CN116440161A - 六氧化四砷组合物在制备用于乳腺癌的药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种包含六氧化四砷的多晶型物的组合物在制备用于乳腺癌的药物中的用途。所述组合物包含99％以上的具有下述(i)至(iii)的特性的六氧化四砷的多晶型物a；(i)单位细胞常数：α＝β＝γ＝90°，(ii)As‑O键长：(iii)O‑As‑O键角：98.36°。本发明的组合物显示出优异的抑制癌细胞的增殖及抑制癌细胞的转移的效果而能够有效地用作抗癌剂。

Description

六氧化四砷组合物在制备用于乳腺癌的药物中的用途
技术领域
本发明涉及一种包含六氧化四砷的多晶型物的组合物在制备用于乳腺癌的药物中的用途，具体地，涉及一种包含六氧化四砷的多晶型物的组合物在制备用于预防或治疗乳腺癌的药物组合物中的用途，还涉及一种包含六氧化四砷的多晶型物的组合物在制备用于抑制乳腺癌转移的药物组合物中的用途。
背景技术
癌被特定为不可抑制的细胞生长，而这种非正常的细胞生长会形成被称作肿瘤(tumor)的细胞块，从而渗透到周围的组织中，严重时还会转移到身体的其它器官。从学术角度来说也被称为新生物(neoplasia)。癌以不同程度的患病率而对身体的所有的组织及脏器产生影响。
乳腺癌(breast cancer)因经济增长所带来的生活水平的提高、饮食生活的变化和西化，生产及哺乳方法的变化等而导致其发病率逐渐增加，在女性肿瘤中占据1位(Kamangar F.，et al.，2006)。乳腺癌与在乳房中长有的阳性肿瘤不同，是会向其它器官扩散而对生命产生威胁的恶性肿瘤，从转移性乳腺癌到固体肿瘤，具有非常多样的生物学特性，因此具有多种治疗选择和预后。
最近，因根治性切除术、抗癌化学疗法及荷尔蒙疗法等的发展，使得乳腺癌的治疗效果获得了大大的提升，在没有发生腋下淋巴结转移的患者中的约25～30％，发生腋下淋巴结转移的患者中的约75～80％在10年内复发，其中的大部分因乳腺癌而导致死亡。随着乳腺癌患者的不断增加，转移性乳腺癌患者也在增加，因此对于早期乳腺癌患者进行研究的同时，对治疗这些患者的方法、预后、对此产生影响的因素等也在持续地进行研究。
因此，对于乳腺癌的治疗来说，正在持续地要求开发出一种具有优异的抗癌效果的治疗剂，而与乳腺癌是否转移无关。
此外，本发明人已经以下述技术特征获得了韩国授权专利号为第272835号的专利。所述技术特征为，通过提纯技术从含有砷的自然产砷石中精制出的六氧化四砷在动物实验中显示出了抑制癌转移的效果，并且在对子宫癌、膀胱癌、肺癌、上颌窦癌、肾癌等晚期癌症患者进行给药时，具有优异的抗癌治疗效果。
本发明人通过对砷的持续地进行研究的结果为，发现了采用与上述授权专利中所公开的方法不同的新型制备方法能够制备出含有99％以上的六氧化四砷的多晶型物a，而包含这种六氧化四砷的组合物尤其是在预防或治疗乳腺癌方面具有显著的效果，从而完成了本发明。
现有技术文献
专利文献
(专利文献0001)韩国授权专利第272835号(天然化学物质六氧化四砷作为新型抗肿瘤治疗剂的用途及其药物组合物，2000.08.30.授权)。
非专利文献
(非专利文献0001)Kamangar F.，et al.，Patterns of cancer incidence，mortality，and prevalence across five continents：defining priorities to reducecancer disparities in different geographic regions of the world，J.Clin.Oncol.，24，2137-2150，2006。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种包含六氧化四砷的多晶型物的组合物在制备用于预防或治疗乳腺癌的药物组合物中的用途。
本发明的另一目的在于，提供一种包含六氧化四砷的多晶型物的组合物在制备用于抑制乳腺癌转移的药物组合物中的用途。
本发明的又一目的在于，提供一种包含六氧化四砷(As4O6)的多晶型物作为有效成分的用于预防或治疗乳腺癌的药物组合物。
本发明的又一目的在于，提供一种包含六氧化四砷(As4O6)的多晶型物作为有效成分的用于预防或治疗乳腺癌的药物组合物的制备方法。
本发明涉及一种包含六氧化四砷(As4O6)的多晶型物的用于预防或治疗乳腺癌的药物组合物，尤其涉及一种包含99％以上的六氧化四砷的多晶型物a(As4O6-a)的组合物。
所述组合物可以包含小于1％的六氧化四砷的多晶型物b(As4O6-b)。
所述六氧化四砷的纯度可以为99.9％以上。
所述As4O6-a及As4O6-b可以为具有下述(i)～(iii)的特性的六氧化四砷多晶型物。
表1
所述As4O6-a为如下晶型。其特征为，在X-射线粉末衍射分光图中，在光源波长为时，在衍射角2θ10°～50°的范围下，用1°/min的速度(扫描步进(scan step)0.02°)表示的峰显示为13.84、27.88、32.32、35.3、39.84、42.38、46.34、48.6及49.34(参见图1)。此外，2θ值13.8和27.9中显示的主峰的比率为1：1.3。
所述As4O6-b为如下晶型。其特征为，在X-射线粉末衍射分光图中，在光源波长为时，在衍射角2θ10°～50°的范围下，用1°/min的速度(扫描步进0.02°)表示的峰显示为13.86、27.92、32.36、35.34、39.9、42.44、46.4、48.66及49.4(参见图1)。此外，2θ值13.8和27.9中显示的主峰的比率为1：2.5。
根据本发明的另一实施方式，涉及一种包含六氧化四砷(As4O6)的多晶型物作为有效成分的用于抑制乳腺癌转移的药物组合物，尤其涉及包含99％以上的六氧化四砷的多晶型物a的用于抑制乳腺癌转移的药物组合物。
下面，对本发明进行更详细的说明。
本发明涉及一种包含六氧化四砷(As4O6)作为有效成分的用于预防或治疗乳腺癌的药物组合物，尤及一种包含99％以上的六氧化四砷的多晶型物a(As4O6-a)的药物组合物。
根据本发明的另一实施方式，涉及一种包含六氧化四砷(As4O6)的多晶型物作为有效成分的用于预防或治疗乳腺癌的药物组合物的制备方法，其特征为，所述用于预防或治疗乳腺癌的药物组合物包括以下工序而制得；将氯化钠在100～800℃下加热后进行冷却的第一工序；将三氧化二砷(As2O3)置于氯化钠上，然后在密闭状态下从100℃加热至1000℃后进行冷却的第二工序；在滤纸中分离结晶化的结晶的第三工序；以及用上述第三工序中获得的结晶来代替第二工序中的三氧化二砷重复实施4～10次第二工序及第三工序，从而获得六氧化四砷结晶的第四工序；在所述第四工序中获得的六氧化四砷结晶包含99％以上的六氧化四砷的多晶型物a(As4O6-a)。
准备高岭土材质的合成反应器，以及在合成反应器的上方能够安装过滤器的夹钳(clamp)，在合成反应器内放置氯化钠进行加热及冷却。在本发明的制备方法中使用氯化钠的原因是，在第二工序中将三氧化二砷放置在氯化钠上进行加热，能够使得热均匀地传递到砷化合物上，有助于砷化合物的升华，为了通过第一工序来去除这种氯化钠的杂质及水分，在100～800℃下加热2～6小时。在第一工序中，对氯化钠进行加热后，在室温下冷却3～10小时。
之后，进行第二工序。即，将三氧化二砷(As2O3)置于氯化钠上，然后在密闭状态下从100℃加热至1000℃后进行冷却。在此，放置三氧化二砷后，在夹钳上安装3～6个能够捕集升华的砷的过滤器(滤纸)，使得各过滤器与过滤器之间的间距为2mm～6mm。此时使用的过滤器优选使用基本重量(basic weight)为70～100g/m2，厚度(thickness)为0.17～0.25mm，过滤速度(filtration speed)为22～30s/100ml，以及保留粒径(retention rate)为5～10μm的过滤器。
安装过滤器之后进行密闭，然后在合成反应器下部从100℃阶段性地升温至1000℃，同时加热3～10小时，使得滤纸的最上方中心部的温度维持在150℃±100℃，使得六氧化四砷通过滤纸的同时被结晶化。然后，在常温下冷却5小时以上，优选冷却5～10小时。
然后，实施第三工序。即，对间隔层叠设置的3～6个滤纸所捕获的白色结晶进行分离。
去除合成反应器中的氯化钠上残留的微量的三氧化二砷后，放上所述捕获的白色结晶，然后以相同的条件重复实施4～10次第二工序及第三工序，最终获得六氧化四砷。对根据本发明的制备方法获得的结晶结构进行确认的结果为，大部分为As4O6-a，As4O6-a为99％以上。
本发明的包含六氧化四砷的多晶型物的药物组合物能够有效地用于乳腺癌的预防或治疗。
本发明的药物组合物可以分别通过常规方法被剂型化为散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮液、乳剂、糖浆剂、气雾剂等口服剂型、外用剂、栓剂及灭菌注射溶液形态而使用。所述药物组合物中可以包含的载体、赋形剂及稀释剂可列举如乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻朊酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁及矿物油。在进行制剂化时，使用通常使用的填充剂、膨胀剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等稀释剂或赋形剂而制备。用于口服的固体型制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，这种固体型制剂在本发明的六氧化四砷中至少混合一种以上的如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等赋形剂而制得。此外，除了简单的赋形剂之外，也使用硬脂酸镁、滑石粉等润滑剂。作为用于口服的液状制剂相当于悬浮剂、内溶液剂、乳剂、糖浆剂等，除了经常使用的作为简单稀释剂的水、液状石蜡之外，还可以包括多种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂等。作为非口服给药的制剂，包括灭菌的水溶液、非水性溶剂、悬浮剂、乳剂、冷冻干燥剂、栓剂。作为非水性溶剂、悬浮剂，可以使用丙二醇、聚乙二醇、橄榄油等植物性油，油酸乙酯等可注射的酯等。作为栓剂的基材，可以使用witepsol、聚乙二醇(macrogol)、吐温(tween)61、可可脂、月桂脂、甘油明胶等。
所述药物组合物的给药量根据受治对象的年龄、性别、体重和所治疗的特定疾病或病理状态、疾病或病理状态的严重程度、给药途径及开药者的判断而有所不同。基于这种因素的给药量的确定在本领域技术人员的水平范围内，通常的给药量的范围在0.01mg/kg/天～大约500mg/kg/天。更优选的给药量为0.1mg/kg/天～100mg/kg/天。可以一天给药一次，也可以分成数次给药。所述给药量从任何方面来说都不是为了限定本发明的范围。
所述药物组合物可以以多种途径对鼠、家畜、人等哺乳动物施用。施用的所有方式是可以预计的，例如，可以通过口服、直肠或静脉、肌肉、皮下、子宫内粘膜或脑血管内注射来进行给药。
本发明的用于预防或治疗乳腺癌的组合物由于包含99％以上的六氧化四砷的多晶型物a，从而具有优异的抗癌效果。
此外，本发明的组合物被确认为，具有优异的抑制乳腺癌转移的效果。
附图说明
图1A和图1B为As4O6-a及As4O6-b的X-射线粉末衍射分光图。
图2A和图2B为示出使用实施例1及比较例1～3对MCF-7细胞进行处理后，培养48小时(图2A)及72小时(图2B)后，通过MTT检测试验来评价细胞增殖抑制效果的结果的图。
图3A和图3B为示出使用实施例1及比较例1～3对SK-BR-3细胞系进行处理后，培养48小时(图3A)及72小时(图3B)后，通过MTT检测试验来评价细胞增殖抑制效果的结果的图。
图4A和图4B为按照不同的浓度对MCF-7细胞用实施例1进行处理，将根据实施例1的浓度的细胞死亡效果，利用流式细胞分析仪检测出的标记在细胞上的膜联蛋白V及PI的结果(4A)，以及分析PI相对于膜联蛋白V的量而确认细胞死亡率(4B)的结果。
图5位按照不同的浓度对MCF-7细胞用实施例1进行处理，对根据实施例1的浓度而变化的关于细胞周期及细胞死亡的基因的表达进行确认的结果。
图6为对临床试验的转移性乳腺癌患者施用实施例1之前和施用之后的肺部CT照片，对根据实施例1的施用而使得转移的肿瘤的大小变小进行确认的结果。
具体实施方式
下面，对本发明的优选实施例进行详细说明。但是，本发明不仅限定于在此说明的实施例，也可以具体化为其它形态。是为了使得在此介绍的内容非常完整，向本领域技术人员充分地传递本发明的思想而提供的。
实施例1：本发明的六氧化四砷的制备
准备由高岭土特殊制得的合成反应器(高100mm，直径190mm)和可安装3～6个过滤器的夹钳。在距离合成反应器50mm处设置1次夹钳，在所述1次夹钳的上方，以2～6mm为间隔设置2次～6次夹钳，此时，各个夹钳的规格为直径210mm及厚度10mm。
将400g～600g的称量的粗盐(水分含量10％以下)加入到合成反应器内，以20mm左右的厚度铺展均匀，并压实，于100℃～800℃下缓慢加热3小时，同时进行连续加热，以使得反应器内部的盐表面温度为290±30℃，从而去除水分及杂质，并在室温下冷却5小时。
将作为原料物质的100gAs2O3(纯度98％以上，制备公司YUNNAN WENSHANJINCHIARSENIC CO.,LTD.)放置在合成反应器内的粗盐上，安装3～6个位于合成器上方的夹钳，以设置可捕获升华的砷的过滤器(滤纸)、各个过滤器之间的间隔为2～6mm。此时使用的过滤器优选使用基本重量为70～100g/m2，厚度为0.17～0.25mm，过滤速度为22～30s/100ml，以及保留粒径为5～10μm的过滤器。
利用夹钳固定过滤器，并在合成反应器下部加热，从100℃阶段性地升温至1000℃。首先，加热1小时，以使得合成反应器下部的外部温度为350℃±100℃左右，之后，进行加热，使得合成反应器下部的外部温度为600～650℃，以及700～1,000℃，总的加热时间为5～10小时，使得过滤器最上方滤纸的中心部温度维持150℃±100℃后，在常温下冷却5～7小时。在该过程中，放置在合成反应器的盐上的粉末As2O3在合成反应器内部变成气体而上升，由于合成反应器外部的上方温度相对要低，因此变成液体，之后结晶化为固体，从而在过滤器上生成白色结晶体。
将采集的白色结晶体放置在合成反应器的粗盐上再次进行加热和冷却，重复实施4次采集结晶的工序，最终获得12.0g的结晶。对获得的砷化合物结晶的结构进行确认的结果，大部分为As4O6-a，As4O6-a为99％以上，As4O6-b为小于1％。
确认到DSC(示差扫描量热分析)值在升温速度为10℃/min时，As4O6-a在282.67℃的点处显示出了吸热峰(熔点)，As4O6-b在286.77℃的点处显示出了吸热峰(熔点)。
As4O6-a及As4O6-b的粉末X射线衍射分光图示于图1A和图1B中，As4O6-a及As4O6-b的衍射数据如下述表2所示。
表2
由图1A和图1B及表2可以确认，具有如下特征。As4O6-a在2θ值为13.8和27.9时显示出的主峰的比例为1：1.3，As4O6-b在2θ值为13.8和27.9时显示出的主峰的比例为1：2.5。对制备的化合物的DSC分析、结构确定及X射线衍射分析按照如下方法实施。
(1)DSC分析
在DSC装置(SDT Q600 V20.9 Build 20)中，使N2以100mL/min的速度流入，并以10℃/min的升温速度将温度升至310℃，同时对20.0mg的试样进行分析。
(2)X射线确定学
将六氧化四砷(As4O6，MW＝395.6)的单结晶置于玻璃纤维(glass fiber)上，照射X-射线束，并观察是否存在衍射出的照片花纹和衍射数据的体系性，从而确定空间群(space group)，确定单位细胞常数(cell parameter)。衍射强度在10°<2θ<50°的范围下采集。使用结构确定程序(SHELXTL程序)对该数据进行处理，并利用重原子方法(Patterson方法)确认As4O6的结晶结构。
(3)X射线衍射分析法
将获得的结晶粉碎，制成10μm～30μm(-325目)的颗粒，填充到X-射线衍射分析用玻璃框(glass holder)(20mm×16mm×1mm)中后，用载玻片等进行压实后，使其变得平展，以使待测面和支撑面平行，从而准备试样。利用XRD的Cu Kα1 在2θ10°～50°的范围下以1°/min的速度(扫描步进0.02°)绘出结晶的X-射线衍射分光图。
比较例1：六氧化四砷的制备
准备由高岭土特殊制得的合成反应器(高100mm，直径190mm)和3～6个可安装过滤器的夹钳。在距离合成反应器50mm处设置1次夹钳，在所述1次夹钳的上方，以2～6mm为间隔设置2次～6次夹钳，此时，各个夹钳的规格为直径210mm及厚度10mm。
将称量的400g～600g的粗盐(水分含量10％以下)加入到合成反应器中后，将其铺展均匀并压实，使厚度为20mm左右，以100℃～800℃缓慢加热3小时，并连续加热，使得反应器内部的盐表面温度成为290±30℃，以去除水分及杂质，并在室温下冷却5小时。
将100g的作为原料物质的As2O3(纯度98％以上，制备公司YUNNAN WENSHANJINCHIARSENIC CO.,LTD.)放到合成反应器内的粗盐上，安装3～6个位于合成器上方的夹钳，使得能够捕集升华的砷的过滤器(滤纸)与过滤器之间的间隔为2～6mm。此时使用的过滤器优选使用基本重量为70～100g/m2，厚度为0.17～0.25mm，过滤速度为22～30s/100ml，以及保留粒径为5～10μm的过滤器。
利用夹钳固定过滤器，并在合成反应器的下部施加热量，从100℃阶段性地加热至1,000℃。首先，对合成反应器加热1小时，以使合成反应器下部的外部温度为350℃±100℃，然后，进行加热使得合成反应器的外部温度为600～650℃，以及700～1000℃，总加热时间为5小时～10小时，以使得过滤器最上方滤纸的中心部温度维持在150℃±100℃，然后在常温下冷却5～7小时。在该过程中，放置在合成反应器中的盐上的As2O3粉末在合成反应器的内部变成气体上升后，由于合成反应器外部的上方温度相对要低，因此会变成液体，之后结晶成固体，从而在过滤器上生成白色结晶体。从过滤器中获取48.5g的结晶。对获取的砷化合物的结晶结构进行确认的结果为，99％以上为As4O6-b，即大部分为As4O6-b。
比较例2～3六氧化四砷的制备
将实施例1(多晶型物As4O6-a为99％以上的组合物)和比较例1(多晶型物As4O6-b为99％以上的组合物)分别以4：1及1：1的比例混合后，分别作为比较例2及比较例3。
实验例1：抑制人乳腺癌(human breast cancer)细胞增殖效果实验
(1)实验材料及细胞培养
准备牛胎儿血清(FBS)和细胞培养基(Hyclone公司)，并准备二甲基亚砜(DMSO)和3-(4,5-二甲基-噻唑-2基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5-Dimethyl-thiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)(Amresco LLC，USC)。
作为人癌细胞系，从中国科学研究院的上海细胞银行获得作为人乳腺癌细胞系(human breast cancer cells)MCF-7及SK-BR-3细胞。MCF-7细胞利用含有10％FBS、100U/ml的青霉素，以及100μg/ml的链霉素的MEM(Minimum Essential Medium)培养基，SK-BR-3细胞利用含有10％FBS、100U/ml的青霉素，以及100μg/ml的链霉素的DMEM(Dulbecco’smodified Eagle’s medium)培养基，并于具有5％CO2及95％的空气和湿气的状态的培养器中，对细胞进行培养。培养基每3天更换一次。
(2)细胞增殖实验(MTT实验)
利用MTT实验来评价实施例1及比较例～比较例3的细胞增殖效果。MTT实验是基于相对于MTT存活的细胞生成不溶性深蓝色甲臜反应物的能力的实验。通过使用胰蛋白酶进行处理而使细胞漂浮在培养基中而收集后，以4×103细胞/孔(cells/well)的密度接种到96孔培养皿(Costar，剑桥，马萨诸塞州，美国)中。24小时后，将实施例1及比较例1～比较例3分别以0、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40或80μM的量对包含有含10％FBS的培养基的细胞进行处理，并进行培养。此时，实施例1及比较例1～比较例3利用了在1M氢氧化钠中以5×10-2M的浓度溶解的存储溶液。为了实施对于细胞增殖的MTT实验，用试样进行处理后，对细胞培养48小时及72小时后，去除上清液，并以每孔(well)5mg/ml的方式分别添加20μl的MTT溶液，然后，为了形成甲瓒结晶，在37℃下孵育4小时。孵育后，再次去除上清液，在所有的孔中以每孔100μl的量添加DMSO，使深蓝色结晶完全溶解而混合。在室温下放置15分钟，以使所有的结晶完全溶解，在570nm(A570)波长下利用微型板仪器测定吸光度。
(3)统计分析
将未用试样进行处理的对照组的吸光度值计算为100，并校准(calibration)相对于对照组用试样处理的处理组的吸光度值，并根据下述公式计算细胞增殖抑制率。
细胞增殖抑制率(％)＝((对照组细胞的平均吸光度-处理组细胞的平均吸光度)/对照组细胞的平均吸光度)×100。
所有的数据以平均±标准误差(means±SEM)来表现。在进行单因素方差分析(one-way analysis of variance，ANOVA)后，通过新复极差法事后检验(Dunnett’s post-test)来进行多重比较。显著性水平为p＜0.05，各实验重复进行3次。
(4)利用MCF-7细胞的结果
将实施例1及比较例1～比较例3对人乳腺癌细胞系MCF-7进行处理，然后培养48小时及72小时，并进行MTT实验的结果示于图2A和图2B中。用实施例1进行处理后培养48小时(图2A)及72小时(图2B)的所有的实验结果为，确认了与使用比较例1处理的情况相比对乳腺癌细胞系MCF-7细胞的增殖抑制率高。此外，确认了与实施例1和比较例1以4：1混合的比较例2或以1：1混合的比较例3相比，MCF-7细胞的增殖抑制率高。
(5)利用SK-BR-3细胞的结果
将实施例1及比较例1～比较例3对人乳腺癌细胞系SK-BR-3进行处理，然后培养48小时及72小时，并进行MTT实验的结果示于图3A和图3B中。用实施例1进行处理后培养48小时(图3A)及72小时(图3B)的所有的实验结果为，确认了与使用比较例1处理的情况相比乳腺癌细胞系SK-BR-3细胞的增殖抑制率高。此外，确认了与实施例1和比较例1以4：1混合的比较例2或以1：1混合的比较例3相比，SK-BR-3细胞的增殖抑制率高。
实验例2：人乳腺癌(human breast cancer)细胞死亡诱导效果实验
准备牛胎儿血清(FBS)和细胞培养基(Hyclone公司)。RT-PCR试剂盒及Trizol购自Takara Biotechnology CO.,LTD.,，引物委托Beijing Aodingkangsheng BiologicalTechnology Co.,LTD.,公司进行设计及合成。
作为人癌细胞系，从中国科学研究院的上海细胞银行获得作为人乳腺癌细胞系(human breast cancer cells)的MCF-7，MCF-7细胞利用含有10％FBS、100U/ml的青霉素，以及100μg/ml的链霉素的MEM(Minimum Essential Medium)培养基，并于具有5％CO2及95％的空气和湿气的状态的培养器中，对细胞进行培养。培养基每3天更换一次。
(2)利用流式细胞分析仪(flow cytometry)
利用流式细胞分析仪来评价对于实施例1的细胞死亡(apoptosis)诱导的效果。以1×105细胞/孔(cells/well)的接种量接种到6孔培养皿中，并培养24小时。24小时之后，用实施例1对包含有含10％FBS的MEM培养基的细胞进行处理，以使实施例1成为0、1、3、6、9、12或15μM，并培养24小时。24小时之后，为了确认细胞死亡，利用annexin V-FITC试剂盒对细胞进行处理，为了与自然的细胞死亡相区别，同时使用了碘化丙啶(propidium iodide，PI)。此时，按照PI和膜联蛋白V-FITC试剂盒的使用方法进行了实验。通过BD FACS calibur流式细胞分析仪对利用annexin V-FITC试剂盒处理的细胞分析了细胞死亡程度，并将其结果显示在图4A和图4B中。利用实施例1处理后，将用膜联蛋白V和PI标记的细胞用流式细胞分析仪进行分析的结果(4A)以及分析相对于PI的膜联蛋白V的量，从而确认细胞死亡率(4B)的结果，确认了随着实施例1的处理浓度的增加，细胞死亡率增加。
(4)利用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chainreaction，RT-PCR)
为了确认对于实施例1的细胞死亡诱导的影响，利用RT-PCR来确认了关于细胞周期及细胞死亡的基因半胱天冬酶-3、p21、细胞周期素E1及细胞周期素A2的mRNA表达程度。在6孔培养皿中以1×105细胞/孔(cells/well)的接种量接种，并培养24小时。24小时后，用实施例1对包含有含10％FBS的MEM培养基的细胞进行处理，以使实施例1成为0、1、3、6、9、12或15μM，并培养24小时。24小时后，收集细胞后利用Trizol试剂提取RNA。以提取的RNA为模板，并利用下述表3中的引物及RT-PCR试剂盒进行基因扩增，并在琼脂糖胶中进行电泳，从而确认半胱天冬酶3、p21、细胞周期素E1及细胞周期素A2的mRNA表达量的变化，并将其结果示于图5中。此时，一起确认了作为负载对照组β-肌动蛋白的表达量。用实施例1处理的结果，与细胞死亡相关的调节细胞周期的基因p21和细胞周期素E1，以及与细胞死亡相关的半胱天冬酶-3的mRNA表达随着实施例1浓度的增加也增加，另一方面，与细胞增殖相关的细胞周期调节因子的细胞周期素A2的mRNA的表达减小了。
由此可知，实施例1的六氧化四砷诱导乳腺癌细胞的死亡，从而能够治疗乳腺癌。
表3
实验例3：临床试验
利用实施例1的组合物实施了下述临床试验。
2006年发现乳腺癌，在医院进行了治疗，还实施了民间疗法等，但转移到肺部、胸膜、骨及肝部，2014年5月胸膜积液并伴有腹水，多次抽取胸膜积液和腹水。但是，因恶性胸膜积液带来的严重的呼吸困难，在急救室及救济院的病床上通过氧气呼吸机呼吸，因氧气不足而开始出现苍白症，在仅剩下1周左右的存活期的状态下，口服了实施例1，每日给药5mg，1日3次(15mg/日)。
该患者的给药实施例1之前和给药后的8个月、13个月、17个月及22个月的CT照片如图6所示。在给药实施例1之前，因向右侧肺部和左侧肺部转移而导致气道封闭，但在给药8个月、13个月、17个月及22个月之后，确认了随着给药时间的增加，两侧肺部的肿瘤大小变小。
通过临床试验结果，本发明的组合物被确认为对转移性乳腺癌具有治疗效果。

Claims (3)

1.一种六氧化四砷(As4O6)组合物在制备用于预防或治疗乳腺癌的药物组合物中的用途，其特征在于，所述六氧化四砷(As4O6)组合物包含99重量％以上的具有下述i至iii的特性的六氧化四砷(As4O6)的多晶型物a；
i、单位细胞常数：
α＝β＝γ＝90°，
ii、As-O键长：
iii、O-As-O键角：98.36°；
包含99％以上的所述六氧化四砷的多晶型物a(As4O6-a)的六氧化四砷(As4O6)组合物通过如下工序制备：
将氯化钠在100～800℃下加热后进行冷却的第一工序；将三氧化二砷(As2O3)置于氯化钠上，然后在密闭状态下从100℃加热至1000℃后进行冷却的第二工序；在滤纸中分离结晶化的结晶的第三工序；以及用上述第三工序中获得的结晶来代替第二工序中的三氧化二砷重复实施4～10次第二工序及第三工序，从而获得包含99％以上的所述六氧化四砷的多晶型物a(As4O6-a)的六氧化四砷(As4O6)组合物的第四工序。
2.根据权利要求1所述的六氧化四砷(As4O6)组合物在制备用于预防或治疗乳腺癌的药物组合物中的用途，其特征在于，所述多晶型物a在X-射线粉末衍射分光图中，在光源波长为时，在衍射角2θ10°～50°的范围下，用1°/min的速度(扫描步进0.02°)表示的峰显示为13.84、27.88、32.32、35.3、39.84、42.38、46.34、48.6及49.34。
3.一种六氧化四砷(As4O6)组合物在制备用于抑制乳腺癌转移的药物组合物中的用途，其特征在于，所述六氧化四砷(As4O6)组合物包含99重量％以上的具有下述i至iii的特性的六氧化四砷(As4O6)的多晶型物a；
(i)单位细胞常数：
α＝β＝γ＝90°，
(ii)As-O键长：
(iii)O-As-O键角：98.36°；
包含99％以上的所述六氧化四砷的多晶型物a(As4O6-a)的六氧化四砷(As4O6)组合物通过如下工序制备：
将氯化钠在100～800℃下加热后进行冷却的第一工序；将三氧化二砷(As2O3)置于氯化钠上，然后在密闭状态下从100℃加热至1000℃后进行冷却的第二工序；在滤纸中分离结晶化的结晶的第三工序；以及用上述第三工序中获得的结晶来代替第二工序中的三氧化二砷重复实施4～10次第二工序及第三工序，从而获得包含99％以上的所述六氧化四砷的多晶型物a(As4O6-a)的六氧化四砷(As4O6)组合物的第四工序。
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