KR20180099753A

KR20180099753A - 폼페병 치료용의 강화된 산 알파-글루코시다제

Info

Publication number: KR20180099753A
Application number: KR1020187021154A
Authority: KR
Inventors: 헝 브이. 두; 리치 칸나; 러셀 갓샬
Original assignee: 아미쿠스 세라퓨틱스, 인코포레이티드
Priority date: 2015-12-30
Filing date: 2016-12-29
Publication date: 2018-09-05
Also published as: JP2022058423A; AU2024200071A1; IL299470A; JP2019501178A; US10857212B2; IL259876A; SG11201804965SA; IL283837A; PH12018501313A1; BR112018013151A2; IL259876B; JP7358446B2; MY198085A; US20210268074A1; JP2024009829A; AU2016381832A1; US20220370571A1; CO2018007680A2; EA201891507A1; WO2017117407A1

Abstract

재조합 인간 산 α-글루코시다제의 효소 활성의 억제를 최소화하면서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 조직 흡수를 최대화하는 유효량의 미글루스타트와 조합하여, 만노스-6-인산염 잔기에 의해 최적으로 글리코실화된 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 투여하는 단계를 포함하는, 폼페병의 치료 방법이 제공된다.

Description

폼페병 치료용의 강화된 산 알파-글루코시다제

본 발명은 산 α-글루코시다제 및 그의 약리학적 샤프론의 조합을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 폼페병(Pompe disease)을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 재조합 인간 산 α-글루코시다제 및 미글루스타트(Miglustat)의 조합을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 폼페병을 치료하기 위한 방법을 제공한다.

산 말타제 결핍 또는 글리코겐 저장 질병 II형으로도 일컬어지는 폼페병은 수개의 리소좀 저장 장애 중 하나이다. 리소좀 저장 장애는 리소좀으로 일컬어지는 세포내 구획 내의 세포 글리코스핑골리피드(glycosphingolipid), 글리코겐, 또는 뮤코다당류(mucopolysaccharide)의 축적을 특징으로 하는 상염색체 열성 유전병 그룹이다. 이들 질병을 갖는 개체는, 이후, 리소좀 내에 누적되는 이들 기질 중 하나 이상의 가수분해의 촉매에 결함이 있는 효소를 코딩하는 돌연변이 유전자를 보유한다. 리소좀 장애의 다른 예는 고셔병, G_M1-강글리오시드축정증, 푸코시드축적증, 뮤코다당증, 후를러-샤이에 질병(Hurler-Scheie disease), 니만-피크(Niemann-Pick) A 및 B 질병 및 파브리병(Fabry disease)을 포함한다. 폼페병은 또한 신경근 질병 또는 대사 근육병으로서 분류된다.

폼페병은 40,000명 중 약 1명꼴로 발생하는 것으로 추정되며, 또한 통상적으로 산 α-글루코시다제로서 일컬어지는 효소 리소좀 α-글루코시다제(EC:3.2.1.20)를 코딩하는 GAA 유전자의 돌연변이에 의해 야기된다. 산 α-글루코시다제는 리소좀 내에서 글루코스로의 가수분해를 촉매함으로써, 동물에서 글루코스의 주요 저장형인 분지쇄 다당류인 글리코겐의 대사에 관여한다. 폼페병을 가진 개체는, 불활성이거나, 활성이 감소된 돌연변이체인 결함이 있는 산 α-글루코시다제를 생성하기 때문에, 글리코겐 분해가 서서히 이루어지거나, 전혀 이루어지지 않고, 글리코겐이 다양한 조직, 특히 횡문근의 리소좀 내에 축적되어, 진행성 근육 약화 및 호흡 부전을 포함하는 다양한 종류의 임상 징후를 야기한다. 심근 및 골격근과 같은 조직이 특히 영향을 받는다.

폼페병은 효소 결핍증의 정도, 중증도 및 발병 연령에서 광범위하게 다양할 수 있고, GAA 유전자에서 500개 이상의 상이한 돌연변이가 확인되었으며, 이중 많은 것은 다양한 중증도의 질병 증상을 야기한다. 이 질병은 조기 발병 또는 유년기 및 후기 발병의 다양한 유형으로 분류된다. 질병의 조기 발병 및 더 낮은 효소 활성은 일반적으로 더욱 심각한 임상 경과와 관련된다. 산 α-글루코시다제의 완전하거나, 거의 완전한 결핍으로 인한 유년기 폼페병이 가장 심각하며, 근육 긴장의 심각한 결여, 약화, 비대해진 간 및 심장, 심근병증을 포함하는 증상을 나타낸다. 혀가 비대해지고, 돌출되어, 삼키는 것이 어려워질 수 있다. 대부분의 발병 소아는 2세 이전에 호흡기 또는 심장 합병증으로 사망한다. 후기 발병 폼페병은 12개월을 초과하는 임의의 연령에서 나타날 수 있으며, 심장 관련성이 부재하고, 단기 예후가 더 양호한 것을 특징으로 한다. 증상은 진행성 골격근 기능이상과 관련되며, 몸통, 근위부 하지 및 횡격막의 일반적인 근육 약화 및 호흡근의 소모를 수반한다. 일부 성인 환자는 주요 증상이나 운동 제한이 부재한다. 예후는 일반적으로 호흡근 관련 정도에 따라 달라진다. 폼페병을 갖는 대부분의 대상체는 결국 휠체어 및 보조 환기를 사용할 필요가 있는 신체적 기능저하로 진행되며, 종종, 호흡 부전으로 인한 조기 사망이 발생한다.

폼페병에 대한 최근 치료 선택권으로는 재조합 인간 산 α-글루코시다제(rhGAA)를 사용한 효소 대체 요법(ERT)이 포함된다. 기존 rhGAA 제품은 상표명 알글루코시다제 알파, 마이오자임(Myozyme)® 또는 루미자임(Lumizyme)®; Genzyme, Inc.으로 공지되어 있다. ERT는 환자의 평생 동안 요구되는 만성 치료이며, 정맥내 주입에 의한 대체 효소의 투여를 포함한다. 그 후, 대체 효소는 순환계로 수송되고, 세포 내의 리소좀으로 유입되어, 축적된 글리코겐을 분해하는 작용을 하여, 결함이 있는 내산성 돌연변이 효소의 활성 결함을 보충함에 따라, 질병 증상을 경감시킨다. 유년기 발병 폼페병을 갖는 대상체에서, 알글루코시다제 알파에 의한 처리는, 역대 대조군과 비교하여, 생존을 유의하게 개선하는 것으로 나타났으며, 후기 발병 폼페병에서, 알글루코시다제 알파는, 완만한 것일지라도, 위약과 비교하여, 6-분 보행 시험(6MWT) 및 노력성폐활량(forced vital capacity)(FVC)에서, 통계적으로 유의한 효과를 가진 것으로 나타났다.

그러나, 대부분의 대상체는, 알글루코시다제 알파에 의한 처리가 진행되는 동안, 안정하게 유지되거나, 계속 악화된다. 알글루코시다제 알파에 의한 ERT의 분명한 차선적 효과의 원인은 불분명하나, 부분적으로는, 근본적인 근육 병리학의 진행성 성질 또는 현 ERT의 저조한 조직 표적화로 인한 것일 수 있다. 예를 들어, 주입된 효소는 혈장의 pH(약 pH 7.4)를 포함하여, 중성 pH에서 안정하지 못하며, 순환계 내에서 비가역적으로 불활성화될 수 있다. 추가로, 주입된 알글루코시다제 알파는, 가능하게는 만노스-6-인산염(M6P) 잔기에 의한 부적절한 글리코실화로 인해, 주요 질병-관련 근육에서 불충분한 흡수를 나타낸다. 이러한 잔기는 세포 표면의 양이온-비의존성 만노스-6-인산염 수용체(CIMPR)와 결합하여, 효소가 세포 및 그 내부의 리소좀으로 유입될 수 있도록 한다. 따라서, 적당량의 활성 효소가 리소좀에 도달할 수 있도록 하기 위해, 고 투여량의 효소가 효과적인 치료를 위해 필요할 수 있으며, 이는 이러한 요법에 비용과 시간이 소모되도록 한다.

추가로, 종종 치료에의 반복적 노출로 인해, 항-재조합 인간 산 α-글루코시다제 중화 항체의 발생이 폼페병 환자에서 발생한다. 이러한 면역 반응은 치료에 대한 환자의 내성을 현저하게 감소시킬 수 있다. 알글루코시다제 알파의 미국 제품 라벨은 과민 반응의 잠재적 위험에 대한 정보를 제공하는 블랙 박스 경고를 포함한다. 아나필락시스성 쇼크(anaphylactic shock)를 포함하여, 생명을 위협하는 아나필락시스성 반응이 알글루코시다제 알파에 의해 처리된 대상체에서 관찰되었다.

이러한 단점을 해결하기 위해, 차세대 ERT가 개발 중에 있다. 한 가지 전략에서, 재조합 효소는, 시험관내(예를 들어, 투여 전 저장시) 또는 생체내에서, 효소의 분해 및/또는 불활성 형태로의 접힘 풀림(unfolding)을 억제하거나, 감소시키기 위해, 효소의 적정 입체형태를 유도하거나, 안정화시킬 수 있는 약리학적 샤프론과 공동 투여될 수 있다. 이러한 전략은 국제 특허 출원 공개 WO 2004/069190, WO 2006/125141, WO 2013/166249 및 WO 2014/014938에 기재되어 있다.

폼페병 환자에 대한 알글루코시다제 알파와 미글루스타트의 공동 투여의 임상 시험 결과가 기재된 바 있다. 이탈리아의 4곳의 치료 센터에서 수행된, 폼페병을 갖는 13명의 대상체(3명은 조기 발병(유년기)하였고, 10명은 후기 발병함)에 대한 임상 시험에서, 20 내지 40 mg/kg 알글루코시다제 알파를 단독 투여한 후, 4회 투여량의 80 mg 미글루스타트를 공동 투여하였다. 연구 결과, 알글루코시다제 알파 단독의 경우와 비교하여, 공동 투여의 경우, 산 α-글루코시다제 활성 노출에서 평균 6.8배 증가한 것으로 나타났다(약동학적 파라미터 AUC(농도 대 시간 곡선 하 면적)에 의해 측정됨)(문헌[Parenti, G., G. Andria, et al. (2015). "Lysosomal Storage Diseases: From Pathophysiology to Therapy." Annu . Rev. Med . 66(1): 471-486]). 추가로, 폼페병을 갖는 대상체에 알글루코시다제 알파의 정맥내 주입과 공동 투여되는 경우, 혈장 미글루스타트의 약동학(PK)을 평가하는 연구가 플로리다 대학에서 수행되었다(문헌[Doerfler, P. A., J. S. Kelley, et al. (2014). "Pharmacological chaperones prevent the precipitation of rhGAA by anti-GAA antibodies during enzyme replacement therapy." Mol . Genet. Metab . 111(2): S38]).

그러나, 폼페병 치료용 효소 대체 요법의 추가 개선 필요가 남아 있다. 예를 들어, 개선된 조직 흡수, 개선된 효소 활성, 개선된 안정성 또는 감소된 면역원성을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 현재 사용되는 효소보다 하나 이상의 이점을 가질 수 있는 신규한 재조합 인간 산 α-글루코시다제 효소가 요망된다.

본 발명은 폼페병의 치료가 필요한 환자에서의 폼페병의 치료 방법을 제공하고, 이러한 방법은 재조합 인간 산 α-글루코시다제(rhGAA)와 조합하여, 미글루스타트를 환자에 투여하는 단계를 포함하고, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 발현되며, 알글루코시다제 알파의 1 또는 2개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위의 함량과 비교하여, 1 또는 2개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위의 증가된 함량을 포함한다. 적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 약 20 mg/kg의 투여량으로 정맥내 투여되며, 미글루스타트는 약 260 mg의 투여량으로 경구 투여된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 폼페병의 치료가 필요한 환자에서의 폼페병 치료를 위한 것으로, 본 명세서에 정의된 바와 같은 미글루스타트 및 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 조합을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 폼페병의 치료가 필요한 환자에서의 폼페병의 치료를 위한 제제의 제조에서 본 명세서에 규정된 바와 같은 미글루스타트 및 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 조합의 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태는 폼페병의 조합 요법이 필요한 환자에서의 폼페병의 조합 요법용 키트를 제공하고, 이러한 키트는 미글루스타트를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태, 본 명세서에 규정된 바와 같은 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태 및 미글루스타트를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태 및 재조합 산 α-글루코시다제를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태가 필요한 환자에 이를 투여하기 위한 설명서를 포함한다.

본 발명의 추가의 특징은 하기에 작성된 기재내용 및 첨부 도면으로부터 명징해질 것이다:
도 1은 다양한 pH 값 및 미글루스타트의 존재 및 부재 하에 접히지 않은 ATB200 단백질의 백분율 대 온도가 도시된 그래프이고;
도 2a 및 도 2b는 각각 루미자임® 및 마이오자임®의 CIMPR 친화도 크로마토그래피의 결과를 도시한다. 점선은 M6P 용리 구배를 나타낸다. M6P에 의한 용리는 글리칸을 포함하는 M6P를 통해 결합된 GAA 분자를 CIMPR로 대체시킨다. 도 2a에 도시된 바와 같이, 루미자임® 내의 GAA 활성의 78%는 M6P의 첨가 전에 용리되었다. 도 2b는 73%의 GAA 마이오자임® 활성이 M6P의 첨가 전에 용리됨을 도시한다. 루미자임® 또는 마이오자임® 중 각각 단지 22% 또는 27%의 rhGAA만이 M6P에 의해 용리되었다. 이들 도면은, 이들 2종의 기존 rhGAA 제품의 대부분의 rhGAA가 세포 흡수 및 리소좀 표적화에 필요한 M6P를 갖는 글리칸이 부재함을 도시한다.
도 3은 rhGAA를 인코딩하는 DNA에 의한 CHO 세포의 형질전환을 위한 DNA 작제물을 도시한다. CHO 세포를 rhGAA를 인코딩하는 DNA 작제물에 의해 형질전환하였다.
도 4a 및 도 4b는 각각 마이오자임® 및 ATB200 rhGAA의 CIMPR 친화도 크로마토그래피의 결과를 도시한다. 도 4b로부터 명백한 바와 같이, ATB200 rhGAA 중 약 70%의 rhGAA가 M6P를 함유하였다.
도 5a 및 도 5b는 음이온 교환(AEX) 칼럼 상의 포획의 존재 및 부재 하에, ATB200 rhGAA의 CIMPR 친화도 크로마토그래피의 결과를 도시한다.
도 6은 루미자임® 및 ATB200 rhGAA의 Polywax 용리 프로파일을 도시한다.
도 7은 BP-rhGAA, ATB200-1 및 ATB200-2로서 확인되는 ATB200 rhGAA의 3종의 상이한 조제물과 비교하여, 루미자임®의 N-글리칸 구조의 요약을 도시한다.
도 8a 내지 도 8h는 ATB200 rhGAA의 부위-특이적 N-글리코실화 분석의 결과를 도시한다.
도 9a는 ATB200 rhGAA(좌측 부분)와 루미자임®(우측 부분)의 CIMPR 결합 친화도를 비교한다.
도 9b는 루미자임® 및 ATB200 rhGAA의 이중-M6P 함량을 비교한다.
도 10a는 다양한 GAA 농도에서 정상 섬유아세포 내에서의 ATB200 rhGAA 활성(좌측 부분)과 루미자임® rhGAA 활성(우측 부분)을 비교한다.
도 10b는 다양한 GAA 농도에서 폼페병을 갖는 대상체로부터의 섬유아세포 내에서의 ATB200 rhGAA 활성(좌측 부분)과 루미자임® rhGAA 활성(우측 부분)을 비교한다.
도 10c는 정상 대상체 및 폼페병을 갖는 대상체로부터의 섬유아세포의 (K_흡수)를 비교한다.
도 11은 ATB200에 대한 집단 약동학(PK) 모델의 적합도를 보여주는 그래프이고;
도 12는 미글루스타트 및 두보글루스타트의 투여량-정규화 혈장 농도-시간 프로파일을 보여주는 그래프이고;
도 13a는 혈장 내 두보글루스타트에 대한 집단 PK 모델의 적합도를 보여주는 그래프이고;
도 13b는 근육 조직 내 두보글루스타트에 대한 집단 PK 모델의 적합도를 보여주는 그래프이고;
도 14는 미글루스타트에 대한 집단 PK 모델의 적합도를 보여주는 그래프이고;
도 15는 인간에서 4시간 동안의 단일 20 mg/kg 정맥내(IV) 투여량의 ATB200의 주입으로부터 야기되는 예측된 농도-시간 프로파일을 보여주는 그래프이고;
도 16a는 비히클(음성 대조군), 20 mg/kg 알글루코시다제 알파(루미자임®), 또는 5, 10 또는 20 mg/kg ATB200과의 접촉 후, 마우스 심장 근육에서 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여량에 대비한 글리코겐의 양을 보여주는 그래프이고;
도 16b는 비히클(음성 대조군), 20 mg/kg 알글루코시다제 알파(루미자임®), 또는 5, 10 또는 20 mg/kg ATB200과의 접촉 후, 마우스 사두근에서 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여량에 대비한 글리코겐의 양을 보여주는 그래프이고;
도 16c는 비히클(음성 대조군), 20 mg/kg 알글루코시다제 알파(루미자임®), 또는 5, 10 또는 20 mg/kg ATB200과의 접촉 후, 마우스 삼두근에서 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여량에 대비한 글리코겐의 양을 보여주는 그래프이고;
도 17은 미글루스타트의 AUC 값 대 ATB200의 AUC 값의 비율에 대한, ATB200의 존재 하에 다양한 투여량의 미글루스타트로 처리된 마우스의 글리코겐 수준 대 ATB200이 단독 처리된 마우스의 글리코겐 수준의 비율을 보여주는 그래프이고;
도 18은 466 mg, 270 mg 및 233 mg의 미글루스타트의 투여의 반복 투여 후 예측된 혈장 중 미글루스타트의 농도-시간 프로파일을 보여주는 그래프이고;
도 19는 466 mg, 270 mg 및 233 mg의 미글루스타트의 투여의 반복 투여 후 예측된 조직 리소좀 내 미글루스타트의 농도-시간 프로파일을 보여주는 그래프이고;
도 20은 리소좀 결합 막 단백질(LAMP1)의 수준을 보여주는 것으로, 미글루스타트의 존재 및 부재 하에 비히클, 알글루코시다제 알파 및 ATB200으로 처리된 야생형 및 Gaa-녹아웃 마우스로부터의 심근, 횡경막 근육 및 비장근의 일련의 현미경 사진이고;
도 21은 과요오드산 - Schiff 시약(PAS)의 염색에 의한 글리코겐 수준을 보여주는 것으로, 미글루스타트의 존재 및 부재 하에 비히클, 알글루코시다제 알파 및 ATB200으로 처리된 야생형 및 Gaa-녹아웃 마우스로부터의 심근 및 비장근의 일련의 현미경 사진이고;
도 22는 액포(화살표로 표시됨)가 보이도록 메틸렌 블루로 염색된 것으로, 미글루스타트의 존재 및 부재 하에 비히클, 알글루코시다제 알파 및 ATB200으로 처리된 야생형 및 Gaa-녹아웃 마우스로부터의 사두근의 일련의 현미경 사진(1000x)이고;
도 23은 자식작용 마커 미소관-결합 단백질 1A/1B-경쇄 3 포스파티딜에탄올아민 접합체(LC3A II) 및 p62, 인슐린-의존적 글루코스 수송인자 GLUT4 및 인슐린-비의존적 글루코스 수송인자 GLUT1의 수준을 보여주는 것으로, 미글루스타트의 존재 및 부재 하에 비히클, 알글루코시다제 알파 및 ATB200으로 처리된 야생형 및 Gaa-녹아웃 마우스로부터의 사두근의 일련의 현미경 사진(400x)이고;
도 24a 내지 도 24d는 인간 대상체에서 5, 10 또는 20 mg/kg ATB200, 또는 20 mg/kg ATB200 및 130 또는 260 mg 미글루스타트의 투여 후 혈장 중 GAA 활성의 농도-시간 프로파일을 보여주는 그래프이고;
도 25a 내지 도 25d는 인간 대상체에서 5, 10 또는 20 mg/kg ATB200, 20 mg/kg ATB200 및 130 mg 미글루스타트, 또는 20 mg/kg ATB200 및 260 mg 미글루스타트의 투여 후 혈장 중 GAA 총 단백질의 농도-시간 프로파일을 보여주는 그래프이고;
도 26은 인간 대상체에서 130 mg 또는 260 mg의 미글루스타트의 투여 후 혈장 중 미글루스타트의 농도-시간 프로파일을 보여주는 그래프이고;
도 27은 야생형 및 폼페 섬유아세포의 GAA 및 LAMP1 수준의 일련의 면역형광 현미경 사진이고;
도 28은 디스트로핀, a- 및 β-디스트로글리칸, 및 다이스페린 수준을 보여주는, 야생형 및 Gaa-녹아웃 마우스로부터의 근섬유의 일련의 현미경 사진이고;
도 29a 및 도 29b는 LAMP1 IHC 신호를 보여주는 것으로, 미글루스타트의 존재 및 부재 하에 비히클, 알글루코시다제 알파 및 ATB200으로 처리된 야생형 및 Gaa-녹아웃 마우스로부터의 대퇴직근(RF) 및 외측광근/내측광근(VL/VM)의 근섬유의 일련의 현미경 사진(200x)이고;
도 30a 및 도 30b는 LC3 II IHC 신호를 보여주는 것으로, 미글루스타트의 존재 및 부재 하에 비히클, 알글루코시다제 알파 및 ATB200으로 처리된 야생형 및 Gaa-녹아웃 마우스로부터의 RF 및 VL/VM의 근섬유의 일련의 현미경 사진(200x)이고;
도 31a 및 도 31b는 다이스페린 IHC 신호를 보여주는 것으로, 미글루스타트의 존재 및 부재 하에 비히클, 알글루코시다제 알파 및 ATB200으로 처리된 야생형 및 Gaa-녹아웃 마우스로부터의 RF 및 VL/VM의 근섬유의 일련의 현미경 사진(200x)이고;
도 32a 내지 도 32d는 미글루스타트의 존재 및 부재 하에 비히클, 알글루코시다제 알파 및 ATB200으로 처리된 야생형 및 Gaa-녹아웃 마우스로부터의 사두근, 삼두근, 비복근 및 심장 세포의 글리코겐 수준을 보여주는 그래프이고;
도 33a 및 도 33b는 미글루스타트의 존재 하에 비히클, 알글루코시다제 알파 및 ATB200으로 처리된 야생형 및 Gaa-녹아웃 마우스에 대한 와이어 핸드(wire hand) 및 악력 근육 데이터를 보여주는 그래프이고;
도 34a 내지 도 34g는 미글루스타트의 존재 및 부재 하에 비히클, 알글루코시다제 알파 및 ATB200으로 처리된 야생형 및 Gaa-녹아웃 마우스로부터의 사두근, 삼두근 및 심장 세포의 글리코겐 수준을 보여주는 그래프이고;
도 35는 LAMP1, LC3 및 다이스페린 IHC 신호를 보여주는 것으로, 미글루스타트의 존재 및 부재 하에 비히클, 알글루코시다제 알파 및 ATB200으로 처리된 야생형 및 Gaa-녹아웃 마우스로부터의 VL/VM의 근섬유의 일련의 현미경 사진이고;
도 36은 Gaa-녹아웃 마우스에서, 시알산 함량이 상이한 2개의 배치(batch)의 ATB200의 투여 후, 혈장 내 GAA 활성의 농도-시간 프로파일을 보여주는 그래프이고;
도 37a 내지 도 37d는 비히클, 알글루코시다제 알파 및 ATB200으로 처리된 야생형 및 Gaa-녹아웃 마우스로부터의 사두근, 삼두근, 비복근 및 심장 세포의 글리코겐 수준을 보여주는 그래프이고;
도 38은 상승 투여량의 ATB200(5, 10 및 20 mg/kg)을 제공한 다음, ATB200(20 mg/kg) 및 미글루스타트(130 및 260 mg)를 공동 투여한 후의 인간 환자에서의 알라닌 아미노기 전달효소(ALT)의 수준을 보여주는 그래프이고;
도 39는 상승 투여량의 ATB200(5, 10 및 20 mg/kg)을 제공한 다음, ATB200(20 mg/kg) 및 미글루스타트(130 및 260 mg)를 공동 투여한 후의 인간 환자에서의 아스파르트산염 아미노기 전달효소(AST)의 수준을 보여주는 그래프이고;
도 40은 상승 투여량의 ATB200(5, 10 및 20 mg/kg)을 제공한 다음, ATB200(20 mg/kg) 및 미글루스타트(130 및 260 mg)를 공동 투여한 후의 인간 환자에서의 크레아틴 포스포키나제(CPK)의 수준을 보여주는 그래프이고;
도 41은 상승 투여량의 ATB200(5, 10 및 20 mg/kg)을 제공한 다음, ATB200(20 mg/kg) 및 미글루스타트(130 및 260 mg)를 공동 투여한 후의 인간 환자에서의 평균값(average) ALT, AST 및 CPK 수준을 보여주는 그래프이며;
도 42는 디스트로핀 신호를 보여주는 것으로, 미글루스타트의 존재 및 부재 하에 비히클, 알글루코시다제 알파 및 ATB200으로 처리된 야생형 및 Gaa-녹아웃 마우스로부터의 외측광근(VL)의 근섬유의 일련의 현미경 사진(100x 및 200x)이다.

정의

본 명세서에 사용되는 용어는 일반적으로, 본 명세서의 문맥 및 각 용어가 사용된 구체적 문맥상 당업계에서의 그의 통상적인 의미를 갖는다. 연구자에 추가의 지침을 제공하기 위해, 특정 용어가 하기 부분 또는 본 명세서의 다른 부분에 논의되어 있다.

본 명세서에서, 명시적인 언어 또는 필요한 의미로 인해, 문맥상 달리 요구되는 경우를 제외하고, "~를 포함하는"이라는 단어 또는 "~를 포함하다" 또는 "~를 포함하는"과 같은 변형은 포괄적인 의미로 사용되는 것으로서, 즉, 언급된 특징의 존재를 명시하는 것이나, 본 발명의 다양한 구현예에서, 추가의 특징의 존재 또는 첨가를 배제하는 것은 아니다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 또한, 산 말타제 결핍, 글리코겐 저장 질병 II형(GSDII), 및 글리코겐증 II형으로도 지칭되는 "폼페병"이라는 용어는 인간 산 α-글루코시다제 효소를 코딩하는 GAA 유전자의 돌연변이를 특징으로 하는 유전적 리소좀 저장 장애를 지칭하는 것으로 의도된다. 이 용어는 유년기, 청소년기 및 성인 발병형 폼페병을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 질병의 초기 및 후기 발병 형태를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "산 α-글루코시다제"는 글리코겐의 D-글루코스 단위, 말토스, 및 이소말토스 사이의 α-1,4 연결을 가수분해하는 리소좀 효소를 지칭하는 것으로 의도된다. 대안적 명칭은 리소좀 α-글루코시다제(EC:3.2.1.20); 글루코아밀라제; 1,4-α-D-글루칸 글루코하이드롤라제; 아밀로글루코시다제; 감마-아밀라제 및 엑소-1,4-α-글루코시다제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 인간 산 α-글루코시다제는 GAA 유전자(미국 국립 생명공학 정보 센터(NCBI) 유전자 ID 2548)에 의해 인코딩되며, 이는 염색체 17의 긴 아암에 매핑된다(위치 17q25.2-q25.3). 현재까지 500개 초과의 돌연변이가 인간 GAA 유전자에서 확인되었으며, 이들 중 대부분은 폼페병과 관련된다. 산 α-글루코시다제 효소의 접힘 오류(misfolding) 또는 가공 오류(misprocessing)를 야기하는 돌연변이는 T1064C(Leu355Pro) 및 C2104T(Arg702Cys)를 포함한다. 추가로, 효소의 성숙 및 가공에 영향을 미치는 GAA 돌연변이는 Leu405Pro 및 Met519Thr를 포함한다. 산 α-글루코시다제 단백질의 활성을 위해서는, 아미노산 잔기 516 내지 521의 보존된 헥사펩티드 WIDMNE가 요구된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 약자 "GAA"는 산 α-글루코시다제 효소를 지칭하는 것으로 의도되며, 이탤릭체 약자 "GAA"는 인간 산 α-글루코시다제 효소를 코딩하는 인간 유전자를 지칭하는 것으로 의도된다. 이탤릭체 약자 "Gaa"는 랫트 또는 마우스 유전자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 비 인간 산 α-글루코시다제 효소를 코딩하는 비 인간 유전자를 지칭하는 것으로 의도되며, 약자 "Gaa"는 비 인간 산 α-글루코시다제 효소를 지칭하는 것으로 의도된다. 따라서, 약자 "rhGAA"는 재조합 인간 산 α-글루코시다제 효소를 지칭하는 것으로 의도된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "알글루코시다제 알파"는 [199-아르기닌,223-히스티딘]프레프로-α-글루코시다제(인간); 화학물질 색인 정보등록번호 420794-05-0으로서 확인되는 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 지칭하는 것으로 의도된다. 알글루코시다제 알파는 제품 루미자임® 및 마이오자임®으로서, 2014년 10월 1일자로 Genzyme에 의해 미국에서 판매 승인되었다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "ATB200"은 그 개시내용이 본 명세서에서 참조로서 포함되는 공동 계류중인 특허 출원 PCT/US2015/053252에 기재된 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 지칭하는 것으로 의도된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "글리칸"은 단백질 또는 폴리펩티드 상의 아미노산 잔기에 공유결합된 다당류 사슬을 지칭하는 것으로 의도된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "N-글리칸" 또는 "N-연결된 글리칸"은 아미노산 잔기의 질소 원자와의 공유 결합을 통해, 단백질 또는 폴리펩티드 상의 아미노산 잔기에 부착된 다당류 사슬을 지칭하는 것으로 의도된다. 예를 들어, N-글리칸은 아스파라긴 잔기의 측쇄의 질소 원자에 공유적으로 결합될 수 있다. 글리칸은 하나 또는 수개의 단당류 단위를 함유할 수 있으며, 단당류 단위는 공유적으로 연결되어, 직쇄 또는 분지쇄를 형성할 수 있다. 적어도 하나의 구현예에서, ATB200에 부착된 N-글리칸 단위는, 각각 비의존성으로 N-아세틸글루코사민, 만노스, 갈락토스 또는 시알산으로부터 선택되는 하나 이상의 단당류 단위를 포함할 수 있다. 단백질 상의 N-글리칸 단위는 임의의 적절한 분석 기법, 예컨대 질량 분광분석에 의해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, N-글리칸 단위는 Thermo Scientific Orbitrap Velos Pro^TM질량 분광분석기, Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribid^TM질량 분광분석기 또는 Waters Xevo® G2-XS QTof 질량 분광분석기와 같은 기기를 사용하여, 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광분석(LC-MS/MS)에 의해 결정될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "고-만노스 N-글리칸"은 1 내지 6개 이상의 만노스 단위를 갖는 N-글리칸을 지칭하는 것으로 의도된다. 적어도 하나의 구현예에서, 고 만노스 N-글리칸 단위는 아스파라긴 잔기에 결합되고, 폴리만노스 분지쇄에 추가로 결합된 bis(N-아세틸글루코사민) 사슬을 함유할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 혼용되는 것으로서, 용어 "M6P" 또는 "만노스-6-인산염"은 6 위치에서 인산화된 것으로; 즉, 6 위치에서 하이드록실기에 결합된 인산염 기를 갖는 만노스 단위를 지칭하는 것으로 의도된다. 적어도 하나의 구현예에서, 하나 이상의 N-글리칸 단위의 하나 이상의 만노스 단위는 6 위치에서 인산화되어, 만노스-6-인산염 단위를 형성한다. 적어도 하나의 구현예에서, 용어 "M6P" 또는 "만노스-6-인산염"은 GlcNAc 캡이 부재하는 노출된 인산기를 갖는 만노스 단위뿐만 아니라, 인산기 상에 "캡"으로서 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)을 갖는 만노스 포스포디에스테르 두 종류 모두를 지칭한다. 적어도 하나의 구현예에서, 단백질의 N-글리칸은 다수의 M6P 기를 가질 수 있고, 적어도 하나의 M6P 기는 GlcNAc 캡을 가지며, 적어도 하나의 다른 M6P 기는 GlcNAc 캡이 부재한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "복합체 N-글리칸"은 하나 이상의 갈락토스 및/또는 시알산 단위를 함유하는 N-글리칸을 지칭하는 것으로 의도된다. 적어도 하나의 구현예에서, 복합체 N-글리칸은 고-만노스 N-글리칸일 수 있으며, 하나의 만노스 단위 또는 만노스 단위들은 각각 비의존성으로 N-아세틸글루코사민, 갈락토스 및 시알산으로부터 선택되는 하나 이상의 단당류 단위와 추가로 결합할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, N-부틸-1-데옥시노지리마이신 또는 NB-DNJ 또는 (2R,3R,4R,5S)-1-부틸-2-(하이드록시메틸)피페리딘-3,4,5-트리올로도 공지된 화합물 미글루스타트는 하기의 화학식을 갖는 화합물이다:

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미글루스타트의 일종의 제형이 제1형 고셔병을 위한 단일요법으로서, 상표명 Zavesca® 하에 시판되고 있다.

하기에서 논의되는 바와 같이, 미글루스타트의 약제학적으로 허용 가능한 염이 또한 본 발명에 사용될 수 있다. 미글루스타트의 염이 사용되는 경우, 염의 투여량은, 환자에 제공되는 미글루스타트의 투여량이, 미글루스타트 유리 염기가 사용되는 경우, 제공되는 양과 균등하도록 조정될 것이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 1-데옥시노지리마이신 또는 DNJ 또는 (2R,3R,4R,5S)- 2-(하이드록시메틸)피페리딘-3,4,5-트리올로도 공지된 화합물 두보글루스타트(duvoglustat)는 하기의 화학식을 갖는 화합물이다:

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본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약리학적 샤프론(pharmacological chaperone)" 또는 때때로 간략하게는 용어 "샤프론"은 산 α-글루코시다제와 특이적으로 결합하고, 하기의 효과 중 하나 이상을 갖는 분자를 지칭하는 것으로 의도된다:

· 단백질의 안정한 분자 입체형태의 형성을 증대시키고;

· 소포체로부터 다른 세포 위치, 바람직하게는 고유의 세포 위치로의 단백질의 적절한 수송을 증대함으로써, 소포체-결합 단백질 분해를 억제하고;

· 입체형태적으로 불안정하거나, 접힘 오류가 있는 단백질의 응집을 억제하고;

· 단백질의 적어도 일부의 야생형 기능, 안정성 및/또는 활성을 복원시키고/시키거나, 증대시키고/시키거나;

· 산 α-글루코시다제를 보유하는 세포의 표현형 또는 기능을 개선한다.

따라서, 산 α-글루코시다제의 약리학적 샤프론은 산 α-글루코시다제와 결합하여, 산 α-글루코시다제의 적절한 접힘, 수송, 비응집 및 활성을 야기하는 분자이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 이러한 용어는 효소, 억제제 또는 길항제 및 작용제의 활성 부위에 결합하는 활성 부위 특이적 샤프론(ASSC)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 적어도 하나의 구현예에서, 약리학적 샤프론은 산 α-글루코시다제의 억제제 또는 길항제일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "길항제"는 산 α-글루코시다제와 결합하여, 산 α-글루코시다제의 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단하거나, 억제하거나, 감소시키거나, 중화하는 임의의 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 적어도 하나의 구현예에서, 약리학적 샤프론은 미글루스타트이다. 산 α-글루코시다제의 약리학적 샤프론의 또 다른 비제한적인 예는 두보글루스타트이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "활성 부위"는 단백질의 특이적 생물학적 활성과 관련되고, 이에 필요한 단백질의 영역을 지칭하는 것으로 의도된다. 적어도 하나의 구현예에서, 활성 부위는, 기질 또는 다른 결합 대상물과 결합하고, 화학 결합의 형성 및 절단에 직접 관여하는 아미노산 잔기에 기여하는 부위일 수 있다. 본 발명에서, 활성 부위는 효소의 촉매 부위, 항체의 항원 결합 부위, 수용체의 리간드 결합 도메인, 조절 인자의 결합 도메인 또는 분비 단백질의 수용체 결합 도메인을 포괄할 수 있다. 활성 부위는 또한 전사 인자 및 조절 인자의 전사 촉진, 단백질-단백질 상호작용 또는 DNA 결합 도메인을 포괄할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "AUC"는 특정 약제에 대한 신체의 총 노출 경과 시간을 평가하기 위한 수학적 계산을 지칭하는 것으로 의도된다. 대상체에 투여된 약제의 혈중 농도의 투여 후 시간에 의한 변화 정도를 보여주는 그래프에서, 약제 농도 변수는 y 축이고, 시간은 x 축이다. 약제 농도 곡선 및 지정 시간 간격의 x 축 사이의 면적이 AUC("곡선하 면적")이다. AUC는 투여 일정 및 체내에서의 상이한 약제의 이용 가능성의 생체이용률의 비교를 위한 지표로서 사용된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "C_max"는 대상체로의 투여 후, 도달된 약제의 최대 혈장 농도를 지칭하는 것으로 의도된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "분포 용적" 또는 "V"는 혈장에서 관찰되는 것과 동일한 농도의 투여 약제의 총량을 함유하는데 필요한 이론적인 용적을 지칭하는 것으로 의도되며, 혈장 이외의 신체 조직에의 약제의 분포 정도를 나타낸다. V 값이 더 클수록, 조직 분포 정도가 더 크다는 것을 나타낸다. "중추 분포 용적" 또는 "V_c"는 혈액 내 및 혈액에 의해 고도로 관류되는 조직 내의 분포 용적을 지칭하는 것으로 의도된다. "말초 분포 용적" 또는 "V2"는 말초 조직 내의 분포 용적을 지칭하는 것으로 의도된다.

본 명세서에 혼용해서 사용되는 바와 같이, 용어 "배출률", "전신적 배출률" 또는 "CL"은 단위 시간당 투여 약제가 완전히 배출된 혈장의 용적을 지칭하는 것으로 의도된다. "말초 배출률"은 단위 시간당 투여 약제가 배출된 말초 조직의 용적을 지칭하는 것으로 의도된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "치료 유효 투여량" 및 "유효량"은, 대상체에서 치료 반응을 야기하기에 충분한 산 α-글루코시다제 및/또는 미글루스타트 및/또는 이들의 조합의 양을 지칭하는 것으로 의도된다. 치료 반응은 사용자(예를 들어, 임상의)가, 본 명세서에 기재되고, 당업계에 공지된 임의의 대용 임상 마커 또는 증상을 포함하여, 치료에 대한 유효한 반응으로 인식하는 임의의 반응일 수 있다. 따라서, 적어도 하나의 구현예에서, 치료 반응은 당업계에 공지된 것과 같은 폼페병의 하나 이상의 증상 또는 마커의 완화 또는 억제일 수 있다. 폼페병의 증상 또는 마커는 저하된 산 α-글루코시다제 조직 활성; 심근병증; 심장비대; 특히 몸통 또는 하지에서의 진행성 근육 약화; 심한 저혈압; 대설증(macroglossia)(및 일부 경우, 혀의 돌출); 연하, 흡인 및/또는 섭식 곤란; 호흡 부전; 간비대 (중등도); 안면 근육 이완; 무반사; 운동 불내성; 운동성 호흡 곤란; 기좌 호흡; 수면 무호흡증; 오전 두통; 졸림; 척추전만 및/또는 측만증; 심부건 반사의 저하; 하부 요통; 및 발달 운동 이정표 미충족을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 산 α-글루코시다제에 대해 억제 효과를 갖는 미글루스타트의 농도는 생체 내 투여시 미글루스타트의 희석(및, 결과적으로 평형의 변화에 기인한 결합 변화), 생체이용률 및 대사에 의해, 본 발명의 목적을 위한 "유효량"을 구성할 수 있음을 유의해야 한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "효소 대체 요법" 또는 "ERT"는 비 천연 정제 효소를 이러한 효소가 결핍된 개체에 도입하는 것을 지칭하는 것으로 의도된다. 투여 단백질은 천연 공급원으로부터 또는 재조합 발현에 의해 얻어질 수 있다. 이 용어는 또한 정제 효소의 투여가 달리 필요하거나, 유익한 개체에게 정제 효소를 도입하는 것을 지칭한다. 적어도 하나의 구현예에서, 이러한 개체는 효소 결핍증을 앓고 있다. 도입 효소는 시험관내에서 생성된 정제된 재조합 효소, 또는 예를 들어 태반 또는 동물 우유와 같은 단리 조직이나, 유체 또는 식물로부터 정제된 단백질일 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "조합 요법"은 2종 이상의 별도의 요법이 동시에 또는 연속적으로 투여되는 임의의 요법을 지칭하는 것으로 의도된다. 적어도 하나의 구현예에서, 각각의 요법이 별도로 수행되는 경우, 각각의 요법의 효과와 비교하여, 조합 요법의 결과는 증대된다. 이러한 증대는, 요법이 단독으로 수행되는 경우, 그 요법에 의해 달성되는 결과와 비교하여, 유리한 결과를 생성할 수 있는 다양한 요법의 효과의 임의의 개선을 포함할 수 있다. 증대된 효과 또는 결과는, 증대된 효과가, 각 요법이 그 자체로 수행되는 경우의 추가적 효과보다 더 큰 상승작용적 증대; 증대된 효과가, 각 요법이 그 자체로 수행되는 경우의 추가적 효과와 실질적으로 동일한 추가적 증대; 또는 증대된 효과가, 각 요법이 그 자체로 수행되는 경우의 추가적 효과보다는 더 낮으나, 각 요법이 그 자체로 수행되는 경우의 효과보다는 여전히 더 큰 상승작용적 효과 미만을 포함할 수 있다. 증대된 효과는, 치료 효율 또는 결과를 측정할 수 있는 것으로 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 측정될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은, 인간에 투여되는 경우, 생리상 내성이며, 일반적으로, 부반응을 생성시키지 않는 분자체 및 조성물을 지칭하는 것으로 의도된다. 바람직하게는, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은, 동물 및 더욱 특히 인간용으로서, 미연방 또는 주 정부 규제 당국에 의해 승인되거나, 미국 약전 또는 일반적으로 인정되는 다른 약전에 등재된 것을 의미한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "담체"는, 화합물과 함께 투여되는 희석제, 애쥬번트, 부형제 또는 비히클을 지칭하는 것으로 의도된다. 적절한 약제학적 담체는 당업계에 공지되어 있으며, 적어도 하나의 구현예에서, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin, 18th Edition] 또는 다른 간행물에 기재되어 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체" 또는 "환자"는 인간 또는 비 인간 동물을 지칭하는 것으로 의도된다. 적어도 하나의 구현예에서, 대상체는 포유류이다. 적어도 하나의 구현예에서, 대상체는 인간이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항 약제 항체"는 대상체에 투여되는 약제에 특이적으로 결합하고, 약제의 대상체로의 투여에 대한 체액성 면역 반응의 적어도 일부분으로서 대상체에 의해 생성되는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 적어도 하나의 구현예에서, 약제는 치료용 단백질 약제 제품이다. 대상체에서의 항 약제 항체의 존재는, 생명을 위협하는 면역 반응을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 경증 내지 중증 범위의 면역 반응을 야기할 수 있으며, 이는 아나필락시스, 사이토카인 방출 증후군 및 주 기능을 매개하는 내산성 단백질의 교차 반응성 중화를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 추가로 또는 대안적으로, 대상체에서의 항 약제 항체의 존재는 약제의 효율을 저하시킬 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "중화 항체"는 약제의 기능을 중화하는 작용을 하는 항 약제 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 적어도 하나의 구현예에서, 치료 단백질 약제 제품은, 대상체에서 그 발현이 감소되거나, 부재하는 내산성 단백질의 대상물이다. 적어도 하나의 구현예에서, 중화 항체는 내산성 단백질의 기능을 중화하는 작용을 할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약(about)" 및 "대략(approximately)"은, 측정 성질 또는 정확도를 감안한, 측정된 양의 허용 오차를 지칭하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 오차는, 당업계에서 이해되는 바와 같이, 측정을 위해 제공된 유효 숫자의 수에 의해 나타낼 수 있으며, 측정을 위해 기록된 가장 정확한 유효 숫자의 ±1의 변동을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 오차의 통상의 예는 일정한 값 또는 값의 범위의 20 퍼센트(%) 이내, 바람직하게는 10% 이내, 및 더욱 바람직하게는 5% 이내이다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템에서, 용어 "약" 및 "대략"은 일정한 값의 척도의 1배 이내, 바람직하게는 5배 이내 및 더욱 바람직하게는 2배 이내의 값을 의미할 수 있다. 본 명세서에 제공된 수량은, 달리 언급되지 않는 한, 용어 "약" 또는 "대략"이 명시되지 않은 경우에도, 유추될 수 있는 근사치이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "동시에"는, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 동일한 시간 또는 전 또는 후의 합리적으로 짧은 시간 기간 이내를 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 2종의 처리가 서로 동시에 투여되는 경우, 1종의 처리는 2종의 처리 중 후속 처리의 준비에 필요한 시간이 허용되도록, 나머지 처리의 전 또는 후에 투여될 수 있다. 따라서, 2종의 처리의 "동시 투여"는 1종의 처리 후, 20분 이하, 약 20분, 약 15분, 약 10분, 약 5분, 약 2분, 약 1분 또는 1ㅂ분 이하 후에, 후속 처리가 이어지는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용 가능한 염"은 타당한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 등이 없이, 인간 및 하등 동물의 조직과 접촉 사용하기에 적합하고, 합리적인 이익/위험 비율에 상응하고, 일반적으로 수용성 또는 지용성 또는 분산성이며, 목적 용도에 효과적인 염을 의미하는 것으로 의도된다. 이 용어는 약제학적으로-허용 가능한 산 부가 염 및 약제학적으로-허용 가능한 염기 부가 염을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌[S. M. Birge et al., J. Pharm. Sci., 1977, 66, pp. 1-19]에 적합한 염의 목록이 개진되어 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로-허용 가능한 산 부가 염"은, 유리 염기의 생물학적 역가 및 특성을 보유하는 그의 염을 의미하는 것으로 의도되며, 이는 생물학적으로 또는 달리는 바람직하지 않게는, 염산, 브롬화수소산, 황산, 술팜산, 질산, 인산 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 무기산 및 아세트산, 트리플루오로아세트산, 아디프산, 아스코르브산, 아스파르트산, 벤젠술폰산, 벤조산, 부티르산, 캄포르산, 캄포술폰산, 신남산, 시트르산, 디글루콘산, 에탄술폰산, 글루탐산, 글리콜산, 글리세로인산, 헤미술픽산(hemisulfic acid), 헥산산, 포름산, 푸마르산, 2-하이드록시에탄술폰산(이세티온산), 젖산, 하이드록시말레산, 말산, 말론산, 만델산, 메시틸렌술폰산, 메탄술폰산, 나프탈렌술폰산, 니코틴산, 2-나프탈렌술폰산, 옥살산, 파모산, 펙틴산, 페닐아세트산, 3-페닐프로피온산, 피발산, 프로피온산, 피루브산, 살리실산, 스테아르산, 숙신산, 술파닐산, 타르타르산, p-톨루엔술폰산, 운데카노산 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 유기산에 의해 형성되지 않는다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로-허용 가능한 염기 부가 염"은 유리 산의 생물학적 역가 및 특성을 보유하는 그의 염을 의미하는 것으로 의도되며, 이는 생물학적으로 또는 달리는 바람직하지 않게는, 암모니아 또는 나트륨, 칼륨, 리튬, 칼슘, 마그네슘, 철, 아연, 구리, 망간, 알루미늄 등과 같은 금속 양이온 또는 암모늄의 수산화물, 탄산염 또는 중탄산염을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 무기 염기에 의해 형성되지 않는다. 약제학적으로-허용 가능한 비독성 유기 염기로부터 유래하는 염은 1차, 2차 및 3차 아민, 4차 아민 화합물, 자연 발생 치환 아민, 사이클릭 아민 및 염기성 이온-교환 수지를 포함하는 치환 아민, 예컨대 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 에틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 이소프로필아민, 트리프로필아민, 트리부틸아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 2-디메틸아미노에탄올, 2-디에틸아미노에탄올, 디사이클로헥실아민, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 하이드라바민, 콜린, 베타인, 에틸렌디아민, 글루코사민, 메틸글루카마인, 테오브로민, 푸린, 피페라진, 피페리딘, N-에틸피페리딘, 테트라메틸암모늄 화합물, 테트라에틸암모늄 화합물, 피리딘, N,N-디메틸아닐린, N-메틸피페리딘, N-메틸모르폴린, 디사이클로헥실아민, 디벤질아민, N,N-디벤질펜에틸아민, 1-에펜아민, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 폴리아민 수지 등의 염을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

상세한 설명

본 발명은 폼페병의 치료가 필요한 환자에서 폼페병을 치료하는 방법을 제공하고, 이러한 방법은 미글루스타트, 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 재조합 인간 산 α-글루코시다제와 조합하여, 환자에 투여하는 단계를 포함하고, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 발현되며, 알글루코시다제 알파의 1 또는 2개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위의 함량과 비교하여, 1 또는 2개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위의 증가된 함량을 포함한다. 적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 저수준의, 말단 갈락토스와의 복합체 글리칸을 갖는다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 폼페병의 치료가 필요한 환자에서 폼페병의 치료를 위한 미글루스타트 및 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 조합의 용도를 제공한다.

적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 경구 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 약 200 mg 내지 약 600 mg의 경구 투여량, 또는 약 200 mg, 약 250 mg, 약 300 mg, 약 350 mg, 약 400 mg, 약 450 mg, 약 500 mg, 약 550 mg 또는 약 600 mg의 경구 투여량으로 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 약 233 mg 내지 약 400 mg의 경구 투여량으로 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 약 250 내지 약 270 mg의 경구 투여량, 또는 약 250 mg, 약 255 mg, 약 260 mg, 약 265 mg 또는 약 270 mg의 경구 투여량으로 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 약 260 mg의 경구 투여량으로 투여된다.

당업자는 약 70 kg의 체중 평균값을 갖는 성인 환자의 경우, 약 200 mg 내지 600 mg의 범위 또는 그 범위 내의 임의의 소범위의 미글루스타트의 경구 투여량이 적합할 수 있음을 이해할 것이다. 의사는, 약 70 kg보다 유의하게 더 낮은 체중을 갖는 유아, 아동 또는 저체중 성인을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 환자의 경우, 더 소량의 투여량이 적합한 것으로 고려할 수 있다. 따라서, 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 약 50 mg 내지 약 200 mg의 경구 투여량, 또는 약 50 mg, 약 75 mg, 약 100 mg, 125 mg, 약 150 mg, 약 175 mg 또는 약 200 mg의 경구 투여량으로 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 약 65 mg 내지 약 195 mg의 경구 투여량, 또는 약 65 mg, 약 130 mg 또는 약 195 mg의 경구 투여량으로 투여된다.

적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 경구 투여에 적합한 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태로 투여되고, 이는 정제, 캡슐, 질좌약, 엘릭서제, 용액 또는 현탁액, 겔, 시럽, 구강 세정제 또는 건조 분말을 포함하지만, 이에 제한되지 않으며, 즉시-, 지연-, 변형-, 지속-, 규칙적- 또는 제어-방출 용도를 위해, 선택적으로 착향 및 착색제와 함께, 사용 전에 물 또는 적절한 다른 비히클과 재구성된다. 정제, 캡슐, 로젠지(lozenge), 캔디형 알약, 알약, 볼루스, 분말, 페이스트, 과립, 불릿(bullet), 당의정 또는 프리믹스 조제물과 같은 고체 조성물이 또한 사용될 수 있다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 정제로서 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 캡슐로서 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 투여 형태는 약 50 mg 내지 약 300 mg의 미글루스타트를 함유한다. 적어도 하나의 구현예에서, 투여 형태는 약 65 mg의 미글루스타트를 함유한다. 적어도 하나의 구현예에서, 투여 형태는 약 130 mg의 미글루스타트를 함유한다. 적어도 하나의 구현예에서, 투여 형태는 약 260 mg의 미글루스타트를 함유한다. 투여 형태가 약 65 mg의 미글루스타트를 함유하는 경우, 미글루스타트는 4개의 투여 형태의 투여량, 또는 260 mg의 미글루스타트의 총 투여량으로 투여될 수 있는 것으로 상정된다. 그러나, 70 kg의 성인 체중 평균값보다 유의하게 더 낮은 체중을 갖는 유아, 아동 또는 저체중 성인을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 환자의 경우, 미글루스타트는 하나의 투여 형태(65 mg의 미글루스타트의 총 투여량), 2개의 투여 형태(130 mg의 미글루스타트의 총 투여량), 또는 3개의 투여 형태(195 mg의 미글루스타트의 총 투여량)의 투여량으로 투여될 수 있다.

경구용 고체 및 액체 조성물은 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 이러한 조성물은 또한, 고체 또는 액체 형태일 수 있는 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체 및 부형제를 함유할 수 있다. 정제 또는 캡슐은 결합제, 충전제, 윤활제, 붕괴제 또는 습윤제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 사용하여, 통상의 수단에 의해 제조될 수 있다. 적절한 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 당업계에 공지되어 있으며, 전호화 전분, 폴리비닐피롤리돈, 포비돈, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스(HPMC), 하이드록시프로필 에틸셀룰로스(HPEC), 하이드록시프로필 셀룰로스(HPC), 수크로스, 젤라틴, 아카시아, 락토스, 미정질 셀룰로스, 인산수소칼슘, 스테아르산마그네슘, 스테아르산, 글리세릴 베헤네이트, 탈크, 실리카, 옥수수, 감자 또는 타피오카 전분, 전분 글리콜산나트륨, 라우릴황산나트륨, 시트르산나트륨, 탄산 칼슘, 이염기성 인산칼슘, 글리신 크로스카르멜로스 나트륨 및 복합체 실리케이트를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 정제는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 피복될 수 있다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 Zavesca®(Actelion Pharmaceuticals)로서 시판되는 제형으로서 투여된다.

적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 발현되며, 알글루코시다제 알파의 하나 이상의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위의 함량과 비교하여, 하나 이상의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위의 증가된 함량을 포함한다. 적어도 하나의 구현예에서, 산 α-글루코시다제는 공동 계류중인 국제 특허 출원 PCT/US2015/053252에 기재되어 있는 바와 같이, 본 명세서에서 ATB200으로서 지칭되는 재조합 인간 산 α-글루코시다제이다. ATB200은, 높은 친화도를 가지며(약 2 내지 4 nM의 K _D ), 폼페 섬유아세포 및 골격 근육 근아세포에 의해 효율적으로 내재화되는(약 7 내지 14 nM의 K_흡수) 양이온-비의존성 만노스-6-인산염 수용체(CIMPR)와 결합하는 것으로 나타났다. ATB200은 생체내에서 특성화되었으며, 알글루코시다제 알파(약 60분의 t_1/ ₂)보다 더 짧은 겉보기 혈장 반감기(약 45분의 t_1/ ₂)를 갖는 것으로 나타났다.

적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2(또는, SEQ ID NO: 2에 의해 인코딩됨), SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5에 제시된 아미노산 서열을 갖는 효소이다.

적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 미국 특허 제 8,592,362호에 기재된 바와 같이, SEQ ID NO: 1에 제시된 야생형 GAA 아미노산 서열을 가지며, GenBank 수탁 번호 AHE24104.1(GI:568760974)을 갖는다. 적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 SEQ ID NO: 2에 의해 인코딩되는 바와 같은 야생형 GAA 아미노산 서열을 가지며, mRNA 서열은 GenBank 수탁 번호 Y00839.1을 갖는다. 적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 SEQ ID NO: 3에 제시된 바와 같은 야생형 GAA 아미노산 서열을 갖는다. 적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 SEQ ID NO: 4에 제시된 바와 같은 GAA 아미노산 서열을 가지며, 미국 국립생물공학정보센터(NCBI) 수탁 번호 NP_000143.2를 갖는다. 적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 관찰된 9개의 GAA 유전자 일배체형 중 가장 우성인 것에 의해 인코딩되는 인간 산 α-글루코시다제 효소인 글루코시다제 알파이다.

적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 처음에는 SEQ ID NO: 1에 제시된 바와 같은 야생형 GAA의 전장의 952개의 아미노산 서열을 갖는 것으로서 발현되며, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 아미노산의 일부분, 예를 들어 처음 56개의 아미노산이 제거되는 세포내 가공을 거친다. 따라서, 숙주 세포에 의해 분비되는 재조합 인간 산 α-글루코시다제는, 처음에 세포 내에서 발현되는 재조합 인간 산 α-글루코시다제보다 더 짧은 아미노산 서열을 가질 수 있다. 적어도 하나의 구현예에서, 이러한 더 짧은 단백질은 SEQ ID NO: 5에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 단지, 신호 펩티드 및 전구체 펩티드를 포함하는 처음 56개의 아미노산이 제거됨으로써, 896개의 아미노산을 갖는 단백질이 생성된다는 점에서, SEQ ID NO: 1과 상이하다. SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열에 대비하여, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 결실, 치환 및/또는 삽입을 갖는 것과 같은, 아미노산 수의 다른 변형이 또한 가능하다. 일부 구현예에서, rhGAA 제품은 상이한 아미노산 길이를 갖는 재조합 인간 산 α-글루코시다제 분자의 혼합물을 포함한다.

적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 단백질 내의 하나 이상의 아미노산 잔기에서 번역 후 및/또는 화학적 변형을 거친다. 예를 들어, 메티오닌 및 트립토판 잔기는 산화를 거칠 수 있다. 또 다른 예로서, N-말단의 글루타민은 피로-글루타메이트(pyro-glutamate)를 형성할 수 있다. 또 다른 예로서, 아스파라긴 잔기는 아스파르트산으로의 탈아미드화를 거칠 수 있다. 추가의 또 다른 예로서, 아스파르트산 잔기는 이소-아스파르트산으로의 이성질체화를 거칠 수 있다. 추가의 또 다른 예로서, 단백질 내의 비쌍 시스테인 잔기는 유리 글루타티온 및/또는 시스테인과 이황화 결합을 형성할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 이 효소는 처음에는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2(또는, SEQ ID NO: 2에 의해 인코딩됨), SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 것으로서 발현되며, 이러한 효소는 번역 후 및/또는 화학적 변형 중 하나 이상을 거친다. 이러한 변형은 또한 본 개시내용의 범위 내에 있다.

본 발명에 따른 rhGAA를 재조합적으로 발현시키기 위해, GAA 및 이러한 인간 변이 GAA를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 또한 고려되며, 사용될 수 있다.

바람직하게는, 총 재조합 인간 산 α-글루코시다제 분자 중 70, 65, 60, 55, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5% 이하는 하나 이상의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위가 부재하거나, 양이온 비의존성인 만노스-6-인산염 수용체(CIMPR)와의 결합능이 부재한다. 대안적으로, 재조합 인간 산 α-글루코시다제 분자 중 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99%, 100% 미만은 하나 이상의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 적어도 하나의 N-글리칸 단위를 포함하거나, CIMPR과의 결합능을 갖는다.

재조합 인간 산 α-글루코시다제 분자는 그의 글리칸 상에 1, 2, 3 또는 4개의 만노스-6-인산염(M6P) 기를 가질 수 있다. 예를 들어, 재조합 인간 산 α-글루코시다제 분자 상의 단지 하나의 N-글리칸만이 M6P(단일 인산화)를 보유할 수 있거나, 단일 N-글리칸이 2개의 M6P 기(이중 인산화)를 보유할 수 있거나, 동일한 재조합 인간 산 α-글루코시다제 분자 상의 2개의 상이한 N-글리칸이 각각 단일 M6P 기를 보유할 수 있다. 재조합 인간 산 α-글루코시다제 분자는 또한 M6P 기를 보유하지 않는 N-글리칸을 가질 수 있다. 또 다른 구현예에서, 평균적으로 N-글리칸은 2.5 mol/mol 초과의 M6P 및 4 mol/mol 초과의 시알산을 함유함으로써, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 평균적으로 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 몰당 적어도 2.5 몰의 만노스-6-인산염 잔기 및 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 몰당 적어도 4 몰의 시알산을 포함한다. 평균적으로, 재조합 인간 산 α-글루코시다제 상의 총 글리칸 중 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10%가 단일-M6P 글리칸의 형태일 수 있고, 예를 들어, 총 글리칸 중 약 6.25%가 단일 M6P 기를 보유할 수 있고, 평균적으로, 재조합 인간 산 α-글루코시다제 상의 총 글리칸 중 적어도 약 0.5, 1, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0%가 이중-M6P 글리칸의 형태이며, 평균적으로 총 재조합 인간 산 α-글루코시다제 중 25% 미만이 CIMPR과 결합한 인산화 글리칸을 함유하지 않는다.

재조합 인간 산 α-글루코시다제는 0.5 내지 7.0 mol/mol 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 범위 또는 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 또는 7.0 mol/mol 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 포함하는 하위범위의 임의의 중간 값의 M6P를 보유하는 N-글리칸의 함량 평균값을 가질 수 있다. M6P-보유 또는 이중-M6P-보유 글리칸 수의 평균값이 상이한 재조합 인간 산 α-글루코시다제 조제물을 제공하기 위해, 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 분획화함으로써, 특정 분획을 선택하거나, 상이한 분획을 선택적으로 조합함으로써, 표적 조직에서, 리소좀을 표적화하는 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 추가로 지정할 수 있다.

재조합 인간 산 α-글루코시다제 상의 N-글리칸의 최대 60%가 완전히 시알릴화될 수 있으며, 예를 들어, 최대 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 60%의 N-글리칸이 완전히 시알릴화될 수 있다. 일부 구현예에서, 총 N-글리칸 중 4 내지 20%가 완전히 시알릴화된다. 다른 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제 상의 N-글리칸 중 5%, 10%, 20% 또는 30% 이하가 시알산 및 말단 갈락토스 잔기(Gal)를 보유한다. 이러한 범위는 모든 중간 값 및 하위범위를 포함하며, 예를 들어, 재조합 인간 산 α-글루코시다제 상의 총 N-글리칸 중 7 내지 30%가 시알산 및 말단 갈락토스를 보유할 수 있다. 추가의 또 다른 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제 상의 N-글리칸 중 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20% 이하는 말단 갈락토스만을 가지며, 시알산을 함유하지 않는다. 이러한 범위는 모든 중간 값 및 하위범위를 포함하며, 예를 들어, 조성물 중 재조합 인간 산 α-글루코시다제 상의 총 N-글리칸 중 8 내지 19%는 말단 갈락토스만을 가질 수 있으며, 시알산을 함유하지 않는다.

본 발명의 다른 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제 상의 총 N-글리칸 중 40, 45, 50, 55 내지 60%가 복합체형 N-글리칸이거나; 재조합 인간 산 α-글루코시다제 상의 총 N-글리칸 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7% 이하가 혼성체형 N-글리칸이고; 재조합 인간 산 α-글루코시다제 상의 고 만노스형 N-글리칸 중 5, 10, 또는 15% 이하가 비 인산화된 것이고; 재조합 인간 산 α-글루코시다제 상의 고 만노스형 N-글리칸 중 적어도 5% 또는 10%가 단일-M6P 인산화된 것이고/이거나; 재조합 인간 산 α-글루코시다제 상의 고 만노스형 N-글리칸 중 적어도 1 또는 2%가 이중-M6P 인산화된 것이다. 이들 값은 모든 중간 값 및 하위범위를 포함한다. 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 전술된 함량 범위 중 하나 이상을 충족할 수 있다.

일부 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 평균적으로, 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 몰당 2.0 내지 8.0 몰의 시알산 잔기를 보유할 것이다. 이러한 범위는 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 및 8.0 몰 잔기/몰 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 포함하여, 모든 중간 값 및 하위범위를 포함한다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 시알산 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위의 존재는 아시알로당단백질 수용체에 의해 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 비생산적 배출을 억제할 수 있는 것으로 여겨진다.

하나 이상의 구현예에서, rhGAA는 재조합 인간 리소좀 단백질의 특정 N-글리코실화 부위에 M6P 및/또는 시알산 단위를 갖는다. 예를 들어, rhGAA 상에는 7개의 잠재적 N-연결된 글리코실화 부위가 존재한다. 이들 잠재적 글리코실화 부위는 SEQ ID NO: 5의 하기의 위치에 존재한다: N84, N177, N334, N414, N596, N826 및 N869. 유사하게는, SEQ ID NO: 1의 전장의 아미노산 서열의 경우, 이들 잠재적 글리코실화 부위는 하기의 위치에 존재한다: N140, N233, N390, N470, N652, N882 및 N925. rhGAA의 다른 변이체는 아스파라긴 잔기의 위치에 따라, 유사한 글리코실화 부위를 가질 수 있다. 일반적으로, 단백질 아미노산 서열 중 ASN-X-SER 또는 ASN-X-THR의 서열은 잠재적 글리코실화 부위를 나타내며, 단, X는 HIS 또는 PRO일 수 없다.

다양한 구현예에서, rhGAA는 특정 N-글리코실화 프로파일을 갖는다. 하나 이상의 구현예에서, 적어도 20%의 rhGAA는 제1 N-글리코실화 부위(예를 들어, SEQ ID NO: 5의 경우 N84 및 SEQ ID NO: 1의 경우 N140)에서 인산화된다. 예를 들어, 적어도 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 rhGAA는 제1 N-글리코실화 부위에서 인산화될 수 있다. 이러한 인산화는 단일-M6P 및/또는 이중-M6P 단위의 결과일 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 rhGAA는 제1 N-글리코실화 부위에서 단일-M6P 단위를 보유한다. 일부 구현예에서, 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 rhGAA는 제1 N-글리코실화 부위에서 이중-M6P 단위를 보유한다.

하나 이상의 구현예에서, 적어도 20%의 rhGAA는 제2 N-글리코실화 부위(예를 들어, SEQ ID NO: 5의 경우 N177 및 SEQ ID NO: 1의 경우 N223)에서 인산화된다. 예를 들어, 적어도 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 rhGAA는 제2 N-글리코실화 부위에서 인산화될 수 있다. 이러한 인산화는 단일-M6P 및/또는 이중-M6P 단위의 결과일 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 rhGAA는 제2 N-글리코실화 부위에서 단일-M6P 단위를 보유한다. 일부 구현예에서, 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 rhGAA는 제2 N-글리코실화 부위에서 이중-M6P 단위를 보유한다. 하나 이상의 구현예에서, 적어도 5%의 rhGAA는 제3 N-글리코실화 부위(예를 들어, SEQ ID NO: 5의 경우 N334 및 SEQ ID NO: 1의 경우 N390)에서 인산화된다. 다른 구현예에서, 5%, 10%, 15%, 20% 또는 25% 미만의 rhGAA는 제3 N-글리코실화 부위에서 인산화된다. 예를 들어, 제3 N-글리코실화 부위는 주종으로서, 비 인산화된 고 만노스 글리칸, 디-, 트리- 및 테트라-안테너리 복합체 글리칸, 및 혼성체형 글리칸의 혼합물을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50%의 rhGAA는 제3 N-글리코실화 부위에서 시알릴화된다.

하나 이상의 구현예에서, 적어도 20%의 rhGAA는 제4 N-글리코실화 부위(예를 들어, SEQ ID NO: 5의 경우 N414 및 SEQ ID NO: 1의 경우 N470)에서 인산화된다. 예를 들어, 적어도 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 rhGAA는 제4 N-글리코실화 부위에서 인산화될 수 있다. 이러한 인산화는 단일-M6P 및/또는 이중-M6P 단위의 결과일 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 rhGAA는 제4 N-글리코실화 부위에서 단일-M6P 단위를 보유한다. 일부 구현예에서, 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 rhGAA는 제4 N-글리코실화 부위에서 이중-M6P 단위를 보유한다. 일부 구현예에서, 적어도 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20% 또는 25%의 rhGAA는 제4 N-글리코실화 부위에서 시알릴화된다.

하나 이상의 구현예에서, 적어도 5%의 rhGAA는 제5 N-글리코실화 부위(예를 들어, SEQ ID NO: 5의 경우 N596 및 SEQ ID NO: 1의 경우 N692)에서 인산화된다. 다른 구현예에서, 5%, 10%, 15%, 20% 또는 25% 미만의 rhGAA는 제5 N-글리코실화 부위에서 인산화된다. 예를 들어, 제5 N-글리코실화 부위는 주종으로서, 푸코실화된 디-안테너리 복합체 글리칸을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 rhGAA는 제5 N-글리코실화 부위에서 시알릴화된다.

하나 이상의 구현예에서, 적어도 5%의 rhGAA는 제6 N-글리코실화 부위(예를 들어, SEQ ID NO: 5의 경우 N826 및 SEQ ID NO: 1의 경우 N882)에서 인산화된다. 다른 구현예에서, 5%, 10%, 15%, 20% 또는 25% 미만의 rhGAA는 제6 N-글리코실화 부위에서 인산화된다. 예를 들어, 제6 N-글리코실화 부위는 주종으로서, 디-, 트리- 및 테트라-안테너리 복합체 글리칸의 혼합물을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 rhGAA는 제6 N-글리코실화 부위에서 시알릴화된다.

하나 이상의 구현예에서, 적어도 5%의 rhGAA는 제7 N-글리코실화 부위(예를 들어, SEQ ID NO: 5의 경우 N869 및 SEQ ID NO: 1의 경우 N925)에서 인산화된다. 다른 구현예에서, 5%, 10%, 15%, 20% 또는 25% 미만의 rhGAA는 제7 N-글리코실화 부위에서 인산화된다. 일부 구현예에서, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% 또는 65% 미만의 rhGAA는 제7 N-글리코실화 부위에서 임의의 글리칸을 갖는다. 일부 구현예에서, 적어도 30%, 35% 또는 40%의 rhGAA는 제7 N-글리코실화 부위에서 글리칸을 갖는다.

재조합 인간 산 α-글루코시다제는 바람직하게는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예컨대 CHO 세포주 GA-ATB-200 또는 ATB-200-001-X5-14에 의하거나, 이러한 CHO 세포 배양의 계대배양물 또는 유도체에 의해 생성된다. SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 5와 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 것과 같은 산 α-글루코시다제의 대립유전자 변이체 또는 다른 변이체 산 α-글루코시다제 아미노산 서열을 발현하는 DNA 작제물이 CHO 세포에서 작제되고, 발현될 수 있다. 이들 변이체 산 α-글루코시다제 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 5에 대비하여, 결실, 치환 및/또는 삽입을 함유할 수 있으며, 예컨대 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열에 대비하여, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 결실, 치환 및/또는 삽입을 가질 수 있다. 당업자는 이러한 DNA 작제물의 생성을 위해, CHO 세포의 형질전환에 적합한 대안적 벡터를 선택할 수 있다.

GCG 서열 분석 패키지(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 위스콘신 대학)의 일부로서 이용 가능한 FASTA, 또는 BLAST를 포함하여, 다양한 정렬 알고리즘 및/또는 프로그램이 2개의 서열 사이의 동일성을 계산하기 위해, 사용될 수 있으며, 이는, 예를 들어, 디폴트 설정으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 구체적 폴리펩티드와 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일성을 가지며, 바람직하게는 실질적으로 동일한 기능을 나타내는 폴리펩티드뿐만 아니라, 이러한 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 고려된다. 달리 명시되지 않는 한, 유사성 점수는 BLOSUM62의 사용을 기반으로 할 것이다. BLASTP가 사용되는 경우, 유사성 퍼센트는 BLASTP 양의 점수를 기반으로 하며, 서열 동일성 퍼센트는 BLASTP 동일성 점수를 기반으로 한다. BLASTP "동일성"은 높은 점수의 서열 쌍에서의 동일한 총 잔기의 수 및 분획을 나타내고; BLASTP "양성"은, 정렬 점수가 양의 값을 가지며, 서로 유사한 잔기의 수 및 분획을 나타낸다. 본 명세서에 개시된 아미노산 서열에 대해 이러한 동일성 또는 유사성 정도 또는 임의의 중간 정도의 유사성의 동일성을 갖는 아미노산 서열이 고려되며, 본 개시내용에 의해 포괄된다. 유사한 폴리펩티드의 폴리뉴클레오타이드 서열은 유전자 코드를 사용하여 추론되며, 이는 통상의 수단, 특히, 유전자 코드를 사용한 아미노산 서열의 역번역에 의해, 얻을 수 있다.

본 발명자들은, 생체내에서 그의 비생산적 배출을 감소시키는 글리코실화 패턴뿐만 아니라, 양이온-비의존성 만노스-6-인산염 수용체(CIMPR) 및 세포 리소좀을 표적화하는 월등한 능력을 가진 재조합 인간 산 α-글루코시다제가 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 사용하여 생성될 수 있음을 발견하였다. 이들 세포는, 알글루코시다제 알파와 같은 기존의 재조합 인간 산 α-글루코시다제 제품보다 유의하게 더 높은 수준의, 하나 이상의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위를 갖는 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 발현시키도록 유도될 수 있다. 예를 들어, ATB200에 의해, 예시된 바와 같이, 이들 세포에 의해 생성된 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 루미자임®과 같은 기존의 산 α-글루코시다제보다 유의하게 더 많은 근육 세포-표적화 만노스-6-인산염(단일-M6P) 및 이중-만노스-6-인산염(이중-M6P) N-글리칸 잔기를 갖는다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 이러한 광범위한 글리코실화에 의해, ATB200 효소가 더욱 효율적으로 표적 세포 내로 흡수될 수 있게 됨으로써, 예를 들어, 훨씬 더 낮은 M6P 및 이중-M6P 함량을 갖는 알글루코시다제 알파와 같은 다른 재조합 인간 산 α-글루코시다제보다 더욱 효율적으로, 순환계로부터 배출될 수 있게 되는 것으로 여겨진다. ATB200은 CIMPR과 효율적으로 결합하고, 골격근 및 심근에 의해 효율적으로 흡수되며, 유리한 약동학적 프로파일을 제공하고, 생체내에서 비생산적인 배출을 감소시키는 글리코실화 패턴을 갖는 것으로 밝혀졌다.

또한, ATB200의 고유한 글리코실화가, 예를 들어, 알글루코시다제 알파와 비교하여, ATB200의 면역원성의 감소에 기여할 수 있는 것으로 고려된다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 포유류 당이 보존된 단백질의 글리코실화는 일반적으로 산물의 용해도를 증대시키며, 산물의 응집 및 면역원성을 감소시킨다. 글리코실화는, 면역계로부터 면역원성 단백질 에피토프를 보호할 뿐만 아니라, 단백질 응집을 최소화함으로써, 단백질의 면역원성을 간접적으로 변이시킨다(문헌[Guidance for Industry - Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein Products, US Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Center for Biologics Evaluation and Research, August 2014]). 따라서, 적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여는 항 약제 항체를 유도하지 않는다. 적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여는 대상체에서, 알글루코시다제 알파의 투여에 의해 유도되는 항 약제 항체의 수준보다 더 낮은 항 약제 항체의 발생을 유도한다.

공동 계류중인 국제 특허 출원 PCT/US2015/053252에 기재된 바와 같이, CHO 세포와 같은 세포가 상기 문헌 내에 기재된 rhGAA를 생성하기 위해, 사용될 수 있으며, 이러한 rhGAA는 본 발명에 사용될 수 있다. 이러한 CHO 세포주의 예는 상기 문헌 내에 기재된 바와 같은 rhGAA 조성물을 생성하는 GA-ATB-200 또는 ATB-200-001-X5-14, 또는 그의 계대배양물이다. 이러한 CHO 세포주는 GAA를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 5, 10, 15, 또는 20개 이상의 복제물과 같은 다수의 유전자 복제물을 함유할 수 있다.

높은 M6P 및 이중-M6P rhGAA, 예컨대 ATB200 rhGAA는, GAA를 인코딩하는 DNA 작제물에 의해, CHO 세포를 형질전환시킴으로써, 생성될 수 있다. CHO 세포는 rhGAA의 제조에 종래부터 사용되어 왔으나, 형질전환된 CHO 세포가, CIMPR을 표적화하는 M6P 및 이중-M6P 글리칸의 고 함량을 갖는 rhGAA가 생성되는 방식으로, 배양되고, 선택될 수 있음은 이해되지 않았다.

놀랍게도, CHO 세포주를 형질전환시키고, CIMPR을 표적화하는 M6P 또는 이중-M6P를 보유하는 글리칸의 고 함량을 함유하는 rhGAA를 생성하는 형질전환체를 선택하며, 이러한 고-M6P rhGAA를 안정하게 발현시키는 것이 가능한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이들 CHO 세포주의 제조 방법이 또한 공동 계류중인 국제 특허 출원 PCT/US2015/053252에 기재되어 있다. 이러한 방법은 GAA 또는 GAA 변이체를 인코딩하는 DNA에 의해 CHO 세포를 형질전환시키는 단계, GAA를 인코딩하는 DNA를 그의 염색체(들) 내로 안정하게 혼입시키고, GAA를 안정하게 발현하는 CHO 세포를 선택하는 단계 및 M6P 또는 이중-M6P를 보유하는 글리칸의 고 함량을 갖는 GAA를 발현하는 CHO 세포를 선택하는 단계 및 선택적으로, 시알산 함량이 높은 N-글리칸을 가지고/가지거나, 비 인산화된 고-만노스 함량이 낮은 N-글리칸을 갖는 CHO 세포를 선택하는 단계를 포함한다. 적어도 하나의 구현예에서, GAA는 말단 갈락토스를 갖는 복합체 글리칸의 저수준을 갖는다.

이들 CHO 세포주는, CHO 세포주를 배양하고, CHO 세포의 배양액으로부터 상기 조성물을 회수함으로써, rhGAA 및 rhGAA 조성물을 생성하는 데 사용될 수 있다.

재조합 인간 산 α-글루코시다제, 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염은 통상의 절차에 따라, 인간 투여용으로 적합한 약제학적 조성물로서 제형화될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 구현예에서, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 주사 부위의 통증을 완화하기 위해, 가용화제 및 국소 마취제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 구성요소는, 예를 들어, 활성 제제의 정량이 표시된 앰플 또는 포와 같은 밀폐형 밀봉 용기 내에 동결건조된 건조 분말 또는 물 무함유 농축물로서, 단위 투여 형태로 개별적으로 또는 함께 혼합되어 제공된다. 조성물이 주입에 의해 투여되어야 하는 경우, 이는 약제학적 등급의 멸균수, 염수 또는 덱스트로스/물을 함유하는 주입 병에 의해, 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 투여 전에 구성요소가 혼합될 수 있도록, 주사용 멸균수 또는 염수 앰플이 제공될 수 있다.

재조합 인간 산 α-글루코시다제(또는, 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 함유하는 조성물 또는 의약품)는 적절한 경로에 의해 투여된다. 일 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 정맥내로 투여된다. 다른 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 심장 또는 골격 근(예를 들어, 근육내), 또는 신경계(예를 들어, 뇌 내로의 직접 주사; 뇌실내; 뇌척수액내)와 같은 표적 조직으로의 직접 투여에 의해 투여된다. 요망되는 경우, 1종 초과의 경로가 동시에 사용될 수 있다.

재조합 인간 산 α-글루코시다제(또는, 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 함유하는 조성물 또는 의약품)는 치료 유효량(예를 들어, 정기적 간격으로 투여되는 경우, 질병 관련 증상을 완화하고, 질병의 발병을 억제하거나, 지연시키고/시키거나, 질병 증상의 중증도 또는 빈도를 감소시킴으로써, 질병을 치료하기에 충분한 투여량)으로 투여된다. 질병의 치료에 치료적으로 유효한 양은 질병의 효과의 성질 및 정도에 따라 다를 것이며, 표준 임상 기법에 의해 결정될 수 있다. 추가로, 최적의 투여량 범위의 확인을 위해, 시험관내 또는 생체내 분석이 선택적으로 사용될 수 있다. 사용되는 정확한 투여량은 또한 투여 경로, 질병의 중증도에 따라 다를 것이며, 의사의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효 투여량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래하는 투여량-반응 곡선으로부터 추산될 수 있다. 적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 정맥내 주입에 의해, 약 5 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 통상적으로 약 5 mg/kg 내지 약 20 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 정맥내 주입에 의해, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 15 mg/kg 또는 약 20 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 정맥내 주입에 의해, 약 20 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 특정 개체를 위한 유효 투여량은 개체의 필요에 의해, 시간 경과에 따라 변화(예를 들어, 증가 또는 저하)할 수 있다. 예를 들어, 신체적 병 또는 스트레스가 존재하는 때, 또는 항-산 α-글루코시다제 항체가 존재하거나, 증가하는 경우 또는 질병 증상이 악화되는 경우, 양이 증가할 수 있다.

재조합 인간 산 α-글루코시다제(또는, 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 함유하는 조성물 또는 의약품)의 치료 유효량이 질병의 효과의 성질과 정도 및 지속적 기준에 따라, 정기적 간격으로 투여된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "정기적 간격"의 투여는 치료 유효량이 주기적으로(1회 투여와 구별됨) 투여되는 것을 나타낸다. 간격은 표준 임상 기법에 의해 결정될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 매월, 격월; 매주; 매주 2회; 또는 매일 투여된다. 단일 개체의 투여 간격은 일정한 간격일 필요는 없으며, 개체의 필요에 따라, 시간 경과에 따라 변화할 수 있다. 예를 들어, 신체적 병 또는 스트레스가 존재하는 때, 항-재조합 인간 산 α-글루코시다제 항체가 존재하거나, 증가하는 경우 또는 질병 증상이 악화되는 경우, 투여간의 간격이 저하될 수 있다. 일부 구현예에서, 5, 10, 20, 50, 100, 또는 200 mg 효소/kg 체중의 치료 유효량이 샤프론의 존재 또는 부재 하에, 1주일에 2회, 매주 또는 매격주 투여된다.

본 발명의 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 추후 사용을 위해, 예컨대 단위 투여량 바이알 또는 주사기 또는 정맥내 투여용 병 또는 백으로 제조될 수 있다. 재조합 인간 산 α-글루코시다제뿐만 아니라, 선택적 부형제 또는 다른 활성 구성요소, 예컨대 샤프론 또는 다른 약제를 함유하는 키트는 포장재 내에 내장될 수 있으며, 폼페병 환자와 같이 치료가 필요한 대상체의 치료를 위한 재구성, 희석 또는 투여를 위한 설명서가 동봉될 수 있다.

적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트 및 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 동시에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트 및 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 연속적으로 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 전에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 3시간 미만 전에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 약 2시간 전에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 2시간 미만 전에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 약 1.5시간 전에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 약 1시간 전에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 약 50분 내지 약 70분 전에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 약 55분 내지 약 65분 전에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 약 30분 전에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 약 25분 내지 약 35분 전에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 약 27분 내지 약 33분 전에 투여된다.

적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여와 동시에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 전 또는 후 20분 이내에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 전 또는 후 15분 이내에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 전 또는 후 10분 이내에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 전 또는 후 5분 이내에 투여된다.

적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 후에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 투여한지 최대 2시간 후에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 투여한지 약 30분 후에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 투여한지 약 1시간 후에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 투여한지 약 1.5시간 후에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 투여한지 약 2시간 후에 투여된다.

본 발명의 또 다른 양태는 폼페병의 조합 요법이 필요한 환자에서의 폼페병의 조합 요법을 위한 키트를 제공한다. 키트는 미글루스타트를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태, 본 명세서에 규정된 바와 같은 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태 및 미글루스타트를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태 및 재조합 산 α-글루코시다제를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태가 필요한 환자에 이를 투여하기 위한 설명서를 포함한다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태는 정제 또는 캡슐을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 경구 투여 형태이다. 적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태는 본 명세서에 기재된 바와 같은 주사용으로 적합한 멸균 용액이다. 적어도 하나의 구현예에서, 투여 형태의 투여를 위한 설명서는 본 명세서에 기재된 바와 같이, 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태를 정맥내 주입에 의해 투여하기 전에, 미글루스타트를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태를 경구 투여하기 위한 설명서를 포함한다.

이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제 ATB200의 약리학적 샤프론으로 작용하며, 그의 활성 부위와 결합하는 것으로 여겨진다. 따라서, 도 1에 도시된 바와 같이, 미글루스타트는 접히지 않은 ATB200 단백질의 백분율을 저하시키고, ATB200의 활성 입체형태를 안정시켜, 혈장의 중성 pH에서 변성 및 비가역적인 불활성화를 억제하며, 순환계 조건에서 충분히 오래 생존하여, 조직에 도달하고, 흡수될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 그러나, ATB200의 활성 부위와 미글루스타트의 결합은 또한 중성 기질인 글리코겐이 활성 부위에 접근하는 것을 억제함으로써, ATB200의 효소 활성의 억제를 야기할 수 있다. 미글루스타트 및 재조합 인간 산 α-글루코시다제가 본 명세서에 기재된 조건 하에서 환자에 투여되는 경우, 혈장 및 조직 내의 미글루스타트 및 ATB200의 농도는, ATB200이 조직 내로 흡수될 수 있고, 리소좀에 표적화될 수 있을 때까지, 안정하나, 미글루스타트의 빠른 배출로 인해, 리소좀 내에서 ATB200에 의한 글리코겐의 가수분해가 미글루스타트의 존재에 의해 과도하게 억제되지 않으며, 효소가 충분한 활성을 보유하여, 치료적으로 유용할 수 있도록 하는 것으로 여겨진다.

전술된 모든 구현예는 조합될 수 있다. 이는 다음과 관련된 특정 구현예를 포함한다:

약리학적 샤프론, 예를 들어 미글루스타트의 성질; 및 특이적 활성 부위;

약리학적 샤프론(미글루스타트)의 투여량, 투여 경로 및 담체의 성질을 포함하는 약제학적 조성물의 유형 및 시판되는 조성물의 용도;

대상체에서 발현이 감소하거나, 부재하는 내산성 단백질의 대상물일 수 있는 약제, 예를 들어 치료적 단백질 약제 제품, 적절하게는 재조합 인간 산 α-글루코시다제, 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 발현되고, 알글루코시다제 알파의 하나 이상의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위의 함량과 비교하여, 하나 이상의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위의 증가된 함량을 포함하며; 적절하게는, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2(또는, SEQ ID NO: 2에 의해 인코딩되는 바와 같음), SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5에 제시된 아미노산 서열을 갖는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 성질;

재조합 인간 산 α-글루코시다제 상의 N-글리칸 단위, 예를 들어 재조합 인간 산 α-글루코시다제에 부착된 N-아세틸글루코사민, 갈락토스, 시알산 또는 이들의 조합으로부터 형성된 복합체 N-글리칸의 수 및 유형;

만노스-6-인산염 및/또는 이중-만노스-6-인산염을 형성하는, 재조합 인간 산 α-글루코시다제 상의 만노스 단위의 인산화의 정도;

대체 효소(재조합 인간 산 α-글루코시다제)의 투여량 및 투여 경로(예를 들어, 정맥내 투여, 특히 정맥내 주입 또는 표적 조직으로의 직접 투여) 및 담체 및 치료 유효량을 포함하는 제형의 유형;

약리학적 샤프론(미글루스타트) 및 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 간격;

치료 반응의 성질 및 조합 요법의 결과(예를 들어, 개별적으로 수행된 각 요법의 효과와 비교하여, 증대된 결과);

조합 요법의 투여 시간, 예를 들어 미글루스타트 및 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 동시 투여 또는 순차적 투여로서, 예를 들어, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제 이전 또는 재조합 인간 산 α-글루코시다제 이후 또는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 전 또는 후의 특정 시간 이내에 투여되는 조합 요법의 투여 시간; 및

치료 환자의 성질(예를 들어, 인간과 같은 포유류) 및 개체가 앓고 있는 질환(예를 들어, 효소 결핍증).

상기 목록의 구현예 중 임의의 것은 목록 내의 다른 구현예 중 하나 이상과 조합될 수 있다.

실시예

본 발명의 다른 특징은, 예로서, 본 발명의 원리를 예시하는 하기의 비제한적인 실시예로부터 명징해질 것이다.

실시예 1: 기존의 마이오자임® 및 루미자임® rhGAA 제품의 한계

현재 유일하게 승인된 폼페병 치료제인 마이오자임® 및 루미자임®의 rhGAA의 능력을 평가하기 위해, 이들 rhGAA 조제물을 (M6P 기를 갖는 rhGAA와 결합하는) CIMPR 칼럼 상에 주사한 후, 유리 M6 구배에 의해 용리시켰다. 분획을 96-웰 플레이트에 수집하고, GAA 활성을 4MU-α-글루코스 기질에 의해 분석하였다. 결합 및 비결합 rhGAA의 상대량을 GAA 활성을 기반으로 결정하고, 전체 효소의 분획으로서 기록하였다.

도 2a 및 도 2b에는 기존의 ERT(마이오자임® 및 루미자임®)와 관련된 문제가 기재되어 있다: 마이오자임®의 73%의 rhGAA(도 2b) 및 루미자임®의 78%의 rhGAA(도 2a)는 CIMPR과 결합하지 않았으며, 각 도면의 좌측-최대 피크를 참조한다. 단지, 마이오자임®의 27%의 rhGAA 및 루미자임®의 22%의 rhGAA만이, 근육 세포 상의 CIMPR에 생산적으로 표적화할 수 있는 M6P를 함유하였다.

마이오자임® 및 루미자임®의 유효 투여량은, 근육 세포 상의 CIMPR을 표적화하는 M6P를 함유하는 rhGAA의 양에 상응한다. 그러나, 이들 2개의 기존 제품의 대부분의 rhGAA는 표적 근육 세포 상의 CIMPR 수용체를 표적화하지 않는다. 대부분의 rhGAA가 근육 세포로 표적화되지 않는 기존의 rhGAA의 투여는 비표적 rhGAA에 대한 알러지 반응 또는 면역반응 유도의 위험을 증가시킨다.

실시예 2: 단일- 또는 이중 - M6P - 보유 N - 글리칸의 고 함량 을 갖는 ATB200 rhGAA를 생성하는 CHO 세포의 제조

CHO 세포를, rhGAA를 발현하는 DNA에 의해 형질감염시킨 후, rhGAA를 생성하는 형질전환체를 선택하였다. rhGAA를 인코딩하는 DNA에 의해 CHO 세포를 형질전환시키기 위한 DNA 작제물이 도 3에 도시되어 있다. CHO 세포를, rhGAA를 발현하는 DNA에 의해 형질감염시킨 후, rhGAA를 생성하는 형질전환체를 선택하였다.

형질감염 후, 안정하게 혼입된 GAA 유전자를 함유하는 DG44 CHO(DHFR-) 세포를 하이포크산틴/티미딘 결핍(-HT) 배지를 사용하여, 선택하였다. 이들 세포에서의 GAA 발현의 증폭을 메토트렉세이트 처리(MTX, 500 nM)에 의해 유도하였다. 다량의 GAA를 발현하는 세포 풀을 GAA 효소 활성 분석에 의해 확인하고, rhGAA를 생성하는 개별 클론을 확립하는 데 사용하였다. 개별 클론을 반고체 배지 플레이트 상에 생성시키고, ClonePix 시스템에 의해, 발출하였으며, 깊은 24-웰 플레이트로 옮겼다. 개별 클론을 GAA 효소 활성에 대해 분석하여, 고수준의 GAA를 발현하는 클론을 확인하였다. GAA 활성을 결정하기 위한 일정한 조건의 배지에는 4-MU-α글루코피라노사이드 α-글루코시다제 기질을 사용하였다. GAA 효소 분석에 의해 측정된 바와 같이, 더 고수준의 GAA를 생성하는 클론을 생존, 성장능력, GAA 생산성, N-글리칸 구조 및 안정한 단백질 발현에 대해 추가로 평가하였다. CHO 세포주 GA-ATB-200을 포함하고, 증대된 단일-M6P 또는 이중-M6P N-글리칸을 갖는 rhGAA를 발현하는 CHO 세포주를 이 절차를 사용하여, 단리하였다.

실시예 3: ATB200 rhGAA의 포획 및 정제

본 발명에 따른 rhGAA의 다수의 배치를 CHO 세포주 GA-ATB-200을 사용하여, 진탕 플라스크 및 관류 생물반응기에 생성하였고, CIMPR 결합을 측정하였다. 그와 유사한 CIMPR 수용체 결합(약 70%)은 도 4b에 도시되어 있고, 도 5a는 상이한 생성 배치로부터의 정제된 ATB200 rhGAA에 대해 관찰된 것이며, 이는 ATB200 rhGAA가 일관되게 생성될 수 있음을 시사한다. 도 2a, 도 2b, 도 4a 및 도 4b에 도시된 바와 같이, 마이오자임® 및 루미자임® rhGAA는 ATB200 rhGAA보다 유의하게 적은 CIMPR 결합을 나타내었다.

실시예 4: ATB200과 루미자임 ®의 분석 비교

약 음이온 교환("WAX") 액체 크로마토그래피를 사용하여, 말단 인산염에 따라 ATB200 rhGAA를 분획화하였다. 염의 양을 증가시키면서, ERT를 용리함으로써, 용리 프로파일을 생성시켰다. 프로파일을 UV(A280 nm)에 의해 모니터링하였다. ATB200 rhGAA를 CHO 세포로부터 얻어서, 정제하였다. 루미자임®을 상업적 공급원으로부터 입수하였다. 루미자임®은 용리 프로파일 좌측 상에 고 피크를 나타내었다. ATB200 rhGAA는 루미자임®의 우측에 4개의 우세한 피크 용리를 나타내었다(도 6). 이는, 이 평가가 CIMPR 친화도가 아닌 말단 전하에 의한 것이므로, ATB200 rhGAA가 루미자임®보다 더 큰 정도로 인산화되었음을 확인시킨다.

실시예 5: ATB200 rhGAA의 올리고당류 특성화

정제된 ATB200 rhGAA 및 루미자임® 글리칸을 각각의 ERT 상에서 발견되는 개별 글리칸 구조를 결정하기 위해, MALDI-TOF에 의해 평가하였다(도 7). ATB200 샘플은 루미자임®보다 더 소량의 비 인산화된 고-만노스형 N-글리칸을 함유한 것으로 나타났다. 루미자임®에서보다 ATB200에서 더 고 함량의 M6P 글리칸은 더욱 효율적으로 ATB200 rhGAA를 근육 세포로 표적화한다. MALDI에 의해 결정된 고 백분율의 단일-인산화 및 이중-인산화 구조는 ATB200과 CIMPR 수용체의 유의하게 더 큰 결합을 예시하는 CIMPR 프로파일에 일관된다. MALDI-TOF 질량 분광분석을 통한 N-글리칸 분석은 평균적으로 각각의 ATB200 분자가 적어도 하나의 천연 이중-M6P N-글리칸 구조를 함유함을 확인시킨다. ATB200 rhGAA 상의 이러한 더 고 함량의 이중-M6P N-글리칸은 도 9a의 M6P 수용체 플레이트 결합 분석(KD 약 2 내지 4 nM)에서 CIMPR과의 고-친화도 결합과 직접 연관된다.

ATB200 rhGAA를 또한 2개의 상이한 LC-MS/MS 분석 기법을 사용하여, 부위-특이적 N-글리칸 프로파일에 대해 분석하였다. 제1 분석에서, LC-MS/MS 분석 전에, 단백질을 변성시키고, 환원시키고, 알킬화시키고, 분해하였다. 단백질의 변성 및 환원 단계 동안, 200 μg의 단백질 샘플, 5 μL 1 mol/L 트리스-HCl(최종 농도: 50 mM), 75 μL 8 mol/L 구아니딘 HCl(최종 농도: 6 M), 1 μL 0.5 mol/L EDTA(최종 농도: 5 mM), 2 μL 1 mol/L DTT(최종 농도: 20 mM) 및 Milli-Q® 물을 1.5 mL 튜브에 첨가하여, 100 μL의 총 용적을 제공하였다. 샘플을 혼합하고, 건조 조에서 56℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 알킬화 단계 동안, 변성되고, 환원된 단백질 샘플을 5 μL 1 mol/L 요오도아세트아미드(IAM, 최종 농도: 50 mM)와 혼합한 후, 10 내지 30℃의 암소에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 알킬화 후, 400 μL의 사전 냉각된 아세톤을 샘플에 첨가하고, 혼합물을 -80℃의 냉동고에서 4시간 동안 동결시켰다. 그 후, 샘플을 4℃, 13000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 분리하였다. 400 μL의 사전 냉각된 아세톤을 펠릿에 첨가한 후, 4℃, 13000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 분리하였다. 그 후, 샘플을 암소에서 얼음 상에서 대기 건조시켜, 아세톤 잔기를 제거하였다. 40 μL의 8 M 요소 및 160 μL의 100 mM NH₄HCO₃을 샘플에 첨가하여, 단백질을 용해시켰다. 그 후, 트립신 분해 단계 동안, 50 μg의 단백질을 최종 용적이 100 μL가 되도록 트립신 분해 완충액에 첨가하고, 5 μL 0.5 mg/mL 트립신(20/1 w/w의 단백질 대 효소 비율)을 첨가하였다. 용액을 잘 혼합하고, 37℃에서 밤새(16 ± 2시간) 인큐베이션하였다. 2.5 μL의 20% TFA(최종 농도: 0.5%)를 첨가하여, 반응을 퀀칭(quenching)시켰다. 그 후, 샘플을 Thermo Scientific Orbitrap Velos Pro^TM질량 분광분석기를 사용하여, 분석하였다.

제2 LC-MS/MS 분석에서, 알킬화 시약으로서, IAM 대신에 요오도아세트산(IAA)을 사용하는 것을 제외하고, 유사한 변성, 환원, 알킬화 및 분해 절차에 따라, ATB200 샘플을 제조한 후, Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribid^TM 질량 분광분석기를 사용하여, 분석하였다.

제3 LC-MS/MS 분석에서, 알킬화 시약으로서, 요오도아세트아미드(IAM)를 사용하여, 유사한 변성, 환원, 알킬화 및 분해 절차에 따라, ATB200 샘플을 제조한 후, Thermo Scientific Orbitrap Fusion 질량 분광분석기를 사용하여, 분석하였다.

제1 및 제2 분석의 결과는 도 8b 내지 도 8h에 도시되어 있으며, 제3 분석의 결과는 도 8a에 도시되어 있다. 도 8b 내지 도 8h에서, 제1 분석 결과는 좌측 막대(진회색)에 의해 표시되어 있으며, 제2 분석으로부터의 결과는 우측 막대(연회색)에 의해 표시되어 있다. 도 8b 내지 도 8h에서, 글리칸 표시의 기호명은 문헌[Varki, A., Cummings, R.D., Esko J.D., et al., Essentials of Glycobiology, 2nd edition (2009)]에 따른 것이다. 도 8a 내지 도 8h에서, 글리코실화 부위가 SEQ ID NO: 5와 관련하여 제시된다: N84, N177, N334, N414, N596, N826 및 N869. SEQ ID NO: 1의 전장의 아미노산 서열에서, 이들 잠재적 글리코실화 부위는 하기의 위치에 존재한다: N140, N233, N390, N470, N652, N882 및 N925.

도 8b 내지 도 8h로부터 인식되는 바와 같이, 제1의 2개의 분석은, 결과 간에 일부 변동이 있기는 하나, 유사한 결과를 제공하였다. 이러한 변동은 사용된 기기 및 N-글리칸 분석의 완전성을 포함하여, 다양한 인자에 의한 것일 수 있다. 예를 들어, 일부 종류의 인산화 글리칸이 확인되지 않고/않거나, 정량화되지 않은 경우, 인산화 글리칸의 총수가 적게 표시될 수 있고, 그 부위에 인산화 글리칸을 보유하는 rhGAA의 백분율이 적게 표시될 수 있다. 또 다른 예로서, 일부 종류의 비 인산화 글리칸이 확인되지 않고/않거나, 정량화되지 않은 경우, 비 인산화 글리칸의 총수가 적게 표시될 수 있고, 그 부위에 인산화 글리칸을 보유하는 rhGAA의 백분율이 많게 표시될 수 있다.

도 8a는 ATB200의 N-글리코실화 부위 점유율을 도시한다. 도 8a로부터 인식될 수 있는 바와 같이, 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 N-글리코실화 부위는 대부분 점유되어 있으며, 글리칸을 갖는 ATB200 효소의 대략 90% 및 최대 약 100%가 각각의 잠재적 부위에서 검출되었다. 그러나, 제7의 잠재적 N-글리코실화 부위는 약 절반의 경우에 글리코실화된다.

도 8b는 제1 부위인 N84의 N-글리코실화 프로파일을 도시한다. 도 8b로부터 인식될 수 있는 바와 같이, 주요 글리칸 종류는 이중-M6P 글리칸이다. 제1 및 제2 분석 둘 모두에서 검출된 75% 이상의 ATB200이 제1 부위에서 이중-M6P 글리칸을 가졌다.

도 8c는 제2 부위인 N177의 N-글리코실화 프로파일을 도시한다. 도 8c로부터 인식될 수 있는 바와 같이, 주요 글리칸 종류는 단일-M6P 글리칸 및 비 인산화된 고 만노스 글리칸이다. 제1 및 제2 분석 둘 모두에서 검출된 40% 이상의 ATB200이 제2 부위에서 단일-M6P 글리칸을 가졌다.

도 8d는 제3 부위인 N334의 N-글리코실화 프로파일을 도시한다. 도 8d로부터 인식될 수 있는 바와 같이, 주요 글리칸 종류는 비 인산화된 고 만노스 글리칸, 디-, 트리- 및 테트라-안테너리 복합체 글리칸, 및 혼성체형 글리칸이다. 제1 및 제2 분석 둘 모두에서 검출된 20% 이상의 ATB200이 제3 부위에서 시알산 잔기를 가졌다.

도 8e는 제4 부위인 N414의 N-글리코실화 프로파일을 도시한다. 도 8e로부터 인식될 수 있는 바와 같이, 주요 글리칸 종류는 이중-M6P 및 단일-M6P 글리칸이다. 제1 및 제2 분석 둘 모두에서 검출된 40% 이상의 ATB200이 제4 부위에서 이중-M6P 글리칸을 가졌다. 또한, 제1 및 제2 분석 둘 모두에서 검출된 25% 이상의 ATB200이 제4 부위에서 단일-M6P 글리칸을 가졌다.

도 8f는 제5 부위인 N596의 N-글리코실화 프로파일을 도시한다. 도 8f로부터 인식될 수 있는 바와 같이, 주요 글리칸 종류는 푸코실화된 디-안테너리 복합체 글리칸이다. 제1 및 제2 분석 둘 모두에서 검출된 70% 이상의 ATB200이 제5 부위에서 시알산 잔기를 가졌다.

도 8g는 제6 부위인 N826의 N-글리코실화 프로파일을 도시한다. 도 8g로부터 인식될 수 있는 바와 같이, 주요 글리칸 종류는 디-, 트리- 및 테트라-안테너리 복합체 글리칸이다. 제1 및 제2 분석 둘 모두에서 검출된 80% 이상의 ATB200이 제6 부위에서 시알산 잔기를 가졌다.

도 8h는 제1의 6개의 잠재적 N-글리코실화 부위 각각에서의 인산화가 요약된 것을 도시한다. 도 8h로부터 인식될 수 있는 바와 같이, 제1 및 제2 분석 둘 모두에서 제1, 제2 및 제4 부위에서 고 인산화 수준이 검출되었다. 두 분석 모두에서 검출된 80% 이상의 ATB200이 제1 부위에서 단일- 또는 이중-인산화되었고, 40% 이상의 ATB200이 제2 부위에서 단일-인산화되었으며, 80% 이상의 ATB200이 제4 부위에서 단일- 또는 이중-인산화되었다.

실시예 6: ATB200의 CIMPR 친화도의 특성화

CIMPR과 결합할 수 있는 rhGAA의 백분율을 더 높이는 것 외에도, 상호작용의 특질을 이해하는 것이 중요하다. 루미자임® 및 ATB200 rhGAA 수용체 결합을 CIMPR 플레이트 결합 분석을 사용하여 결정하였다. 간단히 말해, CIMPR 피복 플레이트를 사용하여, GAA를 포획하였다. 다양한 농도의 rhGAA를 고정된 수용체에 도포하고, 비결합 rhGAA를 세척하였다. rhGAA의 잔류량을 GAA 활동에 의해 결정하였다. 도 9a에 의해 인식된 바와 같이, ATB200 rhGAA는 루미자임®보다 CIMPR과 유의하게 더 잘 결합하였다.

도 9b는 루미자임®, 기존의 rhGAA, 및 본 발명에 따른 ATB200의 이중-M6P 글리칸의 상대 함량을 도시한다. 루미자임®의 경우, 평균적으로 단지 10%의 분자만이 이중-인산화 글리칸을 갖는다. 이는 평균적으로 모든 rhGAA 분자가 적어도 하나의 이중-인산화 글리칸을 가진 ATB200과 대조적이다.

실시예 7: ATB200 rhGAA는 루미자임 ®보다 섬유아세포에 의해 더욱 효율적으로 내재화되었다

ATB200과 루미자임® rhGAA의 상대 세포 흡수를 정상 및 폼페 섬유아세포 세포주를 사용하여 비교하였다. 비교에는 5 내지 100 nM의 본 발명에 따른 ATB200 rhGAA와 10 내지 500 nM의 기존의 rhGAA 루미자임®이 포함되었다. 16시간의 인큐베이션 후, 외부 rhGAA를 TRIS 염기로 불활성화시키고, 세포를 채취하기 전에 PBS로 3회 세척하였다. 4MU-α-글루코사이드 가수분해에 의해 측정된 내재화된 GAA를 총 세포 단백질에 대해 그래프로 나타냈으며, 결과는 도 10a 및 도 10b에 제시되어 있다.

ATB200 rhGAA는 또한 세포 내로 효율적으로 내재화되는 것으로 나타났으며(도 10a 및 도 10b), 이는 각각, ATB200 rhGAA가 정상 및 폼페 섬유아세포 세포 둘 모두 내로 내재화되고, 기존의 루미자임® rhGAA보다 더 큰 정도로 내재화됨을 시사한다. ATB200 rhGAA는 약 20 nM에서 세포 수용체를 포화시키고, 한편, 루미자임®은 약 250 nM이 필요하다. 이러한 결과로부터 추산된 흡수 효율 상수(K_흡수)는 도 10c에 도시된 바와 같이, ATB200의 경우 2 내지 3 nm이고, 루미자임®의 경우 56 nM이다. 이들 결과는 ATB200 rhGAA가 폼페병에 대한 양질의 표적 치료제임을 시사한다.

실시예 8: ATB200 및 미글루스타트에 대한 집단 약동학(PK) 모델링

샘플링 시간, 투여 일정 및 산 α-글루코시다제의 혈장 농도를 포함하는 산 α-글루코시다제(ATB200)의 약동학 데이터를 정맥내 주사에 의해 ATB200을 투여한 마우스, 랫트 및 원숭이로부터 얻는다. 혈장 및 조직 내의 미글루스타트 및 두보글루스타트에 대한 약동학 데이터를 인간 또는 마우스로부터 수집한다.

Phoenix® NLME™ v1.3을 사용하여 모델링 및 시뮬레이션을 수행한다. 혈장 내 ATB200의 PK를 평가하기 위해, 구획 PK 모델을 작제한다. 이 모델은 다음을 포함한다:

· 혈장 농도와 시간 사이의 관계에 대한 설명;

· 모델 파라미터 간 및 동물 내 변동성을 특성화하는 변동 성분; 및

· 중요한 모델 성분에 대한 인식 상태의 불확실성을 설명하는 성분.

비선형 혼합 효과(NLME) 모델의 형식은 다음과 같다:

상기 식에서, C _pij 는 동물 i의 j ^th 수집 시간(t _j )에서의 농도이고, D _i 는 동물 i의 투여 일정을 나타내고, θ _i 는 동물 i의 PK 파라미터의 벡터이며, ε _ij 는 동물 i의 j ^th 농도와 관련된 무작위 오차이다.

파라미터의 대상체간 변동성(BSV)은 로그 정규 분포로서 모델링한다:

상기 식에서, θ _TVn 은 n ^th PK 파라미터(예를 들어, 배출률)의 집단 대표 값이며, η _in 은 동물 i의 n ^th 파라미터에 대한 동물 사이의 무작위 효과이다. 무작위 효과(η ₁,...,η _m )를 정규 분포화하였으며, 평균 0 및 예측 변수 ω²을 OMEGA(Ω) 행렬에 포함시켰다.

PK는 종류에 무관한 것으로 가정되며, 동물의 체중의 힘에 따라 배열 척도가 조정되는 일반화 데드릭(Dedrick) 접근법에 따라 척도를 조정한다:

상기 식에서, CL은 전신적 배출률이고, V는 분포 용적이고, BW는 체중이고, p는 말초이고, b 및 d는 상대성장 지수이며, a 및 c는 BW가 1인 경우의 대표 값이다. 이 시나리오에서, 지수 b 및 d는 문헌에서 허용되는 더욱 일반화된 값과 비교할 수 있다(b = 0.75 및 d = 1.0). 명목상 BW(0.025, 0.25 및 2.5 kg)를 분석에 사용한다.

C_기준일이 종류 특이적이고, ATB200의 농도와 무관하며, 폼페병을 가진 인간에서 인식되어 있기 때문에, C_기준일을 산 α-글루코시다제 합성/CL의 비율로 하여, 인간에 대해 추산할 수 있으므로, 기준일 산 α-글루코시다제 농도를 모델링한다. 1 또는 2개의 구획 모델이 데이터에 최적으로 적합한지를 평가하기 위해, Phoenix® FOCE-ELS를 사용하여, 기본 모델을 결정한다. 산 α-글루코시다제의 PK에서의 변동성 원인을 또한 PK에 대한 다양한 야생형에 대한 효과/종류/투여량 관련 효과를 검색하여, 시각적으로 탐색한다.

ATB200의 경우, 선형 제거의 2-구획 모델은 동물 종 전반의 모든 투여량 수준에 대한 산 α-글루코시다제 활성의 농도-시간 프로파일을 적절히 특성화한다. 이 모델은 배출률(CL) 및 분포 용적(Vc)에 대한 동물 종 전반의 체중 차이를 고려한 이론적 상대성장 성분을 포함한다. ATB200의 집단 PK 모델의 적합도가 도 11에 도시되어 있다. 비임상 연구에서 ATB200의 집단 PK 파라미터는 표 1에 제시되어 있다.

폼페병 환자에서 미글루스타트(200 mg)의 농도-시간 프로파일을 건강한 정상 지원자에서 두보글루스타트의 투여(투여량 범위: 50, 100, 250, 600, 및 1000 mg) 후 얻어진 것과 비교한다. 미글루스타트 및 두보글루스타트의 투여량-정규화 혈장 농도-시간 프로파일은 도 12에 도시되어 있다. 폼페병 환자에서 미글루스타트의 농도-시간 프로파일이 24시간 동안 건강한 대상체에서 두보글루스타트의 투여 후 관찰된 것과 유사하므로, 말초 조직에서 두보글루스타트에 의해 수집된 PK 데이터를 미글루스타트에 대한 모델 노출에 대한 대용으로 사용하였다. 선형 제거의 2-구획 모델을 사용하여, 조직에서 두보글루스타트의 농도-시간 프로파일을 특성화한다.

두보글루스타트의 PK 모델의 적합도는 도 13a 및 도 13b에 도시되어 있다. 혈장 및 조직에서 두보글루스타트의 최종 모델 PK 파라미터는 표 2에 제시되어 있다.

미글루스타트의 집단 PK 모델을 Gaa 녹아웃(KO) 마우스에서 경구 투여를 기반으로 작제한다. Gaa KO 마우스에서 미글루스타트의 집단 PK 파라미터가 표 3에 제시되어 있다. 적합도는 도 14에 도시되어 있다. 이 모델은 0.475 ng/mL의 잔여 부가 오차를 갖는다.

실시예 9: 인간에서 재조합 산 α- 글루코시다제 ( ATB200 ) 약동학적(PK) 파라미터의 모델링

약동학적 모델(실시예 8)을 사용하여, 시뮬레이션을 수행하고, ATB200의 투여 후, 후기 폼페병을 가진 인간 대상체에서 산 α-글루코시다제의 농도-시간 프로파일을 예측하였다. 상대성장 함수는 배출률 및 분포 용적과 체중의 연계를 가능하게 하며, 따라서 70 kg의 체중을 가진 보통의 인간 대상체에서 PK 파라미터의 예측을 가능하게 한다. 인간에서 산 α-글루코시다제 합성의 내산성 비율을 포함시킴으로써, 이 모델을 지정한다(문헌[Umapathysivam K, Hopwood JJ, Meikle PJ. Determination of acid alpha-glucosidase activity in blood spots as a diagnostic test for Pompe disease. Clin Chem. (2001) Aug; 47(8): 1378-83]).

4시간의 주입에 걸쳐, 인간에서 ATB200의 단일 20 mg/kg IV 투여는 도 15에 제시된 농도-시간 프로파일을 생성할 것으로 예측된다. 4시간에 걸친 ATB200의 20 mg/kg IV 주입 후 보통의 70-kg 인간에서의 PK 파라미터 및 결과적 노출 파라미터가 표 4에 제시되어 있다.

보통의 70-kg 환자에서 ATB200의 예측된 전신적 배출률(CL) 및 분포 용적(V)은 각각 0.768 L/h 및 2.41 L이다.

루미자임®(알글루코시다제 알파)의 제품 라벨에 따라, 후기 폼페병 환자에서 루미자임®의 반복 투여 후, 52주차에 산 α-글루코시다제의 전신적 배출률은 601 mL/h(0.601 L/h)이고, 루미자임®의 반감기는 2.4 h이다. 상기 모델을 기반으로, 폼페병을 가진 성인 대상체에서 ATB200의 전신적 배출률은 루미자임®에서 보고된 것보다 대략 28%만큼 더 빠를 것으로 예상된다. 추가로, 인간에서 ATB200의 20 mg/kg 투여 후 예측되는 AUC는 루미자임®의 20 mg/kg 투여 후 보고된 AUC(약 2700 μg·h/mL)보다 약 25%만큼 더 낮은 것으로 예상된다(AUC_0-inf: 1822 mg·h/L).

실시예 10: 글리코겐 감소에 대한 노출 -반응 모델

Gaa 녹아웃 마우스에, 20 mg/kg의 ATB200의 정맥내 투여량에 부수하여, 미글루스타트의 경구 투여량(1, 3, 5, 10, 20, 및 30 mg/kg)을 증가시키거나, 5 또는 10 mg/kg의 ATB200의 정맥내 투여량에 부수하여, 미글루스타트의 경구 투여량(1, 3 및 10 mg/kg)을 증가시키면서, 산 α-글루코시다제(ATB200)를 5, 10 및 20 mg/kg의 투여량으로 정맥내 투여한다. 글리코겐 수준을 종래 기재된 바와 같이 측정한다(문헌[Khanna, R, Flanagan, JJ, Feng, J, Soska, R, Frascella, M, Pellegrino, LJ et al. (2012). "The pharmacological chaperone AT2220 increases recombinant human acid α-glucosidase uptake and glycogen reduction in a mouse model of Pompe disease. PLoS One 7(7): e40776]). 각각의 조합 요법 치료 후 관찰된 글리코겐 수준 대 단일요법 후 관찰된 글리코겐 수준의 비율(글리코겐 비율)을 계산한다. 결과는 표 5에 제공된다.

추가로, 도 15a 내지 도 15c는 Gaa 녹아웃 마우스에서 글리코겐 배출률에 대한 알글루코시다제 알파(루미자임®) 및 ATB200의 투여의 효과를 도시한다. 동물에 2회의 IV 볼루스 투여(매격주)를 제공하고; 최종 투여 2주 후에 조직을 채취하고, 산 α-글루코시다제 활성 및 글리코겐 함량에 대해 분석한다.

표 5의 결과로부터 인식되는 바와 같이, ATB200은 투여량-의존적 방식으로 산 α-글루코시다제(Gaa) 녹아웃 마우스에서 조직 글리코겐을 고갈시키는 것으로 나타났다. 20 mg/kg 투여량의 ATB200은 Gaa 녹아웃 마우스에서 5 및 10 mg/kg 투여량 수준보다 더 큰 비율의 저장 글리코겐을 일관되게 제거하였다. 그러나, 도 15a 내지 도 15c에 도시된 바와 같이, 5 mg/kg으로 투여된 ATB200은 마우스의 심근 및 골격근(사두근 및 삼두근)에서 20 mg/kg으로 투여된 루미자임®과 유사한 글리코겐 감소를 나타내었으며, 10 및 20 mg/kg으로 투여된 ATB200은 골격근에서 루미자임®보다 유의하게 더 양호한 글리코겐 수준의 감소를 나타내었다.

추가로, 20 mg/kg의 ATB200과 공동 투여된 10 및 20 mg/kg 투여량의 미글루스타트는 Gaa 녹아웃 마우스에서 글리코겐 수준을 각각 118 및 122 μg/mg 단백질로 감소시켰다. 30 mg/kg의 미글루스타트의 투여는 더 적은 글리코겐 감소를 야기하였다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 더 고농도의 미글루스타트에서, 리소좀에서의 산 α-글루코시다제의 억제율은 유리한 샤프론 효과를 초과할 수 있으며, 따라서, 리소좀에서의 글리코겐의 분해를 감소시킬 수 있는 것으로 여겨진다.

약동학적 모델(실시예 8)을 사용하여, 표 5의 조직 리소좀 글리코겐 수준 값에 시간-대응하는 산 α-글루코시다제 및 미글루스타트에 대한 노출을 예측한다. 미글루스타트/ATB200의 항정 상태 노출(AUC) 비율(24시간 동안의 노출 평균값)을 시험된 각각의 치료 조합에 대해 도출하고, 상응하는 글리코겐 비율(표 5)에 대해 도시하여, 수학적 함수에 적합화시킨다. 노출-반응 곡선은 도 17에 도시되어 있다.

도 17의 결과로부터 인식되는 바와 같이, 10 및 20 mg/kg 투여량의 미글루스타트와 20 mg/kg 투여량의 ATB200의 공동 투여는 혈장 내에서 산 α-글루코시다제 활성의 양호한 안정성을 제공하며, 글리코겐의 감소를 최대화시킨다. 더 소량의 투여량의 미글루스타트(1, 3, 및 5 mg/kg)는 산 α-글루코시다제 활성의 차선적 안정화를 야기하는 것으로 여겨지고, 최고량의 투여량의 미글루스타트(30 mg/kg)는 리소좀 내에서 α-글루코시다제 활성의 과도한 억제를 야기하는 것으로 여겨진다.

약동학적 모델(실시예 8)을 기반으로, 0.01159의 관찰된 미글루스타트/ATB200 AUC 비율(20 mg/kg ATB200과 공동 투여된 10 mg/kg 미글루스타트)은 보통의 70-kg 인간에서 20 mg/kg ATB200과 공동 투여된 약 270 mg의 미글루스타트 투여량에 상응하는 것으로 예상된다. 0.01 및 0.02의 AUC 비율은 각각, 보통의 70-kg 대상체에서 20 mg/kg ATB200과 공동 투여된 233 및 466 mg의 미글루스타트 투여량에 상응할 것이다.

실시예 11: 인간에서 미글루스타트 / 두보글루스타트 농도의 모델링

약동학적 모델(실시예 8)을 사용하여, 두보글루스타트(미글루스타트 대용)의 혈장 또는 조직 농도가 혈장 및 리소좀에서 미글루스타트의 IC₅₀(산 α-글루코시다제 활성의 최대 억제율의 50%를 제공하는 농도)을 초과하여 유지되는 시간 길이를 예측하였다. 산 α-글루코시다제 활성의 억제율을 종래에 기재된 방법에 의해 결정한다(문헌[Flanagan JJ, Rossi B, Tang K, Wu X, Mascioli K, et al. (2009) "The pharmacological chaperone 1-deoxynojirimycin increases the activity and lysosomal trafficking of multiple mutant forms of acid alpha-glucosidase." Hum Mutat 30: 1683-1692]). 혈장의 pH(pH 7.0)에서의 미글루스타트의 IC₅₀ 값은 170 μg/L로 결정되었으며, 리소좀 구획의 pH(pH 5.2)에서의 IC₅₀ 값은 377 μg/L인 것으로 결정되었다.

모델 예측 결과가 표 6에 제시되어 있다. 반복 투여 후, 혈장 및 리소좀에서의 미글루스타트의 예측된 농도-시간 프로파일은 각각 도 17 및 도 18에 도시되어 있다.

표 6 및 도 17 및 도 18에 제시된 결과를 기반으로, 260 mg 투여량의 미글루스타트는 혈장 내에서 최대 18시간까지, ATB200과 결합하여, 이를 안정화시키는 것으로 예상되며, 리소좀에서의 산 α-글루코시다제 활성의 억제는 단지 4시간 지속되는 것으로 예상된다.

실시예 12: Gaa - 녹아웃 마우스에서의 근육 생리학 및 형태학

Gaa 녹아웃 마우스에 20 mg/kg의 재조합 인간 산 α-글루코시다제(알글루코시다제 알파 또는 ATB200)의 2회의 IV 볼루스 투여를 매격주 제공한다. ATB200의 투여 30분 전에 ATB200으로 처리되는 동물의 하위세트에 미글루스타트를 10 mg/kg의 투여량으로 경구 투여한다. 대조군 마우스는 비히클을 단독으로 처리한다. 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 최종 투여 2주 후에, 비장근, 사두근 및 횡경막 조직을 채취한다. 비장근 및 횡경막 조직을 과요오드산 - Schiff 시약(PAS)에 의해 염색함으로써, 글리코겐 수준에 대해 분석하고, 폼페병의 경우, 상향조절되는 리소좀-결합 막 단백질(LAMP1) 마커의 수준을 측정함으로써, 리소좀 증식에 대해 분석한다. 에폭시 수지(Epon)에 포매된 사두근의 얇은 쪽 단면을 메틸렌 블루로 염색하고, 전자 현미경(1000x)에 의해 관찰하여, 액포의 존재 정도를 결정한다. 사두근 샘플을 면역조직화학적으로 분석하여, 자식작용 마커 미소관-결합 단백질 1A/1B-경쇄의 3개의 포스파티딜에탄올아민 접합체(LC3A II) 및 p62, 인슐린-의존적 글루코스 수송인자 GLUT4 및 인슐린-비의존적 글루코스 수송인자 GLUT1의 수준을 결정한다.

유사한 연구에서, Gaa 녹아웃 마우스에 20 mg/kg의 재조합 인간 산 α-글루코시다제(알글루코시다제 알파 또는 ATB200)의 4회의 IV 볼루스 투여를 매격주 제공한다. ATB200의 투여 30분 전에 ATB200으로 처리되는 동물의 하위세트에 미글루스타트를 10 mg/kg의 투여량으로 경구 투여한다. 대조군 마우스는 비히클을 단독으로 처리한다. 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 최종 투여 2주 후에, 심근 조직을 채취하고, 과요오드산 - Schiff 시약(PAS)에 의해 염색함으로써, 글리코겐 수준에 대해 분석하고, LAMP1의 수준을 측정함으로써, 리소좀 증식에 대해 분석한다.

도 20에 도시된 바와 같이, ATB200의 투여는 알글루코시다제 알파에 의한 통상 처리와 비교하여, 심근, 횡경막 근육 및 골격근(비장근) 조직에서 리소좀 증식의 감소를 나타내고, 미글루스타트와 ATB200의 공동 투여는 리소좀 증식에서의 추가의 유의한 감소를 나타내며, 이는 야생형(WT) 마우스에서 나타나는 수준에 근접한다. 추가로, 도 21에 도시된 바와 같이, ATB200의 투여는 알글루코시다제 알파에 의한 통상 처리와 비교하여, 심근 및 골격근(비장근) 조직에서 점상 글리코겐 수준의 감소를 나타내고, 미글루스타트와 ATB200의 공동 투여는 추가의 유의한 감소를 나타내며, 이는 다시 야생형(WT) 마우스에서 나타나는 수준에 근접한다.

또한, 도 22에 도시된 바와 같이, 미글루스타트와 ATB200의 공동 투여는 미처리된 마우스 및 알글루코시다제 알파에 의해 처리된 마우스와 비교하여, Gaa 녹아웃 마우스의 사두근의 근섬유에서의 액포의 수를 유의하게 감소시킨다. 도 23에 도시된 바와 같이, 야생형 마우스와 비교하여, Gaa 녹아웃 마우스에서 LC3 II 및 p62 둘 모두의 수준이 증가하나, ATB200 및 미글루스타트에 의한 처리시, 유의하게 감소하며, 이는, 산 α-글루코시다제 결핍증과 관련된 자식작용의 증가가 ATB200 및 미글루스타트의 공동 투여시, 감소함을 시사한다. 추가로, 인슐린-의존적 글루코스 수송인자 GLUT4 및 인슐린-비의존적 글루코스 수송인자 GLUT1의 수준은 야생형 마우스와 비교하여, Gaa 녹아웃 마우스에서 증가하나, 이는 다시 ATB200 및 미글루스타트에 의한 처리시 유의하게 감소한다. 산 α-글루코시다제 결핍증과 관련된 증가된 GLUT4 및 GLUT1 수준은 기저 상태 및 식후의 두 경우 모두에서, 근섬유로의 글루코스 흡수의 증가 및 글리코겐 합성의 증가에 기여할 수 있다. 따라서, ATB200 및 미글루스타트에 의한 조합 처리는 폼페병 마우스 모델에서 골격근의 형태학 및 생리학을 개선하는 것으로 밝혀졌다.

실시예 13: 사이노몰거스 원숭이( cynomolgus monkey)에서 미글루스타트 와 공동 투여된 ATB200의 독성

캄보디아생의 나이브(naive)한 사이노몰거스 원숭이를 표 7에 지정된 바와 같은 투여량 그룹에 배정하였다. 동물들을 18일(암컷) 내지 19일(수컷) 동안 연구실에 적응시켰다. 최종 적응 일에, 동물들의 중량은 2.243 kg 내지 5.413 kg이었으며, 2 내지 3년생이었다.

실시예 8의 약동학 모델로부터 예측되는 바와 같은 260 mg 미글루스타트 및 20 mg/kg ATB200의 투여량이 투여된 인간에서의 예상 임상 AUC(각각 대략 20.9 hr·μg/mL 및 대략 1822 hr·μg/mL)와 근사하거나, 이를 약간 초과하거나(25 mg/kg 미글루스타트 및 50 mg/kg ATB200 그룹의 경우), 대략 10- 및 3-배 더 높은(175 mg/kg 미글루스타트 및/또는 100 mg/kg ATB200 그룹의 경우) 노출(AUC)을 제공하기 위해, 비 인간 영장류에서의 종래 연구를 기반으로, 시험 투여량 수준을 선택하였다. 비 인간 영장류에서의 종래 연구에서, 100 mg/kg ATB200의 IV 투여는 5330 hr·μg/mL의 AUC를 야기하는 것으로 나타났으며, 175 mg/kg의 미글루스타트의 경구 투여는 196 hr·μg/mL의 AUC를 야기하는 것으로 추산되었다.

ATB200을 2.92 mg/mL 염화나트륨, 20 mg/mL 만니톨, 및 0.5 mg/mL 폴리소르베이트 80(배합 완충액)을 함유하는 pH 6의 25 mM 인산나트륨 완충액 중에 제형화한다. 시험 품목(ATB200 또는 미글루스타트) 및 대조군 품목/비히클(배합 완충액)을 13주 동안 격주마다 1회 투여하였으며, 이는 1일차에 개시되어, 85일차에 종결되었다. ATB200 및 대조군 품목/비히클을 0 mg/kg(그룹 1, 대조군 품목), 50 mg/kg(그룹 2), 또는 100 mg/kg(그룹 3 및 5)으로 2시간(±10분) 정맥내(IV) 주입에 의해 투여하였다. 미글루스타트를 조합하여 제공하는 경우, ATB200의 주입 개시 전 30분(±2분) 전에 주사용 멸균수 USP 중 25 mg/kg(그룹 2) 또는 175 mg/kg(그룹 3 및 4)으로 경비 투여하였다. 전 그룹 전반의 투여 용적은 10 mL/kg이었다.

생존 단계 연구 동안 평가된 파라미터는 체중, 섭식, 임상 관찰, 상세 임상 관찰, 신체검사, 심전도검사, 안과학적 평가, 임상 병리학(혈액학, 응고, 혈청 화학), 항 약제 항체(ADA) 평가, 중화 ADA 평가, 소변검사, 및 미글루스타트 및 ATB200 활성 및 총 단백질의 혈장 독성동태학(TK)을 포함한다. 99일차(마지막 투여량 투여 14일 후)에 동물의 최종 검시를 수행하였다. 검시시, 전체 관찰 및 장기 중량을 기록하고, 현미경 검사를 위해, 조직을 채취하였다.

모든 동물은 안락사 예정시까지 생존하였고, 신체검사 동안 또는 섭식, 임상 관찰, 상세 임상 관찰, 체중, 안과학, 또는 ECG 파라미터의 평가 동안 ATB200, 미글루스타트의 투여 또는 ATB200 및 미글루스타트의 공동 투여에 기인한 변화는 존재하지 않았다. 추가로, 소변검사, 혈청 화학, 혈액학, 또는 응고 파라미터, 또는 전체 관찰, 장기 중량, 또는 조직병리학의 평가 동안 ATB200, 미글루스타트, 또는 ATB200/미글루스타트-관련 변화는 존재하지 않았다.

총 항 약제 항체(ADA) 및 중화 항체(NAb)

혈장 중 총 항 약제 항체(ADA) 및 중화 항체(NAb)의 수준을 측정한다. 적응기간 동안, 투여전(미글루스타트 투여 전) 및 1, 85 및 99일차에 모든 동물들로부터 혈액 샘플(대략 1.6 mL)을 K₂EDTA 튜브에 1회씩 채혈하였다. 처리시까지, 샘플을 얼음물에 유지하였다. 2℃ 내지 8℃에서 원심분리에 의해, 혈장을 얻고, 분취량(대략 0.2 mL)을 폴리프로필렌 바이알에 옮기고, 채혈시로부터 1시간 이내에 -60℃ 내지 -86℃에 동결 저장하였다. 그룹 1, 2, 3, 및 5의 동물들로부터 채취된 샘플에서 ADA에 대한 샘플 분석을 수행하였다(미글루스타트만의 샘플은 분석하지 않았음). 형광 기질 4-메틸움벨리페릴-α-D-글루코피라노사이드(4MU-Glc)에 의한 효소 분석을 사용하여, 중화 항체에 대한 분석을 수행하였다.

ATB200 투여량 그룹(그룹 2, 3, 및 5)의 모든 동물은 85 및 99일차에 항 약제 항체(ADA)에 대해 양성이었다(100% 발생률). 역가는 85일차에 25600 내지 409600의 범위이었으며, 99일차에는 51200 내지 819200의 범위이었다. ATB200 투여량 수준의 증가에 의해, 역가가 증가하는 명확한 경향성은 존재하지 않았다. 85 및 99일차에, 그룹 2(50 mg/kg ATB200과 25 mg/kg 미글루스타트의 조합)에서 8마리의 동물 중 5마리가 중화 항체(NAb)에 대해 양성이었다. 85일차에, 그룹 3(100 mg/kg ATB200과 175 mg/kg 미글루스타트의 조합)에서 8마리 중 2마리가 NAb에 대해 양성이었으며, 99일차에, 8마리 중 4마리가 양성이었다. 85일차에, 그룹 5(100 mg/kg ATB200 단일요법)에서 8마리 중 2마리가 NAb에 대해 양성이었으며, 99일차에, 8마리 중 3마리가 양성이었다. ATB200 노출 또는 다른 TK 파라미터에 대한 ADA의 명확한 효과는 존재하지 않았다.

ATB200 독성동태학

1 및 85일차에 하기의 시점에 동물들로부터 K₂EDTA 튜브에 채혈된 혈액 샘플에서 ATB200 독성동태학을 측정하였다:

그룹 1, 2, 3, 및 5: 투여전(미글루스타트 투여 전); 주입 개시로부터 1시간; 주입 개시로부터 2시간; 주입 개시로부터 2.5시간; 주입 개시로부터 3시간; 주입 개시로부터 4시간; 주입 개시로부터 6시간; 주입 개시로부터 12시간; 주입 개시로부터 26시간; 주입 개시로부터 168시간; 및 주입 개시로부터 336시간(15일차에 투여하기 전에 채혈됨); 및

그룹 4: 투여전(미글루스타트 투여 전); 미글루스타트 투여 1.5시간 후; 미글루스타트 투여 2.5시간 후; 미글루스타트 투여 3.5시간 후; 미글루스타트 투여 4.5시간 후; 미글루스타트 투여 6.5시간 후; 미글루스타트 투여 12.5시간 후; 미글루스타트 투여 26.5시간 후; 미글루스타트 투여 168.5시간 후; 및 미글루스타트 투여 336.5시간 후(15일차에 투여하기 전에 채혈됨).

2℃ 내지 8℃에서 원심분리에 의해 혈장을 얻었고, 분취량(대략 0.1 mL)을 폴리프로필렌 바이알에 옮기고, -60℃ 내지 -86℃에 동결 저장하였다. 그룹 1의 동물들로부터의 투여 2시간 후의 샘플 및 그룹 2, 3, 및 5의 동물들로부터 채혈된 모든 샘플에 대해 ATB200 산 α-글루코시다제 활성 및 ATB200 총 단백질 분석을 수행하였다. 탠덤 질량 분광분석(LC-MS/MS)에 커플링된 액체 크로마토그래피에 의해, 총 ATB200 단백질을 측정하였다. 2개의 특징 펩티드(TTPTFFPK 및 VTSEGAGLQLQK)를 ATB200의 측정으로서 사용하였다. 이들 2개의 펩티드로부터의 결과는 일관되었으며, 분석된 혈장 샘플 중에 무손상 ATB200이 존재함을 시사하였다. 형광 기질 4-메틸움벨리페릴-α-D-글루코피라노사이드(4MU-Glc)를 사용하여, 산 α-글루코시다제 활성을 분석하였다.

그룹 2, 3, 및 5에서 WinNonlin Phoenix, 버전 6.1 소프트웨어(Pharsight사)를 사용하여, 동물들로부터의 감사/검증 데이터 세트(농도 및 시간)에 대해 독성동태학(TK) 데이터 분석을 수행하였다. 개별 대상체 혈장 농도 데이터의 비구획 분석을 사용하여, IV 주입 후, 산 α-글루코시다제 활성 및 ATB200 총 단백질에 대한 TK 파라미터(2개의 특징 펩티드 TTPTFFPK 및 VTSEGAGLQLQK를 기반으로 함)를 예상하였다. 투여량 수준은 각각의 개별 동물의 투여량 용적, 체중, 및 평균 투여량 농도를 기반으로 하여 계산된 mg 단위의 실제 ATB200 투여량으로서 기입하였다. 각각의 투여 개시 시간(ATB200의 주입 개시)을 투여 요법의 모든 프로파일에 대해 0으로 설정하였다. 모든 분석에 대해, 명목상 샘플 수집 시간을 사용하였다. 로그-선형 사다리꼴 공식에 의해, ATB200(총 단백질 및 활성 분석 데이터세트)에 대해 생성된 혈장-농도-시간-곡선-하-면적(AUC_0-t)을 예상하였다. λ_z의 예상에 사용된 회귀는 균일 가중 농도 데이터를 기반으로 하였다.

각각의 ATB200 데이터 세트(총 ATB200 분석에서의 2개의 특징 펩티드 및 ATB200 활성 분석으로부터 생성됨)에 대해, 하기의 파라미터를 계산하였다:

· R² - λ_z _α의 예상에 사용된 선형 회귀의 상관 계수의 제곱. 설정된 번호의 지점이 농도의 최종 단계(또는, 구체적인 시간 범위) 대 시간 프로파일의 규정에 사용된 경우, 사용됨;

· R²adj - λ_zβ의 예상에 사용된 지점의 번호에 대해 조정된 λ_z의 예상에 사용된 선형 회귀의 상관 계수의 제곱. 농도의 최종 단계 대 시간 프로파일의 규정에 사용된 지점의 번호가 변동 가능할 수 있는 경우, 사용됨;

· 지점 번호 λ_z - λ_z의 예상에 사용된 선형 회귀 분석의 지점 번호;

· λ_z _α - t_max 후 처음 3개의 시점의 제거 속도 상수;

· λ_zβ - 최종 제거 속도 상수;

· t_1/ ₂ _α - t_max 후 처음 3개의 시점을 기반으로 한 반감기;

· t_1/ _2β - λ_z를 기반으로 한 최종 제거 반감기(0.693/λ_z);

· t_max - 혈장 내 분석물의 최대 농도 시간;

· C_max - 혈장 내 분석물의 최대 관찰 농도;

· AUC₀ _-t - 0시간(투여 전)으로부터 측정 가능한 최종 농도의 시점까지 측정된 혈장-농도-시간-곡선-하-면적(AUC);

· AUC₀ _-∞ - 무한대 시간까지 추산된 AUC;

· AUC_ext - 총 AUC₀ _-∞ %로 제시되는, 무한대 시간까지 추산된 AUC의 분율;

· CL_T - 총 배출률(λ_zβ를 기반으로 함); 실질 체중으로부터의 mg 단위의 총 투여량을 기반으로 함;

· CL_T/F - 총 배출률(λ_zβ를 기반으로 함); 실질 체중으로부터의 mg 단위의 총 투여량을 생체적합성 분획으로 나눈 값을 기반으로 함;

· V_ss - 평형시 겉보기 분포 용적;

· V_z - 최종 단계를 기반으로 한 분포 용적(λ_zβ를 기반으로 함); 실질 체중으로부터의 mg 단위의 총 투여량을 기반으로 함;

· V_z/F - 최종 단계를 기반으로 한 분포 용적(λ_zβ를 기반으로 함); 실질 체중으로부터의 mg 단위의 총 투여량을 생체적합성 분획으로 나눈 값을 기반으로 함; 및

· 축적 비율 - AR_Cmax= 85일차 대 1일차의 C_max 비율; AR_AUC= 85일차 대 1일차의 AUC_0-t 비율.

ATB200 농도 및 TK 파라미터는 수컷과 암컷 사이에 유사하였다. 25 mg/kg 미글루스타트와 조합한 50 mg/kg 2-시간 IV ATB200 주입 후의 혈장 농도는 투여 후 12 내지 26시간에 측정 가능하였다. 100 mg/kg 투여량 수준(175 mg/kg 미글루스타트의 존재 또는 부재 하)에서, ATB200 농도는 투여 후 26 내지 168시간에 측정 가능하였다. 단일 투여량(1일차)의 독성동태학 파라미터가 표 8에 제시되어 있다.

반복 투여(85일차)의 독성동태학 파라미터는 표 9에 제시되어 있다.

3개의 모든 투여량 그룹에서, 최대 ATB200 혈장 농도(t_max)까지의 시간은 투여 후 대략 2시간이었다. 총 ATB200 단백질 분석에 의해 측정된 바와 같은 1일차 및 85일차 ATB200 혈장 농도 및 TK 파라미터는 평가된 2개의 특징 펩티드 TTPTFFPK 및 VTSEGAGLQLQK 사이에 일관되었다. C_max 및 AUC₀ _-t에 의해 측정된 바와 같은 노출은 산 α-글루코시다제 활성 분석에 의해 측정되는 경우, 비교적 더 낮았다. 이는, 총 단백질 분석이 활성 및 불활성 효소의 농도 둘 모두를 측정하고, 산 α-글루코시다제 활성 분석이 활성 효소만의 농도를 측정하므로, 예상되는 바와 같다. ATB200 노출은 50 내지 100 mg/kg 투여량 수준의 투여에 의해 증가되었다. 처음 3개의 시점 후 t_max를 기반으로 한 평균 1일차 초기 t₁ _/2α(수컷 및 암컷 조합)는 1.28 내지 3.07시간의 범위였다. 평균 1일차 최종 반감기(t_1/2β)는 1.70 내지 11.1시간의 범위였다(t_1/2β값이 더 길수록, 투여 후 168시간까지 측정 가능한 농도를 갖는 동물에 의해 영향을 받았음). 투여 85일 후에, 유사 범위의 값이 관찰되었다. 격주마다 1회씩 반복 투여된 경우, 축적이 거의 내지 전혀 관찰되지 않았다. 100 mg/kg ATB200 투여량에 175 mg/kg 미글루스타트를 첨가한 경우, 100 mg/kg ATB200 단일요법에 대비하여, ATB200 배출률이 저하하고, 혈장 노출이 대략 2-배 증가하는 것으로 나타났다.

유해한 시험 품목-관련 변화가 확인되지 않았으므로, 사이노몰거스 원숭이에서, 미글루스타트의 투여의 존재 또는 부재 하에, 13주 동안 2시간 주입에 의해 격주마다 1회씩 제공된 경우, ATB200의 비-관찰-유해-효과-수준(NOAEL)은 시험된 최고 투여량인 100 mg/kg/주입이었다. 이러한 투여량 수준에서, 85일차의 평균 성별-평균값 AUC₀ _-t 및 C_max(총 단백질)는 175 mg/kg 미글루스타트와 조합한 ATB200 단독의 경우 및 각각 13900(TTPTFFPK) 또는 13800(VTSEGAGLQLQK) hr·μg/mL 및 2270(펩티드 둘 모두) μg/mL에서 각각 7830(TTPTFFPK) 및 7790(VTSEGAGLQLQK) hr·μg/mL 및 2020(TTPTFFPK) 또는 2010(VTSEGAGLQLQK) μg/mL였다.

미글루스타트 독성동태학

1 및 85일차에 하기의 시점에 동물들로부터 K₂EDTA 튜브에 채혈된 혈액 샘플에서 미글루스타트 독성동태학을 측정하였다:

그룹 1, 2, 3, 및 5: 투여전(미글루스타트 투여 전); 미글루스타트 투여 15분 후; 0시간(주입 개시 전); 주입 개시로부터 0.5시간; 주입 개시로부터 1시간; 주입 개시로부터 2시간; 주입 개시로부터 4시간; 주입 개시로부터 6시간; 주입 개시로부터 12시간; 주입 개시로부터 26시간; 주입 개시로부터 50시간; 및 주입 개시로부터 74시간; 및

그룹 4: 투여전(미글루스타트 투여 전); 미글루스타트 투여 15분 후; 미글루스타트 투여 30분 후; 미글루스타트 투여 1시간 후; 미글루스타트 투여 1.5시간 후; 미글루스타트 투여 2.5시간 후; 미글루스타트 투여 4.5시간 후; 미글루스타트 투여 6.5시간 후; 미글루스타트 투여 12.5시간 후; 미글루스타트 투여 26.5시간 후; 미글루스타트 투여 50.5시간 후; 및 미글루스타트 투여 74.5시간 후.

2℃ 내지 8℃에서 원심분리에 의해 혈장을 얻었고, 분취량(대략 0.2 mL)을 폴리프로필렌 바이알에 옮기고, -60℃ 내지 -86℃에 동결 저장하였다. 문헌[Richie Khanna, Allan C. Powe Jr., Yi Lun, Rebecca Soska, Jessie Feng, Rohini Dhulipala, Michelle Frascella, Anadina Garcia, Lee J. Pellegrino, Su Xu, Nastry Brignol, Matthew J. Toth, Hung V. Do, David J. Lockhart, Brandon A. Wustman, Kenneth J. Valenzano. "The Pharmacological Chaperone AT2220 Increases the Specific Activity and Lysosomal Delivery of Mutant Acid Alpha-Glucosidase, and Promotes Glycogen Reduction in Transgenic Mouse Model of Pompe Disease." PLOS ONE (1 July 2014) 9(7): e102092]에 두보글루스타트 농도의 분석을 위해 기재된 것과 유사한 LC-MS/MS 방법을 사용하여, 미글루스타트 농도 분석을 수행하였다.

그룹 2, 3, 및 4에서 WinNonlin Phoenix®, 버전 6.1 소프트웨어(Pharsight사)를 사용하여, 동물들로부터의 감사/검증 데이터 세트(농도 및 시간)에 대해 미글루스타트의 독성동태학(TK) 데이터 분석을 수행하였다. 개별 혈장 농도 데이터의 비구획 분석을 사용하여, TK 파라미터를 예상하였다. 로그-선형 사다리꼴 공식에 의해, 미글루스타트 TK 파라미터를 예상하였다. λ_z의 예상에 사용된 회귀는 균일 가중 농도 데이터를 기반으로 하였다. 하기의 파라미터를 계산하였다:

· R²adj - λ_z의 예상에 사용된 지점의 번호에 대해 조정된 λ_z의 예상에 사용된 선형 회귀의 상관 계수의 제곱. 농도의 최종 단계 대 시간 프로파일의 규정에 사용된 지점의 번호가 변동 가능할 수 있는 경우, 사용됨;

· λ_z - 최종 제거 속도 상수;

· t_1/ ₂ - λ_z를 기반으로 한 최종 제거 반감기(0.693/λ_z);

· t_max - 혈장 내 분석물의 최대 농도 시간;

· C_max - 혈장 내 분석물의 최대 관찰 농도;

· AUC₀ _-∞ - 무한대 시간까지 추산된 AUC;

· CL_T/F - 실질 체중으로부터의 mg 단위의 총 투여량을 기반으로 한 생체적합성 분획으로 나눈 총 배출률;

· V_z/F - 실질 체중으로부터의 mg 단위의 총 투여량을 기반으로 한 생체적합성 분획으로 나눈 최종 단계를 기반으로 한 분포 용적;

· 축적 비율 - AR_Cmax = 85일차 대 1일차의 C_max 비율; 및 AR_AUC = 85일차 대 1일차의 AUC₀ _-t 비율.

미글루스타트 TK 파라미터에 대한 성별의 일관된 효과는 존재하지 않았다. 50 mg/kg ATB200, 또는 175 mg/kg NG 투여(100 mg/kg ATB200의 존재 또는 부재 하)와 조합한 25 mg/kg 경비(NG) 투여 후의 미글루스타트 혈장 농도는 74.5시간(최종 측정 시점)까지 측정 가능하였다. 단일 투여량(1일차) 및 반복 투여(85일차)의 독성동태학 파라미터가 표 10에 제시되어 있다.

t_max는 투여 후 대략 2 내지 4시간의 범위였다. 25 내지 175 mg/kg 투여량 수준의 투여에 의해, 미글루스타트 노출이 증가하였다. 평균 t_1/2(수컷 및 암컷 조합)는 1일차 및 85일차에 일관되었고, 6.66 내지 8.23시간의 범위였다. 격주마다 1회씩 반복하여 NG 투여된 경우, 축적이 거의 내지 전혀 관찰되지 않았다. 전체 미글루스타트 노출(즉, AUC₀ _- _t) 또는 TK 파라미터에 대한 ATB200 공동 투여의 관찰 가능한 효과는 존재하지 않았다.

유해한 시험 품목-관련 변화가 확인되지 않았으므로, 사이노몰거스 원숭이에서, ATB200의 투여의 존재 또는 부재 하에, 13주 동안 격주마다 1회씩 경비 제공된 경우, 미글루스타트의 비-관찰-유해-효과-수준(NOAEL)은 시험된 최고 투여량인 175 mg/kg/투여량이었다. 이러한 투여량 수준에서, 85일차의 평균 성별-평균값 AUC₀ _-t 및 C_max는 미글루스타트 단독의 경우, 각각 204000 hr·ng/mL 및 14700 ng/mL였고, 100 mg/kg ATB200과 조합된 경우, 각각 216000 hr·ng/mL 및 22000 ng/mL였다.

실시예 14 : 단독 투여된 경우 및 미글루스타트와 공동 투여된 경우의 재조합 산 α - 글루코시다제(ATB200)의 임상 연구를 위한 프로토콜

연구 설계:

이는 정맥내(IV) 재조합 산 α-글루코시다제(ATB200, 주사용 멸균수에 의해 재구성되고, 주사용 0.9% 염화나트륨에 의해 희석된 동결건조 분말) 단독의 경우 및 경구 미글루스타트(경질 젤라틴 캡슐, 65 mg)와 공동 투여된 경우의 안전성, 내성, 및 약동학(PK)을 평가하기 위한 공개-표지 일정-순서 상승-투여량의 최초 인체 연구이다. 연구는 2기로 수행된다. 1기에는, 순차적인 단일 상승 투여량의 ATB200을 3회의 투여 기간 동안 5, 10, 및 20 mg/kg으로 대략 4시간의 정맥내 주입으로서, 2주마다 투여한 후, 안전성, 내성, 및 PK를 평가한다. 2기에는, 단일- 및 다회-상승 투여량 조합으로서, 3회의 투여량 동안 ATB200의 대략 4시간의 정맥내 주입 전 1시간 전에 130 mg 미글루스타트(2개의 65 mg 캡슐)를 경구 투여하고, 20 mg/kg ATB200을 2주마다 공동 투여한 다음, 3회의 투여량 동안 ATB200의 대략 4시간의 정맥내 주입 전 1시간 전에 260 mg 미글루스타트(4개의 65 mg 캡슐)를 경구 투여하고, 20 mg/kg ATB200을 공동 투여한 후, 안전성, 내성, 및 PK를 평가한다.

효소 대체 요법(ERT)을 체험한 12명의 폼페병이 있는 대상체(대략 보행가능 6명 및 보행불가능 6명)를 1기에 등록시킨다. 이들 동 대상체는 2기의 연구에 계속된다. 보행불가능한 대상체의 등록 전에, 적어도 4명의 보행가능한 대상체를 등록시키고, 투여를 진행한다. ERT-체험(보행가능) 대상체는 등록 전에 2 내지 6년 동안 ERT를 받았고, 6-분 보행 시험(6MWT)에서 적어도 200 미터 보행이 가능하며, 예측된 정상 값의 30 내지 80%의 FVC를 갖는 자로서 규정된다. ERT-체험(보행불가능) 대상체는 전적으로 휠체어 의존적이고, 보조없이 보행이 불가능하며, 등록 전에 2년 이상 동안 ERT를 받은 적이 있는 자로서 규정된다. 처리 배정은 표 11에 제시되어 있다.

대상체는 미글루스타트의 적어도 경구 투여 적어도 2시간 전부터 투여 2시간 후까지 금식해야 한다. ATB200의 IV 주입은 미글루스타트의 경구 투여 1시간 후에 개시되어야 한다.

연구 절차

본 연구는 스크리닝, 기준일, 1기(3-기간, 일정-순서, 단일-상승-투여량의 ATB200 단독), 및 2기(2-기간, 일정-순서, 다회-투여량의 20 mg/kg ATB200과 다회-상승-투여량의 미글루스타트의 공동 투여)로 구성된다.

스크리닝:

전 대상체는 정보에 근거한 동의서를 제공하며, 적격성 기준에 대해 검토된다. 전 대상체의 평가는 이전 주입-관련 반응(IAR) 및 병례 이력을 포함하는 의학적 이력; 이전 및 병용 의약품 검토 및 약제 외 요법; 생명 징후(심박수[HR], 호흡률[RR], 혈압[BP], 및 온도); 신장; 중량; 정밀 신체 검사(PE); 12-유도 심전도(ECG); 임상 안전성 실험 평가(혈청 화학, 혈액학 및 소변검사); 소변 임신 검사; 6탄당 사당류(Hex4)용 소변 샘플; 및 GAA 유전자형 분석(스크리닝시 GAA 유전자형 분석 기록의 제공이 불가능한 대상체의 경우)을 포함한다. 또한, 필요한 경우, 면역원성(총 및 중화 항체, 연구 사이토카인/면역계 활성의 다른 바이오마커, 알글루코시다제 알파에 대한 교차 반응성, 및 면역글로불린 E[IgE]) 평가 연구용 혈액 샘플을 얻는다. 전 포함 기준을 충족하고, 배제 기준에 해당 사항이 없는 대상체는 표 11에 기재된 바와 같이, 1기에 배정된다.

기준일:

전 대상체에 대한 안전성 평가는 전 대상체에 대한 적격성 기준 검토; 주입 관련 반응(IAR) 및 병례 이력을 포함하는 의학적 이력, 부작용(AE) 및 중증 AE(SAE)의 조사, 이전 및 병용 의약품 검토 및 약제 외 요법; 생명 징후(HR, RR, BP, 및 온도); 중량; 간소한 PE; ECG; 래쉬-빌트 폼페-특이적 활성(Rasch-built Pompe-specific activity)(R-PAct) 척도; 로테르담 핸디캡 척도; 및 피로 중증도 척도; 임상 안전성 실험 평가(혈청 화학, 혈액학 및 소변검사); 소변 임신 검사; 약역학(PD) 평가(Hex4 및 크레아티닌 포스포키나제[CPK]); 면역원성 평가(총 및 중화 항체, 알글루코시다제 알파와의 항체 교차 반응성, 연구 사이토카인 및 면역계 활성의 다른 바이오마커, 알글루코시다제 알파에 대한 교차 반응성, 및 필요한 경우, IgE); 폐 기능 검사(PFT); 운동 기능 시험; 및 근력 시험을 포함한다.

1기, 기간 1, 2, 및 3 :

이 시기는 다음을 포함한다:

· 안전성: 중증 부작용(SAE) 및 IAR을 포함하는 AE의 검토; 병용 의약품 검토 및 약제 외 요법; 생명 징후(HR, RR, BP, 및 온도); 간소한 PE; ECG; 임상 안전성 실험 평가(혈청 화학, 혈액학 및 소변검사); 및 소변 임신 검사

· PD: 소변 Hex4 및 혈청 CPK

· 면역학: 항-재조합 산 α-글루코시다제 항체 역가(항-재조합 산 α-글루코시다제 총 및 중화 항체 역가 및 알글루코시다제 알파와의 항체 교차 반응성)용 혈액 샘플 및 염증전 사이토카인 및 면역계 활성의 다른 바이오마커의 측정용 혈액 샘플. 필요한 경우, IgE 측정을 또한 수행한다.

· 연속 24-시간 약동학(PK): 기간 1(3회차 방문, 1일차), 기간 2(4회차 방문, 15일차), 및 기간 3(5회차 방문, 29일차) 동안, 혈장 산 α-글루코시다제 활성 수준 및 총 산 α-글루코시다제 단백질 농도용 혈액 샘플링을 전 대상체에서 채혈한다.

2기, 기간 4 및 5:

· 안전성: SAE 및 IAR을 포함하는 AE의 검토; 병용 의약품 검토 및 약제 외 요법; 생명 징후(HR, RR, BP, 및 온도); 중량; PE; ECG; 임상 안전성 실험 평가(혈청 화학, 혈액학 및 소변검사); 및 소변 임신 검사

· PD: 소변 Hex4 및 혈청 CPK

· 면역학: 항-재조합 산 α-글루코시다제 항체 역가(항-재조합 산 α-글루코시다제 총 및 중화 항체 역가, 및 알글루코시다제 알파와의 항체 교차 반응성)용 혈액 샘플 및 염증전 사이토카인 및 면역계 활성의 다른 바이오마커의 측정용 혈액 샘플. 필요한 경우, IgE 측정을 또한 수행한다.

· 연속 24-시간 PK: 기간 4(6회차 방문, 43일차 및 8회차 방문, 71일차) 및 기간 5(9회차 방문, 85일차 및 11회차 방문, 113일차) 동안, 혈장 산 α-글루코시다제 활성 수준, 총 산 α-글루코시다제 단백질 농도, 및 미글루스타트 농도용 혈액 샘플링을 전 대상체에서 채혈한다.

약동학적 단계의 종결:

· PD: 소변 Hex4 및 혈청 CPK

연구 조기 철회 대상체는 조기 종결 방문을 위해, 내방할 것이며, PK 방문의 종결시 수행되어야 하는 모든 평가를 받는다. 연구 약제는 투여되지 않는다. 임의의 센티넬 대상체(sentinel subject)가 연구를 조기 철회한 경우, 이 대상체는 연구에 등록된 다음의 보행가능한 대상체에 의해 대체된다(예를 들어, 대상체 1이 철회한 경우, 대상체 3[보행가능]이 센티넬 대상체로서 그 대상체를 대체함).

이 연구를 완료한 대상체 및/또는 적격 대상인 다른 대상체는 장기간의 연장 연구에 참여할 기회가 제공되며, ATB200과 미글루스타트의 공동 투여의 안전성 및 내성에 대해 계속하여 평가된다. 추가로, 연장 연구에서, 폼페병 관련 기능 평가가 정기적 간격으로 수행된다.

안전성 모니터링

의료 모니터링 요원 및 조사자는 안전성 운영위원회(SSC)에 의한 지속적 기준 및 정기적 기준에 관한 안전성을 모니터링한다.

센티넬 투여

본 연구의 제1의 2명의 보행가능한 대상체는 연구의 센티넬 대상체이며, 각각의 연구 기간(기간 1 내지 5)에 투여되는 제1의 2명의 대상체이다. 센티넬 대상체가 연구를 조기 철회한 경우, 이 대상체는 또 다른 보행가능한 대상체에 의해 대체된다. 주의: 보행불가능한 임의의 대상체가 투여 가능하기 전에, 적어도 4명의 보행가능한 대상체에 5 mg/kg ATB200을 투여한다.

1기(기간 1, 2, 및 3)에, 대상체에 단일 상승 투여량의 ATB200(5 mg/kg[기간 1], 10 mg/kg[기간 2], 및 20 mg/kg[기간 3])을 투여한다.

1기의 각각의 연구 기간의 2명의 센티넬 대상체에의 투여 후, 의료 모니터링 요원 및 조사자는 24 내지 48시간 이내에, 이용 가능한 안전성 데이터(PE, 생명 징후, AE, 주입 반응, ECG, 및 이용 가능성 국부 수행 실험 검사)의 평가를 수행한다. 2명의 센티넬 대상체 모두에서 각각의 투여량 수준의 중추 안전성 실험 데이터가 이용 가능한 경우, 정규 안전성 검토를 위해, SSC가 소집된다. SSC가, 그 기간에 배정된 투여량의 투여를 배제할 안전성 문제가 없다고 결정한 경우, 추가의 10명의 대상체를 등록시키고, 투여를 진행한다. 모두 3회의 1기 투여량 수준에서 전 대상체의 안전성 데이터(중추 실험 안전성 데이터 포함)가 이용 가능한 경우, 안전성 검토를 위해, SSC가 또한 소집된다.

2기(기간 4 및 5)에, 2명의 센티넬 대상체에 투여하고, 1기의 각 기간에 대한 것과 마찬가지로, 제1 투여 후, 안전성을 평가한다. SSC가, 20 mg/kg ATB200과 130 mg 미글루스타트의 공동 투여(기간 4) 또는 20 mg/kg ATB200과 260 mg 미글루스타트의 공동 투여(기간 5)의 추가 투여를 배제할 안전성 문제가 없다고 결정한 경우, 추가의 10명의 대상체에 그 기간에 배정된 투여량의 투여를 격주마다 3회 제공한다. 2기의 종결시, 전 대상체에 대해 모든 안전성 데이터(중추 안전성 실험 데이터 포함)가 이용 가능한 경우, SSC가 재소집된다. SAE 또는 안전성 문제가 확인된 경우, SSC가 또한 임시 소집된다.

SSC는 하기의 검토사항 중 임의의 것을 권고할 수 있다:

· 변형 없이 연구 지속

· 변형하여 연구 지속(수정)

· 일시적 투여 중단

· 영구적 투여 중지

SSC가, 센티넬 대상체에, 지속적 연구 투여를 배제할 AE 또는 안전성 문제가 없다는 의견을 제시한 경우, 나머지 전 대상체에서 그 투여량 수준의 투여를 지속한다. 대상체 안전성은 SSC에 의한 지속적 기준 및 정기적 간격으로 의료 모니터링 요원 및 연구 조사자에 의해 계속하여 밀착 모니터링된다.

대상체 수(예정):

ERT를 체험한 12명의 폼페병이 있는 성인 대상체(대략 보행가능 6명 및 보행불가능 6명)를 1기에 등록시킨다. 이들 동 대상체는 2기의 연구에 계속된다.

진단 및 적격성 기준:

스크리닝 방문시, 하기에 개괄적으로 제시된 적격성 기준을 사용하여, ERT를 체험한 폼페병이 있는 성인 대상체를 평가한다. 각각의 대상체는 모든 포함 기준을 충족하여야 하며, 배제 기준에 해당 사항이 없어야 한다. 포함/배제 기준의 면제는 허용되지 않는다.

포함 기준

ERT-체험 대상체(보행가능)

1. 18세 이상 65세 이하의 남성 및 여성 대상체;

2. 대상체는 임의의 연구 관련 절차 전에 정보에 근거한 서명 동의서를 제공하여야 한다;

3. 출산 가능한 대상체는 연구 동안 및 ATB200 + 미글루스타트의 최종 공동 투여 후 30일 동안 의학적으로 허용되는 피임법을 사용할 것에 동의하여야 한다;

4. 대상체는 GAA 유전자형 분석에 의하거나, 기록된 산 α-글루코시다제 효소 활성 결핍증을 기반으로 하여, 폼페병 진단을 받았다;

5. 대상체는 이전에 2 내지 6년 동안 알글루코시다제 알파에 의한 ERT를 받았다;

6. 대상체는 현재 격주마다 1회씩의 빈도로 알글루코시다제 알파를 받고 있다;

7. 대상체는 투여 중지를 야기하는 약제 관련 부작용 없이 최종 2회의 주입을 받고, 이를 완료하였다;

8. 대상체는 6MWT에서 200 내지 500 미터의 보행이 가능하여야 한다; 및

9. 직립 노력성폐활량(FVC)은 예측된 정상 값의 30% 내지 80%여야 한다.

ERT - 체험 대상체( 보행불가능 )

10. 18세 이상 65세 이하의 남성 및 여성 대상체;

11. 대상체는 임의의 연구 관련 절차 전에 정보에 근거한 서명 동의서를 제공하여야 한다;

12. 출산 가능한 대상체는 연구 동안 및 ATB200 + 미글루스타트의 최종 공동 투여 후 30일 동안 의학적으로 허용되는 피임법을 사용할 것에 동의하여야 한다;

13. 대상체는 GAA 유전자형 분석에 의하거나, 기록된 산 α-글루코시다제 효소 활성 결핍증을 기반으로 하여, 폼페병 진단을 받았다;

14. 대상체는 2년 이상 동안 알글루코시다제 알파에 의한 ERT를 받았다;

15. 대상체는 현재 격주마다 1회씩의 빈도로 알글루코시다제 알파를 받고 있다;

16. 대상체는 투여 중지를 야기하는 약제 관련 부작용 없이 최종 2회의 주입을 받고, 이를 완료하였다; 및

17. 대상체는 전적으로 휠체어 의존적이고, 보조없이 보행이 불가능하여야 한다.

배제 기준

ERT-체험 대상체(보행가능)

1. 대상체가 기준일 방문 전 30일 이내에 알글루코시다제 알파 이외에, 폼페병에 대한 임의의 시험 요법을 받았거나, 연구 동안 그러한 요법에 참여하였다;

2. 대상체가 기준일 방문 30일 이내에 금지 의약품(미글리톨(예를 들어, Glyset®); 미글루스타트(예를 들어, Zavesca®); 아카보스(예를 들어, Precose®, Glucobay®); 보글리보스(예를 들어, Volix®, Vocarb®, 및 Volibo®); 알부테롤 및 클렌부테롤; 또는 임의의 연구/실험 약제)에 의해 치료받은 적이 있다;

3. 여성인 경우, 대상체가 스크리닝시 임신 중이거나, 수유 중이다;

4. 남성이든 또는 여성이든 상관없이, 대상체가 연구 동안 자녀 계획이 있다;

5. 대상체가 침습적 환기 보조기가 필요하다;

6. 대상체가 깨어있는 동안 하루에 6시간 이상 비침습적 환기 보조기를 사용한다;

7. 대상체가, 조사자의 의견상, 대상체에 과도한 안전성 위험이 제기될 수 있거나, 프로토콜 필요조건을 준수할 능력을 손상시킬 수 있는 의학적 또는 임의의 다른 참작 상태 또는 상황에 있다;

8. 대상체가 알글루코시다제 알파에 대한 아나필락시스 이력이 있다;

9. 대상체가 항-재조합 산 α-글루코시다제 항체 역가가 높게 유지된 이력이 있다;

10. 대상체가 미글루스타트 또는 다른 이미노당(iminosugar)에 대해 알러지 또는 민감성 이력이 있다;

11. 대상체가 루푸스, 자가면역 갑상선염, 경피증, 또는 류머티스성 관절염을 포함하여, 자가면역 질병 이력 기록이 있다; 및

12. 대상체가 기관지 천식 이력 기록이 있다.

ERT-체험 대상체(보행불가능)

13. 대상체가 기준일 방문 전 30일 이내에 알글루코시다제 알파 이외에, 폼페병에 대한 임의의 시험 요법을 받았거나, 연구 동안 그러한 요법에 참여하였다;

14. 대상체가 기준일 방문 30일 이내에 금지 의약품(미글리톨(예를 들어, Glyset^®); 미글루스타트(예를 들어, Zavesca^®); 아카보스(예를 들어, Precose^®, Glucobay^®); 보글리보스(예를 들어, Volix^®, Vocarb^®, 및 Volibo^®); 알부테롤 및 클렌부테롤; 또는 임의의 연구/실험 약제)에 의해 치료받은 적이 있다;

15. 여성인 경우, 대상체가 스크리닝시 임신 중이거나, 수유 중이다;

16. 남성이든 또는 여성이든 상관없이, 대상체가 연구 동안 자녀 계획이 있다;

17. 대상체가, 조사자의 의견상, 대상체에 과도한 안전성 위험이 제기될 수 있거나, 프로토콜 필요조건을 준수할 능력을 손상시킬 수 있는 의학적 또는 임의의 다른 참작 상태 또는 상황에 있다;

18. 대상체가 알글루코시다제 알파에 대한 아나필락시스 이력이 있다;

19. 대상체가 항-재조합 산 α-글루코시다제 항체 역가가 높게 유지된 이력이 있다;

20. 대상체가 미글루스타트 또는 다른 이미노당에 대해 알러지 또는 민감성 이력이 있다;

21. 대상체가 루푸스, 자가면역 갑상선염, 경피증, 또는 류머티스성 관절염을 포함하여, 자가면역 질병 이력 기록이 있다; 및

22. 대상체가 기관지 천식 이력 기록이 있다.

시험 제품 , 투여량 및 투여 방식:

1기(2주 간격의 3기의 투여 기간으로 구성됨)

· 기간 1: 5 mg/kg ATB200의 단일-투여량 IV 주입;

· 기간 2: 기간 1이 완료된 전 대상체에 10 mg/kg ATB200의 단일-투여량 IV 주입; 및

· 기간 3: 기간 2가 완료된 전 대상체에 20 mg/kg ATB200의 단일-투여량 IV 주입.

2기(2기의 투여 기간으로 구성됨, 각각 2주의 간격으로 3회의 연구 약제 투여량을 포함함)

· 기간 4: 기간 3이 완료된 전 대상체에 20 mg/kg ATB200의 단일 투여량 IV 주입 전 1시간 전에 130 mg의 미글루스타트를 경구 투여한다(총 3회의 투여 동안 매 2주마다 반복됨); 및

· 기간 5: 기간 4가 완료된 전체 ERT-체험 대상체에 20 mg/kg ATB200의 단일 투여량 IV 주입 전 1시간 전에, 260 mg의 미글루스타트를 경구 투여한다(총 3회의 투여 동안 매 2주마다 반복됨).

주의: 대상체는 미글루스타트의 적어도 경구 투여 2시간 전부터 투여 2시간 후까지 금식해야 한다.

총 연구 지속기간: 최대 22주(최대 4주의 스크리닝 기간 후 대략 18주의 연구 처리[1기 및 2기])

단일- 투여량 PK 관찰 지속기간(1기, 기간 1, 2, 및 3): 6주

다회 - 투여량 PK 관찰 지속기간(2기, 기간 4 및 5): 12주

안전성, 내성, 및 면역원성 관찰 지속기간(기간 1, 2, 3, 4, 및 5): 18주

평가 기준:

1차:

안전성 평가:

· PE

· 체온, RR, HR, 및 BP를 포함하는 생명 징후

· IAR를 포함하는 AE

· 12-유도 ECG

· 임상 안전성 실험 평가: 혈청 화학, 혈액학 및 소변검사

혈장 ATB200 및 미글루스타트의 PK:

· 혈장 산 α-글루코시다제 활성 수준 및 총 산 α-글루코시다제 단백질 농도 PK 파라미터: 최대 관찰 혈장 농도(C_max), 최대 관찰 혈장 농도에 도달하는 시간(t_max), 0시간으로부터 측정 가능한 최종 농도의 시간까지의 혈장-약제 농도 시간 곡선 하 면적(AUC₀ _-t), 0시간으로부터 무한대까지 추산된 혈장-약제 농도 시간 곡선 하 면적(AUC₀ _-∞), 반감기(t_½), 및 IV 투여 후 총 배출률(CL_T)

· 모든 투여 요법의 혈장 산 α-글루코시다제 활성 및 총 산 α-글루코시다제 단백질 C_max 및 AUC_0-∞의 비율

· 각각의 투여량 수준의 혈장 미글루스타트 PK 파라미터: C_max, t_max, AUC₀ _- _t, AUC_0-∞, 및 t_½, 경구 투여 후 약제의 총 겉보기 배출률(CL_T/F), 및 경구 투여 후 최종 단계 분포 용적(Vz/F)

· 각각의 투여량 수준의 혈장 미글루스타트 C_max 및 AUC₀ _-∞의 비율

기능 평가(기준일에 수행됨)

보행가능한 대상체의 경우

· 운동 기능 시험

· 6분 보행 시험(6MWT)

· 10-미터 보행 시험

· 보행, 계단 오르기, 고워(Gower), 및 의자에서 일어서기 점수

· 일어서서 걷기 시험(Timed Up and Go)(TUG)

· 상지 및 하지 둘 모두의 근력 검사(의학 연구 기준[MRC] 및 휴대용 동력계)

· PFT(FVC, MIP, MEP, 및 SNIP)

보행불가능한 대상체의 경우

· 근력 검사 - 상지에 국한됨

· MRC 및 휴대용 동력계, 상지에 대해서만 수행됨

· 폐 기능 검사(PFT)(노력성폐활량[FVC], 최대 흡기 압력[MIP], 최대 호기 압력[MEP], 및 비강 흡기 압력(sniff nasal inspiratory pressure)[SNIP])

환자-보고 결과(기준일에 수행됨)

· 피로 중증도 척도

· 로테르담 핸디캡 척도

· 래쉬-빌트 폼페-특이적 활성(R-PAct)

연구

· 항-ATB200 항체 역가(총 및 중화)

· 알글루코시다제 알파에 대한 항-재조합 산 α-글루코시다제 항체의 교차 반응성

· 염증전 사이토카인 및 면역계 활성의 다른 바이오마커

· PD 마커(Hex4 및 CPK)

분석 방법:

통계 방법:

PK 파라미터에 대한 기술 통계가 제공되다. 요약 통계가 PK 파라미터 이외의 모든 변수에 대해 제공된다. 5, 10, 및 20 mg/kg ATB200 단독의 경우의 산 α-글루코시다제 활성 및 총 산 α-글루코시다제 단백질 노출(C_max, AUC₀ _- _t, 및 AUC_0-∞) 비율에 대한 투여량 비례성 평가. 각 집단 및 전체 내의 20 mg/kg ATB200 단독의 경우 대 20 mg/kg ATB200 + 130 mg 미글루스타트 및 20 mg/kg ATB200 단독의 경우 대 20 mg/kg ATB200 + 260 mg 미글루스타트의 산 α-글루코시다제 활성 및 총 산 α-글루코시다제 단백질 노출(C_max, AUC_0-t, 및 AUC_0-∞) 비율에 대한 변동성 분석(ANOVA). 20 mg/kg ATB200 + 130 mg 미글루스타트 및 20 mg/kg ATB200 + 260 mg 미글루스타트에서의 보행가능한 대상체와 보행불가능한 대상체 사이의 산 α-글루코시다제 활성 및 총 산 α-글루코시다제 단백질 노출(C_max, AUC_0-t, 및 AUC_0-∞) 비율에 대한 ANOVA. 각 대상체 집단 및 전체 내의 130 mg 및 260 mg 미글루스타트 사이의 노출 비율(C_max, AUC₀ _- _t, 및 AUC₀ _-∞)에 대한 투여량 비례성 평가. PK, PD, 및 안전성에 대한 면역원성 결과의 효과가 평가된다.

중간 분석 :

적어도 50%(n=6)의 대상체가 2기 연구를 완료한 경우, 중간 분석을 수행한다. 최대 2회의 추가적 중간 분석을 연구 중 수행할 수 있다.

초기 PK 결과 :

대상체에 대한 GAA 활성 및 GAA 총 단백질의 PK 요약이 각각 표 12 및 13에 제시되어 있다.

표 12 내지 표 15 및 도 24 내지 도 26에서, 미글루스타트 및 ATB200의 단일 투여 후, 단일 투여량(SD) 측정을 수행하였고, 미글루스타트 및 ATB200의 제3 격주 투여 후, 다회 투여량(MD) 측정을 수행하였다.

도 24a는 5 mg/kg, 10 mg/kg 및 20 mg/kg ATB200의 투여 후 평균 혈장 GAA 활성의 농도-시간 프로파일을 도시한다. 도 24b는 또한 5 mg/kg, 10 mg/kg 및 20 mg/kg ATB200의 투여 후 평균 혈장 GAA 활성의 농도-시간 프로파일을 제공하나, 혈장 GAA 활성은 로그 척도로 표시된다. 도 24a 및 도 24b 및 표 12로부터 인식될 수 있는 바와 같이, ATB200은 혈장 GAA 활성의 투여량 비례 노출보다 다소 더 큰 것으로 나타났다.

도 24c는 20 mg/kg ATB200 단독의 경우뿐만 아니라, 20 mg/kg의 ATB200 및 130 또는 260 mg의 미글루스타트의 투여 후 평균 혈장 GAA 활성의 농도-시간 프로파일을 도시한다. 도 24d는 또한 130 mg 미글루스타트 또는 260 mg 미글루스타트와 함께, 20 mg/kg ATB200의 단독 투여 후 평균 혈장 GAA 활성을 제공하나, 혈장 GAA 활성은 로그 척도로 표시된다.

도 25a는 5 mg/kg, 10 mg/kg 및 20 mg/kg ATB200의 투여 후 평균 혈장 GAA 총 단백질의 농도-시간 프로파일을 도시한다. 도 25b는 또한 5 mg/kg, 10 mg/kg 및 20 mg/kg ATB200의 투여 후 평균 혈장 GAA 총 단백질의 농도-시간 프로파일을 제공하나, 혈장 GAA 총 단백질은 로그 척도로 표시된다. 도 25a 및 도 25b 및 표 13으로부터 인식될 수 있는 바와 같이, ATB200은 혈장 GAA 총 단백질의 투여량 비례 노출보다 다소 더 큰 것으로 나타났다.

도 25c는 20 mg/kg ATB200 단독, 20 mg/kg의 ATB200 및 130 mg의 미글루스타트, 및 20 mg/kg의 ATB200 및 260 mg의 미글루스타트의 투여 후 평균 혈장 GAA 총 단백질의 농도-시간 프로파일을 도시한다. 도 25d 또한 130 mg 미글루스타트 또는 260 mg 미글루스타트와 함께 20 mg/kg ATB200의 단독 투여 후 평균 혈장 GAA 총 단백질을 제공하나, 혈장 GAA 총 단백질은 로그 척도로 표시된다.

표 13에 제시된 바와 같이, 미글루스타트의 공동 투여는 ATB200이 단독 투여된 경우에 대비하여, 총 GAA 단백질 혈장 반감기를 대략 30%만큼 증가시켰다. 모든 처리의 경우, 분포 용적은 3.5 내지 5.7 L의 범위였으며, 이는, ATB200의 글리코실화는 ATB200이 조직으로 효율적으로 분포될 수 있도록 함을 시사한다.

미글루스타트의 PK 요약이 표 14에 제시되어 있다.

도 26은 인간 대상체에서 130 mg 또는 260 mg의 미글루스타트의 투여 후 혈장 중 미글루스타트의 농도-시간 프로파일을 도시한다.

표 14 및 도 26으로부터 인식될 수 있는 바와 같이, ATB200 주입 전 1시간 전에 경구 투여된 혈장 미글루스타트는 주입 2시간만에 피크 농도에 도달하였으며, 이에 의해, 투여량-비례 속도론이 입증된다.

부분적 AUC를 결정하기 위해, GAA 활성 및 총 단백질에 대한 혈장 농도 곡선의 다수의 일부분에 대한 분석을 수행하였다. 표 15는 GAA 활성 및 총 단백질에 대한 0-t_max, t_max-6h, t_max-10h, t_max-12h 및 t_max-24hr으로부터의 부분적 AUC의 요약을 제공한다.

표 15로부터 인식될 수 있는 바와 같이, 20 mg/kg ATB200 단독의 경우에 대비하여, 20 mg/kg + 미글루스타트에서의 pAUCt_max _-24h의 GAA 활성 퍼센트 평균의 증가는 130 mg SD, 130 mg MD, 및 260 mg SD의 경우, 각각 21.4%, 17.8%, 40.2%였다.

유사하게는, 20 mg/kg ATB200 단독의 경우에 대비하여, 20 mg/kg + 미글루스타트에서의 pAUCt_max _-24h의 GAA 총 단백질 퍼센트 평균의 증가는 130 mg SD, 130 mg MD, 및 260 mg SD의 경우, 각각 12.5%, 16.4%, 37.5%였다.

따라서, 부분적 AUC 분석은, 미글루스타트의 공동 투여가 ATB200의 최종 단계의 부분적 AUC(t_max-24h)를 유의하게 증가시킴을 나타내며, 130 mg의 미글루스타트의 투여의 경우, 대략 15%이고, 260 mg의 미글루스타트의 경우, 대략 40%였다.

초기 바이오마커 결과

루미자임®을 ATB200으로 교체한 인간 환자에서, 알라닌 아미노기 전달효소(ALT), 아스파르트산염 아미노기 전달효소(AST) 및 크레아틴 포스포키나제(CPK)의 수준을 모니터링하였다. 환자에 상승 투여량의 ATB200(5, 10 및 20 mg/kg)을 제공한 다음, ATB200(20 mg/kg) 및 미글루스타트(130 및 260 mg)를 공동 투여하였다. 고수준의 CPK 효소는 근육 조직, 심장 또는 뇌의 손상 또는 스트레스를 나타낼 수 있다. 증가된 ALT 및 AST는 각각 폼페병으로부터의 간 및 근육 손상의 마커이다. ALT, AST 및 CPK 수준의 초기 분석이 도 38 내지 도 41에 도시되어 있다.

도 38 내지 도 41로부터 인식될 수 있는 바와 같이, 2명의 환자는 3개의 모든 바이오마커에서 초기 개선 경향을 나타내었으며, 2명의 환자는 안정하게 유지되었다. 1명의 환자는 CPK, AST 및 ALT에서 각각 44%, 28% 및 34%만큼 감소하였다. 또 다른 환자는 CPK, AST 및 ALT에서 각각 31%, 22% 및 11%만큼 감소하였다.

따라서, 지금까지 중증 부작용(SAE)은 없었다. AE는 일반적으로 경미하고, 일시적이었다. 전 등록 환자에서 100+ 주입 후, 현재까지 주입-관련 반응은 없었다. 모든 환자는 기준일에 항-rhGAA 항체를 가졌으며, 일반적으로 안정하게 유지되었다. 사이토카인은 주입 동안 낮고 안정하게 유지되었다.

실시예 15 : 야생형 및 폼페 섬유아세포의 GAA 및 LAMP1 수준

면역형광 현미경을 사용하여, 공통의 스플라이싱 돌연변이(splicing mutation)를 갖는 야생형 섬유아세포 및 폼페 섬유아세포에서 GAA 및 LAMP1 수준을 검출하였다. 도 27에 도시된 바와 같이, GAA는 야생형 섬유아세포에서 별도의 리소좀 구획에 존재한다. 도 27은 또한 폼페 섬유아세포에서의 다량의 GAA 신호, 및 폼페 섬유아세포의 GAA 및 LAMP1 신호 둘 모두가 원위 리소좀이 아닌 ER 및 골지에 위치하는 것으로 나타남을 도시한다. 이는 폼페 섬유아세포에서의 변이된 GAA 단백질 수송의 증거이다.

실시예 16: Gaa - 녹아웃 마우스에서 세포 기능이상 및 근육 기능의 개선

GAA 결핍증으로 인한 리소좀 글리코겐 대사의 손상이 실질적인 세포 기능이상을 야기하는 것으로 나타났으며, 이는 축적된 글리코겐으로 채원진 막-결합 세포내 구획의 확연하고, 지속적인 자식작용 및 증식 및 축적에 의해 입증되는 바와 같다(문헌[N. Raben et al.]). 본 발명자들의 면역조직학적 데이터는, 다이스페린과 같은 근육 치유에 포함되는 단백질뿐만 아니라, 디스트로핀, a- 및 β-디스트로글리칸, 다양한 사르코글리칸 및 디스트로핀 당단백질 복합체를 포함하는 다른 것들과 같은, 근육 막 안정성에 필수적인 수개의 주요 단백질을 포함하는 다수의 단백질에서 단백질 수송이 유의하게 변이됨을 시사한다. 이들 주요 근육 단백질은, 이들이 기능하는 근육 세포막으로 적절하게 단백질이 수송될 필요가 있다. 도 28에 도시된 바와 같이, 본 발명자들의 면역조직학적 데이터에 의해, 이들 주요 근육 단백질 중 상당한 분획이 폼페병의 Gaa 녹아웃(KO) 마우스 모델의 근육에서 세포내 위치화되는 것으로 밝혀졌다. 이들 데이터는, 이들 주요 근육 단백질의 수송 오류가 가성-근육 근이영양증(pseudo-muscular dystrophy)을 유도할 수 있으며, 결국 근육 약화 및 파손으로 이어질 수 있음을 시사한다.

10 mg/kg 미글루스타트의 존재 및 부재하의 알글루코시다제 알파(마이오자임®) 및 ATB200을 매격주 투여 일정을 통해, 균등한 ERT 투여량(20 mg/kg)에서 Gaa KO 마우스에서 평가하였다. 2회의 투여 후, 알글루코시다제 알파는, 비히클-처리 마우스와 비교하여, 골격근에서 축적된 리소좀 글리코겐을 완만하게 감소시켰으며(도 32a 내지 도 32c), 자식작용(도 30a 및 도 30b) 또는 리소좀 증식(도 29a 및 도 29b)을 감소시키는 효과는 무시해도 될 만큼 미세하였다. 이와 달리, 동일한 조건 하의 ATB200/미글루스타트의 경우, 실질적으로 더 양호한 리소좀 글리코겐 배출률이 관찰되었다(도 32a 내지 도 32d). ATB200/미글루스타트는 또한 전체 근육 생리학을 개선하는 것으로 나타났으며, 이는 감소된 LC3 II 수준(도 30a 및 도 30b), LAMP1에 의해 염색된 축적된 세포내 소포의 잘 확립된 자식작용 바이오마커 및 배출률(도 29a 및 도 29b), 근육 치유에 포함되는 인식된 세포 표면 단백질인 인식된 상주하는 리소좀 내재 막 단백질 및 다이스페린(도 31a 및 도 31b)에 의해 입증된 바와 같다. 추가로, ATB200/미글루스타트는 야생형 마우스의 근섬유와 유사한 근육 구조물을 유의하게 개선하였다.

또한, 도 29 내지 도 32는, 2개의 상이한 배치의 ATB200(초기 및 후기 생성 제조 공정)이 근사한 결과를 생성하였음을 도시한다. 도 32a 내지 도 32d에서, ^*는 마이오자임® 단독의 경우와 비교하여, 통계적으로 유의함을 나타낸다.

실시예 17: Gaa - 녹아웃 마우스에서의 근육의 기능

12회의 격주 투여의 더 장기간의 연구에서, 20 mg/kg ATB200 + 10 mg/kg 미글루스타트는 Gaa KO 마우스에서 기준일로부터 기능성 근력을 지속적으로 증가시켰으며, 이는 악력 및 와이어 매달리기 시험 둘 모두에 의해 측정되는 바와 같다(도 33a 및 도 33b). 동일한 ERT 투여량(20 mg/kg)이 제공된 알글루코시다제 알파(루미자임®)-처리 마우스는 대부분의 연구 전반에 걸쳐, 동일한 조건 하에서 저하하는 것으로 관찰되었다(도 33a 및 도 33b). 더 단기간의 연구에 의한 바와 같이, ATB200/미글루스타트는 3 개월(도 34a 내지 도 34c) 및 6 개월(도 34d 내지 도 34g)의 처리 후, 알글루코시다제 알파보다 실질적으로 더 양호한 글리코겐 배출률을 나타내었다. ATB200/미글루스타트는 또한 3 개월의 처리(도 35) 후, 알글루코시다제 알파와 비교하여, LAMP1 및 다이스페린의 자식작용 및 세포내 축적을 감소시켰다. 도 33a에서, ^*는 루미자임® 단독의 경우와 비교하여, 통계적으로 유의함을 나타낸다(p<0.05, 2-면 t-검정). 도 34a 내지 도 34g에서, ^*는 루미자임® 단독의 경우와 비교하여, 통계적으로 유의함을 나타낸다(p<0.05, 1-방 ANOVA 분석 하에 Dunnett 방법을 사용한 다중 비교).

종합하자면, 이들 데이터는, ATB200/미글루스타트가 세포 기능이상을 역전시키고, 근육 기능을 개선하기 위해, 근육으로 효율적으로 표적화됨을 시사한다. 중요하게는, 근육 구조물의 명백한 개선 및 LAMP1 및 다이스페린의 감소된 자식작용 및 세포내 축적은 기능성 근력의 개선과 연관된 개선된 근육 생리학의 좋은 대용물이 될 수 있다. 이들 결과는, 자식작용 및 이들 주요 근육 단백질의 모니터링이, Gaa KO 마우스에서 폼페병의 치료적 처리로서의 유효성을 평가하기 위한 합리적이고, 실용적인 방법이 될 수 있음을 시사하며, 이는 임상 연구의 근육 생검에서 유용한 바이오마커라고 할 수 있다.

도 40은, 미글루스타트의 존재 또는 부재 하에, 6개월의 ATB200의 투여가 Gaa KO 마우스에서 디스트로핀의 세포내 축적을 저하시킴을 도시한다. ATB200 ± 미글루스타트의 경우, 루미자임®에 의한 경우보다 디스트로핀 축적이 더 크게 감소하였다.

실시예 18: Gaa - 녹아웃 마우스에서 ATB200에 대한 시알산 함량의 효과

시알산 함량이 상이한 2개의 배치의 ATB200을 Gaa KO 마우스에서 약동학 및 효능에 대해 평가하였다. 표 16은 2개의 배치의 특징의 요약을 제공한다.

표 16으로부터 인식될 수 있는 바와 같이, 배치 B는 배치 A보다 시알산 함량이 더 높았으나, M6P 함량은 배치 A보다 다소 더 적었다.

도 36은 Gaa KO 마우스에서 ATB200의 단일 IV 볼루스 투여 후, 혈장 중 GAA 활성의 농도-시간 프로파일을 도시한다. 배치 A 및 B의 반감기가 하기의 표 17에 제공된다.

표 17로부터 인식될 수 있는 바와 같이, 배치 B는 배치 A보다 반감기가 더 적았다. 반감기의 저하가 완만할지라도, 이러한 반감기의 저하는 통계적으로 유의한 것이다(p<0.05, 2-면 t-검정).

관련 연구에서, ATB200(배치 A 및 B) 및 루미자임®의 IV 볼루스 꼬리 정맥 주사를 총 2회의 주사 동안 Gaa KO 마우스에 격주마다 제공하였다. 최종 투여 14일 후에 조직 내 글리코겐 수준을 측정하였다. 도 37a 내지 도 37d에 도시된 바와 같이, 배치 B는 일반적으로, 유사한 투여량에서 배치 A보다 글리코겐의 감소에 더욱 효과적이었다. 배치 A 및 배치 B는 둘 모두 글리코겐의 감소에 대해 루미자임®보다 더 월등하였다. 도 37a 내지 도 37d에서, ^*는 루미자임®과 비교하여, 통계적으로 유의함을 나타내고(p<0.05, t-검정), ^∧는 동일한 투여량에서 배치 A 및 배치 B의 통계적으로 유의한 비교를 나타낸다(p<0.05, t-검정).

본 명세서에 기재된 구현예는 본 발명의 조성물 및 방법의 예시로서 의도되며, 본 발명의 범위의 제한으로 의도되지 않는다. 기재내용 전체와 일치하고, 당업자에게 용이하게 명백한 다양한 변형 및 변경이 포함되는 것으로 의도된다. 첨부된 청구범위는 실시예에 제시된 특정 구현예에 의해 제한되어서는 안되며, 기재내용 전체에 일관되도록, 최광의로 해석되어야 한다.

그 전문의 개시내용은 모든 목적을 위해, 본 명세서에 참조로 포함되는 특허, 특허 출원, 공보물, 제품 설명서, GenBank 수탁 번호 및 프로토콜은 본 출원 전반에 걸쳐 인용된다.

SEQUENCE LISTING <110> Amicus Therapeutics, Inc. <120> AUGMENTED ACID ALPHA-GLUCOSIDASE FOR THE TREATMENT OF POMPE DISEASE <130> AT-P8500-PCT <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 952 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Val Arg His Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Val Cys 1 5 10 15 Ala Leu Val Ser Leu Ala Thr Ala Ala Leu Leu Gly His Ile Leu Leu 20 25 30 His Asp Phe Leu Leu Val Pro Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Pro Val 35 40 45 Leu Glu Glu Thr His Pro Ala His Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly 50 55 60 Pro Arg Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr 65 70 75 80 Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys 85 90 95 Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro 100 105 110 Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe 115 120 125 Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser 130 135 140 Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe 145 150 155 160 Pro Lys Asp Ile 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Gly Ala Ser Arg Pro Gly 50 55 60 Pro Arg Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr 65 70 75 80 Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys 85 90 95 Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro 100 105 110 Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe 115 120 125 Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser 130 135 140 Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe 145 150 155 160 Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu 165 170 175 Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu 180 185 190 Val Pro Leu Glu Thr Pro His Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu 195 200 205 Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val Arg Arg 210 215 220 Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe 225 230 235 240 Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr 245 250 255 Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser 260 265 270 Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly 275 280 285 Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly 290 295 300 Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val 305 310 315 320 Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile 325 330 335 Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln 340 345 350 Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly 355 360 365 Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr 370 375 380 Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val 385 390 395 400 Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe 405 410 415 Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His 420 425 430 Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser 435 440 445 Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg 450 455 460 Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile 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Val 130 135 140 His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu 145 150 155 160 Pro Phe Gly Val Ile Val His Arg Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu 165 170 175 Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu 180 185 190 Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu 195 200 205 Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn 210 215 220 Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro 225 230 235 240 Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu 245 250 255 Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu 260 265 270 Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly 275 280 285 Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr 290 295 300 Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp 305 310 315 320 Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr 325 330 335 Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr 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Claims

미글루스타트와 조합한 폼페병(Pompe disease) 치료용 재조합 산 α-글루코시다제로서, 재조합 산 α-글루코시다제는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 발현되며, 알글루코시다제 알파의, 1개 또는 2개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위의 함량과 비교하여, 1개 또는 2개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위의 증가된 함량을 포함하는, 재조합 산 α-글루코시다제.
제1항에 있어서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 5와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는, 재조합 산 α-글루코시다제.
제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 30%의 재조합 인간 산 α-글루코시다제 분자는 1개 또는 2개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 하나 이상의 N-글리칸 단위를 포함하는, 재조합 산 α-글루코시다제.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 평균적으로 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 몰당 0.5 몰 내지 7.0 몰의, 1개 또는 2개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위를 포함하는, 재조합 산 α-글루코시다제.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 평균적으로 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 몰당 적어도 2.5 몰의 만노스-6-인산염 잔기 및 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 몰당 적어도 4 몰의 시알산 잔기를 포함하는, 재조합 산 α-글루코시다제.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 7개의 잠재적 N-글리코실화 부위를 포함하고, 적어도 50%의 재조합 인간 산 α-글루코시다제 분자는 제1 부위에서 2개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위를 포함하고, 적어도 30%의 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 분자는 제2 부위에서 1개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위를 포함하고, 적어도 30%의 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 분자는 제4 부위에서 2개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위를 포함하며, 적어도 20%의 재조합 인간 산 α-글루코시다제 분자는 제4 부위에서 1개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위를 포함하는, 재조합 산 α-글루코시다제.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 중국 햄스터 난소 세포주 GA-ATB-200 또는 ATB-200-001-X5-14 또는 그의 계대배양물에 의해 생성되는, 재조합 산 α-글루코시다제.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 약 5 mg/kg 내지 약 20 mg/kg의 투여량으로 정맥내 투여되며, 미글루스타트는 약 200 mg 내지 약 600 mg의 투여량으로 경구 투여되는, 재조합 산 α-글루코시다제.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 전에 투여되는, 재조합 산 α-글루코시다제.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 약 1시간 전에 투여되는, 재조합 산 α-글루코시다제.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 약 5 mg/kg 내지 약 20 mg/kg의 투여량으로 정맥내 투여되며, 미글루스타트는 약 233 mg 내지 약 500 mg의 투여량으로 경구 투여되는, 재조합 산 α-글루코시다제.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 약 5 mg/kg 내지 약 20 mg/kg의 투여량으로 정맥내 투여되며, 미글루스타트는 약 50 mg 내지 약 200 mg의 투여량으로 경구 투여되는, 재조합 산 α-글루코시다제.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 약 20 mg/kg의 투여량으로 정맥내 투여되며, 미글루스타트는 약 260 mg의 투여량으로 경구 투여되는, 재조합 산 α-글루코시다제.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 전에 투여되는, 재조합 산 α-글루코시다제.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 약 1시간 전에 투여되는, 재조합 산 α-글루코시다제.
폼페병의 조합 요법이 필요한 환자에서의 폼페병의 조합 요법용 키트로서, 키트는 미글루스타트를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태, 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태, 및 미글루스타트를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태 및 재조합 산 α-글루코시다제를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태가 필요한 환자에 이를 투여하기 위한 설명서를 포함하며;
재조합 산 α-글루코시다제는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 발현되며, 알글루코시다제 알파의 1개 또는 2개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위의 함량과 비교하여, 1개 또는 2개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위의 증가된 함량을 포함하는, 키트.
제16항에 있어서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태는 약 5 mg/kg 내지 약 20 mg/kg의 투여량의 정맥 투여용으로 구성되고, 미글루스타트를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태는 약 200 mg 내지 약 600 mg의 투여량을 포함하며 경구 투여용으로 구성되는, 키트.
제16항 또는 제17항에 있어서, 설명서는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 약 1시간 전에 미글루스타트를 투여하기 위한 지침을 포함하는, 키트.
제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태는 약 5 mg/kg 내지 약 20 mg/kg의 투여량의 정맥 투여용으로 구성되고 미글루스타트를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태는 약 50 mg 내지 약 200 mg의 투여량을 포함하며 경구 투여용으로 구성되는, 키트.
제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태는 약 20 mg/kg의 투여량의 정맥 투여용으로 구성되고 미글루스타트를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태는 약 260 mg의 투여량을 포함하며 경구 투여용으로 구성되는, 키트.
제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 설명서는 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태의 투여 약 1시간 전에 미글루스타트를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태를 투여하기 위한 지침을 포함하는, 키트.