BR112019009483A2 - composição farmacêutica para prevenção ou tratamento de câncer de mama, incluindo o polimorfo cristalino de hexóxido tetra-arênsico, e método para produção da mesma - Google Patents
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Abstract
a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica para prevenção ou tratamento de câncer de mama que inclui hexóxido tetra-arsênico, em que um polimorfo cristalino a (as4o6-a) de hexóxido tetra-arsênico está presente em 99 % ou maior, e a um método para produzir a mesma. a composição da presente invenção exibe excelentes efeitos de inibição da proliferação e a metástase de células cancerosas e, deste modo, pode ser empregada de forma útil como um agente anticâncer.
Description
COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA PREVENÇÃO OU TRATAMENTO DE CÂNCER DE MAMA, INCLUINDO O POLIMORFO CRISTALINO DE HEXÓXIDO TETRA-ARÊNSICO, E MÉTODO PARA PRODUÇÃO DA MESMA”.
Campo Técnico [001] A presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica que contém um polimorfo cristalino de hexóxido tetraarsênico para prevenção ou tratamento de câncer de mama.
Antecedentes da Técnica [002] O câncer é caracterizado pelo crescimento celular descontrolado, e este crescimento celular anormal forma uma massa de células denominada tumor, a qual penetra nos tecidos circundantes e, em casos graves, causa metástase em outros órgãos do corpo. Academicamente, os tumores são denominados neoplasia. O câncer afeta todos os tecidos e órgãos do corpo em várias taxas de prevalência. [003] Uma vez que a incidência de câncer de mama está aumentando gradualmente em virtude de uma melhora do padrão de vida devido ao crescimento econômico, mudanças e ocidentalização de hábitos alimentares, mudanças nos métodos de parto e amamentação, e assim por diante, o câncer de mama ocupa o primeiro lugar entre os tumores femininos (Kamangar F., etaL, 2006). O câncer de mama é um tumor maligno que pode se espalhar para outros órgãos e ameaçar a vida, ao contrário dos tumores benignos que permanecem no seio. O câncer de mama, incluindo o câncer de mama metastático, em tumores sólidos tem uma grande variedade de características biológicas e, assim, tem várias opções terapêuticas e prognosticas.
[004] Embora desenvolvimentos recentes de excisão radical, quimioterapia e terapia hormonal tenham melhorado significativamente os resultados de tratamento do câncer de mama, o câncer de mama
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2/23 recorre em aproximadamente 25-30 % dos pacientes sem metástase para os linfonodos axilares e aproximadamente 75-80 % dos pacientes com metástase para os linfonodos axilares em 10 anos, e a maioria destes pacientes morrem de câncer de mama metastático. Uma vez que o número de pacientes com câncer de mama aumenta constantemente, os pacientes com câncer de mama metastático também estão aumentando e, portanto, a pesquisa continua em pacientes com câncer de mama precoce, bem como métodos de tratamento destes pacientes, prognóstico e fatores que afetam o prognóstico, mas os resultados são ainda insignificantes.
[005] Portanto, no que diz respeito ao tratamento de câncer de mama, há uma necessidade contínua pelo desenvolvimento de agentes terapêuticos com excelentes efeitos antineoplásicos, independentemente da presença ou ausência de metástases do câncer de mama.
[006] Os presentes inventores já receberam direitos de patente de características técnicas em que o hexóxido tetra-arsênico purificado a partir de arsenolita natural que contém arsênico através de técnicas de separação e purificação mostrou efeitos de supressão de metástase em experimentos com animais e tiveram excelentes efeitos de tratamento antineoplásico quando administrados a pacientes com câncer uterino em estágio terminal, câncer de bexiga, câncer de pulmão, câncer do seio maxilar, câncer renal e assim por diante (Patente Coreana N° 272835).
[007] Os presentes inventores, como um resultado de pesquisa contínua sobre o arsênico, revelaram que o hexóxido tetra-arsênico com 99 % ou mais de polimorfo cristalino a de hexóxido tetra-arsênico pode ser produzido através de um método de preparação inovador, diferente do método descrito na patente registrada acima, e uma composição que contém tal hexóxido tetra-arsênico tem um efeito notável sobre a
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3/23 prevenção ou tratamento do câncer de mama, e concluíram a presente invenção.
Descrição Detalhada da Invenção
Problema Técnico [008] Um aspecto da presente invenção consiste em fornecer uma composição farmacêutica que contém um polimorfo cristalino de hexóxido tetra-arsênico (AS4O6) como um ingrediente ativo para a prevenção ou tratamento de câncer de mama.
[009] Outro aspecto da presente invenção é fornecer um método para a preparação de uma composição farmacêutica que contém um polimorfo cristalino de hexóxido tetra-arsênico (As4Oe) como um ingrediente ativo para a prevenção ou tratamento de câncer de mama.
[010] Outro aspecto da presente invenção é fornecer uma composição farmacêutica que contém um polimorfo cristalino de hexóxido tetra-arsênico (As4Oe) como um ingrediente ativo para a inibição de metástases do câncer de mama.
Solução Técnica [011] A presente invenção é dirigida a uma composição farmacêutica que contém hexóxido tetra-arsênico como um ingrediente ativo para a prevenção ou tratamento de câncer de mama, em que o hexóxido tetra-arsênico inclui 99 % ou mais de polimorfo cristalina a de hexóxido tetra-arsênico (como As4Oe-a).
[012] O hexóxido tetra-arsênico da composição pode ser preparado através de: uma primeira etapa de aquecimento de cloreto de sódio a 100 ~ 800 °C, seguido de resfriamento; uma segunda etapa de colocação de trióxido de arsênio (AS2O3) sobre 0 cloreto de sódio, seguido por aquecimento a 100 °C para 1000 °C em estado hermético e, em seguida, resfriamento; uma terceira etapa de separar os cristais cristalizados em um leito filtrante, coletando 0 arsênio sublimado; e uma quarta etapa de repetir as segunda e terceira etapas de quatro a dez
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[013] O hexóxido tetra-arsênico da composição pode incluir menos de 1 % de polimorfo cristalino b de hexóxido tetra-arsênico (A4O6-b).
[014] O hexóxido tetra-arsênico pode ter uma pureza de 99,9 % ou mais.
[015] O As4C>6-a e o As4Oe-b podem ter as características (i) a (iii) abaixo.
Tabela 1
| Categoria | Polimorfo cristalino a (como As4C>6-a) | Polimorfo cristalino b (como As4C>6-b) |
| (i) Parâmetros celulares | a = b = c = 11,0734 Á α = β = y = 90° V = 1357,82 Á3 | a = b = c = 11,0600 Á α = β = y = 90° V = 1352,90 Á3 |
| (ii) Extensão de ligação As-0 | 1,786 Á | 2,011 Á |
| (iii) Angulo de ligação O-As-O | 98,36° | 109,47° |
016] O As4C>6-a tem uma forma cristalina da qual o espectro de difração de raios X obtido usando um comprimento de onda da fonte de luz de 1,5406 Á dentro de um ângulo de difração (2Θ) de 10°a 50°em uma taxa de 17min (etapa de varredura de 0,02^ mo stra picos em valores 2Θ de 13,84, 27,88, 32,32, 35,3, 39,84, 42,38, 46,34, 48,6 e 49,34 (consulte Figura 1). Além disso, a proporção dos principais picos mostrados nos valores 2Θ de 13,8 e 27,9 é de 1:1,3.
[017] O As4C>6-b tem uma forma cristalina da qual o espectro de difração de raios X obtido usando um comprimento de onda da fonte de luz de 1,5406 Á dentro de um ângulo de difração (2Θ) de 10°a 50°em uma taxa de 17min (etapa de varredura de 0,02^ mo stra picos em
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5/23 valores 2Θ de 13,86, 27,92, 32,36, 35,34, 39,9, 42,44, 46,4, 48,66 e 49,4 (consulte Figura 1). Além disso, a proporção dos principais picos mostrados nos valores 2Θ de 13,8 e 27,9 é de 1:2,5.
[018] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecida uma composição farmacêutica que contém hexóxido tetraarsênico como ingrediente ativo para inibir a metástase de câncer de mama, em que o hexóxido tetra-arsênico inclui 99 % ou mais do polimorfo cristalino a de hexóxido tetra-arsênico (As4Oe-a).
[019] A seguir, a presente invenção será descrita em detalhes.
[020] A presente invenção é dirigida a uma composição farmacêutica que contém hexóxido tetra-arsênico (As4Oe) como ingrediente ativo para a prevenção ou tratamento de câncer de mama, em que o hexóxido tetra-arsênico inclui 99 % ou mais de polimorfo cristalino a de hexóxido tetra-arsênico (As4Oe-a).
[021] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para preparar uma composição farmacêutica que contém um polimorfo cristalino de hexóxido tetra-arsênico (As4Oe) como um ingrediente ativo para a prevenção ou tratamento de câncer de mama, o método incluindo: uma primeira etapa de aquecimento de cloreto de sódio a 100 ~ 800 °C, seguido de resfriamento; uma segunda etapa de colocação de trióxido de arsênio (AS2O3) no cloreto de sódio, seguido de aquecimento a partir de 100 °C para 1000 °C em um estado hermético e, em seguida, resfriamento; uma terceira etapa de separar os cristais cristalizados em um leito filtrante, coletando arsênio sublimado; e uma quarta etapa de repetir as segunda e terceira etapas quatro a dez vezes usando os cristais obtidos na terceira etapa, em vez do trióxido de arsênio na segunda etapa, deste modo, obtendo cristais de hexóxido tetra-arsênico, em que os cristais de hexóxido tetraarsênico obtidos na quarta etapa incluem 99 % ou mais do polimorfo cristalino a de hexóxido tetra-arsênico (As4Oe-a).
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6/23 [022] Um reator de síntese de urn material de caulim e braçadeiras capazes de montar filtros sobre o reator de síntese são preparados. Em seguida, o cloreto de sódio é colocado no reator de síntese e aquecido e resfriado. A razão pela qual o cloreto de sódio é usado no método de preparação da presente invenção é que, quando o aquecimento é realizado enquanto o trióxido de arsênio é colocado sobre o cloreto de sódio na segunda etapa, o calor é uniformemente transferido para os compostos de arsênio, deste modo, auxiliando na sublimação dos compostos de arsênio. De modo a remover as impurezas e umidade de tal de cloreto de sódio, o cloreto de sódio é aquecido a 100- 800 °C durante 2-6 horas na primeira etapa. Na primeira etapa, o cloreto de sódio é esfriado em temperatura ambiente durante 3-10 horas após o aquecimento.
[023] Então, a segunda etapa é conduzida ao colocar trióxido de arsênio (AS2O3) no cloreto de sódio, seguido por aquecimento de 100 °C para 1000 °C em um estado hermético e, então, resfriando. Aqui, após a colocação do trióxido de arsênio, três a seis filtros (leitos de filtro) capazes de coletar arsênio sublimado são montados nas braçadeiras de modo que os espaços entre os filtros sejam de 2 a 6 mm. Os filtros usados aqui têm, de preferência, um peso de base de 70-100 g/m2, uma espessura de 0,17-0,25 mm, uma velocidade de filtração de 22-30 s/100 ml e uma taxa de retenção de 5-10 μιη.
[024] Após a montagem dos filtros, um estado hermético é obtido e, então, uma porção inferior do reator de síntese é aquecida por 3-10 horas, enquanto a temperatura é aumentada gradativamente de 100 °C para 1000 °C, de modo que a temperatura da porção central do leito de filtração mais elevado seja mantida a 150 ± 100 Ό e hexóxido tetraarsênico seja cristalizado ao passar através dos leitos filtrantes. Em seguida, 0 resfriamento é realizado em temperatura ambiente durante 5 horas ou mais e, de preferência, 5-10 horas.
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7/23 [025] Em seguida, a terceira etapa é realizada ao separar os cristais brancos coletados nos três a seis leitos filtrantes espaçados instalados em um tipo empilhado.
[026] Depois que uma pequena quantidade de trióxido de arsênio restante no cloreto de sódio no reator de síntese é removida, os cristais brancos coletados são colocados nele e, então, as segunda e terceira etapas são repetidas quatro a dez vezes sob as mesmas condições, deste modo, obtendo cristais de hexóxido tetra-arsênico. Como um resultado de verificação das estruturas cristalinas obtidas de acordo com o método de preparação da presente invenção, descobriu-se que a maioria dos cristais eram As4Oe-a, os quais representavam 99 % ou mais.
[027] A composição farmacêutica que contém um polimorfo cristalino de hexóxido tetra-arsênico da presente invenção pode ser usada favoravelmente na prevenção ou tratamento de câncer de mama e na inibição de metástase do câncer de mama.
[028] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser formulada na forma de: uma formulação oral, tal como um pó, grânulos, um comprimido, uma cápsula, uma suspensão, uma emulsão, um xarope ou um aerossol; uma preparação externamente aplicada; um supositório; e uma solução injetável estéril, de acordo com os métodos usuais, respectivamente. Exemplos de um carreador, um excipiente e um diluente que podem estar contidos na composição farmacêutica podem incluir lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, amido, borracha de acácia, alginato, gelatina, fosfato de cálcio, cálcio silicato, celulose, metil celulose, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, água, hidroxibenzoato de metila, hidroxibenzoato de propila, talco, estearato de magnésio e óleo mineral. A composição farmacêutica pode ser formulada em preparações usando um diluente ou um excipiente, tal como um material de
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8/23 enchimento, um diluente, um aglutinante, um agente umectante, um desintegrante ou um tensoatívo. Uma preparação sólida para administração oral inclui um comprimido, uma pílula, um pó, grânulos, uma cápsula e assim por diante. Estas preparações sólidas podem ser preparadas ao misturar o hexóxido tetra-arsênico da presente invenção com pelo menos um excipiente, por exemplo, amido, carbonato de cálcio, sacarose ou lactose, gelatina ou similar. Também, lubrificantes, tais como estearato de magnésio e talco, podem ser usados além de excipientes simples. Uma preparação líquida para administração oral corresponde a uma suspensão, um líquido para uso interno, uma emulsão, um xarope e assim por diante, e pode incluir diluentes simples que são frequentemente usados, tais como água e parafina líquida, e vários excipientes, tais como um agente umectante, um edulcorante, um agente aromático e um conservante. Uma preparação para administração parentérica inclui uma solução aquosa estéril, um solvente não aquoso, uma suspensão, uma emulsão, um agente liofilizante e um supositório. O solvente não aquoso e a suspensão podem incluir propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais, tais como azeite, ésteres injetáveis, tal como oleato de etila e assim por diante. Um material de base para o supositório pode incluir Witepsol, Macrogol, Tween 61, manteiga de cacau, manteiga de laurina, glicerogelatina e assim por diante.
[029] A dose da composição farmacêutica pode variar dependendo da idade, sexo e peso corporal de um indivíduo a ser tratado, da doença ou condição patológica particular a ser tratada, gravidade da doença ou condição patológica, via de administração e determinação de prescrição. A determinação da dose com base nestes fatores está dentro do nível daqueles versados na técnica e a dose geral está na faixa de aproximadamente 0,01-500 mg/kg/dia. Uma dose mais preferida é 0,1-100 mg/kg/dia. A administração pode ser realizada uma
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9/23 vez por dia ou várias vezes em uma dose dividida por dia. A dose acima não se destina a restringir o âmbito da presente invenção de qualquer forma.
[030] A composição farmacêutica pode ser administrada a mamíferos, tais como ratos, animais domésticos e seres humanos, através de diversas vias. Todos os modos de administração podem ser previstos e, por exemplo, a administração pode ser realizada através de injeção oral, retal, intravenosa, intramuscular, subcutânea, endometrial, intracerebroventricular.
Efeitos Vantajosos [031] As composições farmacêuticas para prevenção ou tratamento de câncer de mama da presente invenção têm excelentes efeitos antineoplásicos por conter hexóxido de tetra-arsênico que inclui 99 % ou mais do polimorfo cristalino a de hexóxido tetra-arsênico.
[032] Além disso, descobriu-se que as composições farmacêuticas da presente invenção têm um excelente efeito de inibir a metástase de câncer de mama.
Breve Descrição dos Desenhos [033] A Figura 1 mostra o espectrograma de difração de raios X de As4C>6-a e As40e-b.
[034] A Figura 2 mostra gráficos que ilustram os resultados de avaliação dos efeitos inibidores de proliferação celular através do ensaio MTT após as células MCF-7 terem sido tratadas com o Exemplo 1 e Exemplos Comparativos 1 a 3 e incubadas durante 48 horas (Figura 2A) e 72 horas (Figura 2B).
[035] A Figura 3 mostra gráficos que mostram os resultados de avaliação dos efeitos inibidores da proliferação celular através do ensaio
MTT após as células SK-BR-3 terem sido tratadas com o Exemplo 1 e
Exemplos Comparativos 1 a 3 e incubadas durante 48 horas (Figura 3A) e 72 horas (Figura 3B).
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10/23 [036] A Figura 4 mostra os resultados da detecção de anexina V e PI, que são marcadores celulares, através de citometria de fluxo (4A), em relação ao efeito apoptótico sobre a célula de acordo com a concentração do Exemplo 1 quando as células MCF-7 foram tratadas com o Exemplo 1 em diferentes concentrações e os resultados de investigação da taxa de apoptose celular ao analisar a quantidade de anexina V comparado com PI (4B).
[037] A Figura 5 mostra os resultados de investigação das alterações de expressão de genes envolvidos no ciclo celular e apoptose celular, de acordo com a concentração do Exemplo 1, quando as células MCF-7 foram tratadas com o Exemplo 1 em diferentes concentrações.
[038] A Figura 6 mostra imagens CT dos pulmões antes e após a administração do Exemplo 1 a um paciente com câncer de mama metastático em ensaios clínicos, confirmando que o tamanho dos tumores que sofreram metástase diminuiu em virtude da administração do Exemplo 1.
Modo para Realizar a Invenção [039] Daqui em diante, exemplos preferidos da presente invenção serão descritos em detalhes. No entanto, a presente invenção não está limitada aos exemplos descritos aqui e, assim, pode ser incorporada em diferentes formas. Pelo contrário, estes exemplos são fornecidos de modo que a presente invenção seja exaustiva e completa, e transmitirão completamente o âmbito da invenção para aqueles versados na técnica. Exemplo 1: Preparação do presente hexóxido tetra-arsênico [040] Um reator de síntese (100 mm de altura e 190 mm de diâmetro) especialmente fabricado com caulim e três a seis braçadeiras capazes de montar filtros sobre o mesmo foram preparados. Uma primeira braçadeira foi instalada a uma distância de 50 mm do reator de síntese e as segunda à terceira braçadeiras foram instaladas acima da
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11/23 primeira braçadeira em intervalos de 2-6 mm da primeira braçadeira, e a dimensão de cada braçadeira era 210 mm de diâmetro e 10 mm de espessura.
[041 ] Sal grosso pesando 400-600 g (um teor de umidade de 10 % ou menos) foi introduzido no reator de síntese e depois uniformemente espalhado e empacotado até uma espessura de cerca de 20 mm. O reator de síntese foi lentamente aquecido a 100 - 800 °C durante 3 horas e continuamente aquecido, de modo que a temperatura da superfície do sal fosse de 290 ± 30 Ό dentro do reator, deste modo, removendo a umidade e impurezas. Em seguida, o resfriamento foi realizado em temperatura ambiente durante 5 horas.
[042] Então, 100 g de uma matéria-prima, AS2O3 (pureza de 98 % ou maior, preparada pela YUNNAN WENSHAN JINCHI ARSENIC CO., LTDA.) foram colocados no sal grosso no interior do reator de síntese, e os filtros (leitos de filtro) capazes de coletar 0 arsênio sublimado foram montados nas três a seis braçadeiras instalados acima do reator de síntese, de modo que os intervalos entre os filtros fossem de 2-6 mm. Os filtros usados aqui tinham, de preferência, um peso de base de 70100 g/m2, uma espessura de 0,17-0,25 mm, uma velocidade de filtração de 22-30 s/100 ml e uma taxa de retenção de 5-10 pm.
[043] Os filtros foram fixados usando as braçadeiras e, em seguida, calor foi aplicado à porção inferior do reator de síntese para elevar gradativamente a temperatura de 100 °C para 1000 °C. Primeiramente, a porção inferior do reator de síntese foi aquecida durante 1 hora de modo que a temperatura do exterior da porção inferior do reator de síntese fosse cerca de 350 ± 100 °C e, em seguida, 0 aquecimento foi realizado de modo que a temperatura do exterior da porção inferior do reator de síntese fosse cerca de 600-650 °C e cerca de 700-1000 °C, de modo que a temperatura da porção central do leito de filtro mais alto fosse mantida a 150 ± 100 °C através de aquecimento
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12/23 durante um total de 5-10 horas. Em seguida, o resfriamento foi realizado em temperatura ambiente durante 5 a 7 horas. Neste procedimento, o pó de AS2O3 colocado no sal dentro do reator de síntese se transformou em gás dentro do reator de síntese, e 0 gás se moveu e, então, se transformou um em líquido, uma vez que a temperatura máxima fora do reator de síntese era relativamente baixa e, posteriormente, 0 líquido foi cristalizado como um sólido e, assim, cristais brancos foram gerados nos filtros.
[044] Os cristais brancos coletados foram colocados no sal grosso no interior do reator de síntese, e os processos de aquecimento, resfriamento e coleta de cristais foram novamente repetidos quatro vezes, finalmente obtendo 12,0 g dos cristais. Como um resultado de verificação da estrutura dos cristais compostos de arsênio obtidos, foi confirmado que a maioria dos cristais era As4Oe-a, enquanto que 99 % em peso ou mais de As4Oe-a e menos de 1 % em peso de As4Oe-b foram obtidos.
[045] Foi confirmado que, conforme para 0 valor de calorimetria de varredura diferencial (DSC) em uma taxa de elevação de temperatura de 10 °C/min, As4Oe-a mostrou um pico endotérmico (ponto de fusão) a 282,67 °C e As4Oe-b mostrou um pico endotérmico (ponto de fusão) a 286,77 °C.
[046] Os espectros de difração de raios X de As4Oe-a e As4Oe-b são mostrados na Figura 1, e os dados de difração de As4Oe-a e AS4O6b são mostrados na Tabela 2 abaixo.
Tabela 2
| Como As4Oe-a | Como As4C>6-b | ||
| 2Θ (°) | Intensidade de Difração | 2Θ (°) | Intensidade de Difração |
| 13,84 | 7631,01 | 13,86 | 4012,09 |
| 27,88 | 10000 | 27,92 | 10000 |
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| Como As4C>6-a | Como As4C>6-b | ||
| 2Θ (°) | Intensidade de Difração | 2Θ (°) | Intensidade de Difração |
| 32,32 | 2801,74 | 32,36 | 2130,23 |
| 35,3 | 3369,82 | 35,34 | 2511 |
| 39,84 | 623,242 | 39,9 | 447,422 |
| 42,38 | 1551,5 | 42,44 | 1431,86 |
| 46,34 | 2345,2 | 46,4 | 4159,8 |
| 48,6 | 447,69 | 48,66 | 564,995 |
| 49,34 | 502,761 | 49,4 | 375,571 |
[047] Conforme confirmado na Figura 1 e Tabela 2, a proporção dos principais picos mostrados nos valores 2Θ de 13,8 e 27,9 foi de 1:1,3 em As4C>6-a e a proporção dos principais picos mostrados nos valores 2Θ de 13,8 e 27,9 foi de 1:2,5 em As4Oe-b. A análise DSC, determinação da estrutura e análise de difração de raios X dos compostos preparados foram realizadas por meio dos métodos a seguir.
(1) Análise DSC [048] Usando um sistema DSC (SDT Q600 V20.9 Build 20), 20,0 mg de uma amostra foram analisados enquanto a temperatura era aumentada para 310 °C em uma taxa de elevação de temperatura de 10 °C/min com N2fluindo a 100 mL/min.
(2) Cristalografia de Raios X [049] Cristais simples de hexóxido tetra-arsênico (AS4O6, MW = 395,6) foram colocados em um tubo de vidro e, então, um feixe de raios X foi aplicado para observar os padrões de difração em filmes fotográficos e a presença ou ausência de organização de difração dados, determinando grupos espaciais e parâmetros celulares. As intensidades de difração foram coletadas na faixa de 10°< 2 Θ < 50°. A estrutura cristalina de AS4O6 foi determinada a partir dos dados por meio do método de Patterson usando um programa de determinação de
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14/23 estrutura (programa SHELXTL).
(3) Difratometria de Raios X [050] Uma amostra foi preparada por meio de pulverização dos cristais obtidos em partículas com um tamanho de 10 - 30 pm (~325 mesh), preenchendo um suporte de vidro para análise de difração de raios X (20 mm x 16 mm x 1 mm) com as partículas, comprimindo as partículas com uma lâmina de vidro ou similar e achatando as partículas para permitir que a superfície da amostra ficasse paralela à superfície de suporte. O espectro de difração de raios X dos cristais foi concebido usando Cu Και (1,54060 Á) de XRD dentro de um ângulo de difração (2Θ) de 10°a 50°em uma taxa de 17min (etapa de varr edura de 0,02^.
Exemplo Comparativo 1: Preparação de hexóxido tetra-arsênico [051] Um reator de síntese (100 mm de altura e 190 mm de diâmetro) especialmente fabricado com caulim e três a seis braçadeiras capazes de montar filtros sobre o mesmo foram preparados. Uma primeira braçadeira foi instalada a uma distância de 50 mm do reator de síntese e as segunda à sexta braçadeiras foram instaladas acima da primeira braçadeira em intervalos de 2-6 mm da primeira braçadeira e a dimensão de cada braçadeira era 210 mm de diâmetro e 10 mm de espessura.
[052] Sal grosso pesando 400-600 g (um teor de umidade de 10 % ou menos) foi introduzido no reator de síntese e depois uniformemente espalhado e empacotado até uma espessura de cerca de 20 mm. O reator de síntese foi lentamente aquecido a 100 - 800 Ό durante 3 horas, e continuamente aquecido de modo que a temperatura da superfície do sal fosse de 290 ± 30 Ό dentro do reator, deste modo, removendo a umidade e impurezas. Em seguida, o resfriamento foi realizado em temperatura ambiente durante 5 horas.
[053] Então, 100 g de uma matéria-prima, AS2O3 (pureza de 98 % ou maior, preparada por YUNNAN WENSHAN JINCHI ARSENIC CO.,
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LTDA.) foi colocado no sal grosso no interior do reator de síntese e os filtros (leitos de filtro) capazes de coletar o arsênio sublimado foram montados nas três a seis braçadeiras instaladas acima do reator de síntese, de modo que os intervalos entre os filtros fossem de 2-6 mm. Os filtros usados aqui tinham, de preferência, um peso de base de 70100 g/m2, uma espessura de 0,17-0,25 mm, uma velocidade de filtração de 22-30 s/100 ml e uma taxa de retenção de 5-10 pm.
[054] Os filtros foram fixados usando as braçadeiras e, em seguida, calor foi aplicado na porção inferior do reator de síntese para elevar gradativamente a temperatura de 100 °C para 1000 °C. Primeiramente, a porção inferior do reator de síntese foi aquecida durante 1 hora de modo que a temperatura do exterior da porção inferior do reator de síntese fosse cerca de 350 ± 100 °C e, em seguida, o aquecimento foi realizado de modo que a temperatura do exterior da porção inferior do reator de síntese fosse cerca de 600-650 °C e cerca de 700-1000 °C, de modo que a temperatura da porção central do leito de filtro mais alto fosse mantida a 150 ± 100 °C através de aquecimento durante um total de 5-10 horas. Em seguida, o resfriamento foi realizado em temperatura ambiente durante 5-7 horas. Neste procedimento, o pó de AS2O3 colocado no sal dentro do reator de síntese se transformou em gás dentro do reator de síntese, e 0 gás se moveu, se transformando em líquido, uma vez que a temperatura máxima no reator de síntese era relativamente baixa e, posteriormente, 0 líquido foi cristalizado como um sólido e, assim, cristais brancos foram gerados nos filtros. 48,5 g de cristais foram coletados dos filtros. Como um resultado de verificação da estrutura cristalina dos compostos de arsênio coletados, foi confirmado que As4Oe-b era responsável por 99 % ou mais.
Exemplos Comparativos 2 a 4: Preparação de hexóxido tetraarsênico [055] Os Exemplos Comparativos 2 e 3 foram preparados ao
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16/23 misturar o Exemplo 1 (composição que tem 99 % ou mais de polimorfo cristalino como As4Oe-a) e do Exemplo Comparativo 1 (composição que tem 99 % ou mais de polimorfo cristalino como As40e-b) a 4:1 e 1:1, respectivamente.
Exemplo de Teste 1: Teste dos Efeitos Inibidores de Proliferação Celular em Câncer de Mama Humano (1) Materiais e Cultura Celular [056] Soro bovino fetal (FBS) e meio de cultura de células (Hyclone) foram preparados e sulfóxido de dimetila (DMSO) e brometo de 3-(4,5-dimetil-tiazol-2il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT, Amresco LLC, USC) foram preparados.
[057] Como linhagens de células de câncer humano, as células de câncer de mama humano MCF-7 e SK-BR-3 foram obtidas do Shanghai Cell Bank of Chinese Academy of Sciences. As células MCF-7 foram incubadas em Meio Essencial Mínimo (MEM) suplementado com FBS a 10 %, 100 U/ml de penicilina e 100 ml/ml de estreptomicina e as células SK-BR-3 foram incubadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com FBS a 10 %, 100 U/ml de penicilina e 100 ml/ml de estreptomicina em uma incubadora umidificada com 5 % de CO2 e 95 % de ar. O meio foi trocado a cada três dias.
(2) Ensaio de Proliferação Celular (Ensaio MTT) [058] Os efeitos do Exemplo 1 e Exemplos Comparativos 1 a 3 sobre a proliferação celular foram avaliados usando 0 ensaio MTT. O ensaio MTT se baseia na capacidade de células viáveis contra 0 MTT de produzir produtos de formazano azul-escuros insolúveis. Depois que as células foram suspensas no meio por meio de tratamento com tripsina e coletadas, as células foram distribuídas em uma densidade de 4 x 103 células/cavidade em uma placa de cultura com 96 cavidades (Costar, Cambridge, MA, EUA). Após 24 horas, as células no meio que contém FBS a 10 % foram tratadas com 0 Exemplo 1 e Exemplos
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Comparativos 1 a 3, a 0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40 ou 80 μΜ e depois incubadas. Aqui, foram usadas soluções mãe obtidas por meio de dissolução do Exemplo 1 e Exemplos Comparativos 1 a 3 a 5 x 10'2 M em hidróxido de sódio a 1M. Para o ensaio MTT para proliferação celular, os sobrenadantes foram removidos das células incubadas durante 48 horas e 72 horas após o tratamento da amostra e 20 μΙ de solução de MTT a 5 mg/ml foram adicionados por cavidade e as células foram incubadas a 37 í durante 4 horas para formar cristais de formazano. Após a incubação, os sobrenadantes foram novamente removidos, seguidos pela adição de 100 μΙ_ de DMSO a cada cavidade e, depois, mistura foi realizada para dissolver completamente os cristais azuis-escuros. Todos os cristais foram completamente dissolvidos permanecendo na temperatura ambiente durante 15 minutos, e a absorbância foi medida usando um leitor de micro-placas em um comprimento de onda de 570 nm (A570 nm).
(3) Análise Estatística [059] O valor de absorbância do grupo controle tratado sem a amostra foi calculado como 100 e 0 valor de absorbância do grupo de tratamento tratado com a amostra, comparado com aquela do grupo controle, foi calibrada e a porcentagem de inibição da proliferação celular foi calculada de acordo com a equação a seguir.
[060] Percentagem (%) de inibição da proliferação celular = ((absorbância média das células do grupo de controle - absorção média das células do grupo de tratamento)/absorbância média das células do grupo de controle) χ 100 [061] Todos os dados foram expressos como a média ± erro padrão da média (média ± SEM). Análise de variância unidirecional (ANOVA), seguido de pós-teste de Dunnett, foi usada para realizar comparações múltiplas. A significância estatística foi definida como p <
0,05 e cada teste foi repetido três vezes.
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18/23 (4) Resultados do Teste Usando Células MCF-7 [062] Células MCF-7 da linhagem de células de câncer de mama humano foram tratadas com o Exemplo 1 e os Exemplos Comparativos 1 a 3 e incubadas durante 48 e 72 horas, seguido do ensaio MTT. Os resultados são mostrados na Figura. 2. Foi confirmado que as percentagens de inibição da proliferação de células da linhagem de células de câncer de mama MCF-7 eram maiores no tratamento com o Exemplo 1 e depois incubação durante 48 horas (Figura 2A) e 72 horas (Figura 2B) comparado com o tratamento com o Exemplo Comparativo
1. Também foi confirmado que a percentagem de inibição da proliferação de células MCF-7 era maior no Exemplo 1 do que no Exemplo Comparativo 2 ou 3, onde o Exemplo 1 e o Exemplo Comparativo 1 foram misturados a 4:1 ou 1:1.
(5) Resultados do Teste Usando Células SK-BR-3 [063] Células SK-BR-3 da linhagem de células de câncer de mama humano foram tratadas com o Exemplo 1 e os Exemplos Comparativos 1 a 3 e incubadas durante 48 e 72 horas, seguido do ensaio MTT. Os resultados são mostrados na Figura. 3. Foi confirmado que as percentagens de inibição da proliferação de células SK-BR-3 da linhagem de células de câncer de mama eram maiores no tratamento com o Exemplo 1 e depois incubação durante 48 horas (Figura 3A) e 72 horas (Figura 3B) comparado com o tratamento com o Exemplo Comparativo 1. Também foi confirmado que a percentagem de inibição da proliferação de células SK-BR-3 foi maior no Exemplo 1 do que no Exemplo Comparativo 2 ou 3, onde o Exemplo 1 e o Exemplo Comparativo 1 foram misturados a 4:1 ou 1:1.
Exemplo de Teste 2: Teste do Efeito Inibidor de Apoptose de Células de Câncer de Mama Humano (1) Materiais e Cultura Celular [064] Soro bovino fetal (FBS) e meio de cultura celular (Hyclone)
Petição 870190043743, de 09/05/2019, pág. 33/47
19/23 foram preparados. O kit RT-PCR e o Trizol foram obtidos da Takara Biotechnology Co., LTDA., e Anexina V-FITC foi obtida da empresa Shanghai Biyuntian Biological Technology Co., LTDA. Os iniciadores foram concebidos e sintetizados pela Beijing Aodingkangsheng Biological Technology Co., LTDA.
[065] As células de câncer de mama humano MCF-7, como uma linhagem de células de câncer humano, foram obtidas do Shanghai Cell Bank of Chinese Academy of Sciences. Células MCF-7 foram incubadas em meio Essencial Mínimo (MEM) suplementado com FBS a 10 %, 100 U/ml de penicilina e 100 qg/ml de estreptomicina em uma incubadora umidificada com 5 % de CO2 e 95 % de ar. O meio foi trocado a cada três dias.
(2) Citometria de Fluxo [066] O efeito do Exemplo 1 sobre a indução de apoptose celular foi avaliado por meio de citometria de fluxo. As células foram distribuídas a 1 x 105 células/cavidade em uma placa de cultura com 6 cavidades e incubadas durante 24 horas. Após 24 horas, as células contidas no MEM que contém FBS a 10 % foram tratadas com 0 Exemplo 1 a 0, 1, 3, 6, 9, 12 ou 15 μΜ e incubadas durante 24 horas. Após 24 horas, as células foram tratadas usando 0 kit A nnexin V-FITC para verificar a apoptose celular e também foram tratadas com iodeto de propídio (PI) para distinguir da morte celular natural. Aqui, os experimentos foram conduzidos de acordo com os métodos de uso do kit PI and Annexin VFITC. As células tratadas com 0 kit PI and Annexin V-FITC foram analisadas quanto ao grau de apoptose celular usando 0 sistema de citometria de fluxo BD FACS Calibur. Os resultados são mostrados na Figura. 4. Como um resultado de análise através de citometria de fluxo (4A) nas células tratadas com 0 Exemplo 1 e depois marcadas com anexina V e PI e como um resultado da investigação das taxas de apoptose celular (4B) através de análise da quantidade de anexina V
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20/23 comparado com PI, foi confirmado que a apoptose celular aumentou com o aumento da concentração de tratamento do Exemplo 1.
(3) Reação em Cadeia de Polimerase por Transcrição Reversa (RTPCR) [067] De modo a investigar o efeito do Exemplo 1 sobre a indução de apoptose celular, os níveis de expressão de mRNA de caspase-3, p21, ciclina E1 e ciclina A2, os quais são genes envolvidos no ciclo celular e apoptose, foram examinados por RT-PCR. As células foram distribuídas a 1 X 105 células/cavidade em uma placa de cultura com 6 cavidades e incubadas durante 24 horas. Após 24 horas, as células contidas no MEM que contém FBS a 10 % foram tratadas com o Exemplo 1 a 0, 1, 3, 6, 9, 12 ou 15 μΜ e incubadas durante 24 horas. Após 24 horas, as células foram coletadas e, em seguida, o RNA foi extraído usando o reagente Trizol. A amplificação gênica foi realizada usando os iniciadores na Tabela 3 abaixo e o kit de RT-PCR enquanto o RNA extraído foi usado como modelo e depois as alterações nos níveis de expressão de mRNA de caspase 3, p21, ciclina E1 e ciclina A2 foram examinados por meio de eletroforese em gel de agarose. Os resultados são mostrados na Figura 5. Aqui, o nível de expressão de βactina também foi examinado como um grupo de controle de carregamento. Como um resultado de tratamento com o Exemplo 1, as expressões de mRNA de p21 e ciclina E1, os quais são genes que regulam os ciclos celulares relevantes para a apoptose celular, e caspase-3, o qual é um gene envolvido na apoptose celular, foram aumentados com o aumento da concentração do Exemplo 1, enquanto que a expressão de mRNA de ciclina A2, o qual é um fator de regulação do ciclo celular envolvido na proliferação celular, foi diminuída.
[068] Portanto, pode ser observado que o hexóxido tetra-arsênico do Exemplo 1 pode tratar o câncer de mama ao induzir à apoptose de células de câncer de mama.
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21/23
Tabela 3
| Gene | Sequências de iniciadores (5' 3') | Extensão de amplificação (bp) |
| β-actina | A montante: TGACGTGGACATCCGCAAAG A jusante: CTGGAAGGTGGACAGCGAGG | 206 |
| p21 | A montante: ACATCTTCTGCCTTAGTCTCA A jusante: GCCCCTTCAAAGTGCCATC | 426 |
| Caspase- 3 | A montante: TGGCAACAGAAI I IGAGTCCT A jusante: GCAGTTAAGTCATCCGTGTAT | 596 |
| Ciclina E1 | A montante: GCCTTGTATCAI I I CTCGTCAT A jusante: CTCTGCTTCTTACCGCTCT | 305 |
| Ciclina A2 | A montante: GTAAACAGCCTGCGTTCACC A jusante: ACTTCAACTAACCAGTCCACGAG | 382 |
Exemplo de Teste 3: Teste para Investigar o Efeito Inibidor de
Metástase em Câncer De Mama [069] Camundongos Balb/C de 5 semanas de idade nus machos, os quais eram isentos de patógenos específicos e doenças respiratórias e tinham um peso de corpo de 18-20 g, foram usados como animais experimentais. Foi permitido aos camundongos nus acesso livre à comida e água e eles foram criados em um ciclo de 12 horas de escuro/12 horas de luz durante 7 dias.
Petição 870190043743, de 09/05/2019, pág. 36/47
22/23 [070] Os camundongos foram transplantados com células de câncer de mama humano, MDA-MB-231, através de injeção subcutânea e criados por 7 dias. Após 7 dias, os camundongos foram divididos aleatoriamente e depois os respectivos camundongos receberam oralmente as composições do Exemplo 1 e do Exemplo Comparativo 1 a 4,5 mg/kg durante 7 dias. Aqui, os camundongos sem tratamento após o transplante de células de câncer de mama foram usados como um grupo de controle. Após 7 dias de administração das composições, os tecidos do pulmão foram retirados dos camundongos e depois as células cancerosas espalhadas pelos pulmões foram contadas para comparar o grau de inibição de metástase do câncer de mama.
[071] Como um resultado, foi confirmado que a maioria das células de câncer de mama transplantadas se espalhou para os pulmões no grupo de controle sem tratamento após o transplante de células de câncer de mama, enquanto que a disseminação das células de câncer de mama para os pulmões foi inibida nos grupos tratados com o Exemplo Comparativo 1 e o Exemplo 1. Foi especialmente confirmado que o Exemplo 1 exibiu uma percentagem de inibição de metástases de células cancerosas de 90 % ou mais, indicando um efeito inibidor de metástases cancerosas significativamente excelente comparado com o Exemplo Comparativo 1, o qual mostra uma percentagem de inibição metástase de células cancerosas de 50 %.
Exemplo de Teste 4: Teste Clínico [072] O teste clínico a seguir foi realizado usando a composição do Exemplo 1.
[073] O paciente recebeu tratamentos hospitalares e remédios populares desde que o câncer de mama foi encontrado em 2006, porém, o câncer de mama sofreu metástase para os pulmões, pleura, ossos e fígado. Em maio de 2014, derrame pleural e coleta de fluido peritoneal foram encontrados e, assim, o derrame pleural foi extraído várias vezes.
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No entanto, em virtude de uma grave dificuldade respiratória causada por derrame pleural maligno, o paciente respirava através de um sistema respiratório de oxigênio em uma sala de emergência e enfermaria de cuidados paliativos. No entanto, o paciente começou a desenvolver palidez em virtude da falta de oxigênio, e o paciente, com cerca de uma semana de vida, recebeu por via oral com 5 mg do Exemplo 1, três vezes ao dia (15 mg/dia).
[074] Imagens de TC do paciente antes de administração do Exemplo 1 e após 8, 13, 17 e 22 meses de administração do Exemplo 1 são mostradas na Figura 6. Antes da administração do Exemplo 1, as vias aéreas foram fechadas em virtude de metástases para o pulmão direito e para o pulmão esquerdo, porém, após 8, 13, 17 e 22 meses de administração, os tamanhos dos cânceres em ambos os pulmões diminuíram à medida que a duração da administração aumentava.
[075] Foi confirmado através dos resultados do teste clínico que a composição da presente invenção teve um efeito sobre o tratamento de câncer de mama metastático.
Claims (5)
- REIVINDICAÇÕES1. Composição farmacêutica que contém hexóxido tetraarsênico (AS4O6) como um ingrediente ativo para a prevenção ou tratamento de câncer de mama, caracterizada pelo fato de que 0 hexóxido tetra-arsênico inclui 99 % em peso ou mais de polimorfo cristalino de hexóxido tetra-arsênico com as características (i) a (iii) abaixo:(i) parâmetros celulares:a = b = c = 11,0734 Á α = β = γ = 90°V= 1357,82 Á3 (ii) Extensão da ligação As-O: 1,786 Á (iii) Ângulo da ligação O-As-O: 98,36°
- 2. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação1, caracterizada pelo fato de que 0 hexóxido tetra-arsênico é preparado através de:uma primeira etapa de aquecimento do cloreto de sódio a 100 ~ 800 °C, seguido de resfriamento;uma segunda etapa de colocação de trióxido de arsênio (AS2O3) sobre 0 cloreto de sódio, seguido de aquecimento de 100 °C para 1000 °C em estado hermético e, em seguida, resfriamento;uma terceira etapa de separar os cristais cristalizados em um leito de filtração, coletando arsênio sublimado; e uma quarta etapa de repetir as segunda e terceira etapas de quatro a dez vezes usando os cristais obtidos na terceira etapa, em vez do trióxido de arsênio na segunda etapa, deste modo, obtendo cristais de hexóxido de tetra-arsênico.
- 3. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que 0 hexóxido tetra-arsênico tem uma pureza de 99,9 % ou maior.Petição 870190043743, de 09/05/2019, pág. 39/472/2
- 4. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que, no espectro de difração de raios X de pó do polimorfo cristalino a obtido usando um comprimento de onda de fonte de luz de 1,5406 Á dentro de um ângulo de difração (2Θ) de 10o a 50°em uma taxa de 1 Ό/min (etapa de varredura de 0,02^, os picos são mostrados em valores 2Θ de 13,84, 27,88, 32,32, 35,3, 39,84, 42,38, 46,34, 48,6, e 49,34.
- 5. Composição farmacêutica que contém hexóxido tetraarsênico (As40e) como ingrediente ativo para inibição de metástases de câncer de mama, caracterizada pelo fato de que o hexóxido tetraarsênico inclui 99 % em peso ou mais de polimorfo cristalino de hexóxido tetra-arsênico com as características (i) a (iii) abaixo:(i) parâmetros celulares:a = b = c = 11,0734 Á α = β = y = 90°V= 1357,82 Á3 (ii) Extensão da ligação As-O: 1,786 Á (iii) Ângulo da ligação O-As-O: 98,36°.
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