JP2020503372A

JP2020503372A - 六酸化四砒素の結晶多形を含む乳癌予防または治療用薬学組成物及びその製造方法

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Publication number: JP2020503372A
Application number: JP2019547058A
Authority: JP
Inventors: ジュペ、イル; リアン、ゼンリン
Original assignee: Chemas Co Ltd
Current assignee: Chemas Co Ltd
Priority date: 2016-11-21
Filing date: 2017-11-17
Publication date: 2020-01-30
Anticipated expiration: 2037-11-17
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Abstract

六酸化四砒素の結晶多形ａ（Ａｓ４Ｏ６−ａ）が９９％以上である六酸化四砒素を含む乳癌予防または治療用薬学組成物またはその製造方法に関するものであって、本発明の組成物は優れる癌細胞増殖抑制及び転移抑制効果を示して抗癌剤に有用に利用できる。【選択図】図２

Description

本発明は、六酸化四砒素の結晶多形を含む乳癌予防または治療用薬学組成物に関するものである。

癌は制御されない細胞成長と特徴付けられ、このような異常な細胞成長により腫瘍（tumor）と呼ばれる細胞塊りが形成されて周囲の組織に侵入し、甚だしい場合には身体の他の器官に転移されることもある。学問的には新生物（neoplasia）とも呼ばれる。癌は多様な程度の有病率で身体の全ての組織及び臓器に影響を及ぼす。

乳癌（breast cancer）は経済的成長に従う生活水準の向上、食生活の変化と西欧化、出産、及び授乳方法の変化などにより発生率が徐々に増加して女性腫瘍のうちの１位を占める（非特許文献１）。乳癌は乳房の中に留まる陽性腫瘍とは異なり、他の器官に広がって生命を威嚇することがある悪性腫瘍で、転移性乳癌から固形腫瘍まで非常に多様な生物学的特性を有しているので、多様な治療的選択と予後を有する。

最近、根治的切除術、坑癌化学療法、及びホルモン療法などの発展により乳癌の治療結果が相当に向上したことにもかかわらず、今までも腋窩リンパ節転移のない患者の約２５〜３０％で、腋窩リンパ節転移がある患者の約７５〜８０％で１０年内に再発しており、これらのうちの大部分は転移性乳癌により死亡している。たゆまぬ乳癌患者の増加によって転移性乳癌患者もやはり増加しているので、早期乳癌患者と共にこれら患者の治療方法、予後、これに影響を及ぼす因子に対する研究が持続しているが、まだ微小な実状である。

したがって、乳癌の治療と関連して乳癌の転移有無に関わらず、優れる坑癌効果を有する治療剤の開発が持続的に要求されている実状である。

一方、本発明者らは既に砒素が含まれた自然産信石から分離精製技術を通じて精製された六酸化四砒素が動物実験で癌転移抑制効果を示しており、併せて、子宮癌、膀胱癌、肺癌、上顎洞癌、腎臓癌などの末期癌患者に投与した時、優れる坑癌治療効果があるという技術的特徴として特許登録（特許文献１）を受けたことがある。

本発明者らが砒素に対する持続的な研究結果、前記特許登録に開示された方法と異なる新規な製造方法により、六酸化四砒素の結晶多形ａが９９％以上である六酸化四砒素を製造することができ、このような六酸化四砒素を含む組成物が特に乳癌予防または治療に顕著な効果があることを明らかにして、本発明を完成するようになった。

Kamangar F., et al. 、２００６

韓国特許登録第２７２８３５号

本発明の目的は、有効成分として六酸化四砒素（Ａｓ_４Ｏ_６）の結晶多形を含む乳癌予防または治療用薬学組成物を提供することにある。

本発明の他の目的は、有効成分として六酸化四砒素（Ａｓ_４Ｏ_６）の結晶多形を含む乳癌予防または治療用薬学組成物の製造方法を提供することにある。

また、本発明の目的は有効成分として六酸化四砒素（Ａｓ_４Ｏ_６）の結晶多形を含む乳癌転移抑制用薬学組成物を提供することにある。

本発明は有効成分に六酸化四砒素を含む乳癌予防または治療用薬学組成物であって、前記六酸化四砒素は六酸化四砒素結晶多形ａ（Ａｓ_４Ｏ_６−ａ）が９９％以上である乳癌予防または治療用組成物に関するものである。

前記組成物の六酸化四砒素は塩化ナトリウムを１００〜８００℃に加熱した後、冷却する第１工程；塩化ナトリウムの上に三酸化二砒素（Ａｓ_２Ｏ_３）を上げた後、密閉状態で１００℃から１０００℃まで加熱した後、冷却する第２工程；昇華された砒素を捕集する濾過紙で結晶化された結晶を分離する第３工程；及び前記第３工程で得た結晶を第２工程の三酸化二砒素の代わりに使用して第２工程及び第３工程を４〜１０回繰り返して六酸化四砒素結晶を得る第４工程；を通じて製造できる。

前記組成物の六酸化四砒素は、六酸化四砒素の結晶多形ｂ（Ａｓ_４Ｏ_６−ｂ）が１％未満に含まれることができる。

前記六酸化四砒素は、純度が９９．９％以上でありうる。

前記Ａｓ_４Ｏ_６−ａ及びＡｓ_４Ｏ_６−ｂは以下の（i）乃至（iii）の特性を有するものでありうる：

前記Ａｓ_４Ｏ_６−ａはＸ−線粉末回折分光図で、光源波長が１．５４０６Åの時、回折角２θ １０°〜５０°範囲で、１°／ｍｉｎの速度（scan step ０．０２°）で表示されたピークが１３．８４、２７．８８、３２．３２、３５．３、３９．８４、４２．３８、４６．３４、４８．６、及び４９．３４と示されることを特徴とする結晶形である（図１参照）。また、２θ値１３．８と２７．９で示される主ピークの割合が１：１．３であることを特徴とする。

前記Ａｓ_４Ｏ_６−ｂはＸ−線粉末回折分光図で、光源波長が１．５４０６Åの時、回折角２θ １０°〜５０°範囲で１°／ｍｉｎの速度（scan step ０．０２°）で表示されたピークが１３．８６、２７．９２、３２．３６、３５．３４、３９．９、４２．４４、４６．４、４８．６６、及び４９．４と示されることを特徴とする結晶形である（図１参照）。また、２θ値１３．８と２７．９で示される主ピークの割合が１：２．５であることを特徴とする。

本発明の他の態様によれば、有効成分に六酸化四砒素を含む乳癌転移抑制用薬学組成物であって、前記六酸化四砒素は六酸化四砒素結晶多形ａ（Ａｓ_４Ｏ_６−ａ）が９９％以上である乳癌転移抑制用薬学組成物に関するものである。

以下、本発明をより詳細に説明する。

本発明は有効成分として六酸化四砒素（Ａｓ_４Ｏ_６）を含む乳癌予防または治療用薬学組成物であって、前記六酸化四砒素は六酸化四砒素の結晶多形ａ（Ａｓ_４Ｏ_６−ａ）が９９％以上である薬学組成物に関するものである。

本発明の他の態様によれば、有効成分として六酸化四砒素（Ａｓ_４Ｏ_６）の結晶多形を含む乳癌予防または治療用薬学組成物の製造方法であって、塩化ナトリウムを１００〜８００℃に加熱した後、冷却する第１工程；塩化ナトリウムの上に三酸化二砒素（Ａｓ_２Ｏ_３）を上げた後、密閉状態で１００℃から１０００℃まで加熱した後、冷却する第２工程；昇華された砒素を捕集する濾過紙で結晶化された結晶を分離する第３工程；及び前記第３工程で得た結晶を第２工程の三酸化二砒素の代わりに使用して第２工程及び第３工程を４〜１０回繰り返して六酸化四砒素結晶を得る第４工程；を含む方法により製造され、前記第４工程で得た六酸化四砒素結晶が六酸化四砒素の結晶多形ａ（Ａｓ_４Ｏ_６−ａ）を９９％以上含むことを特徴とする乳癌予防または治療用薬学組成物の製造方法に関するものである。

高嶺土材質の合成反応器、及び合成反応器の上部にフィルターが装着できるクランプを準備し、合成反応器内に塩化ナトリウムをあげて加熱及び冷却を進行する。本発明の製造方法で塩化ナトリウムを使用する理由は、第２工程で三酸化二砒素を塩化ナトリウムの上にあげて加熱することによって、砒素化合物に熱が均等に伝達されながら砒素化合物が昇華することに助けになるためであり、第１工程を通じてこのような塩化ナトリウムの不純物及び水分を除去するために１００〜８００℃に２〜６時間の間加熱する。第１工程において、塩化ナトリウムを加熱した後、室温で３〜１０時間の間冷却する。

次に、塩化ナトリウムの上に三酸化二砒素（Ａｓ_２Ｏ_３）を上げた後、密閉状態で１００℃から１０００℃まで加熱し、以後、冷却する第２工程を進行する。ここで、三酸化二砒素を上げた後、クランプに昇華される砒素が捕集できるフィルター（濾過紙）を各フィルターとフィルターとの間の間隔が２ｍｍ〜６ｍｍになるように３〜６個装着する。この時に使われるフィルターは、平量（basic weight）７０〜１００ｇ／ｍ^２、厚さ（thickness）０．１７〜０．２５ｍｍ、濾過速度（filtration speed）２２〜３０ｓ／１００ｍｌ、及び保留粒子径（retention rate）５〜１０μｍのものを使用することが好ましい。

フィルターを装着してから密閉させた後、合成反応器の下部に１００℃から１０００℃まで段階的に上げながら３時間〜１０時間の間加熱して濾過紙の最上部の中心部の温度は１５０℃±１００℃維持されるようにし、濾過紙を通過しながら六酸化四砒素が結晶化されるようにする。そして、常温で５時間以上、好ましくは５時間〜１０時間の間冷却する。

次に、離隔して積層に設置された３〜６個の濾過紙に捕集された白色結晶を分離する第３工程を遂行する。

合成反応器の塩化ナトリウムの上に残留する微量の三酸化二砒素を除去した後、前記捕集された白色結晶を上げた後、第２工程及び第３工程を同一条件で４〜１０回繰り返して最終的に六酸化四砒素結晶を収得する。本発明の製造方法により得られた結晶構造を確認した結果、大部分Ａｓ_４Ｏ_６−ａであり、Ａｓ_４Ｏ_６−ａが９９％以上であると確認された。

本発明の六酸化四砒素の結晶多形を含む薬学組成物は、乳癌予防または治療及び乳癌転移抑制に有用に使用できる。

本発明の薬学組成物は各々通常の方法によって、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾールなどの経口型剤形、外用剤、坐剤、及び滅菌注射溶液の形態に剤形化して使用できる。前記薬学組成物に含まれることができる担体、賦形剤、及び希釈剤には、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、非晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシ安息香酸、プロピルヒドロキシ安息香酸、タルク、マグネシウムステアレート、及び鉱物油を挙げることができる。製剤化する場合には、普通使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤、または賦形剤を使用して調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれて、このような固形製剤は本発明の六酸化四砒素に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤の以外にマグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も使われる。経口のための液状製剤には、懸濁剤、内用液剤、油剤、シロップ剤などが該当されるが、よく使われる単純希釈剤である水、リキッドパラフィンの以外にさまざまな賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれることができる。非経口投与のための製剤には滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、油剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどが使用できる。坐剤の基剤には、ウィテップゾール（witepsol）、マクロゴール、ツイーン（tween）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用できる。

前記薬学組成物の投与量は治療を受ける対象の年齢、性別、体重と、治療する特定疾患または病理状態、疾患または病理状態の深刻度、投与経路及び処方者の判断によって変わる。このような因子に基づいた投与量の決定は当業者の水準内にあり、一般的に投与量は０．０１ｍｇ／ｋｇ／日乃至略５００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。より好ましい投与量は０．１ｍｇ／ｋｇ／日乃至１００ｍｇ／ｋｇ／日である。投与は１日に１回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。前記投与量はどんな面でも本発明の範囲を限定するものではない。

前記薬学組成物は、ネズミ、家畜、ヒトなどの哺乳動物に多様な経路に投与できる。投与の全ての方式は予想できるが、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内粘膜、または脳血管内注射により投与できる。

本発明の乳癌予防または治療用薬学組成物は、六酸化四砒素の結晶多形ａが９９％以上である六酸化四砒素を含むことによって、優れる坑癌効果を有する。
また、本発明の薬学組成物は、乳癌転移を抑制する効果に優れることが確認された。

Ａｓ_４Ｏ_６−ａ及びＡｓ_４Ｏ_６−ｂのＸ−線粉末回折分光図ＭＣＦ−７細胞に実施例１、及び比較例１乃至３を処理し、４８時間（図２Ａ）及び７２時間（図２Ｂ）培養した後、ＭＴＴアッセイにより細胞増殖抑制効果を評価した結果グラフＳＫ−ＢＲ−３細胞に実施例１、及び比較例１乃至３を処理し、４８時間（図３Ａ）及び７２時間（図３Ｂ）培養した後、ＭＴＴアッセイにより細胞増殖抑制効果を評価した結果グラフＭＣＦ−７細胞に実施例１を濃度別に処理して実施例１の濃度に従う細胞死滅効果を流細胞分析器で細胞に標識されたannexin V及びＰＩを検出した結果（４Ａ）及びＰＩ対比annexin Vの量の分析して細胞死滅率（４Ｂ）を確認した結果の説明図ＭＣＦ−７細胞に実施例１を濃度別に処理して実施例１の濃度に従う細胞周期及び細胞死滅に関連した遺伝子の発現変化を確認した結果の説明図臨床試験の転移性乳癌患者に対する実施例１の投与前及び投与後の肺ＣＴ写真であって、実施例１の投与によって転移された腫瘍のサイズが小さくなることを確認した結果の説明図

以下、本発明の好ましい実施例を詳細に説明する。しかしながら、本発明はここで説明される実施例に限定されず、他の形態に具体化されることもできる。むしろ、ここで紹介される内容が徹底し完全になり、当業者に本発明の思想を十分に伝達するために提供するものである。

実施例１：本発明の六酸化四砒素の製造

高嶺土で特殊製作された合成反応器（高さ１００ｍｍ、直径１９０ｍｍ）と、３〜６個のフィルターを装着することができるクランプを準備する。クランプは合成反応器から５０ｍｍ離れて１次クランプを設置し、前記１次クランプから２〜６ｍｍ間隔でその上部に２次〜６次クランプを設置し、この際、各クランプの規格は直径２１０ｍｍ及び厚さ１０ｍｍである。

称量した太い塩（水分含有量１０％以下）４００ｇ〜６００ｇを合成反応器に投入して２０ｍｍ内外に厚さを均等に押し固めて１００℃〜８００℃で３時間の間熱を徐々に加熱しながら反応器の内部の塩表面温度が２９０±３０℃になるように連続加熱して水分及び不純物を除去し、室温で５時間の間冷却させる。

原料物質であるＡｓ_２Ｏ_３（純度９８％以上、製造社YUNNAN WENSHAN JINCHI ARSENIC CO., LTD.）１００ｇを合成反応器内の太い塩の上に入れて、合成機の上部に位置した昇華される砒素が捕集できるフィルター（濾過紙）を各フィルターとフィルターとの間の間隔が２〜６ｍｍになるように３〜６個のクランプを装着する。この時に使われるフィルターは、平量（basic weight）７０〜１００ｇ／ｍ^２、厚さ（thickness）０．１７〜０．２５ｍｍ、濾過速度（filtration speed）２２〜３０ｓ／１００ｍｌ、及び保留粒子径（retention rate）５〜１０μｍのものを使用することが好ましい。

クランプを用いてフィルターを固定させ、合成反応器の下部に熱を加えて１００℃から１，０００℃まで段階的に温度を上げる。まず合成反応器下部の外部温度を３５０℃±１００℃位になるように１時間の間加熱し、以後に合成反応器の下部の外部温度を６００〜６５０℃、及び７００〜１，０００℃位になるように加熱して、総５時間〜１０時間の間加熱してフィルターの最上部の濾過紙の中心部の温度が１５０℃±１００℃を維持するようにした後、常温で５〜７時間位冷却する。この過程で、合成反応器の塩の上に上がっている粉末Ａｓ_２Ｏ_３は合成反応器の内部で気体に変わって上昇してから、合成反応器の外部の上部温度が相対的に低いので、液体に変わり、以後、固体に結晶化されてフィルター上に白色結晶体が生成される。

採取した白色結晶体を合成反応器の太い塩の上に入れて、また加熱及び冷却し、結晶を採取する工程をまた４回繰り返して最終的に結晶１２．０ｇを得た。得られた砒素化合物の結晶の構造を確認した結果、大部分Ａｓ_４Ｏ_６−ａであり、Ａｓ_４Ｏ_６−ａが９９重量％以上であり、Ａｓ_４Ｏ_６−ｂが１重量％未満であると確認された。

ＤＳＣ（示差走査熱分析）値が昇温速度が１０℃／ｍｉｎの時、Ａｓ_４Ｏ_６−ａは２８２．６７℃である点で吸熱ピーク（融点）が示されることが確認されており、Ａｓ_４Ｏ_６−ｂは２８６．７７℃である点で吸熱ピーク（融点）が示されることが確認された。

Ａｓ_４Ｏ_６−ａ及びＡｓ_４Ｏ_６−ｂの粉末Ｘ線回折分光図を図１に図示し、Ａｓ_４Ｏ_６−ａ及びＡｓ_４Ｏ_６−ｂの回折データは次の表２の通りである。

図１及び表２から確認できるように、Ａｓ_４Ｏ_６−ａは２θ値１３．８と２７．９で示される主ピークの割合が１：１．３であり、Ａｓ_４Ｏ_６−ｂは２θ値１３．８と２７．９で示される主ピークの割合が１：２．５であることを特徴とする。製造された化合物のＤＳＣ分析、構造結晶、及びＸ線回折分析は、次のような方法により遂行した。

（１）ＤＳＣ分析

ＤＳＣ装備（SDT Q600 V20.9 Build 20）で、Ｎ_２１００ｍＬ／ｍｉｎを流しながら１０℃／ｍｉｎ昇温速度で３１０℃まで上昇させながら試料２０．０ｍｇを分析した。

（２）Ｘ線結晶学

六酸化四砒素（Ａｓ_４Ｏ_６、ＭＷ＝３９５．６）の単結晶をglass fiberの上に上げた後、X-ray beamを照射して回折されて出る写真紋と回折データの体系性の有無を観察して空間群（space group）を決定し、単位格子定数（cell parameter）を決定する。回折強さは１０゜＜２θ＜５０゜範囲で収集する。このデータを構造結晶プログラム（ＳＨＥＬＸＴＬプログラム）を使用して重原子方法（Patterson方法）によりＡｓ_４Ｏ_６の結晶構造を確認する。

（３）Ｘ線回折分析法

収得した結晶を粉砕して１０μｍ〜３０μｍ（−３２５メッシュ）の粒子に作り、Ｘ−線回折分析用ガラスホルダー（２０ｍｍ×１６ｍｍ×１ｍｍ）に充填させた後、ガラススライドなどで圧着させ、検体面とホルダー面が平行になるように滑らかにして試料を準備した。ＸＲＤのＣｕＫα_１（１．５４０６０Å）を用いて２θ １０°〜５０°範囲で１°／ｍｉｎの速度（scan step ０．０２°）で結晶のＸ−線回折分光図を描く。

比較例１：六酸化四砒素の製造

高嶺土で特殊製作された合成反応器（高さ１００ｍｍ、直径１９０ｍｍ）と、３〜６個のフィルターが装着できるクランプを準備する。クランプは合成反応器から５０ｍｍ離れて１次クランプを設置し、前記１次クランプから２〜６ｍｍ間隔でその上部に２次〜６次クランプを設置し、この時の各クランプの規格は直径２１０ｍｍ及び厚さ１０ｍｍである。

称量した太い塩（水分含有量１０％以下）４００ｇ〜６００ｇを合成反応器に投入して２０ｍｍ内外に厚さを均等に押し固めて１００℃〜８００℃３時間の間熱を徐々に加熱しながら反応器の内部の塩表面温度が２９０±３０℃になるように連続加熱して水分及び不純物を除去し、室温で５時間の間冷却させる。

クランプを用いてフィルターを固定させ、合成反応器の下部に熱を加えて１００℃から１，０００℃まで段階的に温度を上げる。まず、合成反応器の下部の外部温度を３５０℃±１００℃位になるように１時間の間加熱し、以後に合成反応器の下部の外部温度を６００〜６５０℃、及び７００〜１，０００℃位になるように加熱して、総５時間〜１０時間の間加熱してフィルターの最上部の濾過紙の中心部の温度が１５０℃±１００℃を維持するようにした後、常温で５〜７時間位冷却する。この過程で、合成反応器の塩の上に上げている粉末Ａｓ_２Ｏ_３は合成反応器の内部で気体に変わって上昇してから、合成反応器の外部の上部温度が相対的に低いので液体に変わり、以後、固体に結晶化されてフィルター上に白色結晶体が生成される。フィルターから４８．５ｇの結晶を採取した。採取した砒素化合物の結晶構造を確認した結果、９９％以上が大部分Ａｓ_４Ｏ_６−ｂであると確認された。

比較例２乃至４：六酸化四砒素の製造

実施例１（結晶多形Ａｓ_４Ｏ_６−ａが９９％以上である組成物）と比較例１（結晶多形Ａｓ_４Ｏ_６−ｂが９９％以上である組成物）を各々４：１、及び１：１に混合して、各々比較例２及び比較例３にした。

実験例１：ヒト乳癌（human breast cancer）細胞増殖抑制効果実験

（１）実験材料及び細胞培養

牛胎兒血清（ＦＢＳ）と細胞培養培地を準備し（Hyclone社）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、３−（４，５−ジメチル−チアゾール−２イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（３−（４，５−dimetyl-thiazol-2yl）−２，５−diphenyltetrazolium bromide、ＭＴＴ）を準備した（Amresco LLC、ＵＳＣ）。

ヒトの癌細胞株であって、ヒト乳癌細胞株（human breast cancer cells）であるＭＣＦ−７細胞及びＳＫ−ＢＲ−３細胞を中国科学アカデミーの上海細胞銀行から分譲を受けて、ＭＣＦ−７細胞は１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンが含まれたＭＥＭ（Minimum Essential Media）培地を、ＳＫ−ＢＲ−３細胞は１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンが含まれたＤＭＥＭ（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）培地を用いて５％ＣＯ_２及び９５％空気と湿気がある状態の培養器で細胞を培養した。培地は３日毎に交替した。

（２）細胞増殖アッセイ（ＭＴＴアッセイ）

実施例１、及び比較例１乃至３の細胞増殖に対する効果をＭＴＴアッセイを用いて評価した。ＭＴＴアッセイはＭＴＴに対して生きている細胞が不溶性暗青色ホルマザン反応物を生成する能力に基盤する。トリプシンを処理して細胞を培地に浮遊させて集めた後、４×１０^３細胞／ウェル（cells／well）の密度で９６−ウェル培養ディッシュ（Costar、Cambridge、ＭＡ、ＵＳＡ）に分株される。２４時間後に、実施例１、及び比較例１乃至３の各々を０、０．６２５、１．２５、２．５、５、１０、２０、４０、または８０μMになるように１０％のＦＢＳを含む培地が入っている細胞に処理して培養した。この際、実施例１、及び比較例１乃至３は、１Ｍ水酸化ナトリウムに５×１０^−２Ｍ濃度で溶解させた貯蔵溶液を用いた。細胞増殖に対するＭＴＴアッセイを遂行するために、試料処理後、４８時間及び７２時間の間培養した細胞から上澄液を除去し、ウェル（well）当たり５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ溶液を２０μＬずつ添加してから、ホルマザン結晶を形成するために３７℃で４時間の間インキュベーションした。インキュベーション後に、上澄液をまた除去し、ＤＭＳＯを全てのウェル当たり１００μＬずつ添加し、暗青色結晶を完全に溶解するように混合した。室温で１５分間放置して全ての結晶が完全に溶解されるようにし、５７０ｎｍ（Ａ_{５７０ｎｍ}）波長でマイクロ−プレート機で吸光度を測定した。

（３）統計分析

試料を処理しない対照群の吸光度値を１００として計算し、前記対照群対比試料を処理した処理群の吸光度値を較正（calibration）し、細胞増殖抑制率を以下の式によって計算した。

細胞増殖抑制率（％）＝（（対照群細胞の平均吸光度−処理群細胞の

平均吸光度）／対照群細胞の平均吸光度）×１００

全てのデータは平均±標準誤差（means±ＳＥＭ）で表現される。１元配置分散分析（one-way analysis of variance、ＡＮＯＶＡ）後、ダネットの事後検証（Dunnett’s post-test）により多重比較を遂行した。留意水準はｐ＜０．０５であり、各実験は３回ずつ反復された。

（４）ＭＣＦ−７細胞利用結果

実施例１、及び比較例１乃至３をヒト乳癌細胞株であるＭＣＦ−７細胞に処理してから、４８時間及び７２時間培養し、ＭＴＴアッセイを遂行した結果を図２に示した。実施例１を処理した後、４８時間（図２Ａ）及び７２時間（図２Ｂ）培養した実験結果全てで、比較例１を処理した場合に比べて乳癌細胞株であるＭＣＦ−７細胞の増殖抑制率の高いことが確認された。また、実施例１と比較例１が４：１に混合された比較例２や、１：１に混合された比較例３に比べて、ＭＣＦ−７細胞の増殖抑制率の高いことが確認された。

（５）ＳＫ−ＢＲ−３細胞利用結果

実施例１、及び比較例１乃至３をヒト乳癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ−３細胞に処理してから、４８時間及び７２時間培養し、ＭＴＴアッセイを遂行した結果を図３に示した。実施例１を処理した後、４８時間（３Ａ）及び７２時間（図３Ｂ）培養した実験結果全てで、比較例１に比べて乳癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ−３細胞の増殖抑制率の高いことが確認された。また、実施例１と比較例１が４：１に混合された比較例２や、１：１に混合された比較例３に比べて、ＳＫ−ＢＲ−３細胞の増殖抑制率の高いことが確認された。

実験例２：ヒト乳癌（human breast cancer）細胞死滅誘導効果実験

（１）実験材料及び細胞培養

牛胎兒血清（ＦＢＳ）と細胞培養培地を準備（Hyclone社）した。RT-PCR Kit及びTrizolはTakara Biotechnology CO., LTD.から、Annexin V-FITCはShanghai Biyuntian Biological Technology CO., LTD.,から入手した。プライマーはBeijing Aodingkangsheng Biological Technology CO., LTD.社に依頼してデザイン及び合成した。

ヒトの癌細胞株であって、ヒト乳癌細胞株（human breast cancer cells）であるＭＣＦ−７細胞を中国科学アカデミーの上海細胞銀行から分譲を受けて、ＭＣＦ−７細胞は１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンが含まれたＭＥＭ（Minimum Essential Media）培地を用いて５％ＣＯ_２及び９５％空気と湿気がある状態の培養器で細胞を培養した。培地は３日毎に交替した。

（２）流細胞分析器（flow cytometry）利用

実施例１の細胞死滅（apoptosis）誘導に対する効果を流細胞分析器を用いて評価した。６−ウェル培養ディッシュに１×１０^５細胞／ウェル（cells／well）を分株し、２４時間の間培養した。２４時間後に、実施例１を０、１、３、６、９、１２、または１５μMになるように１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地が入っている細胞に処理して２４時間の間培養した。２４時間後に細胞死滅を確認するためにAnnexin V-FITC kitを用いて細胞に処理し、自然的な細胞死との区別のためにＰＩ（propidium iodide）も共に処理した。この際、ＰＩとAnnexin V-FITC kitの利用方法に従って実験を進行した。Annexin V-FITC kitで処理した細胞をBD FACS calibur流細胞分析器を通じて細胞死滅程度を分析し、その結果を図４に示した。実施例１を処理した後、annexin VとＰＩとして標識された細胞を流細胞分析器で分析した結果（４Ａ）及びＰＩ対比annexin Vの量を分析して細胞死滅率（４Ｂ）を確認した結果、実施例１の処理濃度が増加することによって細胞死滅が増加することが確認された。

（３）逆転写重合酵素連鎖反応（reverse transcription polymerase chain reaction、ＲＴ−ＰＣＲ）利用

実施例１の細胞死滅誘導に対する影響を確認するためにＲＴ−ＰＣＲを用いて細胞周期及び細胞死滅と関連した遺伝子であるcaspase-3、p21、cyclin E1、及びcyclin A2のｍＲＮＡ発現程度を確認した。６−ウェル培養ディッシュに１×１０^５細胞／ウェル（cells／well）を分株し、２４時間の間培養した。２４時間後に、実施例１を０、１、３、６、９、１２、または１５μMになるように１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地が入っている細胞に処理して２４時間の間培養した。２４時間後に細胞を収集した後、Trizol試薬を用いてＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡを鋳型にし、以下の表３のプライマー及びRT-PCR kitを用いて遺伝子増幅を遂行し、アガロースゲルに電気泳動してcaspase 3、p21、cyclin E1、cyclin A2のｍＲＮＡ発現量の変化を確認し、その結果を図５に示した。この際、ローディング対照群にβ-actinの発現量も共に確認した。実施例１を処理した結果、細胞死滅と関連した細胞周期を調節する遺伝子であるp21とCyclin E1及び細胞死滅と関連したcaspase-3のｍＲＮＡ発現が実施例１の濃度増加によって増加する一方、細胞増殖に関連した細胞周期調節因子であるCyclin A2のｍＲＮＡ発現は減少することが確認された。

これを通じて、実施例１の六酸化四砒素が乳癌細胞の死滅を誘導することによって乳癌が治療できることが分かった。

実験例３：乳癌転移抑制効果確認試験

実験動物は特定病原菌及び呼吸器疾患から安全で、５週齢の体重が１８〜２０ｇ位であるbabl／c-nu雄ヌードマウス（nude mouse）を用いた。ヌードマウスは飲食と水を自由に摂取するようにし、１２時間の夜と１２時間の昼を周期にして７日間飼育した。

マウスにヒト乳癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を皮下注射して移植し、７日間飼育した。７日後にマウスをランダムに分けた後、各々のマウスに実施例１及び比較例１の組成物を４．５ｍｇ／ｋｇになるように７日間経口投与した。この際、乳癌細胞移植後、なんにも処理しないマウスを対照群に用いた。組成物投与７日後にマウスから肺組織を取って肺に転移された癌細胞を数えて乳癌転移抑制程度を比較した。

その結果、乳癌細胞を移植し、なんにも処理しない対照群の場合には移植された乳癌細胞が大部分肺に転移された一方、比較例１を処理した群と実施例１を処理した群の場合、肺への転移が抑制されたことを確認し、特に実施例１の場合、癌転移抑制率が９０％以上で、５０％癌転移抑制率を示す比較例１に比べて癌転移抑制効果が顕著に優れることを確認した。

実験例４：臨床試験

実施例１の組成物を用いて次のように臨床試験を施行した。

２００６年に乳癌が発見されて病院治療と民間療法などを施行したが、肺、胸膜、骨、及び肝に転移されて、２０１４年５月に胸水と腹膜に腹水が溜まって数回に亘って胸水を抜いた。しかしながら、悪性胸水による深刻な呼吸困難により応急室及びホスピス病棟で酸素呼吸器を通じて呼吸したが、酸素不足によって蒼白症が表れ始めて、生存期間１週間位を残した状態で実施例１を毎日５ｍｇずつ３回（１５ｍｇ／日）経口服用した。

この患者の実施例１の投与前及び投与後８ケ月、１３ケ月、１７ケ月、２２ケ月のＣＴ写真は図６に示した。実施例１の投与前には右側肺と左側肺への転移によって気道が閉鎖されていたが、投与８ケ月、１３ケ月、１７ケ月、及び２２ケ月後には投与期間が増えることによって両側肺にいた癌のサイズが減ることを確認した。

臨床試験結果を通じて本発明の組成物は転移性乳癌の治療効果があると確認された。

Claims

有効成分として六酸化四砒素（Ａｓ_４Ｏ_６）を含む乳癌予防または治療用薬学組成物であって、
前記六酸化四砒素は、以下の（i）乃至（iii）の特性
（i）単位格子定数：
ａ＝ｂ＝ｃ＝１１．０７３４Å
α＝β＝γ＝９０°
Ｖ＝１３５７．８２Å^３
（ii）Ａｓ−Ｏ結合長さ：１．７８６Å
（iii）Ｏ−Ａｓ−Ｏ結合角：９８．３６゜
を有する六酸化四砒素の結晶多形ａが９９重量％以上である
ことを特徴とする乳癌予防または治療用薬学組成物。
前記六酸化四砒素は、
塩化ナトリウムを１００〜８００℃に加熱した後、冷却する第１工程；
塩化ナトリウムの上に三酸化二砒素（Ａｓ_２Ｏ_３）を上げた後、密閉状態で１００℃から１０００℃まで加熱した後、冷却する第２工程；
昇華された砒素を捕集する濾過紙で結晶化された結晶を分離する第３工程；及び
前記第３工程で得た結晶を第２工程の三酸化二砒素の代わりに使用して第２工程及び第３工程を４〜１０回繰り返して六酸化四砒素結晶を得る第４工程；
を通じて製造される
ことを特徴とする請求項１に記載の乳癌予防または治療用薬学組成物。
前記六酸化四砒素は純度が９９．９％以上である
請求項１に記載の乳癌予防または治療用薬学組成物。
前記結晶多形ａはＸ−線粉末回折分光図で、光源波長が１．５４０６Åの時、回折角２θ＝１０〜５０°で１°／ｍｉｎの速度（scan step ０．０２°）で表示されたピークが１３．８４、２７．８８、３２．３２、３５．３、３９．８４、４２．３８、４６．３４、４８．６、及び４９．３４と示される
請求項１に記載の乳癌予防または治療用薬学組成物。
有効成分として六酸化四砒素（Ａｓ_４Ｏ_６）を含む乳癌転移抑制用薬学組成物であって、
前記六酸化四砒素は、以下の（i）乃至（iii）の特性
（i）単位格子定数：
ａ＝ｂ＝ｃ＝１１．０７３４Å
α＝β＝γ＝９０°
Ｖ＝１３５７．８２Å^３
（ii）Ａｓ−Ｏ結合長さ：１．７８６Å
（iii）Ｏ−Ａｓ−Ｏ結合角：９８．３６゜
を有する六酸化四砒素の結晶多形ａが９９重量％以上である
ことを特徴とする乳癌転移抑制用薬学組成物。