不同，并且在受试者年龄之间也显著不同。许多患有HPP的受试者表现出骨骼变化、身材矮小、慢性疼痛、下肢疼痛、步态障碍以及过早、非外伤性牙齿脱落。

阿法酸酶α(Asfotase alfa)(Alexion Pharmaceuticals，Inc.，一种包含TNSALP的可溶性片段的重组产生的酶替代疗法(ERT))是可用于HPP受试者的第一种ERT。阿法酸酶α对HPP的最严重形式表现出变革性的作用，如通过骨矿化和密度以及呼吸和运动功能、认知发育和肌肉强度的改善所证明的(Whyte等人，New Engl.J.Med.366：904-913，2012)。

发明内容

第一方面的特征在于含有与SEQ ID NO：5具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、97％、99％或100％)序列同一性的碱性磷酸酶多肽和药学上可接受的载体的药物组合物。相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列，多肽可以包含选自E108M、N213Q和N286Q的至少一种突变(例如，多肽可以含有这些突变中的两种或全部三种)。例如，多肽与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、97％、99％或100％)的序列同一性，并且含有选自E108M、N213Q和N286Q的突变中的至少一种、两种或全部三种。药学上可接受的载体可以包含磷酸盐、脯氨酸和蔗糖中的一种或多种。例如，多肽可以包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，多肽的碱性磷酸酶部分与SEQ ID NO：3具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、97％、99％或100％)的序列同一性。该多肽还可以连接至Fc区(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)和/或聚天冬氨酸区。在一些实施方案中，多肽包含IgG2/4Fc区，例如与SEQ ID NO：4具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、97％、99％或100％)的同一性。聚天冬氨酸可以包含例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个天冬氨酸残基。在一些实施方案中，聚天冬氨酸包含十个天冬氨酸残基(D10)。

组合物可以配制成含有约0.1mg/mL至约200mg/mL(例如，约1、10、20、25、50、75、100、125、150、175或200mg/mL)剂量的碱性磷酸酶多肽。组合物可以配制成约0.1mL至约50mL(例如，约0.1至约10mL，例如，约0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL、0.9mL或1.0mL，例如，约1mL至约10mL，例如，约2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL或10mL)的体积。在一些实施方案中，组合物配制成约1mL)。例如，组合物可以含有100mg/mL与SEQ ID NO：5的序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、97％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO：5的序列的碱性磷酸酶多肽(例如，多肽含有选自SEQ ID NO：5的E108M、N213Q和N286Q的突变中的至少一种、两种或全部三种)和药学上可接受的载体。

组合物可以包含磷酸盐(例如，磷酸钠)，例如浓度为约1mM至约100mM或约5mM至约20mM，例如约2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM，例如约10mM。组合物还可以包含脯氨酸和/或蔗糖。组合物还可以包含脯氨酸。组合物还可以包含蔗糖。例如，组合物可以包含约1mM至约500mM脯氨酸，例如约70mM至约280mm，例如约50mM至约200mM，例如约2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM、200mM、300mM、400mM或500mM，例如约140mM脯氨酸和/或约1mM至约500mM蔗糖，例如约70mM至约280mm，例如约50mM至约200mM，例如约2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM、200mM、210、mM、220mM、230mM、240mM、250mM、260mM、270mM、280mM、290mM、300mM、350mM、400mM、450mM或500mM，例如约140mM蔗糖或约210mM蔗糖。在一些实施方案中，组合物包含约1∶0至约1∶3(例如，约1∶1)的摩尔比的脯氨酸∶蔗糖。在一些实施方案中，制剂包含约1mM至约500mM脯氨酸(例如，约50mM至约200mM脯氨酸，例如，约140mM脯氨酸)和约1mM至约500mM蔗糖(例如，约40mM至约280mM，例如，约50mM至约200mM蔗糖，例如，约140mM或约210mM蔗糖)。在一些实施方案中，制剂包含约140mM脯氨酸。在一些实施方案中，制剂包含约140mM蔗糖。在一些实施方案中，制剂包含约210mM蔗糖。在一些实施方案中，制剂包含约210mM蔗糖并且不包含脯氨酸。在一些实施方案中，制剂包含约140mM脯氨酸和约140mM蔗糖。在一些实施方案中，制剂包含约140mM脯氨酸、和约140mM蔗糖和约10mM磷酸盐(例如，磷酸钠)。在一些实施方案中，制剂包含约210mM蔗糖和约10mM磷酸盐(例如，磷酸钠)。制剂还可以包含约0.01％至约0.5％聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯，例如约0.01％至约0.1％聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯，例如约0.05％聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯。聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯可以是例如聚山梨醇酯80(PS80)。在一些实施方案中，组合物在约pH 7.0至约pH 7.6(例如，约pH 7.1、7.2、7.3、7.4、7.5或7.6，例如，约pH 7.3)的pH下配制。在一些实施方案中，组合物包含约10mM磷酸盐、约140mM脯氨酸、约140mM蔗糖和约0.05％聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯(例如，PS80)，pH为约7.3。

组合物可以是配制成含有多肽(例如，SEQ ID NO：5及其与其具有至少约85％序列同一性的变体的多肽(例如，多肽是含有选自SEQ ID NO：5的E108M、N213Q和N286Q的突变中的一种、两种或全部三种的多肽))的溶液的药物组合物。药物组合物可以含有例如约0.1mg/mL至约200mg/mL，诸如约100mg/mL的量的多肽。药物组合物可以配制用于皮下施用，例如多肽剂量为约0.1mg/mL至约10mg/mL。组合物可以配制在约0.1mL至约50mL(例如，约0.1至约10mL，例如，约0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL、0.9mL或1.0mL，例如，约1mL至约10mL，例如，约2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL或10mL)的体积的溶液中。在一些实施方案中，组合物配制成约1mL。溶液可以含有约10mM磷酸盐、约140mM脯氨酸、约140mM蔗糖和约0.05％聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯(例如，PS80)，pH为约7.3。

特征还在于含有如本文所述的药物组合物的小瓶。小瓶可以含有溶液(例如，约10mM磷酸钠、约140mM脯氨酸、约140mM蔗糖和约0.05％聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯(例如，PS80)，pH为约7.3)，该溶液含有例如约0.1mL至约10mL(例如，约1mL)的体积的多肽(例如，量为约0.1mg至约1.0g(例如，约10mg至约200mg))。小瓶可以含有例如约0.1mg/mL至约500mg/mL、约1mg/mL至约200mg/mL、约50mg/mL至约150mg/mL或约100mg/mL的量的多肽。多肽可具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列或其与其具有至少85％序列同一性的变体(例如，多肽是含有选自SEQ ID NO：5的E108M、N213Q和N286Q的突变中的一种、两种或全部三种的多肽)。

第二方面的特征在于一种通过向有需要的受试者(例如，人受试者)施用第一方面的药物组合物来治疗受试者的骨矿化病症或具有骨表现的疾病(例如，选自由以下组成的组的疾病：低磷酸酯酶症(HPP)、骨折、骨质疏松症、硬化性骨化病、软骨钙质沉着病、张力减退、杜氏肌营养不良、气管支气管软化症、癫痫、神经纤维瘤病(例如，NF-1)和颅缝早闭，或其一种或多种症状)的方法。组合物可以以足以治疗疾病或减轻其一种或多种症状的量和持续时间施用。治疗可以增强受试者的骨形成。多肽可用于治疗肌无力。

多肽或含有其的药物组合物可以以约0.01mg/kg至约60mg/kg(例如，约0.1mg/kg至约50mg/kg，例如，约0.1mg/kg至约20mg/kg，或例如，约0.1mg/kg至约10mg/kg)的剂量施用。多肽可以每天、每周、每月或每年施用一次(例如，每周一次)。在一些实施方案中，多肽每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用一次或多次。多肽可以每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或更长时间施用。多肽可以以约0.01mg/kg/周至约50mg/kg/周(例如，约0.01mg/kg/周至约40mg/kg/周，例如，约0.1mg/kg/周至约20mg/kg/周，或例如，约0.1mg/kg/周至约10mg/kg/周)的剂量施用。多肽可以施用至少一天、一周、一个月、一年或更长时间(例如，受试者的一生)。

多肽或含有其的药物组合物可以皮下、静脉内、肌内、舌下、鞘内或皮内施用。具体地，多肽或含有所述多肽的组合物可以通过皮下或静脉内施用来施用。

在一些实施方案中，将药物组合物皮下(例如，在腹部或大腿中)施用。例如，可以将约10mg至约100mg(例如，约10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg或100mg，例如，约15mg、45mg或90mg，诸如约15mg、45mg或90mg)皮下施用于受试者，例如，每周一次或两次，例如，持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多周或更长时间(例如，持续受试者的一生)。组合物可以以例如约5mL或更少的体积(例如，4.0mL、3.0mL、2.0mL、1.0mL、0.9mL、0.8mL、0.7mL、0.6mL、0.5mL、0.4mL、0.3mL、0.2mL或0.1mL，或约5mL至约0.1mL范围内的体积)施用。

在一些实施方案中，将药物组合物静脉内(IV)施用。例如，可以将约10mg至约100mg(例如，约10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg或100mg，例如，约15mg、45mg或90mg)静脉内施用于受试者，例如，每周一次或两次，例如，持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多周(例如，持续3周)或更长时间(例如，持续受试者的一生)。例如，将药物组合物通过IV以约5mL或更小的体积(例如，4.0mL、3.0mL、2.0mL、1.0mL、0.9mL、0.8mL、0.7mL、0.6mL、0.5mL、0.4mL、0.3mL、0.2mL或0.1mL，或约5mL至约0.1mL范围内的体积)施用。

在一些实施方案中，将药物组合物静脉内和皮下(例如，在腹部或大腿中)施用。例如，药物组合物以组合静脉内和皮下(例如，在腹部或大腿中)施用的治疗方案施用。例如，组合物可以首先以约10mg至约100mg(例如，约10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg或100mg，例如，约15mg、45mg或90mg)的量以单剂量静脉内施用于受试者，接着随着时间的推移以一个或多个剂量皮下施用(例如，在腹部或大腿中)于受试者。例如，皮下剂量可以为约10mg至约100mg(例如，约10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg或100mg，例如，约15mg、45mg或90mg，诸如约15mg、45mg或90mg)。皮下剂量可以例如每周一次或两次、每两周一次、每三周一次或每四周一次施用，例如，持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50或更多周，或持续更长时间(例如，持续1-10年，或持续受试者的一生)。静脉内和皮下剂量可以以例如约5mL或更少的体积(例如，4.0mL、3.0mL、2.0mL、1.0mL、0.9mL、0.8mL、0.7mL、0.6mL、0.5mL、0.4mL、0.3mL、0.2mL或0.1mL，或约5mL至约0.1mL范围内的体积)施用。

受试者可以是人受试者，诸如新生儿、婴儿、儿童、青少年或成人。

在一些实施方案中，重组碱性磷酸酶多肽的TSAC为约1.0mol/mol至约6.0mol/mol。在一些实施方案中，TSAC为约1.2mol/mol至约6.0mol/mol重组碱性磷酸酶。在一些实施方案中，TSAC为约1.5mol/mol至约6.0mol/mol重组碱性磷酸酶。在一些实施方案中，TSAC为约3.0mol/mol至约6.0mol/mol重组碱性磷酸酶。在一些实施方案中，TSAC为约3.2mol/mol至约5.9mol/mol重组碱性磷酸酶。在一些实施方案中，TSAC为约0.9mol/mol、约1.0mol/mol、约1.1mol/mol、约1.2mol/mol、约1.3mol/mol、约1.4mol/mol、约1.5mol/mol、约1.6mol/mol、约1.7mol/mol、约1.8mol/mol、约1.9mol/mol、约2.0mol/mol、约2.1mol/mol、约2.2mol/mol、约2.3mol/mol、约2.4mol/mol、约2.5mol/mol、约2.6mol/mol、约2.7mol/mol、约2.8mol/mol、约2.9mol/mol、约3.0mol/mol、约3.1mol/mol、约3.2mol/mol、约3.3mol/mol、约3.4mol/mol、约3.5mol/mol、约3.6mol/mol、约3.7mol/mol、约3.8mol/mol、约3.9mol/mol、约4.0mol/mol、约4.1mol/mol、约4.2mol/mol、约4.3mol/mol、约4.4mol/mol、约4.5mol/mol、约4.6mol/mol、约4.7mol/mol、约4.8mol/mol、约4.9mol/mol、约5.0mol/mol、约5.1mol/mol、约5.2mol/mol、约5.3mol/mol、约5.4mol/mol、约5.5mol/mol、约5.6mol/mol、约5.7mol/mol、约5.8mol/mol、约5.9mol/mol或约6.0mol/mol重组碱性磷酸酶。在一些实施方案中，TSAC为约3.2mol/mol重组碱性磷酸酶。在一些实施方案中，TSAC为约5.0mol/mol重组碱性磷酸酶。在一些实施方案中，TSAC为约5.9mol/mol重组碱性磷酸酶。

在一些实施方案中，组合物包含约10mM磷酸盐、约140mM脯氨酸、约140mM蔗糖、约0.05％聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯(例如，PS80)，pH为约7.3，并且TSAC值为约3.0mol/mol至约6.0mol/mol。

在一些实施方案中，该方法在受试者的血液中产生约50μg×小时/mL至约4000μg×小时/mL的AUC_0-168h。例如，该方法可以在受试者的血液中产生约1000μg×小时/mL至约3000μg×小时/mL的AUC_0-168h。在一些实施方案中，该方法在受试者的血液中产生约0.5μg/mL至约25μg/mL的C_max。例如，该方法可以在受试者的血液中产生约0.6μg/mL至约20μg/mL的C_max。

定义

术语“约”是指所列举值的±10％。除非另有明确说明，否则本文报告的所有测量值均应理解为由术语“约”修饰，无论是否明确使用该术语。

术语“骨靶向部分”意指长度为至少3个氨基酸残基的氨基酸序列，其对骨基质具有足够的亲和力，使得单独的骨靶向部分对骨基质具有至少约1×10^-5M或更大(例如，约10^-6M、约10^-7M、约10^-8M、约10^-9M或更大)的体内结合亲和力。

如本文所用，术语“具有催化能力”是指水解骨矿化抑制剂无机焦磷酸盐(PPi)以提供无机磷酸盐(Pi)，从而降低PPi的细胞外浓度的sALP。因此，具有催化能力的sALP通过调节PPi的浓度来改善骨骼矿化。

术语“Fc”意指免疫球蛋白(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的片段可结晶区，包括免疫球蛋白重链的CH2和CH3结构域。Fc也可以包括连接Fab和Fc区的铰链区的任何部分。Fc可以源自任何哺乳动物，包括人，并且可以被翻译后修饰(例如，通过糖基化或唾液酸化)。在一个非限制性示例中，Fc可以是SEQ ID NO：4的人IgG2/4片段可结晶区。

“片段”意指多肽或核酸分子的一部分，其优选地含有参考核酸分子或多肽的全长的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。片段可以含有例如10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、500、600、700、800、900、1,000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100个或更多个核苷酸，直至核酸分子的全长，或10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、400、500、600、700个或更多个氨基酸残基，直至多肽的全长。

如本文所用，术语“低磷酸酯酶症”和“HPP”是指由例如编码组织非特异性碱性磷酸酶(TNSALP)的ALPL(碱性磷酸酶，肝/骨/肾)基因中的一或多个功能丧失突变引起的罕见的遗传性骨骼病症。HPP还可以表征为婴儿HPP、儿童HPP、围产期HPP(例如，良性围产期HPP或致死性围产期HPP)、牙质HPP、青少年HPP或成人HPP。例如，“儿童HPP”描述约5岁至约12岁的患有HPP的受试者，“青少年HPP”描述约13岁至约17岁的患有HPP的受试者，并且“成人HPP”描述约18岁或更大的患有HPP的受试者。如本文所用，术语“成人HPP”是指特征在于存在一种或多种以下症状的疾患或表型：无机焦磷酸盐(PPi)的血液和/或尿液水平升高、矿化不足、高钙尿症、一种或多种骨骼畸形、张力减退、肌肉无力、类风湿并发症、蹒跚步态、行走困难、骨痛、疼痛、骨折、焦磷酸钙二水合物晶体沉积、假性痛风、关节炎、焦磷酸盐关节病、软骨钙质沉着病、钙化性关节炎和假性骨折。如本文所用，术语“青少年HPP”是指特征在于存在一种或多种以下症状的疾患或表型：血液或尿液PPi、PEA或PLP水平升高；骨软化、一种或多种骨骼畸形、张力减退、肌肉无力、类风湿并发症、关节炎、假性痛风、蹒跚步态、行走困难、骨痛、疼痛、牙齿过早脱落、矿化不足、肺发育不全、呼吸功能不全、癫痫发作、高钙尿症、身材矮小和生长迟缓。如本文所用，术语“儿童HPP”是指特征在于存在一种或多种以下症状的疾患或表型：血液或尿液PPi、PEA或PLP水平升高；佝偻病、佝偻性肋骨、一种或多种骨骼畸形、张力减退、肌肉无力、类风湿并发症、关节炎、假性痛风、蹒跚步态、行走困难、骨痛、疼痛、牙齿过早脱落、矿化不足、运动发育迟缓、癫痫发作、高钙尿症、身材矮小、骨折、假性骨折和生长迟缓。

术语“核酸”或“核酸分子”意指具有两个或更多个共价结合的、天然存在的或修饰的核苷酸的序列的聚合分子，例如RNA或DNA。核酸分子可以是例如单链或双链的，并且可以包括修饰的或未修饰的核苷酸、或其混合物或组合。还包括核酸分子的各种盐、混合盐和游离酸形式。

“治疗”是指对受试者的医学管理，其目的是治愈、改善、稳定疾病状况诸如HPP(例如，儿童、青少年或成人HPP)或其一种或多种症状、降低其可能性，或预防疾病状况例如HPP(例如，儿童，青少年或成人HPP)或其一种或多种症状，和/或管理表现出或可能患有疾病状况诸如HPP的受试者，例如通过施用药物组合物(例如，如本文所述的sALP)。治疗(以及本文使用的其他形式)包括积极治疗，即，专门针对疾病、病理疾患、病症或事件的改善或与疾病、病理疾患、病症或事件的治愈相关的治疗，并且还包括病因治疗，即，针对相关疾病、病理疾患、病症或事件的病因的消除的治疗。此外，该术语包括姑息治疗，即，设计用于减轻或改善至少一种症状而不是治愈疾病、病理疾患、病症或事件的治疗；对症治疗，即，针对相关疾病、病理疾患、病症或事件的全身症状的治疗；预防性治疗，即，针对最小化或部分或完全抑制相关疾病、病理疾患、病症或事件的发展的治疗，例如在尚未患病但易患特定疾病、病理疾患、病症或事件或以其他方式处于特定疾病、病理疾患、病症或事件的风险中的受试者中；以及支持性治疗，即，用于补充针对相关疾病、病理疾患、病症或事件的改善的另一种特定疗法的治疗。

术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指两个或更多个天然或非天然氨基酸残基的任何链，无论翻译后修饰(例如，糖基化、唾液酸化或磷酸化)如何，其构成天然存在或非天然存在的多肽或肽的全部或部分，如本文所述。

术语“sALP”、“可溶性碱性磷酸酶”和“碱性磷酸酶的胞外结构域”可互换使用(除非上下文另有说明)，意指可溶性、非膜结合的碱性磷酸酶或其生物活性片段或变体。sALP包括例如缺乏C末端GPI信号序列的碱性磷酸酶，以及保留碱性磷酸酶活性(例如，水解PPi或其他天然或人工底物的能力)的其他变体和类似物。除非另有说明，否则这包括对应于TNSALP、PALP、GLALP和IALP的胞外结构域的可溶性片段及其生物活性片段或变体。成熟的sALP缺乏GPI膜锚和信号肽，其在加工过程中被切割。

术语“ALP”和“碱性磷酸酶”是指能够水解PPi或其他天然或人工底物的天然存在的碱性磷酸酶，诸如TNSALP、PALP、GLALP和IALP。

术语“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”是指对于所治疗的受试者是生理学上可接受的同时保留与其一起施用的化合物的治疗性质的载体或赋形剂。一种示例性的药学上可接受的载体物质是生理盐水。其他生理学上可接受的载体及其制剂是本领域技术人员已知的，并且例如在Remington′s Pharmaceutical Sciences(Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第22版，Allen编辑，2012)中进行了描述。

术语“药物组合物”意指含有与药学上可接受的赋形剂一起配制的如本文所述的多肽或核酸分子的组合物，并且包括经政府监管机构批准作为用于治疗或预防受试者的疾病或事件的治疗方案的一部分而制造或销售的那些。药物组合物可以配制成例如用于皮下施用(例如，在腹部或大腿中)、静脉内施用(例如，作为不含颗粒栓子的无菌溶液并且在适于静脉内使用的溶剂系统中)、用于口服施用(例如，片剂、胶囊、囊片、胶囊锭或糖浆)，或本文所述的任何其他制剂，例如以单位剂量形式。

术语“受试者”是指哺乳动物，包括但不限于人或非人哺乳动物，诸如牛、马、犬、绵羊或猫。

术语“治疗有效量”是指足以基本上治疗、预防、延迟、抑制或阻止本文所述的疾病或病症、特别是HPP的任何症状的本文所述的多肽或核酸分子的量。本文所述的组合物的治疗有效量可以取决于所治疗的病症的严重程度以及受试者的状况、体重和一般状态，并且可以由普通技术人员考虑此类因素来确定。可以将治疗有效量的本文所述的组合物在一段时间内以单剂量或以多剂量施用的形式施用于受试者。

如本文所用，术语“总唾液酸含量”或“TSAC”是指特定蛋白质分子上唾液酸(碳水化合物)的量。它表示为每摩尔蛋白质掺入的唾液酸的摩尔数，或“mol/mol”。TSAC浓度在纯化过程中测量。例如，TSAC定量的一种方法是使用酸水解从碱性磷酸酶中释放TSAC，随后使用具有脉冲安培检测技术的高效阴离子交换色谱法(“HPAE-PAD”)通过电化学检测来检测释放的TSAC。

术语“唾液酸”通常是指神经氨酸(一种具有九个碳原子的主链的单糖)的N-或O-取代的衍生物。唾液酸也可以特指化合物N-乙酰基神经氨酸，有时缩写为Neu5Ac或NANA。唾液酸的存在可能影响糖蛋白从血清中的吸收、血清半衰期和清除，以及糖蛋白的物理、化学和免疫原性特性。在本公开的一些实施方案中，与碱性磷酸酶例如ALP201相关的唾液酸影响生理条件下分子的体内暴露和半衰期。在一些实施方案中，对碱性磷酸酶的总唾液酸含量(TSAC)的精确且可预测的控制用作质量控制属性。

如本文所用，当多肽或核酸序列被称为与参考序列具有“至少X％序列同一性”时，是指当序列被最佳比对时，多肽或核酸中至少X％的氨基酸残基或核苷酸与参考序列相同。序列的最佳比对可以由本领域技术内的多种方式来确定，例如，Smith Waterman比对算法(Smith等人，J.Mol.Biol.147：195-7，1981)和BLAST(基本局部比对搜索工具；Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-10，1990)。这些和其他比对算法可以使用公开可用的计算机软件诸如并入GENEMATCHERPLUS^TM(Schwarz和Dayhof，Atlas of Protein Sequence andStructure，Dayhoff，M.O.编辑，第353-358页，1979)的“Best Fit”(Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics，482-489，1981)、BLAST、BLAST-2、BLAST-P、BLAST-N、BLAST-X、WU-BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2、CLUSTAL或Megalign(DNASTAR)来获得。此外，本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的长度上实现最佳比对所需的任何算法。

词语“优选的”和“优选地”是指在某些情况下可以提供某些益处的所公开的化合物、组合物和方法的实施方案。然而，在相同或其他情况下，其他实施方案也可以是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的列举并不意味着其他实施方案没有用，并且该术语的使用并不旨在将其他实施方案排除在本公开的范围之外。

对于本文公开的包括离散步骤的任何方法，这些步骤可以以任何可行的顺序进行；此外，适当时，可以同时进行两个或更多个步骤的任何组合。

上述概述并非旨在描述所公开的化合物、组合物和方法的每个所公开的实施方案或每个实施方式。下面的描述更具体地例示了说明性实施方案。在整个申请的几个地方，可以通过示例列表来提供指导，这些示例可以以各种组合使用。在每种情况下，所列举的列表仅用作代表性组，而不应被解释为排他性列表。

所有标题都是为了方便读者，并且不应用于限制标题后的文本的含义，除非这样指定。

附图说明

图1是一组饱和曲线，示出了对于ALP201(SEQ ID NO：5；左)和阿法酸酶α(SEQ IDNO：6；右)增加的PPi水平与PPi水解速率的关系。

图2是一组饱和曲线，示出了对于ALP201(左)和阿法酸酶α(右)增加的PLP水平与PLP水解速率的关系。

图3是示出给药组在研究结束时Akp2GW(-/-)小鼠血浆中活性碱性磷酸酶浓度的图。缩写：q1w＝每周一次；q2d＝每2天一次；qd＝每天一次。

图4是示出第36/37天研究结束时小鼠股骨组织碱性磷酸酶活性水平的图。缩写：q2d＝每2天一次；qd＝每天一次。

图5是在36天功效研究中用ALP201和阿法酸酶α处理的Akp2GW(-/-)小鼠的一组代表性存活曲线。缩写：MED＝最小有效剂量；PBS＝磷酸盐缓冲盐水；q1w＝每周一次；q2d＝每2天一次；qd＝每天一次。

图6是示出ALP201和阿法酸酶α剂量-反应建模结果的比较图。缩写：ALP＝碱性磷酸酶；D-R＝剂量反应；MED＝最小有效剂量；POC＝概念验证。

图7是示出每个首次人体试验(FIH)群组的模拟人ALP201浓度-时间曲线的图。灰色区域表示90％的预测区间，即5％至95％的范围；黑色实线是模拟浓度-时间曲线的中值；LLOQ是PK测定的水平虚线；缩写：LLOQ＝定量下限(0.15μg/mL)。

图8A和图8B是示出对雄性C57BL/6小鼠静脉内(图8A)和皮下(图8B)施用后平均(SD)ALP201活性血浆浓度与时间曲线的图。

图9A和图9B是示出对雄性C57Bl/6小鼠静脉内(图9A)和皮下(图9B)施用后ALP201(TSAC＝5.9的批次)的平均(SD)ALP201活性血浆浓度与时间曲线的图。

图10A和图10B是示出对雄性C57Bl/6小鼠静脉内(图10A)和皮下(图10B)施用后ALP201(TSAC＝5.0的批次)的平均(SD)ALP201活性血浆浓度与时间曲线的图。

图11A和图11B是示出对雄性C57Bl/6小鼠静脉内(图11A)和皮下(图11B)施用后ALP201(TSAC＝3.2的批次)的平均(SD)ALP201活性血浆浓度与时间曲线的图。

图12是示出对雄性C57BL/6小鼠静脉内施用后ALP201 TSAC值(3.2、5.0和5.9)的平均(SD)ALP201活性血浆浓度与时间曲线的图。

图13是示出对雄性C57BL/6小鼠皮下施用后ALP201 TSAC变体的平均(SD)ALP201活性血浆浓度与时间曲线的图。

图14是示出在大鼠中单次IV和SC施用后ALP201和阿法酸酶α平均(±SD)血浆浓度与时间曲线的比较的图。缩写：IV静脉内；SC＝皮下，SD＝标准差。阿法酸酶α源数据：混合性别，以3mg/kg IV和SC。

图15是示出在猴中单次IV和SC施用后ALP201和阿法酸酶α平均(±SD)血浆浓度与时间曲线的比较的图。

图16是示出ALP201和阿法酸酶α剂量-反应建模的比较图。缩写：ALP＝碱性磷酸酶；D-R＝剂量反应；MED＝最小有效剂量；POC＝概念验证。

具体实施方式

特征是可溶性碱性磷酸酶多肽(例如，具有SEQ ID NO：5的序列及其与其具有至多80％或更多序列同一性的变体的那些，其中多肽含有选自SEQ ID NO：5的E108M、N213Q和N286Q的突变中的一种、两种或全部三种)、其片段及其融合蛋白、编码其的核酸分子以及使用多肽和核酸分子治疗疾病(诸如骨矿化病症，例如，低磷酸酯酶症(HPP))或其一种或多种症状的方法。所述多肽包含可溶性碱性磷酸酶(sALP)或其片段，其来源于天然存在的碱性磷酸酶(ALP)。碱性磷酸酶包括在不同组织中差异表达的多种同工酶。四种主要的ALP同工酶包括组织非特异性碱性磷酸酶(TNSALP)、胎盘碱性磷酸酶(PALP)、种系碱性磷酸酶(GLALP)和肠碱性磷酸酶(IALP)。因此，特征是来源于这些ALP同工酶的蛋白质。

本文所述的多肽配制成含有例如磷酸盐、脯氨酸和蔗糖中的一种或多种的药物组合物。这些组分赋予多肽有益的特征，诸如稳定性提高、聚集减少、截短的蛋白质产物减少和制剂中所需蛋白质产物的纯度提高。

HPP是一种罕见的遗传性骨骼疾病，对于最严重的疾病形式的发病率为每100，000名新生儿中有1人患有这种疾病。这种病症通常是由编码TNSALP的基因发生功能丧失突变引起的。HPP表现出一系列显著的症状和严重程度，从牙齿过早脱落到子宫内几乎完全没有骨矿化。HPP的表现在受试者之间显著不同，并且在受试者年龄之间也显著不同。许多患有HPP的受试者表现出骨骼变化、身材矮小、慢性疼痛、下肢疼痛、步态障碍以及过早、非外伤性牙齿脱落。由于内源性TNSALP中的功能丧失突变，患有HPP的受试者需要本文所述的多肽的功能性ALP活性以恢复天然ALP活性并提供正常的骨基质矿化。

可溶性碱性磷酸酶多肽

本文所述的多肽包括可溶性碱性磷酸酶(sALP)，诸如突变型组织非特异性碱性磷酸酶(TNSALP)或其片段。sALP可以与Fc区和序列n(“Dn”，其中n等于例如3-20)的聚天冬氨酸融合(sALP-Fc-Dn)。多肽可以包括人TNSALP，诸如人TNSALP的可溶性片段(例如，SEQ IDNO：1的残基1-491或1-485)。多肽可以包含相对于SEQ ID NO：1的突变E108M、N213Q和/或N286Q中的一种、两种或全部三种。例如，sALP可以与SEQ ID NO：2或3具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、97％、99％或100％)的同一性。Fc区可以是IgG2/4Fc区。例如，Fc区可以与SEQ ID NO：4具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、97％、99％或100％)的同一性。聚天冬氨酸可以包含例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个天冬氨酸残基。在一些实施方案中，聚天冬氨酸包含十个天冬氨酸残基(D10)。在一些实施方案中，多肽与SEQ ID NO：5具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、97％、99％或100％)的同一性。例如，多肽可以包括SEQ ID NO：5的多肽或由其组成。多肽可以由SEQ ID NO：5组成。

在一些实施方案中，多肽的碱性磷酸酶部分与SEQ ID NO：3具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、97％、99％或100％)的序列同一性。该多肽还可以连接至Fc区(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)和/或聚天冬氨酸区。在一些实施方案中，多肽包含IgG2/4Fc区，例如与SEQ ID NO：4具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、97％、99％或100％)的同一性。聚天冬氨酸可以包含例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个天冬氨酸残基。在一些实施方案中，聚天冬氨酸包含十个天冬氨酸残基(D10)。

SEQ ID NO：1-缺少信号肽的人TNSALP(UniProt P05186.4)

SEQ ID NO：2-人TNSALP(1-485；E108M、N213Q、N286Q)

SEQ ID NO：3-人TNSALP(1-491；E108M、N213Q、N286Q)

SEQ ID NO：4-IgG2/4Fc

SEQ ID NO：5-ALP201

SEQ ID NO：6-阿法酸酶α

总唾液酸含量

如本文所述，TSAC可以影响重组碱性磷酸酶在生理条件下的半衰期。因此，TSAC水平可以作为重组产生的碱性磷酸酶例如ALP201的质量属性。在多肽的生产过程中控制TSAC范围可以提高批次与批次之间的再现性，并且可以降低所生产的多肽中的异质性。在一些实施方案中，TSAC为约0.8mol/mol至约8.0mol/mol的重组碱性磷酸酶。在一些实施方案中，TSAC为约0.9mol/mol至约7.0mol/mol的重组碱性磷酸酶。在一些实施方案中，TSAC为约1.0mol/mol至约6.0mol/mol的重组碱性磷酸酶。在一些实施方案中，TSAC为约1.2mol/mol至约6.0mol/mol的重组碱性磷酸酶。在一些实施方案中，TSAC为约1.5mol/mol至约6.0mol/mol的重组碱性磷酸酶。在一些实施方案中，TSAC为约2.0mol/mol至约6.0mol/mol的重组碱性磷酸酶。在一些实施方案中，TSAC为约3.2mol/mol至约5.9mol/mol的重组碱性磷酸酶。在一些实施方案中，TSAC为约0.9mol/mol、约1.0mol/mol、约1.1mol/mol、约1.2mol/mol、约1.3mol/mol、约1.4mol/mol、约1.5mol/mol、约1.6mol/mol、约1.7mol/mol、约1.8mol/mol、约1.9mol/mol、约2.0mol/mol、约2.1mol/mol、约2.2mol/mol、约2.3mol/mol、约2.4mol/mol、约2.5mol/mol、约2.6mol/mol、约2.7mol/mol、约2.8mol/mol、约2.9mol/mol、约3.0mol/mol、约3.1mol/mol、约3.2mol/mol、约3.3mol/mol、约3.4mol/mol、约3.5mol/mol、约3.6mol/mol、约3.7mol/mol、约3.8mol/mol、约3.9mol/mol、约4.0mol/mol、约4.1mol/mol、约4.2mol/mol、约4.3mol/mol、约4.4mol/mol、约4.5mol/mol、约4.6mol/mol、约4.7mol/mol、约4.8mol/mol、约4.9mol/mol、约5.0mol/mol、约5.1mol/mol、约5.2mol/mol、约5.3mol/mol、约5.4mol/mol、约5.5mol/mol、约5.6mol/mol、约5.7mol/mol、约5.8mol/mol、约5.9mol/mol或约6.0mol/mol的重组碱性磷酸酶。在一些实施方案中，TSAC为约3.2mol/mol的重组碱性磷酸酶。在一些实施方案中，TSAC为约5.0mol/mol的重组碱性磷酸酶。在一些实施方案中，TSAC为约5.9mol/mol的重组碱性磷酸酶。

药物组合物

本文所述的多肽(例如，具有SEQ ID NO：5的序列或其与其具有至少85％序列同一性的变体的多肽(例如，包含相对于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5的突变E108M、N213Q和N286Q中的一种或多种或全部的多肽))可以通过本领域已知的多种方法配制成药物组合物。

组合物可以包含磷酸盐、脯氨酸和蔗糖中的一种或多种或全部。组合物可以包含例如磷酸盐和蔗糖。例如，组合物可以包含磷酸盐(例如，磷酸钠)，浓度为例如约1mM至约100mM或约5mM至约20mM磷酸盐，例如约2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM，或例如约10mM。组合物还可以包含脯氨酸和/或蔗糖。组合物还可以包含脯氨酸。组合物还可以包含蔗糖。例如，组合物可以包含约1mM至约500mM脯氨酸，例如约70mM至约280mM，例如约50mM至约200mM，例如约2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM、200mM、300mM、400mM或500mM，例如约140mM脯氨酸和/或约1mM至约500mM蔗糖，例如约70mM至约280mM，例如约50mM至约200mM，例如约2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM、200mM、210、mM、220mM、230mM、240mM、250mM、260mM、270mM、280mM、290mM、300mM、350mM、400mM、450mM或500mM，例如约140mM蔗糖或约210mM蔗糖。在一些实施方案中，组合物包含约1∶0至约1∶3(例如，约1∶1)的摩尔比的脯氨酸：蔗糖。在一些实施方案中，组合物包含约140mM脯氨酸。在一些实施方案中，制剂包含约140mM蔗糖。在一些实施方案中，制剂包含约210mM蔗糖。在一些实施方案中，制剂包含约210mM蔗糖并且不包含脯氨酸。在一些实施方案中，组合物包含约210mM蔗糖和约10mM磷酸盐(例如，磷酸钠)。制剂还可以包含约0.01％至约0.5％，例如约0.01％至约0.1％，例如约0.05％聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯(例如，聚山梨醇酯80(PS80))。在一些实施方案中，组合物在约pH7.0至约pH7.6(例如，约pH 7.1、7.2、7.3、7.4、7.5或7.6，例如，约7.3)的pH下配制。在一些实施方案中，组合物包含约10mM磷酸盐、约140mM脯氨酸、约140mM蔗糖和约0.05％聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯(例如，PS80)，pH为约7.3。

组合物可以配制为含有例如约0.1mg/mL至约200mg/mL，诸如约100mg/mL的量的多肽的溶液。组合物可以配制用于静脉内或皮下施用，例如多肽剂量为约0.1mg/mL至约10mg/mL。组合物可以配制在约0.1mL至约50mL(例如，约0.1至约10mL，例如，约0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL、0.9mL或1.0mL，例如，约1mL至约10mL，例如，约2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL或10mL)的体积的溶液中。在一些实施方案中，组合物配制成约1mL。

本公开的特征还在于含有如本文所述的药物组合物的小瓶。小瓶可以含有例如约0.1mL至约10mL(例如，约1mL)的体积的溶液。小瓶可以含有例如约0.1mg/mL至约500mg/mL，例如约1mg/mL至约200mg/mL，例如约50mg/mL至约150mg/mL，例如约100mg/mL的量的多肽(例如，SEQ ID NO：5的多肽或与其具有至少85％序列同一性的变体)。

例如，小瓶可以含有约0.25mL、约0.5mL、约0.75mL或约1.0mL的体积的含有约50至约100mg/mL的浓度的SEQ ID NO：5的多肽的溶液，其中溶液含有约10mM磷酸盐、约140mM脯氨酸、约140mM蔗糖和约0.05％聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯(例如，PS80)，pH为约7.3。

制剂

包含sALP和sALP融合多肽(例如，具有SEQ ID NO：5的序列或其与其具有至少85％序列同一性的变体的多肽(例如，包含相对于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5的突变E108M、N213Q和N286Q中的一种或多种或全部的多肽))的组合物可以根据标准方法配制。例如，sALP组合物可以配制为例如合适浓度的缓冲溶液并且适于在2-8℃(例如，4℃)下储存。sALP组合物还可以配制用于在低于0℃(例如，-20℃或-80℃)的温度下储存。sALP组合物还可以配制用于在2-8℃(例如，4℃)下储存长达2年(例如，一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、10个月、11个月、1年、1¹/₂年或2年)。因此，本文所述的组合物可以配制成在2-8℃(例如，4℃)下稳定储存至少1年。组合物可以配制成合适的体积，例如约0.1mL至约10mL的体积。

包含sALP和sALP融合多肽(例如，具有SEQ ID NO：5的序列或其与其具有至少85％序列同一性的变体的多肽(例如，包含相对于SEQ ID NO：1或5的突变E108M、N213Q和N286Q中的一种或多种或全部的多肽))的组合物可以是液体形式。

例如，用于全身或局部递送的组合物可以是可注射或可输注溶液的形式。因此，sALP组合物(例如，含有具有SEQ ID NO：5的序列或其与其具有至少85％序列同一性的变体的多肽(例如，包含相对于SEQ ID NO：1或5的突变E108M、N213Q和N286Q中的一种或多种或全部的多肽)的组合物)可以配制用于通过肠胃外模式(例如，皮下、静脉内、腹膜内或肌内注射)施用。如本文所用，“肠胃外施用”和其他语法上等同的短语是指除肠内和局部施用之外的施用模式，通常通过注射，并且包括但不限于皮下、皮内、静脉内、鼻内、眼内、肺部、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、肺内、腹膜内、经气管、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外、脑内、颅内、颈动脉内和胸骨内注射和输注。具体的施用途径包括静脉内和皮下施用。

组合物可以制备为冻干组合物。组合物可以在施用前用溶液(例如，如本文所述)再水合。

剂量

本文所述的sALP多肽(例如，具有SEQ ID NO：5的序列或其与其具有至少85％序列同一性的变体的多肽(例如，包含相对于SEQ ID NO：1的突变E108M、N213Q和N286Q中的一种或多种或全部的多肽))可以以例如0.01mg/kg至500mg/kg(例如，0.05mg/kg至500mg/kg、0.1mg/kg至60mg/kg、0.1mg/kg至50mg/kg、0.1mg/kg至20mg/kg、5mg/kg至500mg/kg、0.1mg/kg至100mg/kg、10mg/kg至100mg/kg、0.1mg/kg至50mg/kg、0.5mg/kg至25mg/kg、1.0mg/kg至10mg/kg、1.5mg/kg至5mg/kg或2.0mg/kg至3.0mg/kg)或1μg/kg至1,000μg/kg(例如，5μg/kg至1,000μg/kg、1μg/kg至750μg/kg、5μg/kg至750μg/kg、10μg/kg至750μg/kg、1μg/kg至500μg/kg、5μg/kg至500μg/kg、10μg/kg至500μg/kg、1μg/kg至100μg/kg、5μg/kg至100μg/kg、10μg/kg至100μg/kg、1μg/kg至50μg/kg、5μg/kg至50μg/kg或10μg/kg至50μg/kg)范围内的单独剂量施用于患有或易患骨矿化病症诸如HPP的受试者。

sALP的示例性剂量包括例如0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、2.5、5、10、20、25、50、100、125、150、200、250或500mg/kg；或1、2、2.5、5、10、20、25、50、100、125、150、200、250、500、750、900或1，000μg/kg。对于本文列举的所有剂量或范围，术语“约”可用于以列举值或范围端点的±10％修饰这些剂量。具体地，根据本公开的组合物(例如，具有SEQ ID NO：5的序列或其与其具有至少85％序列同一性的变体的多肽(例如，包含相对于SEQ ID NO：1或5的突变E108M、N213Q和N286Q中的一种或多种或全部的多肽))可以以约0.001mg/kg/天至约500mg/kg/天、约0.01mg/kg/天至约100mg/kg/天或约0.01mg/kg/天至约20mg/kg/天范围内的剂量施用于受试者。例如，sALP组合物(例如，具有SEQ ID NO：5的序列或其与其具有至少85％序列同一性的变体的多肽(例如，包含相对于SEQ ID NO：1或5的突变E108M、N213Q和N286Q中的一种或多种或全部的多肽))可以以例如约0.5mg/kg/周至约140mg/kg/周，例如约0.8mg/kg/周至约50mg/kg/周或约1mg/kg/周至约10mg/kg/周(例如，约6或约9mg/kg/周)的每周剂量范围施用于受试者。具体地，sALP可以每周施用一次或多次(例如，每周1、2、3、4、5、6、7或更多次)、每隔一周施用一次或多次或每月施用一次或多次(例如，每14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天或30天施用一次)。在一些实施方案中，制剂每周施用一次。在一些实施方案中，制剂每两周施用一次。

具体地，sALP(例如，具有SEQ ID NO：5的序列或其与其具有至少85％序列同一性的变体的多肽(例如，包含相对于SEQ ID NO：1或5的突变E108M、N213Q和N286Q中的一种或多种或全部的多肽))可以以2mg/kg每周三次(总剂量6mg/kg/周)、，1mg/kg每周六次(总剂量6mg/kg/周)、3mg/kg每周三次(总剂量9mg/kg/周)、0.5mg/kg每周三次(总剂量1.5mg/kg/周)或9.3mg/kg每周三次(总剂量28mg/kg/周)的剂量施用。剂量可以由临床医生根据常规因素(诸如疾病的程度和来自患有或易患骨矿化病症(诸如HPP)的受试者的不同参数)来调整。替代性地，可以每周一次或每两周一次施用约0.1mg/kg至约20mg/kg(例如，约0.1mg/kg至约9mg/kg)。sALP组合物也可以每周或每两周以每剂1-90mg的剂量(例如，以0.1mL至100mL的体积)施用1-10次(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9和10次)。在一些实施方案中，sALP组合物每周施用一次。在一些实施方案中，sALP组合物每两周施用一次。

含有sALP或sALP融合多肽(例如，具有SEQ ID NO：5的序列或其与其具有至少85％序列同一性的变体的多肽(例如，包含相对于SEQ ID NO：1或5的突变E108M、N213Q和N286Q中的一种或多种或全部的多肽))的组合物可以以单剂量方案或多剂量方案施用于受试者。剂量可以例如每小时、每两小时、每天、每两天、每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、每周六次、每周、每两周、每月、每两月或每年施用。替代性地，剂量可以例如每天、每周或每月施用两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次或十二次。具体地，给药方案是每周一次、两次或三次。给药方案的持续时间可以是例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天、周、月，或者甚至是患有或易患骨矿化病症诸如HPP的受试者的剩余寿命。剂量的量、频率和持续时间可以由临床医生根据常规因素(诸如疾病的程度和来自患有或易患骨矿化病症(诸如HPP)的受试者的不同参数)来调整。

例如，sALP或sALP融合多肽(例如，具有SEQ ID NO：5的序列或其与其具有至少85％序列同一性的变体的多肽(例如，包含相对于SEQ ID NO：1或5的突变E108M、N213Q和N286Q中的一种或多种或全部的多肽))的剂量可以为约0.1mg/kg体重至约10mg/kg体重，每周一次或多(例如，2、3、4、5、6或7)次皮下或静脉内施用。

在一些具体的实施方案中，多肽(例如，具有SEQ ID NO：5的序列或其与其具有至少85％序列同一性的变体的多肽(例如，包含相对于SEQ ID NO：1或5的突变E108M、N213Q和N286Q中的一种或多种或全部的多肽))或含有其的药物组合物可以以约0.01mg/kg至约60mg/kg(例如，约0.1mg/kg至约50mg/kg，例如，约0.1mg/kg至约20mg/kg，例如，约0.1mg/kg至约10mg/kg)的剂量施用。多肽可以每天、每周、每月或每年施用一次(例如，每周一次)。在一些实施方案中，多肽每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用一次或多次。多肽可以以约0.01mg/kg/周至约50mg/kg/周(例如，约0.01mg/kg/周至约40mg/kg/周，例如，约0.1mg/kg/周至约20mg/kg/周，例如，约0.1mg/kg/周至约10mg/kg/周)的剂量施用。多肽可以施用至少一天、一周、一个月、一年或更长时间(例如，1-5年或受试者的一生)。

在一些实施方案中，将药物组合物皮下施用。例如，可以将约10mg至约100mg(例如，约10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg或100mg，例如，约15mg、45mg或90mg)皮下施用于受试者，例如，每周一次或两次，例如，持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多周。

在一些实施方案中，将药物组合物静脉内施用。例如，可以将约10mg至约100mg(例如，约10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg或100mg，例如，约15mg、45mg或90mg)静脉内施用于受试者，例如，每周一次或两次，例如，持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多周。

在一些实施方案中，将药物组合物静脉内和皮下施用。在一些实施方案中，将药物组合物同时静脉内和皮下施用。在一些实施方案中，将组合物静脉内然后皮下施用。在一些实施方案中，将药物组合物皮下然后静脉内施用。例如，可以将药物组合物以一个或多个剂量(例如，以单个剂量)，例如作为负荷剂量静脉内施用于受试者，并且随后例如作为维持剂量皮下施用于受试者一次或多次(例如，在治疗的持续时间内，每个剂量约每周一次施用)。

治疗方法

本文提供了用于治疗或改善患有骨矿化病症诸如HPP的受试者的至少一种症状的方法。其他疾病或病症，诸如骨折、骨质疏松症、硬化性骨化病、软骨钙质沉着病、张力减退、杜氏肌营养不良、气管支气管软化症、癫痫发作、神经纤维瘤病1(NF-1)和颅缝早闭也可以通过本文所述的组合物和方法治疗。受试者可能患有肌肉无力。受试者可能患有肌肉无力疾病，诸如焦磷酸钙沉积(CPPD)或家族性低磷酸盐血症。此类治疗可以包括施用碱性磷酸酶(例如，含有碱性磷酸酶的药物组合物)或具有碱性磷酸酶活性的多肽，以降低此类受试者中升高的PPi浓度。例如，可溶性碱性磷酸酶(sALP，例如，具有SEQ IDNO：5的序列或其与其具有至少85％序列同一性的变体的多肽(例如，包含相对于SEQ ID NO：1或5的突变E108M、N213Q和N286Q中的一种或多种或全部的多肽))可以施用于新生儿、婴儿、儿童、青少年或成人。

在施用碱性磷酸酶或具有碱性磷酸酶活性的多肽(例如，sALP，例如，具有SEQ IDNO：5的序列或其与其具有至少85％序列同一性的变体的多肽(例如，包含相对于SEQ IDNO：1或5的突变E108M、N213Q和N286Q中的一种或多种或全部的多肽))之前，受试者可能被诊断患有骨矿化病症(例如，HPP)。另外，患有或易患骨矿化病症诸如HPP的受试者可以是先前未接受过sALP(例如，具有SEQ ID NO：5的序列或其与其具有至少85％序列同一性的变体的多肽(例如，包含相对于SEQ ID NO：1或5的突变E108M、N213Q和N286Q中的一种或多种或全部的多肽))治疗的未接受过治疗的受试者。

疾病的一种或多种症状可能首先在为新生儿、婴儿或儿童的受试者中显现。在其他实施方案中，疾病的一种或多种症状可能首先在为成人的受试者中显现。在一些实施方案中，在成年前受试者中没有出现可检测的疾病症状。在一些实施方案中，可检测的疾病症状在成年前在受试者中出现，但疾病状态直到成年才被诊断。

该方法包括将碱性磷酸酶或具有碱性磷酸酶活性的多肽(例如，sALP，例如，具有SEQ ID NO：5的序列或其与其具有至少85％序列同一性的变体的多肽(例如，包含相对于SEQ ID NO：1或5的突变E108M、N213Q和N286Q中的一种或多种或全部的多肽))以单剂量或多剂量在一段时间内施用于患有或易患骨矿化病症诸如HPP的受试者。具体地，sALP(诸如具有SEQ ID NO：5的序列的多肽)可以施用于先前确定具有升高的无机焦磷酸盐(PPi)浓度或HPP症状(例如，肌肉无力)的至少一种预定生物标志物/评分的受试者，诸如小于10的平均BOT-2力量评分、小于5的平均BOT-2跑步速度和敏捷性评分、大于约0.8的平均CHAQ指数评分和/或小于约40的平均PODCI评分、小于预测6MWT值的约80％的平均6MWT、小于5的肌肉力量等级和/或例如小于预测HHD值的约80％的平均HHD值(例如，平均HHD肌肉或握力值)。例如，对于婴儿或儿童，可以将sALP施用于先前确定样品(例如，血浆样品)中PPi浓度大于约5.71μM的受试者(例如，约12岁或更小的受试者)；对于青少年，大于约4.78μM(例如，约13至约18岁的受试者)；或对于成人，大于约5.82μM(例如，大于约18岁的受试者)。在其他实施方案中，本文所述的骨矿化病症诸如HPP由至少一种碱性磷酸酶底物(例如，PPi、PLP、PEA等)浓度升高引起。替代性地，在确定肌肉无力评分的多肽(例如，使用BOT-2力量评分、BOT-2跑步速度和敏捷性评分、CHAQ指数评分、BSID-III标准化评分、PDMS-2标准评分、肌肉力量评分、6MWT值和/或HHD值)之前，可以将碱性磷酸酶或具有碱性磷酸酶活性的多肽(例如，sALP，例如，具有SEQ ID NO：5的序列或其与其具有至少85％序列同一性的变体的多肽(例如，包含相对于SEQ ID NO：1或5的突变E108M、N213Q和N286Q中的一种或多种或全部的多肽))施用于患有或易患骨矿化病症诸如HPP的受试者。根据本文所述的方法用ALP治疗促进例如ADL活性的增加、疼痛的减轻和/或运动发育的改善。

另外，本文所述的患有或易患骨矿化病症诸如HPP的受试者的所述评分中的每一个(例如，BOT-2力量评分、BOT-2跑步速度和敏捷性评分、CHAQ指数评分、BSID-III标准化评分、PDMS-2标准评分、6MWT、12-POMA-G、改进的以表现为导向的移动性评估(mPOMA-G，诸如Phillips等人2015Bone Abstracts 4：P136中所说明的)或HHD值)可以单独或以任何组合使用以评估使用sALP(例如，具有SEQ ID NO：5的序列或其与其具有至少85％序列同一性的变体的多肽(例如，包含相对于SEQ ID NO：1或5的突变E108M、N213Q和N286Q中的一种或多种或全部的多肽))的治疗功效，其中相对于某个测试评分的改善表明sALP对于治疗骨矿化病症诸如HPP是有效的。

例如，当将碱性磷酸酶或具有碱性磷酸酶活性的多肽(例如，sALP，例如，具有SEQID NO：5的序列或其与其具有至少85％序列同一性的变体的多肽(例如，包含相对于SEQ IDNO：1或5的突变E108M、N213Q和N286Q中的一种或多种或全部的多肽))施用于患有或易患骨矿化病症诸如HPP的受试者时，导致BOT-2力量评分平均增加至约10或大于约10，其中如果受试者先前具有小于约10的平均BOT-2力量评分，则碱性磷酸酶或具有碱性磷酸酶活性的多肽治疗在治疗例如与骨矿化病症诸如HPP相关的身体损伤方面是有效的。替代性地，当施用sALP没有导致BOT-2力量评分平均增加至约10或大于约10时，可以改变(例如，增加，例如，无限期或短期(例如，1-6个月或长达一年或更长))施用碱性磷酸酶或具有碱性磷酸酶活性的多肽的剂量和/或频率，以确定受试者的碱性磷酸酶或具有碱性磷酸酶活性的多肽的有效量。例如，sALP(例如，具有SEQ ID NO：5的序列的多肽或与其具有至少85％序列同一性的其变体(例如，包含相对于SEQ ID NO：1或5的突变E108M、N213Q和N286Q中的一种或多种或全部的多肽))的剂量可以从例如约0.1-1mg/kg/周增加至约1-2m/kg/周，从约0.5-3mg/kg/周增加至约3-6mg/kg/周或从约3-6mg/kg/周增加至约6-9mg/kg/周。类似地，可以增加给药频率，例如从约每三周一次至约每两周一次或从约每两周一次至约每周一次。替代性地，如果实现本文所述的量度之一的改善，则施用的剂量和/或频率可以保持相同或从例如约6-9mg/kg/周减少至约3-6mg/kg/周，从约3-6mg/kg/周减少至约0.5-3mg/kg/周，或从约0.5-3mg/kg/周减少至约0.1-1mg/kg/周。类似地，剂量施用的频率可以从约每周一次减少至约每两周一次或从约每两周一次减少至约每三周一次。

此外，当将碱性磷酸酶或具有碱性磷酸酶活性的多肽(例如，sALP，例如，具有SEQID NO：5的序列或其与其具有至少85％序列同一性的变体的多肽(例如，包含相对于SEQ IDNO：1或5的突变E108M、N213Q和N286Q中的一种或多种或全部的多肽))施用于患有或易患骨矿化病症诸如HPP的受试者时，导致受试者的肌肉力量等级分类提高1或更多(例如，从先前较低的肌肉力量等级提高至肌肉力量等级为1、2、3、4或5)，其中受试者先前具有小于约5的平均肌肉力量等级，则碱性磷酸酶或具有碱性磷酸酶活性的多肽治疗在治疗例如与骨矿化病症诸如HPP相关的身体损伤方面是有效的。替代性地，当施用sALP没有导致受试者的肌肉力量等级分类从先前较低的肌肉力量等级提高1或更多时，可以改变(例如，增加)施用碱性磷酸酶或具有碱性磷酸酶活性的多肽的剂量和/或频率，以确定受试者的碱性磷酸酶或具有碱性磷酸酶活性的多肽的有效量。例如，sALP(例如，具有SEQ ID NO：5的序列的多肽或与其具有至少85％序列同一性的其变体(例如，包含相对于SEQ ID NO：1或5的突变E108M、N213Q和N286Q中的一种或多种或全部的多肽))的剂量可以从例如约0.1-1mg/kg/周增加至约1-2m/kg/周，从约0.5-3mg/kg/周增加至约3-6mg/kg/周或从约3-6mg/kg/周增加至约6-9mg/kg/周。类似地，可以增加给药频率，例如从约每三周一次至约每两周一次或从约每两周一次至约每周一次。替代性地，如果实现本文所述的量度之一的改善，则施用的剂量和/或频率可以保持相同或从例如约6-9mg/kg/周减少至约3-6mg/kg/周，从约3-6mg/kg/周减少至约0.5-3mg/kg/周，或从约0.5-3mg/kg/周减少至约0.1-1mg/kg/周。类似地，剂量施用的频率可以从约每周一次减少至约每两周一次或从约每两周一次减少至约每三周一次。

药代动力学(PK)参数

在一些实施方案中，该治疗方法在受试者的血液中产生约50μg×小时/mL至约4000μg×小时/mL的AUC_0-168h。例如，该方法可以在受试者的血液中产生约1000μg×小时/mL至约3000μg×小时/mL的AUC_0-168h。在一些实施方案中，该治疗方法在受试者的血液中产生约0.5μg/mL至约25μg/mL的C_max。例如，该治疗方法可以在受试者的血液中产生约0.6μg/mL至约20μg/mL的C_max。

实施例

本公开通过以下非限制性实施例进行说明。应当理解，具体实施例、材料、量和程序应根据如本文所阐述的本公开的范围和实质来广义地解释。

实施例1

ALP201是一种人重组TNSALP-Fc-十-天冬氨酸融合蛋白。它是一种由724个氨基酸的两条多肽链组成的可溶性糖蛋白，这两条多肽链由人TNSALP的催化结构域(SwissProt，P05186)、人免疫球蛋白(Ig)G2/4Fc结构域(SwissProt，P01859、P01861)(以促进纯化和延长半衰期)和十天冬氨酸肽(以靶向骨)组成。

ALP201是一种ERT，用于通过替代缺陷型碱性磷酸酶来解决骨矿化病症诸如HPP的根本原因。ALP201与阿法酸酶α具有一些结构相似性，阿法酸酶α也是一种TNSALP-Fc-十-天冬氨酸融合蛋白ERT，它是唯一批准的用于患有儿科发作HPP的受试者的治疗(以商品名销售)。

ALP201是下一代HPP疗法，与阿法酸酶α相比具有相同的效力和改善的活性。由于半衰期更长、α相清除率降低和生物利用度增加，ALP201还增加了暴露。相对于阿法酸酶α，这些改进的特征支持ALP201的较低的剂量和较长的给药间隔。预期通过减少注射体积和给药频率来改善受试者体验，这也可以转化为较少的注射部位反应。

ALP201

理化特性

ALP201是一种具有约160KDa分子量的可溶性Fc融合蛋白，并且由通过两个二硫键共价连接的两条多肽链组成。每条多肽链含有724个氨基酸，并且由三个片段组成：

·多肽的N末端区域，氨基酸L1-A491，含有酶TNSALP，它是人体组织非特异性碱性磷酸酶的可溶部分并含有催化功能。在每条多肽链的酶区域内，引入单点突变(E108M)以提高酶活性，并除去两个N连接的糖基化位点(N213Q和N286Q)以改进方法。

·多肽的第二部分，氨基酸V492-K714，包含含有铰链、CH2和CH3结构域的人免疫球蛋白γ2/4(IgG2/4)的Fc部分。

·多肽的C末端区域，氨基酸D715-D724，含有十个天冬氨酸。该肽序列促进ALP201与骨的矿物质相的结合。

ALP201的每条多肽链含有四个糖基化位点(N123、N254、N413和N564)和十一个半胱氨酸(Cys)残基。Cys102作为游离半胱氨酸存在。每条多肽链在Cys122至Cys184、Cys472至Cys480、Cys528至Cys588和Cys634-Cys692之间含有四个链内二硫键。两条多肽链通过Cys494-Cys494和Cys497-Cys497之间的两个链间二硫键连接。除了这些共价结构特征之外，哺乳动物碱性磷酸酶通常在每条多肽链上具有四个金属结合位点，即两个锌位点、一个镁位点和一个钙位点。

ALP201的一般性质

表1列出了ALP201的一般性质。假设除两个半胱氨酸残基外所有半胱氨酸残基都是二硫键连接的，计算理论化学式和理论平均分子量。

表1：ALP201的一般性质

药物产品

ALP201 100mg/mL小瓶

ALP201药物产品(100mg/mL)是装在一次性使用的2mL小瓶中的无菌、无防腐剂的ALP201和赋形剂的配制液体溶液。该药物产品不含任何新型动物或人来源的赋形剂。每个2mL小瓶标称含有1.2mL(过量)药物产品，可提供100mg ALP201/小瓶。将药物产品装入具有带铝密封件的13mm氯丁基塞的2mL I型透明玻璃小瓶中。ALP201药物产品的定量组成如表2所示。

表2：用于皮下或静脉内施用的ALP201药物产品的组成

缩写：QS＝足量。

体内研究

使用体内研究对ALP201进行评估，以表征其药理学、PK/毒代动力学(TK)、局部耐受性和潜在的全身毒性。进行的药理学研究包括在HPP小鼠(Akp2GW(-/-)小鼠)中的重复剂量研究，以确定ALP201最小有效剂量。为了理解ALP201的PK性质，在小鼠、大鼠和猴中进行了单剂量PK研究。毒理学研究评估了SC ALP201在大鼠和猴中施用的全身毒性；这些研究包括安全药理学终点(猴研究中的心血管、呼吸系统和大鼠研究中的神经功能)、TK评估以及评估任何治疗相关作用的可逆性的恢复期。

表3提供了用支持其在人中使用的ALP201进行的体内研究的总结。

体外药理学

焦磷酸盐(PPi)是TNSALP的关键天然底物，并且HPP受试者中的低TNSALP水平导致循环PPi血液水平升高。升高的焦磷酸盐水平会阻止适当的骨矿化，并导致在患有HPP的受试者中观察到的异常骨表现。因此，在工程化的第二代阿法酸酶α分子中，PPi被视为以更高的酶活性水平为目标的天然底物。

图1示出了ALP201和阿法酸酶α的焦磷酸盐水解的底物饱和曲线。ALP201对于焦磷酸盐保留了与阿法酸酶α(53mM)相似的Km值(47mM)，但是ALP201的转换数显著更高(对于ALP201，kcat＝11,619min^-1，而对于阿法酸酶α，kcat＝6,714min^-1)。ALP201和阿法酸酶α中野生型TNSALP催化结构域的类似Km值表明，当以相等的血清碱性磷酸酶活性水平存在时，ALP201不应比阿法酸酶α更可能危险地降低循环PPi水平。

吡哆醛-5′-磷酸盐是TNSALP的第二种天然底物，与HPP具有临床相关性。TNSALP裂解PLP形成吡哆醛，它是最容易被组织吸收的B6类维生素。当血清碱性磷酸酶水平非常低时，全身维生素B6代谢可能会受损。在HPP中，大脑中的PLP缺乏表现为癫痫发作，并且由TNSALP进行的PLP水解的全身缺陷可能在一些HPP受试者经历的疼痛、肌肉无力和张力减退中起作用。因此，可以使用ERT治疗HPP以提供足够的PLP水解活性。

图2示出了由ALP201和阿法酸酶α进行的PLP水解的底物饱和曲线。与阿法酸酶α(1.71mM)相比，ALP201对于PLP具有稍弱的Km值(2.76mM)，但是ALP201以显著更高的转换数(对于ALP201，kcat＝3,324min^-1，而对于阿法酸酶α，kcat＝2,623min^-1)起作用，导致两种分子的PLP活性饱和曲线非常类似。底物动力学参数列于表4中。

表4：ALP201和阿法酸酶α水解底物的动力学参数

缩写：PPi＝焦磷酸盐；PLP＝吡哆醛-5′-磷酸盐；Km＝米氏常数：μM＝微摩尔；Kcat＝周转率的催化常数；min＝分钟。

体内药理学

使用Akp2GW(-/-)小鼠(其为人HPP的动物模型)进行对ALP201的临床前功效研究。Akp2GW(-/-)小鼠具有与先前用于阿法酸酶α临床前评估的Akp2(-/-)小鼠相同的HPP诱导TNSALP突变。在Akp2GW(-/-)小鼠发育期间在Alexion进行的自然史研究表明，纯合TNSALP活性敲除Akp2GW(-/-)小鼠表现出与Akp2(-/-)小鼠(Akp2GW-NH-01-02)几乎相同的骨矿化和存活表型。

在使用Akp2GW(-/-)小鼠模型评估ALP201功效的功效研究中，从出生后第1天开始直至第35天皮下给予一定剂量的测试物。所有研究中报告的结果包括总存活、体重增长率、第36天(或研究结束[EOS]前死亡时)的后爪骨的骨矿化和EOS谷血浆酶活性水平(每天[qd]和每周[q1w]组在第36天服用，而每2天[q2d]剂量组在第37天服用)。在一些研究中，测定了EOS股骨和胫骨长度以及小鼠股骨碱性磷酸酶活性。

在使用Akp2(-/-)小鼠的先前研究中，阿法酸酶α表现出在骨矿化和总存活研究终点方面的功效，阿法酸酶α的活性制剂的剂量为7-10mg/kg/天，这取决于测试物的比活性。阿法酸酶α的估计最小有效剂量(MED)定义为在研究结束时或在死亡时(如果死亡发生在研究结束之前)使获得正常骨矿化评分的组中有85％的可测量小鼠的剂量。功效数据的分析将该值设置为大致2.0-2.5mg/kg/天，这取决于测试物的比活性。

在Akp2GW(-/-)小鼠中以不同的SC剂量和给药间隔在2个多剂量研究中测试ALP201在HPP的鼠模型中的功效。在这些研究中，将ALP201的功效与每日SC施用阿法酸酶α给药的阳性对照组中观察到的功效进行了比较。

在先前的研究中，阿法酸酶α通过SC施用以9.8mg/kg/天的完全有效剂量按qd给药方案给药。ALP201的等效4-MUP活性剂量通过在PBS中SC施用按qd、q2d和q1w给药间隔给药。在一个剂量组中，ALP201的剂量在第25天小鼠断奶后减少半个对数。按qd方案皮下施用PBS作为阴性对照。这些给药组的列表可见于表5。

在HPP-MED-01研究中，阿法酸酶α通过SC施用以2.5mg/kg/天的最小有效剂量按qd给药方案给药。ALP201在PBS中按q2d给药方案以2.0、0.8、0.3和0.15mg/kg的剂量皮下施用。按q2d方案皮下施用PBS作为阴性对照。这些给药组的列表可见于表5。

表5：Akp2GW(-/-)功效研究的剂量分组研究计划

缩写：PBS＝磷酸盐缓冲盐水；q1w＝每周一次；q2d＝每2天；qd＝每天一次；U MUP＝4-甲基伞形酮磷酸酯水解中的活性单位；NA＝不适用。

骨矿化结果

通过对经处理的Akp2GW(-/-)小鼠的后爪进行X射线分析来确定第36/37天的骨矿化结果。将后爪骨矿化的X射线可视化与第36天的基准X射线图像进行比较，这些基准X射线图像例示了4个分类类别：未受影响、轻度缺陷、中度缺陷和重度缺陷。这些分类的详细描述可见于表6。由不知情的个体为每只小鼠的图像分配评分，并且一旦完成，在单独的剂量组中编辑评分。

表6：第36天后爪骨矿化指数评分的分类

每个给药组观察到的EOS后爪骨矿化指数评分的分布可见于表7。

表7：研究结束时经处理的Akp2GW(-/-)小鼠组后爪骨的骨矿化指数分布

缩写：HOM＝纯合敲除；PBS＝磷酸盐缓冲盐水；qd＝每天；q2d＝每2天；q1w＝每周一次；WT＝野生型。

用ALP201处理的Akp2GW(-/-)小鼠显示，按Q2D给药间隔，随着ALP201剂量的增加，后爪骨矿化未受影响的小鼠百分比增加的剂量反应。所有ALP201剂量组相对于PBS处理的Akp2GW(-/-)对照显示出统计学上显著的改善(通过单向ANOVA分析p＜0.001)。这些数据用于为基于模型的分析提供信息并预测人体剂量预测。

研究结束时谷血浆活性酶浓度结果

通过测量第36/37天血浆样品中的TNSALP活性水平来确定谷血浆活性TNSALP酶浓度。将测量的TNSALP活性与已知酶活性和浓度的标准曲线拟合，以定量每单位体积血浆的活性酶水平。EOS谷血浆活性酶浓度的分布如图3所示。表8中总结了按剂量组的平均EOS谷血浆活性酶浓度的列表。

表8：剂量分组平均研究结束谷血浆活性酶浓度和酶活性水平

注：平均研究结束酶浓度(μg/mL)的计算＝平均EOS谷血浆活性水平(单位4-MUP水解/L)/蛋白质比活性(U/mg)。

a研究中使用的ALP201的比活性＝43U/mg

b研究中使用的阿法酸酶α的比活性＝21U/mg

c研究中使用的ALP201的比活性＝38.8U/mg

d研究中使用的阿法酸酶α的比活性＝21.5U/mg

缩写：EOS＝研究结束；4-MUP＝4-甲基伞形酮磷酸酯；NA＝不适用；PBS＝磷酸盐缓冲盐水；qw＝每周一次；q2d＝每2天一次；qd＝每天一次；WT＝野生型。

对多剂量后经处理的Akp2GW(-/-)小鼠中的EOS谷血浆活性酶和相应的酶活性水平的分析清楚地表明，当与阿法酸酶α相比时，ALP201的绝对积累和剂量归一化的积累更大，这可能是由于SC施用后ALP201的优良PK特征。

第36/37天经处理的Akp2GW(-/-)小鼠研究结束骨酶活性水平

在HPP-MED-01研究结束时，使用4-MUP作为底物，在离体测定中测定了经处理的Akp2GW(-/-)小鼠股骨组织中的碱性磷酸酶活性水平。在该测定中，仅测定了股骨矿化部分的活性以避免血液或高灌注组织的潜在污染，该血液或高灌注组织可能仍保持高水平的ALP201或阿法酸酶α。图4示出了与经处理的Akp2GW(-/-)小鼠股骨相关的酶活性水平的分布，数据以4-MUP水解活性/mg矿化股骨组织的微单位显示。

表9：剂量分组平均研究结束股骨活性酶浓度

缩写：4-MUP＝4-甲基伞形酮磷酸酯；PBS＝磷酸盐缓冲盐水；q1w＝每周一次；q2d＝每2天；qd＝每天；WT＝野生型；mg＝毫克；SD＝标准偏差；NA＝不适用

骨活性数据显示，随着ALP201剂量增加，EOS骨组织活性水平增加，剂量反应也随之增加。在研究结束时，与阿法酸酶α2.5mg/kgqd组的26.9％相比，ALP201 0.15mg/kg q2d组小鼠的野生型碱性磷酸酶活性恢复了22.6％。0.3、0.8和2.0mg/kg q2d的ALP201剂量分别恢复了野生型活性的34.4％、37.6％和44.9％。当用单因素ANOVA分析时，0.8和2.0mg/kgq2d的ALP201剂量之间的研究结束骨活性水平差异在统计学上显著于阿法酸酶α2.5mg/kgq2d组，其中调整的p值分别为0.0048和＜0.0001。

经处理的Akp2GW(-/-)小鼠存活结果

所有PBS处理的Akp2GW(-/-)在研究第26天或之前死亡，中位存活时间为20天。在所有剂量组中，相对于PBS媒介物对照，Akp2GW(-/-)小鼠的ALP201处理显著提高了36天存活率(图5和表10)。所有ALP201给药组均达到至少69％的EOS存活率，所有qd和q2d间隔剂量组的剂量高于0.15mg/kg/天，总存活率达到88％或更高。ALP2014.8mg/kg q1w组和阿法酸酶α9.8mg/kg qd组的存活曲线具有高度相似的结果。

表10：在36天功效研究中经处理的Akp2GW(-/-)小鼠组的存活百分比总结

缩写：MED＝最小有效剂量；PBS＝磷酸盐缓冲盐水；PoC＝概念验证；qd＝每天一次；q2d＝每2天一次；q1w＝每周一次；NA＝不适用。

体重结果

所有组中ALP201和阿法酸酶α处理的Akp2GW(-/-)小鼠的平均体重始终低于用PBS处理的它们的野生型同窝小鼠的平均体重。所有ALP201给药组的研究结束体重与阿法酸酶α给药组没有统计学差异。

安全药理学

未对ALP201进行独立安全药理学研究。然而，对心血管、呼吸和血压终点作为关键的符合GLP的猴毒性研究的一部分进行了测量，并且对神经功能终点作为大鼠GLP毒性研究的一部分进行了评估。ALP201治疗仅在低剂量组导致心率增加(与对照组相比增加28％)，并伴有RR、PR、QT间期减少，并且QRS持续时间没有任何显著变化；在中剂量组和高剂量组中没有观察到具有生物学意义的变化。因此，在心率的轻微增加与ALP201剂量之间没有剂量反应关系。由于心率增加幅度适中，因此这些发现不被认为是不利的。此外，在研究中评估的最高剂量20mg/kg，每3天一次SC施用28天后，在猴中评估的ECG、血压或呼吸参数上没有ALP201相关的发现。在研究中评估的最高剂量30mg/kg，每3天一次SC施用28天后，ALP201对大鼠的行为指数或运动活动没有影响。

动物的药代动力学和药物代谢

在小鼠、大鼠和猴中进行了单剂量PK研究。这些研究的数据用于评估ALP201在临床前物种中的处置(吸收、分布和消除)。

吸收

在Sprague-Dawley大鼠和食蟹猴中评估了ALP201的PK。本文提供了单剂量和重复剂量施用ALP201后的非GLP和GLP研究的总结。

小鼠、大鼠和猴的平均生物利用度分别为96％、58％和78％。达到最大浓度的时间(t_max)的范围为给药后17至48小时，表明ALP201从SC注射部位缓慢吸收。

分布

对小鼠、大鼠和猴单次静脉内施用后，ALP201的表观分布体积范围为0.08至0.15L/kg。该值比这些物种的血浆体积大得多(＞2倍)，表明ALP201分布在血管内房室之外。

单剂量研究中的药代动力学

雄性C57BL/6小鼠中的单剂量PK(研究HPP-PK-01)

在对雄性C57BL/6小鼠进行单剂量IV或SC施用后，评估ALP201的PK。十六只动物接受单次IV或SC施用4mg/kg剂量的ALP201。对于每种施用途径，将小鼠随机分成4个取样群组，每组4只小鼠。在剂量施用后使用半连续取样设计收集血液样品达20天。ALP201的PK参数总结于表11中。

表11：C57BL/6小鼠中IV和SC施用后ALP201的PK参数

缩写：AUC_∞＝从时间零(给药)外推至无穷大的浓度时间曲线下面积；AUC_t＝从时间零(给药)到最后可检测浓度的浓度时间曲线下面积；CL或CL/F＝总清除率；C_max＝观察到的最大血浆浓度；F＝绝对生物利用度；IV＝静脉内；NA＝不适用；SC＝皮下；t_max＝达到观察到的最大血浆浓度的时间；t_1/2＝终末消除半衰期；V_d或V_d/F＝表观分布体积

IV施用后，浓度-时间曲线以多指数方式下降。CL为0.0019L/h/kg，表观终末t1/2为48小时(表11)。V_d为0.13L/kg，其大于小鼠的血浆体积，表明ALP201分布在血管内空间之外。SC施用后，达到最大浓度的时间(t_max)为给药后48小时，表明从SC注射部位吸收相对较慢。SC施用后的绝对生物利用度为96％。

大鼠中单次给药PK研究

在对大鼠进行单次IV或SC施用后，评估ALP201的PK。四只动物(每种性别/剂量2只)接受单次IV或SC递增剂量(以1、3、9或27mg/kg的剂量IV推注，或以2或27mg/kg的剂量SC)的ALP201。给药后长达28天ALP201血浆浓度可定量。由于没有观察到ALP201PK参数存在明显的性别特异性差异，因此提供了汇总的性别值。表12总结了汇总的性别组的ALP201 PK参数的描述性统计数据。图14示出了ALP201平均血浆浓度与时间的曲线；注意，添加阿法酸酶α的历史数据以进行比较。

表12：大鼠中IV或SC施用后ALP201的平均(±SD)PK参数

缩写：AUC_∞＝从时间零(给药)外推至无穷大的浓度时间曲线下面积；AUC_t＝从时间零(给药)到最后可检测浓度的浓度时间曲线下面积；CL或CL/F＝总清除率；C_max＝观察到的最大血浆浓度；IV＝静脉内；SC＝皮下；SD＝标准偏差；t_max＝达到观察到的最大血浆浓度的时间；t_1/2＝终末消除半衰期；V_d或V_d/F＝表观分布体积。

对于IV施用，在1mg/kg至27mg/kg的研究剂量范围内，ALP201PK暴露(C_max和AUC_∞)以略低于剂量比例的方式增加。ALP201的平均CL和V_d在剂量上保持一致。平均CL值范围为0.0012至0.0019L/h/kg，平均V_d值范围为0.12至0.15L/kg。类似地，ALP201的t1/2平均为约2天，其在IV剂量中保持相对类似。对于SC施用，CL/F、V_d/F和t_1/2值与从IV施用估计的值类似，27mg/kg SC剂量组除外，该组似乎是异常值。平均t_max范围为给药后30至48小时，表明从SC注射部位的吸收相对较慢。对于2和27mg/kg剂量，SC施用后的绝对生物利用度分别为61％和54％。

猴单次给药PK研究

在对猴进行单次IV或SC施用后，评估ALP201的PK。三只雄性猴接受单次IV或SC递增剂量(以2、6或20mg/kg的剂量IV推注，或以2或20mg/kg的剂量SC)的ALP201。给药后长达28天ALP201血浆浓度可定量。ALP201的PK参数的描述性统计总结于表13中。图15示出了ALP201平均血浆浓度与时间的曲线。注意，添加阿法酸酶α的历史数据以进行比较。

表13：猴中单次IV或SC施用后ALP201的平均(±SD)PK参数

缩写：AUC_∞＝从时间零(给药)外推至无穷大的浓度时间曲线下面积；AUC_t＝从时间零(给药)到最后可检测浓度的浓度时间曲线下面积；CL或CL/F＝总清除率；C_max＝观察到的最大血浆浓度；CV＝变异系数；IV＝静脉内；SC＝皮下；SD＝标准偏差；t_max＝达到观察到的最大血浆浓度的时间；t_1/2＝终末消除半衰期；V_d或V_d＝表观分布体积。

对于IV施用，在2mg/kg至20mg/kg的研究剂量范围内，C_max和AUC_∞值的增加接近与剂量成比例。ALP201的CL和V_d在剂量上保持一致，平均CL值范围为0.0008至0.0011L/h/kg，平均V_d值范围为0.08至0.10L/kg。ALP201的t_1/2在剂量上也保持相对类似，平均为约3天。对于SC施用，平均CL/F、V_d/F和t_1/2值与IV施用后估计的值一致。平均t_max范围为给药后17至19小时，表明从SC注射部位的吸收相对较慢。对于2mg/kg和20mg/kg剂量，绝对生物利用度分别为69.6％和86.9％。

使用ALP201的重复剂量毒代动力学研究

对大鼠进行四周的SC施用(1727-227)：将ALP201以2、10或30mg/kg/剂量每3天一次SC施用于大鼠，持续4周。此外，将ALP201以10mg/kg的单剂量静脉内施用于大鼠，以比较IV和SC途径生物利用度。使用非房室分析从第0天和第24天给药后的ALP201复合血浆浓度计算药代动力学参数并示于表14中。

在第0天和第24天SC施用ALP201后以及在第0天单次IV推注ALP201后，ALP201的全身暴露似乎与性别无关。在每3天SC施用ALP201后，ALP201的C_max和AUC_0-72h值在第0天和第24天以略小于剂量比例的方式随剂量的增加而增加。在重复SC施用后，ALP201的全身暴露(AUC_0-72h)似乎减少。暴露减少似乎是剂量依赖性的，在重复SC施用30mg/kgALP201后最大减少高达2倍。ALP201的皮下生物利用度(基于10mg/kg的AUC_0-72h值)为约44.2％。

表14：大鼠中4周重复SC或单次IV施用后的毒代动力学参数

^a：R＝第24天的AUC_0-72h/第0天的AUC_0-72h。

^b：F＝第0天10mg/kg SC剂量组的AUC_0-72h/第0天10mg/kg IV剂量组的AUC_0-72h*100

缩写：AUC_0-72h＝从0至72小时的血浆浓度-时间曲线下面积；AUC_0-168h＝从0至168小时的血浆浓度-时间曲线下面积；C_max＝观察到的最大血浆浓度；IV＝静脉内；SC＝皮下；NA＝不适用；T_max＝达到观察到的最大血浆浓度的时间。

对猴进行四周的SC施用：将ALP201以1、5或20mg/kg/剂量每3天一次SC施用于猴，持续4周。使用非房室分析从第1天和第24天给药后的ALP201血浆浓度计算PK参数并示于表15中。

表15：猴中4周重复SC施用后的ALP201毒代动力学参数

a：中位数(最小值-最大值)，仅在实际收集间隔时报告中位数值

b：R＝第24天的AUC_0-72h/第0天的AUC_0-72h。

缩写：AUC_0-72h＝从0至72小时的血浆浓度-时间曲线下面积；AUC_0-168h＝从0至168小时的血浆浓度-时间曲线下面积；C_max＝观察到的最大血浆浓度；IV＝静脉内；NA＝不适用；SC＝皮下；T_max＝达到观察到的最大血浆浓度的时间。

在第0天和第24天SC施用ALP201后，ALP201的全身暴露似乎与性别无关。在每3天皮下施用ALP201后，ALP201的C_max和AUC_0-72h值在第0天和第24天以大致与剂量成比例的方式随剂量的增加而增加。在第24天重复皮下施用ALP201后，ALP201的全身暴露(AUC_0-72h值)似乎增加。

重复剂量研究中的药代动力学、药效学和免疫原性

对大鼠进行的28天毒性研究，恢复期为28天

在每三天一次SC施用2、10或30mg/kg(10次/性别/剂量组，5次/性别/时间点)持续4周(共10剂)和10mg/kg的单次IV剂量(共1剂)后，对雄性和雌性大鼠评估ALP201的TK/ADA。从第0天和第24天开始，在72小时内从所有动物收集用于TK分析的血液样品。ALP201的PK参数总结于表16中。

表16.大鼠中重复SC或单次IV施用后第0天和第24天ALP201的平均PK参数

^a在第0天和第18天计算AUC_168h值

^bR＝第24天的AUC_72h/第0天的AUC_72h。

^cF＝第0天10mg/kg SC剂量组的AUC_72h/第0天10mg/kg IV剂量组的AUC_72h*100

缩写：AUC_72h＝从0至72小时的血浆浓度-时间曲线下面积；AUC_168h＝从0至168小时的血浆浓度-时间曲线下面积；C_max＝观察到的最大血浆浓度；F＝生物利用度；IV＝静脉内；SC＝皮下；NA＝不适用；t_max＝达到观察到的最大血浆浓度的时间；R＝累积比率

在重复SC施用ALP201和单次IV推注ALP201后，ALP201的全身暴露似乎与性别无关。因此，汇总的性别结果包括在表16中。在每3天(q3d)SC施用ALP201后，ALP201暴露(C_max和AUC_72h)在第0天和第24天以略低于剂量比例的方式随剂量的增加而增加。在重复SC施用后，第24天的全身暴露(C_max和AUC_72h)似乎减少。暴露减少似乎是剂量依赖性的，在重复SC施用30mg/kg ALP201后最大减少高达60％。ALP201的皮下生物利用度为约44.2％。

所有给药前样品的ADA反应均为阴性。D28和D56给药后ADA样品的ADA发生率分别为58％和90％。30mg/kg剂量在第24天的暴露减少(60％)可能是由于免疫原性反应。

对猴进行的28天毒性研究，恢复期为28天

在每三天一次SC施用1、5或20mg/kg(5次/性别/剂量组)持续4周(共10剂)后，对雄性和雌性猴评估ALP201的TK/ADA。在第0天和第24天收集用于TK分析的血液样品。ALP201的PK参数的描述性统计总结于表17中。

表17.猴中重复SC施用后第0天和第24天ALP201的平均(±SD)PK参数

^a中位数(最小值-最大值)，仅在实际收集间隔时报告中位数值

^b在第0天和第18天计算AUC_0-168h值

^cR＝第24天的AUC_72h/第0天的AUC_72h。

缩写：AUC_72h＝从0至72小时的血浆浓度-时间曲线下面积；AUC_168h＝从0至168小时的血浆浓度-时间曲线下面积；C_max＝观察到的最大血浆浓度；NA＝不适用；t_max＝达到观察到的最大血浆浓度的时间；R＝累积比率。

在第0天和第24天ALP201的全身暴露没有性别差异。因此，汇总的性别结果包括在表17中。在每3天一次皮下施用ALP201后，ALP201(C_max和AUC_72h)在第0天和第24天以大致与剂量成比例的方式随剂量的增加而增加。在第24天重复皮下施用ALP201后，ALP201的全身暴露(AUC_72h值)似乎增加，在1、5和20mg/kg下平均累积AUC_72h比率分别为2.12、1.83和2.15。

给药前样品的ADA反应均为阴性。D28和D56给药后ADA样品的ADA发生率分别为23％和92％。虽然阳性ADA反应与全身暴露浓度-时间曲线之间无法建立直接相关性，因为在TK采集日没有对ADA样品取样，但在多次给药后，一些动物在≤5mg/kg时的异常浓度-时间曲线似乎受到抗ALP201抗体的影响。

基于模型的分析和预测的人剂量方案

ALP201建模

群体药代动力学(Pop-PX)模型

为了鉴于小鼠剂量-反应结果预测人的ALP201暴露，使用基于体重的异速生长缩放和汇总的小鼠、大鼠和猴PK数据来开发Pop-PK模型以预测人PK参数估计。小鼠PK数据包括来自2个多剂量Akp2GW(-/-)小鼠功效研究(HPP-PoC-01和HPP-MED-01)的单剂量野生型小鼠研究(HPP-PK-01)和单C_谷测量(D36/D37)。对于大鼠和猴，还包括在大鼠和食蟹猴中进行的单剂量、剂量范围探索研究以及在大鼠和食蟹猴中进行的多剂量4周GLP毒理学研究。

使用NONMEM软件程序版本7.2(ICON解决方案)开发当前Pop-PK模型，以使用异速生长原理同时分析来自3个动物物种的IV和SC PK数据，考虑体重差异，其中动物体重集中在70kg，并且异速生长指数对于清除率参数固定为0.75，对于分布体积参数固定为1.0。基于4周TK评估ADA对PK对CL的影响，显示对于ADA+动物，大鼠和较小程度的猴似乎具有较低的ALP201浓度。当前最好的Pop-PK模型是具有线性消除的两房室模型。ADA+对ALP201浓度影响的测试是不确定的。估计人体中的生物利用度为约75％，计算的人体有效半衰期为7至9天。人PK模拟使用来自人阿法酸酶Pop-PK模型的估计变异性和参与评估阿法酸酶℃作为HPP治疗的临床试验的HPP受试者的平均(和标准偏差)成人基线体重。

剂量-反应模型

通过来自E_max家族的测试模型选择开发的剂量-反应模型。大多数剂量-反应关系可以通过E_max模型参数化之一来描述。目前的最佳剂量-反应表征是使用E_max+E₀(基线)模型。功效终点(骨矿化)是一种放射学评估，之所以选择它，是因为它具有与阿法酸酶α非临床剂量反应评估相同的功效临床定义。将用来自2个功效研究(HPP-PoC-01和HPP-MED-01)的阿法酸酶α或ALP201处理后的骨矿化与剂量作图(图6)。包括来自先前功效研究的阿法酸酶α数据用于比较。y轴表示为％正常，其定义为骨矿化评分为4的剂量组中小鼠的百分比。x轴表示为归一化为mg/kg/天的剂量。选择在85％的治疗群体中产生正常矿化的剂量(ED85)作为目标有效剂量。

从小鼠到人的剂量转换和建议的人起始剂量

对小鼠靶有效剂量(ED85)应用异速生长缩放以确定人剂量。用于预测小鼠ED85与人等效剂量(HED，mg/kg/天)的公式为ED85×(0.025kg小鼠/70kg人)^0.25。将HED转化为每周平均剂量45mg/周，并将用作FIH研究第2群组(IV和SC)的剂量。群组3(IV和SC)将使用90mg/周。群组1将使用15mg/周(IV和SC)的基于NOAEL的起始剂量。

ALP201的预测人体暴露和安全PK裕度

Pop-PK模型用于基于对人的异速生长缩放剂量模拟丰富PK曲线(图7)。使用模拟的PK数据，计算暴露量度C_max和AUC。

建议的FIH ALP201剂量的预测的人体暴露(C_max和AUC_168h)和预期的安全PK裕度示于表18中。使用预测的人体暴露和从4周GLP猴毒理学研究中观察到的NOAEL暴露(以20mg/kg/Q3D SC施用的NOAEL剂量)计算建议的FIH ALP201剂量的安全PK裕度。

表18：预测的ALP201 PK暴露、安全裕度和标准化矿化反应％

缩写：AUC_168h＝从时间零至168小时的浓度时间曲线下面积；C_max＝给药后测量的观察到的最大浓度；HPP＝低磷酸酯酶症；IV＝静脉内；n＝受试者数量；SC＝皮下；NA＝不可用

*来自猴4周SC毒理学研究的20mg/kg/q3d的NOAEL。

毒理学研究

对大鼠和猴进行了非临床安全性研究，以评估在SC施用ALP201长达28天后的局部耐受性、全身毒性和安全性药理学参数。在大鼠28天毒性研究中还评估了单剂量IV施用ALP201的非临床安全性评价，以表征SC ALP201的生物利用度。

单剂量毒理学研究

未对ALP201进行独立的单剂量耐受性研究。然而，将ALP201在大鼠和猴中的耐受性作为单剂量PK研究的一部分进行了评估。通过临床观察评估ALP201的耐受性，包括注射反应部位和临床病理学数据。在大鼠或猴单剂量PK研究中未发现值得注意的ALP201相关的注射部位反应、临床观察和临床病理学观察。总之，当对大鼠通过IV或SC施用高达27mg/kg和对猴施用高达20mg/kg时，单剂量的ALP201被良好耐受。基于获得的耐受性和临床病理学数据选择ALP201重复剂量确定性(GLP)毒理学研究的剂量。

重复剂量毒理学研究

对Sprague-Dawley大鼠和食蟹猴进行了明确的或符合GLP的28天毒性研究。在大鼠28天毒性研究中，通过皮下注射向雄性和雌性大鼠每3天一次施用ALP201，持续28天(第1、4、7、10、13、16、19、22、25和28天)，共10剂，高达30mg/kg/剂(本研究中评估的最高SC剂量)被良好耐受。此外，在单次注射后以10mg/kgIV施用ALP201也被良好耐受。在临床观察、体重、体重增加、定量食物消耗、眼科、功能性观察组合、血液学、尿液分析、大体病理学和器官重量方面没有ALP201相关的变化。在给药阶段结束时，在≥2mg/kg/剂量的ALP201SC下，碱性磷酸酶(ALP)活性出现剂量相关性增加(预期的药理学作用)，其在28天恢复期后完全消退。非不良微观变化与注射程序和引流淋巴结的相关反应性变化有关。注射部位或引流淋巴结变化的发生率、严重程度或微观特征没有明显的ALP201相关变化。恢复动物的注射部位和引流淋巴结的微观变化与终末尸检动物中观察到的相似，但在恢复组动物中不太明显。综上所述，认为30mg/kg/剂量的剂量水平是皮下施用未观察到的不良反应水平(NOAEL)；这对应于第24天雄性和雌性组合的C_max值为43.9μg/mL，AUC_0-72h值为2120h*μg/mL。

对大鼠单次IV推注注射10mg/kg ALP2-1后产生3690h*μg/mL的AUC_0-72h。ALP201在大鼠中的SC生物利用度(基于10mg/kg/剂的SC AUC_0-72h值)为约44.2％。

在猴28天毒性研究中，通过SC注射向雄性和雌性食蟹猴每3天一次以1mg/kg、5mg/kg或20mg/kg的剂量施用ALP201，持续28天(在第1、4、7、10、13、16、19、22、25和28天，共10天)，高达20mg/kg/剂量(本研究中评估的最高剂量)被良好耐受。在注射部位反应(皮肤评分)、体重、体重增加、定性食物消耗、眼科、手动呼吸率、间接血压、定性心电图、血液学、尿液分析、大体病理学和器官重量方面没有ALP201相关变化。在给药阶段结束时，碱性磷酸酶(ALP)活性出现剂量相关性增加(预期的药理学作用)，其在28天恢复期后完全(1mg/kg/剂)或大部分(≥5mg/kg/剂)消退。非不良ALP201相关微观变化局限于注射部位，包括最小至轻度变性/坏死、矿化和混合细胞炎症/浸润。在恢复组中观察到注射部位的变性/坏死和混合细胞炎症/浸润的部分恢复，而恢复期雄性在≥1mg/kg/剂量和雌性在20mg/kg/剂时持续最小至轻度矿化。所有动物在1mg/kg/剂时和一些动物在≥5mg/kg/剂时观察到心率增加。这些心率增加不被认为是不利的，因为除了全身暴露数据不一致之外，该年龄的猴的心率和ECG值仍保持在正常的生物学变化范围内。综上所述，认为20mg/kg/剂的剂量水平是未观察到的不良反应水平(NOAEL)，这分别对应于第24天雄性和雌性组合的平均C_max值为254μg/mL，平均AUC_0-72h值为15400h*μg/mL。

局部耐受性

没有进行独立的非临床研究来评估局部耐受性。然而，在大鼠和猴一般毒理学研究中的SC ALP201和在大鼠一般毒理学研究中的IVALP201中进行了注射部位的评估。ALP201的皮下和IV施用在猴中局部耐受良好，在注射部位没有观察到不良结果

与ALP201的临麻研究相关的非临床观察结果的总结

安全性评估

在28天毒理学研究中，在临床观察、体重、体重增加、定量食物消耗、眼科、功能性观察组合(CNS)观察、心血管终点、呼吸终点、血液学、尿液分析、大体病理学和器官重量方面没有ALP201相关的变化。在给药阶段结束时，碱性磷酸酶(ALP)活性出现显著的剂量相关性增加，这是大鼠或猴中预期的药理学作用。在各研究中评估的任何剂量下，在大鼠或猴中均没有观察到显著的全身器官毒性。

对大鼠和猴SC施用后，ALP201被局部良好耐受。猴研究中非不良ALP201相关微观变化局限于注射部位，包括雄性和雌性的最小至轻度变性/坏死。在恢复组中，注射部位的变性/坏死和混合细胞炎症/浸润的发生率和严重程度较低或具有慢性(矿化)特征，表明部分恢复。大鼠研究中的非不良微观变化限于注射程序和引流淋巴结的相关反应性变化。注射部位或引流淋巴结变化的发生率、严重程度或微观特征没有明显的ALP201相关变化。恢复动物的注射部位和引流淋巴结的微观变化与终末尸检动物中观察到的相似，但在恢复组动物中不太明显。

从GLP SC猴毒性研究中观察到的20mg/kg/剂的NOAEL暴露是约建议的15mg IV或15mg qw x 3SC人起始单剂量的预计AUC暴露的113倍(对于IV)和83倍(对于SC)(表18)。考虑到在使用ALP201的28天大鼠和猴毒理学研究中的安全裕度和缺乏全身毒性或局部耐受性结果，在15mg起始剂量下对人的安全风险非常低。

免疫原性

通过测量从GLP大鼠和猴28天毒理学研究收集的血清中的ALP201抗药物抗体(ADA)评估ALP201的免疫原性潜力。

在大鼠毒性研究中，在PK第28天，对照组的20只动物中的9只(6只雄性；3只雌性)、2mg/kg/剂的19只动物中的10只(6只雄性；4只雌性)、10mg/kg/剂的20只动物中的12只(7只雄性；5只雌性)、30mg/kg/剂的20只动物中的12只(6只雄性；6只雌性)在SC施用后ADA反应呈阳性。此外，在PK第28天，20只动物中的14只(8只雄性；6只雌性)在以10mg/kg单剂量IVALP201施用后ADA反应呈阳性。阳性ADA反应似乎不一致地影响第24天2和10mg/kg/剂SC剂量组的复合血浆浓度-时间曲线，但ADA可能导致第24天30mg/kg/剂的全身暴露明显减少。基于所进行的研究，对照动物中的阳性ADA反应不太可能是由于ALP201错误给药所致。在终末尸检之前，观察到≥2mg/kgSC剂量组的ALP的剂量依赖性增加(ALP201的预期药理学作用)，这在恢复尸检时消退。对照组中的动物在终末和恢复期尸检前的ALP结果相似。此外，在给药和恢复期没有ALP201-相关的活体发现。因此，总而言之，在PK第28天和第56天(研究日期第29天和第57天)在对照动物中观察到的阳性ADA反应最有可能是由于血液收集污染，并且被认为对研究没有影响。

在猴毒性研究中，在第0天所有给药前样品的抗ALP201抗体反应均为阴性。在第28天，1mg/kg/剂的10只动物中的4只、5mg/kg/剂的10只动物中的6只和20mg/kg/剂的10只动物中的5只ADA反应呈阳性。虽然阳性ADA反应与全身暴露浓度-时间曲线之间无法建立直接相关性，因为在TK采集日没有对ADA样品取样，但在多次给药后，一些动物在≤5mg/kg时的浓度-时间曲线似乎受到抗ALP201抗体的影响。受抗ALP201抗体影响的动物是1mg/kg/剂的3只动物(2只雄性和1只雌性)和5mg/kg/剂的3只动物(3只雌性)，这些动物对浓度-时间曲线的影响天数在第18天至第24天的范围内。

实施例2

阿法酸酶α在多种物种中的药代动力学特征表明，绝对生物利用度和半衰期降低的组合需要频繁给药。人TNSALP的催化结构域是高度糖基化的分子。脱唾液酸化聚糖的存在导致肝脏中通过脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的清除。

考虑到这些因素，ALP201被开发为下一代碱性磷酸酶ERT。ALP201保留了阿法酸酶α中使用的TNSALP-IgG Fc-D10结构，并掺入了两个非必需的N-连接聚糖的去除、人Fc同种型至IgG2/4的改变，以及导致更高的TSAC掺入的分子表达的多种方法改进。在本报告中，我们呈现了通过静脉内和皮下施用在雄性C57BL/6小鼠的单剂量研究中确定的ALP201的药代动力学参数。我们还报告了用不同水平的TSAC掺入表达和纯化的多批ALP201的PK参数，以帮助确定哪些PK参数受脱唾液酸化聚糖清除率的影响最大。

材料和方法

动物品系

为了保持这些研究与先前对阿法酸酶α进行的药代动力学研究之间的一致性，使用在给药时约11-12周龄的雄性C57BL/6小鼠进行该研究。测试分子的信息在表19中示出。

表19：测试物

*比活性以U/mg 4-MUP水解列出，其中1U＝在37℃的测定缓冲液条件下在1分钟内水解1微摩尔4-MUP所需的酶。

动物给药和血液采样

根据体重将11-12周龄的动物随机分成4组。在第0天通过静脉内递送(IV)(组1)或皮下(SC)(组2)向16只小鼠/组施用4mg/kg剂量的ALP201。在第0天通过IV(组3)或SC(组4)向4只小鼠/组施用等重量调整体积的PBS。通过尾静脉施用IV给药。SC推注给药在肩膀上方的肩胛区域进行施用。

使用半连续取样设计，每组4个群组，n＝4/每群组+每组额外1只小鼠。在Alexion进行的研究中，对每只小鼠取血3次，包括终末取血。每个群组的时间点(给药后小时数)在下表20中示出。

对于非终末取血，通过颌下采集将100mL全血收集到预涂肝素锂管中，以在每个时间点收集每只动物至少50μL血浆。在终末取血时，通过心脏穿刺将尽可能多的血液收集到肝素锂收集管中。将血液保存在4℃并在采集后尽可能快地通过离心处理血浆。将每个血浆样品分成2个等体积的等分试样，然后在CO₂/乙醇中快速冷冻并储存在-80℃。

表20：内部研究的实验治疗组、剂量、施用途径和血液采样计划表

^aN＝每组16只+额外1只，在动物死亡或给药错误的情况下用作替代动物

表21：内部研究、组1和组2的群组的血液采样计划表

表22：内部研究、组3和组4的血液采样计划表

对于批次2、3和4，每种施用途径将32只小鼠组分成8个群组，每个时间点4只动物。在IV施用的组中，每个群组在给药后约0.5、1、3、8、12、21、26、32、45、49、72、96、120、192、264和336小时取血两次(第一时间点为存活采集，并且第二时间点为终末)。在SC施用的组中，每个群组在给药后约1、3、6、8、12、21、26、32、45、49、72、96、120、192、264和336小时取血两次(第一次为存活采集，并且第二次为终末、)。

血浆中活性ALP201浓度的测定

使用4-甲基伞形酮磷酸酯(4-MUP)作为人工底物测定血浆样品的碱性磷酸酶活性。4-MUP中磷酸酯键的水解释放荧光化合物4-甲基伞形酮(4-MU)，其容易被荧光计检测到。通过酶活性标准曲线进行活性定量。

内部PK研究的样品分析

通过酶活性标准曲线进行活性定量，该酶活性标准曲线使用在同一板上的4-MUP测定中具有已知活性的阿法酸酶α蛋白参考标准品的系列稀释液产生。将解冻的血浆样品在测定缓冲液(50mM HEPES、150mM NaCl、1mM MgCl₂、pH 7.4和1mg/mL BSA)中稀释100倍至2,000倍并测定以确定活性ALP201酶浓度。每个板上的最终蛋白质标准范围为4-80ng/mL。

如下定量稀释的样品：在开始测定之前，通过向蛋白质样品中添加4-MUP，使所有稀释的样品达到37℃，得到10mM 4-MUP的最终浓度。在360nm的激发波长和465nm的发射波长下测量4-MU的产生。在保持在37℃的读板器中收集数据，每40秒读板一次，共20分钟。使用Microsoft Excel以每分钟的相对荧光单位(RFU)为单位通过反应斜率的线性回归计算血浆和标准样品的反应速率。使用标准样品的反应速率来构建以RFU/min/U为单位的线性标准曲线。将血浆样品中测量的反应速率与标准曲线进行比较以确定以U/mL为单位的ALP201的血浆活性。通过将样品活性除以测试蛋白质样品的比活性(以U/mg为单位)，将以单位/mL为单位的样品活性转换为以mg/L为单位的质量单位。样品一式两份运行两次以编辑每个独立采样点的数据。

PK研究的样品分析

进行相同的4-MUP水解测定。在测定当天，将标准品、质量对照(QC)、稀释对照(DC)和空白在测定缓冲液中稀释250倍。用底物4-甲基伞形酮磷酸酯(4-MUP)进一步将标准品、QC、DC和空白稀释2倍，达到总共500倍的最小所需稀释(MRD)。在进行MRD之前，将DC在小鼠血浆中稀释200倍。基于荧光产物甲基伞形酮定量ALP201，该荧光产物甲基伞形酮由测定中使用的4-MUP底物的水解产生。将板置于读板器中并在37℃下在360nm(激发)、455nm(截止)和465nm(发射)的动态荧光设置下每60秒读取一次，持续25分钟。酶活性与底物反应速率成正比。根据数据的最佳拟合线确定Vmax(荧光强度速率/min)。曲线拟合中不包括空白。结果以mg/L为单位报告。根据测试物与蛋白质活性标准品之间的比活性差异对值进行了校正。

药代动力学分析

使用Phoenix WinNonlin v8.0(Certara)进行PK分析。使用非房室分析计算药代动力学参数。

计算以下非房室PK参数：从时间零(给药)到最后可检测浓度的浓度-时间曲线下面积(AUC_t)、从时间零(给药)到最后可检测浓度的浓度-时间曲线下剂量归一化面积(AUC_t/剂量)、从时间零(给药)外推至无穷大的浓度-时间曲线下面积(AUC_inf)、从时间零(给药)外推至无穷大的浓度-时间曲线下剂量归一化面积(AUC_inf/剂量)、观察到的最大血浆浓度(C_max)、观察到的剂量归一化最大血浆浓度(C_max/剂量)、达到观察到的最大血浆浓度的时间(T_max)、终末消除半衰期(t_1/2)、总清除率(CL)、表观分布体积(V_d)和生物利用度(F)。使用实际样品采集时间来计算PK参数。使用实际剂量来计算剂量归一化的PK参数。

结果和讨论

小鼠中IV和SC施用后ALP201的药代动力学参数

在向雄性C57BL/6小鼠单次IV或SC施用后评估ALP201的PK。在每组中对16只小鼠给药，并在施用后的以下时间点从每组中4只小鼠的细分群组采集血液：0.25、1、6、24、48、72、96、120、192、264、336和480小时。

使用酶活性测定法测量血浆ALP201浓度，该酶活性测定法测量ALP201的碱性磷酸酶催化活性。然后将ALP201的酶活性转换为质量单位(mg/L)以进行报告。

IV和SC施用后的平均活性ALP201血浆浓度对时间的曲线以半对数标度呈现在图8A和图8B中。ALP201的PK参数总结于上表7和11中。

IV组中的一些小鼠的个体小鼠血浆活性曲线似乎表明一些剂量可能是皮下递送的，这可能是在IV给药曲线的早期时间点观察到的相对较高变异性的原因。如果发生这种情况，IV给药组的C_max的计算值也可能被人为地降低。IV施用后，浓度-时间曲线以多指数方式下降(图8A和图8B)。CL为0.0019L/h/kg，表观终末t1/2为48小时。SC施用后，达到最大浓度的时间(t_max)为给药后48小时，表明从SC注射部位吸收相对较慢。SC施用后的绝对生物利用度为96％。

小鼠中具有不同总唾液酸含量值的ALP201批次的药代动力学参数

将三个单独批次的ALP201(经测量的TSAC值分别为5.9、5.0和3.2摩尔唾液酸/摩尔蛋白质单体纯化)通过IV和SC施用给32只小鼠。在施用后的以下时间点从每个施用组内的4只小鼠的细分群组采集血液：IV施用的给药后0.5、1、3、8、12、21、26、32、45、49、72、96、120、192、264和336小时；SC施用的给药后1、3、6、8、12、21、26、32、45、49、72、96、120、192、264和336小时，每只小鼠取血两次。

使用一种测定法测量血浆ALP201浓度，该测定法测量ALP201的碱性磷酸酶催化活性。ALP201的酶活性由Charles River以质量单位(mg/L)报告。

每个蛋白质批次的IV和SC施用后的平均活性ALP201血浆浓度与时间的曲线以半对数标度呈现在图9A和图9B、图10A和图10B以及图11A和图11B中。图12呈现了IV施用TSAC值变体的血浆浓度与时间曲线的集合。图13呈现了SC施用的血浆浓度与时间曲线的集合。IV和SC施用后的平均PK参数和平均剂量归一化PK参数的列表总结可分别参见表21和表22。

表23：对雄性C57BL/6小鼠皮下施用后TSAC值变体的ALP201药代动力学参数的总结

缩写：AUC_∞＝从时间零(给药)外推至无穷大的浓度时间曲线下面积；AUC_t＝从时间零(给药)到最后可检测浓度的浓度时间曲线下面积；CL或CL/F＝总清除率；C_max＝观察到的最大血浆浓度；F＝绝对生物利用度；IV＝静脉内；NA＝不适用；SC＝皮下；TSAC＝总唾液酸含量；t_max＝达到观察到的最大血浆浓度的时间；t_1/2＝终末消除半衰期；V_d或V_d/F＝表观分布体积。

表24：对雄性C57BL/6小鼠皮下施用后TSAC值变体的剂量归一化ALP201药代动力学参数的总结

缩写：AUC_inf/剂量＝从时间零(给药)外推至无穷大的浓度时间曲线下剂量归一化面积；AUC_t/剂量＝从时间零(给药)到最后可检测浓度的浓度时间曲线下剂量归一化面积；C_max/剂量＝观察到的剂量归一化最大血浆浓度；IV＝静脉内；SC＝皮下；TSAC＝总唾液酸含量

TSAC值为5.9、5.0和3.2mol/mol的ALP201蛋白批次对应于每个共有N-连接聚糖位点1.48、1.25和0.80摩尔的唾液酸，并且所有批次(对于IV和SC施用)的PK曲线形状相似，具有相似的T_max和t_1/2值。

随着TSAC值的增加，清除率略微降低，IV和SC途径的C_max和AUC增加，分布体积减小。所有这些变化都与以下观点一致：较低的TSAC值导致较高水平的不成熟N-连接聚糖，这些不成熟N-连接聚糖可以被细胞受体如ASGPR快速清除并导致蛋白质样品的清除率较高、C_max较低和AUC较小。这些参数的变化相对较小，并且最大相差最多2倍。

小鼠ALP201 PK参数与小鼠阿法酸酶αPK参数的比较

作为第二代碱性磷酸酶ERT，ALP201旨在改善阿法酸酶α的PK参数，其先前在使用雄性C57BL/6小鼠的小鼠PK研究中进行了测试。阿法酸酶α的PK参数总结在表25中呈现。

表25：在以2mg/kg单次IV或SC施用后在C57BL/6小鼠中先前确定的阿法酸酶α的药代动力学参数

缩写：AUC_∞＝从时间零(给药)外推至无穷大的浓度时间曲线下面积；AUC_t＝从时间零(给药)到最后可检测浓度的浓度时间曲线下面积；CL＝总清除率；C_max＝观察到的最大血浆浓度；F＝绝对生物利用度；IV＝静脉内；SC＝皮下；t_1/2＝终末消除半衰期

在雄性C57BL/6小鼠中收集的ALP201的所有PK数据集中，ALP201表现出优异的体内半衰期(如通过t_1/2所测量的)、体内暴露(如通过Cmax和AUC所测量的)和生物利用度。对于所有测试样品，ALP201在小鼠体内的清除率也显著低于阿法酸酶α。

由于阿法酸酶α释放规范将分子的TSAC值限制在1.2-3.0mol/mol，并且该分子每个单体具有6个N-连接糖基化位点，因此阿法酸酶α的唾液酸掺入仅为0.20-0.50摩尔唾液酸/聚糖。这表明阿法酸酶α上的许多聚糖不含唾液酸部分，并且可以是ASPGR清除的有效底物。这可以解释观察到的阿法酸酶α相对于ALP201的较高清除率和较低剂量归一化Cmax和AUC。

这些ALP201样品都具有比阿法酸酶α高得多的生物利用度，其中生物利用度最低的ALP201样品的生物利用度是观察到的阿法酸酶α的生物利用度的大致两倍(72.1％对38.8％)。两种构建体之间人IgGFc结构域同种型的差异可能是造成这种观察结果的原因。我们已经证明，ALP201的IgG2/4Fc结构域不与一组常见的Fcg受体结合，但阿法酸酶α的IgG1 Fc结构域确实与它们中的至少两种强烈结合(来源：研究技术报告036)。如果这些Fcg受体存在于皮下空间，阿法酸酶α甚至可以在其进入体循环之前被清除，从而降低生物利用度和暴露。

结论

这些研究的结果表明，ALP201在小鼠中相对于阿法酸酶α在IV或SC施用后具有显著改善的剂量调整药代动力学特征，具有更高的生物利用度、剂量归一化C_max和剂量归一化暴露。使用具有不同TSAC掺入水平的ALP201样品进行的其他PK研究表明，随着TSAC水平的增加，C_max和体内暴露略有增加。消除半衰期、T_mmax和生物利用度似乎相对不受TSAC值变化的影响。

实施例3

使用ALP201的单剂量PK研究的概述

分别在Sprague-Dawley大鼠和食蟹猴中进行了两个单剂量PK研究作为阿法酸酶α非临床开发程序的一部分(表26)。这些研究支持ALP201单剂量研究。

表26：用阿法酸酶α进行的单剂量PK研究

注：除非另有说明，否则PK/TK参数均通过非房室分析(NCA)方法表征。

缩写：IV＝静脉内；PK＝药代动力学；SC＝皮下；TK＝毒代动力学。

在单剂量IV施用后，阿法酸酶α的全身清除率(CL)为0.0193-0.0492L/h/kg，表观半衰期为27-34小时。稳态分布体积(V_ss)范围为0.432-1.39L/kg。在对大鼠和猴单次SC施用后，达到最大浓度的时间(T_max)的范围为给药后10-32小时，表明阿法酸酶α从SC注射部位缓慢吸收。SC施用途径在大鼠和猴中的估计生物利用度为26％-35％。

单剂量PK研究的结论

ALP201旨在改进已批准产品阿法酸酶α的特性，提高功效/活性、全身暴露、绝对生物利用度和半衰期。ALP201中的Ig Fc结构域同种型是G2/4而不是阿法酸酶α中存在的IgG1Fc结构域。这种改变旨在改善ALP201的药代动力学特性，包括全身PK暴露、半衰期和生物利用度。

来自3种动物物种(小鼠、大鼠和猴)的临床前数据提供了已经实现这些目的的支持性证据。与阿法酸酶α相比，在3种动物物种中IV/SC施用后，ALP201在PK暴露(＞10倍)、绝对生物利用度(2倍)和半衰期(2倍)方面表现出显著改善。临床前群体PK建模还预测，改善的ALP201 PK特性预期外推至人，这将有利于以减少的注射体积、较小的施用频率和较低的每年总量治疗患者，从而减轻患者的治疗负担。

非临床安全性研究

支持首次人体研究的毒理学研究总结

未对ALP201进行独立的单剂量毒理学/耐受性研究。基于从大鼠和猴中的ALP201单剂量IV和SC PK研究获得的数据，选择用于重复剂量确定性(GLP)毒理学研究的ALP201剂量。在大鼠和猴的单剂量IV和SC PK研究中，通过临床观察(包括注射部位反应和临床病理学数据)评估了ALP201的耐受性。总之，当对大鼠通过IV或SC施用单剂量高达27mg/kg和对猴施用高达20mg/kg时，ALP201被良好耐受。

对食蟹猴和Sprague-Dawley大鼠的最终符合GLP标准的ALP20128天毒性研究正在进行中。大鼠和猴研究的活体部分(包括恢复期)已经完成，并且正在准备报告。尽管尚未获得这些研究的审核报告草稿，但除ADA数据外，这两项研究的所有数据均已提供，结果总结于表27中。总之，对大鼠和猴的ALP20128天毒性研究的结果表明，ALP201治疗并未导致在两个研究中评估的任何毒性终点(包括安全药理学终点)的任何显著/生物学上有意义的治疗相关不良反应。

表27：ALP201大鼠和猴28天GLP毒性研究结果的比较

^a大鼠和猴28天毒性研究正处于报告阶段。

^b在大鼠研究中，将单剂量的ALP201以10mg/kg静脉内施用于第5组动物，以确定SC施用后ALP201的绝对生物利用度。

^c报告了性别组合的平均全身暴露值。IV和SC研究的AUC值分别报告为AUC_0-245和AUC_0-168。

缩写：ALP＝碱性磷酸酶；AUC＝浓度-时间曲线下面积；C_max＝观察到的最大血浆浓度；CNS＝中枢神经系统；ECG＝心电图；GLP＝良好实验室规范；IV＝静脉内；NOAEL＝未观察到的不良反应水平；Q3D＝每3天一次；SC＝皮下。

ALP201晚期临床开发的非临床安全性策略

相对于Alexion销售的ERT产品阿法酸酶ALP201是改进的ERT。ALP201的人TNSALP催化结构域包括在3个位置处的合理设计的改变，以赋予更高的酶活性。ALP201的Fc部分是人免疫球蛋白γ2/4(IgG2/4)，而阿法酸酶α的Fc部分是人免疫球蛋白IgG1。靶向骨的ALP201和阿法酸酶α的C末端区域是相同的。

来自ALP201和选择的阿法酸酶α研究的可用发现如下：

1.对大鼠和猴的ALP201 GLP 28天毒理学研究的毒性发现非常相似(表31)

2.对猴和大鼠进行相似持续时间(4周/28天)的ALP201和阿法酸酶α毒理学研究的毒性发现非常相似(分别为表32和表33)

3.阿法酸酶α完整非临床安全包的毒性发现很大程度上限于大鼠的短暂局部耐受性发现，没有其他显著的与阿法酸酶α治疗相关的不良发现。

ALP201慢性/6个月一般毒理学研究策略

以下观察结果支持单一物种慢性毒理学研究策略：

4.在大鼠和猴28天GLP毒理学研究中，在每3天一次(Q3D)10次重复SC施用ALP201后，没有观察到显著的全身毒性和/或局部耐受性发现，但与阿法酸酶α相比，ALP201的全身暴露显著更高。全身暴露总结于表31和表32中

5.ALP201大鼠和猴28天GLP毒理学研究的毒性发现非常相似。这些研究的结果总结于表28中

6.如果短期一般毒理学研究的毒理学结果相似，则通常认为对1种物种进行长期一般毒性研究就足够了。

7.大鼠是用ALP201进行慢性毒性研究的优选物种。另外，当仅使用一种物种进行长期一般毒性研究时，大鼠是优选物种。

基于模型的分析和预测的人剂量方案

ALP201建模

当前模型中使用的数据

为了进行从小鼠(疾病模型物种)到人的剂量外推，需要进行足够的PK分析来模拟异速生长缩放剂量下的人暴露。可用的小鼠PK数据有限；来自2个多剂量Akp2GW-/-小鼠功效研究(HPP-PoC-01和HPP-MED-01)的单剂量野生型小鼠研究(HPP-PK-01)和单C_谷测量(D36/D37)。为了建立ALP201的强有力的PK表征，用来自大鼠和食蟹猴中的剂量范围探索研究的PK数据丰富小鼠数据。表30示出了迄今为止使用群体药代动力学(Pop-PK)建模方法分析的数据(47只动物和387种PK浓度)。对于剂量-反应建模，使用了来自2个Akp2GW-/-小鼠功效研究(HPP-PoC-01和HPP-MED-01)的功效(骨矿化)数据。

表30：用于开发Pop-PK模型的ALP201单剂量PK数据

缩写：IV＝静脉内；N＝动物数量；PK＝药代动力学；Pop-PK＝种群-药代动力学；SC＝皮下。

当前Pop-PK模型

使用NONMEM软件程序，版本7.2(ICON解决方案)开发当前Pop-PK模型，以使用基于体重的异速生长原理同时分析3个动物物种的PK数据，考虑PK处置中的物种差异，其中动物体重集中在70kg，并且异速生长指数对于清除率参数固定为0.75，对于分布体积参数固定为1.0。还同时拟合IV和SC数据以估计SC注射后的血管外参数，例如绝对生物利用度。当前模型是具有线性消除的两房室模型，并且模型参数估计值在表31中。

表31：临时Pop-PK模型的参数估计值

缩写：BSV＝受试者之间的变异性；RSE＝相对标准误差($COV步骤的参数精度)

充分估计PK参数的典型值或平均参数估计值。CL的变异性(BSV)是可以接受的并且得到了很好的估计；然而，Ka和F的变异性较大(分别为86％和76％)，并且没有得到很好的估计。收缩率是对数据如何影响PK参数估计的评估，其中值＜30％为良好。考虑到Ka和F的高收缩值(分别为40％和59％)，4周GLP毒理学研究的附加数据应改善Ka和F参数的估计。总体而言，考虑到良好的平均参数估计，当前Pop-PK模型应提供合理的剂量模拟；但是，变异性区域可能过宽。

当前剂量-反应模型

通过来自E_max家族的测试模型选择开发的剂量-反应模型。大多数剂量-反应关系可以通过E_max模型参数化之一来描述。目前的最佳剂量-反应表征是使用E_max+E₀(基线)模型。功效终点(骨矿化)是一种放射学评估，并且之所以选择它，是因为它具有与阿法酸酶α非临床剂量反应评估相同的功效临床定义。将用来自2个功效研究(HPP-PoC-01和HPP-MED-01)的阿法酸酶α或ALP201处理后的骨矿化对剂量作图(图16、)。包括来自先前功效研究ALP-PT-12的阿法酸酶α数据用于比较。y轴表示为％正常，其定义为骨矿化评分为4的剂量组中小鼠的百分比。x轴表示为归一化为mg/kg/天的剂量。选择在85％的治疗群体中产生正常矿化的剂量(ED85)作为目标有效剂量。

从小鼠到人的剂量转换和建议的人起始剂量

对小鼠靶有效剂量(ED85)应用异速生长缩放以确定人剂量。预测小鼠ED85与人等效剂量(HED，mg/kg/天)的公式为ED85×(0.025kg小鼠/70kg人)^0.25。将HED转化为每周平均剂量45mg/周，并用作FIH研究的MAD组的起始剂量。在考虑NOAEL和MABEL方法的结果后，选择SAD组的最大推荐起始剂量(MRSD)。决定选择产生最小目标药理学反应的研究剂量并将其转化为平均人剂量(5mg)。

其他实施方案

给出前述详细描述和实施例仅为了清楚地理解。由此不应理解为不必要的限制。本公开不限于示出和描述的确切细节，对于本领域技术人员显而易见的变化将包括在由权利要求限定的范围内。

除非另外说明，否则说明书和权利要求书中使用的表示组分的量、分子量等的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，除非另有相反说明，否则在说明书和权利要求书中阐述的数值参数是近似值，其可以根据寻求获得的所需特性而变化。至少，并且不试图限制权利要求范围的等同原则，每个数值参数应当至少根据所报告的有效数字的数量并通过应用普通的四舍五入技术来解释。

尽管阐述本公开的宽范围的数值范围和参数是近似值，但尽可能精确地报告了具体实施例中阐述的数值。然而，所有数值本质上包含一定由在它们各自的测试测量中发现的标准偏差产生的范围。

本文引用的所有专利、专利申请(包括临时专利申请)、出版物(包括专利出版物和非专利出版物)和电子可获得的材料(包括例如在GenBank和RefSeq中提交的核苷酸序列，以及在例如SwissProt、PIR、PRF、PDB中提交的氨基酸序列，以及来自GenBank和RefSeq中带注释的编码区的翻译)的完整公开内容均以引用方式并入。给出前述详细描述和实施例仅为了清楚地理解。由此不应理解为不必要的限制。本公开不限于示出和描述的确切细节，对于本领域技术人员显而易见的变化将包括在由权利要求限定的实施方案内。

序列表

<110> 阿雷克森制药公司(Alexion Pharmaceuticals, Inc.)

<120> 碱性磷酸酶多肽及其使用方法

<130> 50694-094WO2

<150> US 63/149,090

<151> 2021-02-12

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 507

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

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<212> PRT

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<223> 合成构建体

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 4

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<210> 5

<211> 724

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 5

Leu Val Pro Glu Lys Glu Lys Asp Pro Lys Tyr Trp Arg Asp Gln Ala

1 5 10 15

Gln Glu Thr Leu Lys Tyr Ala Leu Glu Leu Gln Lys Leu Asn Thr Asn

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275 280 285

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Ala Arg Gly Thr Arg Leu Asp Gly Leu Asp Leu Val Asp Thr Trp Lys

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Phe Glu Pro Gly Asp Met Gln Tyr Glu Leu Asn Arg Asn Asn Val Thr

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530 535 540

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

545 550 555 560

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

565 570 575

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

580 585 590

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

595 600 605

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

610 615 620

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

625 630 635 640

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

645 650 655

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

660 665 670

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

675 680 685

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

690 695 700

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Asp Ile Asp Asp Asp Asp

705 710 715 720

Asp Asp Asp Asp Asp Asp

725

Claims (51)

1.一种药物组合物，其包含与SEQ ID NO:5具有至少80％序列同一性并且具有至少一种选自相对于SEQ ID NO:1的E108M、N213Q和N286Q的突变的多肽，以及包含磷酸盐、脯氨酸和蔗糖中的一种或多种的药学上可接受的载体。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述多肽与SEQ ID NO:5具有至少85％、90％、95％、97％或99％的序列同一性。

3.如权利要求2所述的药物组合物，其中所述多肽包含SEQ ID NO:5的序列或由其组成。

4.如权利要求1至3中任一项所述的药物组合物，其中所述多肽包含相对于SEQ ID NO:1的两种或三种突变E108M、N213Q和N286Q。

5.如权利要求1至4中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物包含约1mM至约100mM磷酸盐。

6.如权利要求5所述的药物组合物，其中所述组合物包含约5mM至约20mM磷酸盐。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其中所述组合物包含约10mM磷酸盐。

8.如权利要求1至7中任一项所述的药物组合物，其中所述磷酸盐是磷酸钠。

9.如权利要求1至8中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物包含约1mM至约500mM脯氨酸。

10.如权利要求9所述的药物组合物，其中所述组合物包含约50mM至约200mM脯氨酸。

11.如权利要求10所述的药物组合物，其中所述组合物包含约140mM脯氨酸。

12.如权利要求1至11中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物包含约1mM至约500mM蔗糖。

13.如权利要求12所述的药物组合物，其中所述组合物包含约50mM至约200mM蔗糖。

14.如权利要求13所述的药物组合物，其中所述组合物包含约140mM蔗糖。

15.如权利要求6至14中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物包含约10mM磷酸盐、约140mM脯氨酸和约140mM蔗糖。

16.如权利要求1至15中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物包含约0.01％至约0.5％聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯。

17.如权利要求16所述的药物组合物，其中所述组合物包含约0.01％至约0.1％聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯。

18.如权利要求17所述的药物组合物，其中所述组合物包含约0.05％聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯。

19.如权利要求18所述的药物组合物，其中所述组合物包含约140mM脯氨酸、约140mM蔗糖和约0.05％聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯。

20.如权利要求1至19中任一项所述的药物组合物，其中所述多肽包含约1.0mol/mol至约6.0mol/mol的总唾液酸含量(TSAC)。

21.如权利要求20所述的药物组合物，其中所述TSAC为约3.0mol/mol至约6.0mol/mol。

22.如权利要求21所述的药物组合物，其中所述TSAC为约3.2mol/mol、5.0mol/mol或约5.9mol/mol。

23.如权利要求1至22中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物的pH为约7.3。

24.如权利要求1至23中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物以约0.1mg/mL至约200mg/mL的浓度配制。

25.如权利要求1至24中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物配制成约0.1mL至约50mL的体积。

26.如权利要求24或25所述的药物组合物，其中所述组合物以约100mg/mL的浓度配制成约1mL的体积。

27.一种小瓶，其包含权利要求1至23中任一项所述的药物组合物。

28.如权利要求27所述的小瓶，其中所述组合物配制成约0.1mL至约50mL的体积。

29.如权利要求28所述的小瓶，其中所述组合物配制成约10mL的体积。

30.如权利要求27至29中任一项所述的小瓶，其中所述组合物以约0.1mg/mL至约200mg/mL的浓度配制。

31.如权利要求30所述的小瓶，其中所述组合物以约100mg/mL的浓度配制。

32.如权利要求27至31中任一项所述的小瓶，其中所述组合物以约100mg/mL的浓度配制成约1mL的体积。

33.一种治疗有需要的受试者的骨矿化病症的方法，其包括向所述受试者施用一定剂量的权利要求1至26中任一项所述的药物组合物。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述骨矿化病症选自低磷酸酯酶症(HPP)、骨折、骨质疏松症、硬化性骨化病、软骨钙质沉着病、张力减退、杜氏肌营养不良、气管支气管软化症、癫痫发作、神经纤维瘤病和颅缝早闭。

35.如权利要求33或34所述的方法，其中所述多肽以足以治疗所述骨矿化病症的量和持续时间施用。

36.如权利要求33至35中任一项所述的方法，其中所述治疗增强了所述受试者的骨形成。

37.如权利要求33至36中任一项所述的方法，其中所述多肽以约0.01mg/kg至约20mg/kg的剂量施用。

38.如权利要求37所述的方法，其中所述多肽以约0.1mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。

39.如权利要求33至38中任一项所述的方法，其中所述多肽每天、每周、每月或每年施用一次。

40.如权利要求33至39中任一项所述的方法，其中每周施用约10至约100mg的所述多肽。

41.如权利要求40所述的方法，其中每周施用约15至约90mg多肽。

42.如权利要求41所述的方法，其中每周施用约15mg、约30mg、约45mg或约90mg多肽。

43.如权利要求33至42中任一项所述的方法，其中所述多肽施用至少一天、一周、一个月、一年或更长时间。

44.如权利要求33至43中任一项所述的方法，其中所述组合物皮下、静脉内、肌内、舌下、鞘内或皮内施用。

45.如权利要求44所述的方法，其中所述组合物皮下或静脉内施用。

46.如权利要求33至45中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

47.如权利要求46所述的方法，其中所述人是新生儿、儿童、青少年或成人。

48.如权利要求33至47中任一项所述的方法，其中所述方法在所述受试者的血液中产生约50μg×小时/mL至约4000μg×小时/mL的AUC_0-168h。

49.如权利要求48所述的方法，其中所述方法在所述受试者的所述血液中产生约1000μg×小时/mL至约3000μg×小时/mL的AUC_0-168h。

50.如权利要求33至48中任一项所述的方法，其中所述方法在所述受试者的所述血液中产生约0.5μg/mL至约25μg/mL的C_max。

51.如权利要求49所述的方法，其中所述方法在所述受试者的所述血液中产生约0.6μg/mL至约20μg/mL的C_max。