JP6824409B2

JP6824409B2 - 六酸化四砒素の結晶多形を含む癌予防または治療用薬学組成物

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Publication number: JP6824409B2
Application number: JP2019529224A
Authority: JP
Inventors: ジュペ、イル; リアン、ゼンリン
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Priority date: 2016-12-09
Filing date: 2017-12-04
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Description

本発明は、六酸化四砒素の結晶多形を含む癌予防または治療用薬学組成物に関するものである。

癌は制御されない細胞成長と特徴付けられ、このような異常な細胞成長により腫瘍（tumor）と呼ばれる細胞塊りが形成されて周囲の組織に侵入し、甚だしい場合には身体の他の器官に転移されることもある。学問的には新生物（neoplasia）とも呼ばれる。癌は多様な程度の有病率で身体の全ての組織及び臓器に影響を及ぼす。

癌の種類は初めて癌細胞が発生した組織及び臓器によって分類するか、または癌細胞の形態と発生起源によって分類することもある。多くは肺癌、胃癌、大腸癌、子宮頚部癌などは腫瘍が初めて生じた臓器を基準に称する。また、発生起源面では大別して結合組織性腫瘍、上皮性腫瘍、腺癌などに区分されることもある。我が国の場合、最も多く発生した癌は甲状腺癌であり、次に、胃癌、大腸癌、肺癌の順に発病率が高い。

癌の治療は臓器に固形化された癌組織を除去するか、または癌細胞を殺す積極的な治療療法と、癌細胞の進行を遅延させて副作用を最小化する緩和療法とに区分される。癌発生初期段階の場合、手術、坑癌化学的療法、放射線治療などを通じて腫瘍を除去するか、または化学薬物及び放射線などで癌細胞を殺す治療方法を選択することができる。しかしながら、末期癌患者の場合、積極的な治療療法による副作用が相対的に大きいため、癌細胞の進行を遅らせて副作用を減らし、生活の質を高める治療法を選択することができる。一般に、抗癌剤は積極的な治療療法に属する坑癌化学療法をいい、癌細胞を毒性物質で死滅させる細胞毒性抗癌剤、癌細胞及び組織の周辺の新生血管に選択的に作用する標的抗癌剤などを含む（非特許文献１）。

大部分の抗癌剤は速く成長、分裂する癌細胞に作用して効果を表す薬剤であって、成長分裂が速い一部の定常細胞も攻撃して副作用を起こし、まだ完璧に癌を治療することができる治療剤は開発されていない。したがって、癌の治療と関連して優れる坑癌効果を有する治療剤の開発が持続的に要求されている実状である。

一方、本発明者らは既に砒素が含まれた自然産信石から分離精製技術を通じて精製された六酸化四砒素が動物実験で癌転移抑制効果を示し、併せて、子宮癌、膀胱癌、肺癌、上顎洞癌、腎臓癌などの末期癌患者に投与した時、優れる坑癌治療効果があるという技術的特徴として特許登録（特許文献１）を受けたことがある。

本発明者らが砒素に対する持続的な研究結果、前記特許登録に開示された方法と異なる新規な製造方法により、六酸化四砒素の結晶多形ａが９９％以上である六酸化四砒素を製造することができ、このような六酸化四砒素を含む組成物が多様な癌の成長を抑制して癌の予防または治療に顕著な効果があることを明らかにして本発明を完成するようになった。

韓国特許登録第２７２８３５号（天然化学物質六酸化四砒素の新規な抗腫瘍治療剤としての用途及びその薬学的組成物、２０００．０８．３０．登録）

ジョングンヨン、坑癌化学療法の紹介及び治療動向、BRIC View動向リポート、２０１６−Ｔ２０、２０１６

本発明の目的は、有効成分として六酸化四砒素（Ａｓ_４Ｏ_６）の結晶多形を含む癌予防または治療用薬学組成物を提供することにある。

本発明の他の目的は、有効成分として六酸化四砒素（Ａｓ_４Ｏ_６）の結晶多形を含む癌予防または治療用薬学組成物の製造方法を提供することにある。

本発明は六酸化四砒素（Ａｓ_４Ｏ_６）を含む癌予防または治療用薬学組成物であって、前記六酸化四砒素は六酸化四砒素結晶多形ａ（Ａｓ_４Ｏ_６−ａ）が９９％以上である癌予防または治療用薬学組成物に関するものである。

前記組成物の六酸化四砒素は、塩化ナトリウムを１００〜８００℃に加熱した後、冷却する第１工程；塩化ナトリウムの上に三酸化二砒素（Ａｓ_２Ｏ_３）を上げた後、密閉状態で１００℃から１０００℃まで加熱した後、冷却する第２工程；昇華された砒素を捕集する濾過紙で結晶化された結晶を分離する第３工程；及び前記第３工程で得た結晶を第２工程の三酸化二砒素の代わりに使用して第２工程及び第３工程を４〜１０回繰り返して六酸化四砒素結晶を得る第４工程；を通じて製造できる。

前記組成物は、六酸化四砒素の結晶多形ｂ（Ａｓ_４Ｏ_６−ｂ）が１％未満に含むことができる。

前記六酸化四砒素は、純度が９９．９％以上でありうる。

前記Ａｓ_４Ｏ_６−ａ及びＡｓ_４Ｏ_６−ｂは以下の（i）乃至（iii）の特性を有するものでありうる：

前記Ａｓ_４Ｏ_６−ａはＸ−線粉末回折分光図で、光源波長が１．５４０６Åの時、回折角２θ １０°〜５０°範囲で、１°／ｍｉｎの速度（scan step ０．０２°）で表示されたピークが１３．８４、２７．８８、３２．３２、３５．３、３９．８４、４２．３８、４６．３４、４８．６、及び４９．３４と示されることを特徴とする結晶形である（図１参照）。また、２θ値１３．８と２７．９で示される主ピークの割合が１：１．３であることを特徴とする。

前記Ａｓ_４Ｏ_６−ｂはＸ−線粉末回折分光図で、光源波長が１．５４０６Åの時、回折角２θ １０°〜５０°範囲で１°／ｍｉｎの速度（scan step ０．０２°）で表示されたピークが１３．８６、２７．９２、３２．３６、３５．３４、３９．９、４２．４４、４６．４、４８．６６、及び４９．４と示されることを特徴とする結晶形である（図１参照）。また、２θ値１３．８と２７．９で示される主ピークの割合が１：２．５であることを特徴とする。

前記癌は、肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、前立腺癌、膵贓癌、子宮頚部癌、卵巣癌、及び子宮内膜癌からなる群より選択できる。

以下、本発明をより詳細に説明する。

本発明は有効成分として六酸化四砒素（Ａｓ_４Ｏ_６）を含む癌予防または治療用薬学組成物であって、前記六酸化四砒素は六酸化四砒素の結晶多形ａ（Ａｓ_４Ｏ_６−ａ）が９９％以上である薬学組成物に関するものである。

本発明の他の態様によれば、有効成分として六酸化四砒素（Ａｓ_４Ｏ_６）の結晶多形を含む癌予防または治療用薬学組成物の製造方法であって、塩化ナトリウムを１００〜８００℃に加熱した後、冷却する第１工程；塩化ナトリウムの上に三酸化二砒素（Ａｓ_２Ｏ_３）を上げた後、密閉状態で１００℃から１０００℃まで加熱した後、冷却する第２工程；昇華された砒素を捕集する濾過紙で結晶化された結晶を分離する第３工程；及び前記第３工程で得た結晶を第２工程の三酸化二砒素の代わりに使用して第２工程及び第３工程を４〜１０回繰り返して六酸化四砒素結晶を得る第４工程；を含む方法により製造され、前記第４工程で得た六酸化四砒素結晶が六酸化四砒素の結晶多形ａ（Ａｓ_４Ｏ_６−ａ）を９９％以上含む癌予防または治療用薬学組成物の製造方法に関するものである。

高嶺土材質の合成反応器、及び合成反応器の上部にフィルターが装着できるクランプを準備し、合成反応器内に塩化ナトリウムをあげて加熱及び冷却を進行する。本発明の製造方法で塩化ナトリウムを使用する理由は、第２工程で三酸化二砒素を塩化ナトリウムの上にあげて加熱することによって、砒素化合物に熱が均等に伝達されながら砒素化合物が昇華することに助けになるためであり、第１工程を通じてこのような塩化ナトリウムの不純物及び水分を除去するために１００〜８００℃に２〜６時間の間加熱する。第１工程において、塩化ナトリウムを加熱した後、室温で３〜１０時間の間冷却する。

次に、塩化ナトリウムの上に三酸化二砒素（Ａｓ_２Ｏ_３）を上げた後、密閉状態で１００℃から１０００℃まで加熱し、以後、冷却する第２工程を進行する。ここで、三酸化二砒素を上げた後、クランプに昇華される砒素が捕集できるフィルター（濾過紙）を各フィルターとフィルターとの間の間隔が２ｍｍ〜６ｍｍになるように３〜６個装着する。この時に使われるフィルターは、平量（basic weight）７０〜１００ｇ／ｍ２、厚さ（thickness）０．１７〜０．２５ｍｍ、濾過速度（filtration speed）２２〜３０ｓ／１００ｍｌ、及び保留粒子径（retention rate）５〜１０μｍのものを使用することが好ましい。

フィルターを装着してから密閉させた後、合成反応器の下部に１００℃から１０００℃まで段階的に上げながら３時間〜１０時間の間加熱して濾過紙の最上部の中心部の温度は１５０℃±１００℃維持されるようにし、濾過紙を通過しながら六酸化四砒素が結晶化されるようにする。そして、常温で５時間以上、好ましくは５時間〜１０時間の間冷却する。

次に、離隔して積層に設置された３〜６個の濾過紙に捕集された白色結晶を分離する第３工程を遂行する。

合成反応器の塩化ナトリウムの上に残留する微量の三酸化二砒素を除去した後、前記捕集された白色結晶を上げた後、第２工程及び第３工程を同一条件で４〜１０回繰り返して最終的に六酸化四砒素結晶を収得する。本発明の製造方法により得られた結晶構造を確認した結果、大部分Ａｓ_４Ｏ_６−ａであり、Ａｓ_４Ｏ_６−ａが９９％以上であることが確認された。

本発明の六酸化四砒素の結晶多形を含む薬学組成物は、癌予防または治療に有用に使用できる。

本発明の薬学組成物は各々通常の方法によって、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾールなどの経口型剤形、外用剤、坐剤、及び滅菌注射溶液の形態に剤形化して使用できる。前記薬学組成物に含まれることができる担体、賦形剤、及び希釈剤には、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、非晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシ安息香酸、プロピルヒドロキシ安息香酸、タルク、マグネシウムステアレート、及び鉱物油を挙げることができる。製剤化する場合には、普通使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤、または賦形剤を使用して調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれて、このような固形製剤は本発明の六酸化四砒素に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤の以外にマグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も使われる。経口のための液状製剤には、懸濁剤、内用液剤、油剤、シロップ剤などが該当されるが、よく使われる単純希釈剤である水、リキッドパラフィンの以外にさまざまな賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれることができる。非経口投与のための製剤には滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、油剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどが使用できる。坐剤の基剤には、ウィテップゾール（witepsol）、マクロゴール、ツイーン（tween）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用できる。

前記薬学組成物の投与量は治療を受ける対象の年齢、性別、体重と、治療する特定疾患または病理状態、疾患または病理状態の深刻度、投与経路及び処方者の判断によって変わる。このような因子に基づいた投与量の決定は当業者の水準内にあり、一般的に投与量は０．０１ｍｇ／ｋｇ／日乃至略５００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。より好ましい投与量は０．１ｍｇ／ｋｇ／日乃至１００ｍｇ／ｋｇ／日である。投与は１日に１回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。前記投与量はどんな面でも本発明の範囲を限定するものではない。

前記薬学組成物は、ネズミ、家畜、ヒトなどの哺乳動物に多様な経路に投与できる。投与の全ての方式は予想できるが、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内粘膜、または脳血管内注射により投与できる。

本発明の癌予防または治療用薬学組成物は、六酸化四砒素の結晶多形ａが９９％以上である六酸化四砒素を含むことによって、優れる坑癌効果を有する。

Ａｓ_４Ｏ_６−ａ及びＡｓ_４Ｏ_６−ｂのＸ−線粉末回折分光図肺癌細胞株であるＮＣＬ−Ｈ２２６に実施例１、及び比較例１乃至３を処理し、４８時間（図２Ａ）及び７２時間（図２Ｂ）の間培養した後、細胞増殖抑制効果を評価した結果グラフ肺癌細胞株であるＮＣＬ−Ｈ２２６及びＳＫ−ＭＥＳ−１に１０ｕＭの実施例１を処理し、処理時間に従う肺癌細胞の増殖抑制効果を評価した結果グラフ食道癌細胞株であるＫＹＳＥ−１５０及びＴＥ−１に１０ｕＭの実施例１を処理し、処理時間に従う（図４Ａ）食道癌細胞の増殖抑制効果及びＴＥ−１に実施例１、及び比較例１乃至３を処理し、７２時間（図４Ｂ）の間培養した後、細胞増殖抑制効果を評価した結果グラフ胃癌細胞株であるＡＧＳに処理した実施例１の濃度及び処理時間に従う（図５Ａ）胃癌細胞の増殖抑制効果及びＡＧＳに実施例１、及び比較例１乃至３を処理し、７２時間（図５Ｂ）の間培養した後、細胞増殖抑制効果を評価した結果グラフ大腸癌細胞株であるＨＴ２９及びＨＣＴ１１６に１０ｕＭの実施例１を処理し、処理時間に従う（図６Ａ）大腸癌細胞の増殖抑制効果及びＨＴ２９に実施例１、及び比較例１乃至３を処理し、７２時間（図６Ｂ）の間培養した後、細胞増殖抑制効果を評価した結果のグラフ前立腺癌細胞株であるＰＣ−３に実施例１、及び比較例１乃至３を処理し、４８時間（図７Ａ）及び７２時間（図７Ｂ）の間培養した後、細胞増殖抑制効果を評価した結果のグラフ膵贓癌細胞株であるＢｘＰＣ−３に実施例１、及び比較例１乃至３を処理し、７２時間（図８Ａ）の間培養した後、細胞増殖抑制効果及び膵贓癌細胞株であるＢｘＰＣ−３及びＰＡＮＣ−１に実施例１を濃度別に処理して７２時間（図８Ｂ）の間培養した後、細胞増殖抑制効果を評価した結果のグラフ実施例１、及び比較例１乃至３を卵巣癌細胞株であるＳＫ−ＯＶ−３（図９Ａ）、子宮頚部癌細胞株であるＨｅＬａ（図９Ｂ）及び子宮内膜癌細胞株であるＨＥＣ−１Ｂ（図９Ｃ）に処理し、７２時間の間培養した後、細胞増殖抑制を評価した結果のグラフ実施例１のヒト肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、前立腺癌、膵贓癌、子宮頚部癌、卵巣癌、及び子宮内膜癌細胞株での細胞増殖抑制程度をＩＣ_５０値で比較した結果のグラフ

以下、本発明の好ましい実施例を詳細に説明する。しかしながら、本発明はここで説明される実施例に限定されず、他の形態に具体化されることもできる。むしろ、ここで紹介される内容が徹底し完全になり、当業者に本発明の思想を十分に伝達するために提供するものである。

実施例１：本発明の六酸化四砒素の製造

高嶺土で特殊製作された合成反応器（高さ１００ｍｍ、直径１９０ｍｍ）と、３〜６個のフィルターが装着できるクランプを準備する。クランプは合成反応器から５０ｍｍ離れて１次クランプを設置し、前記１次クランプから２〜６ｍｍ間隔でその上部に２次〜６次クランプを設置し、この際、各クランプの規格は直径２１０ｍｍ及び厚さ１０ｍｍである。

称量した太い塩（水分含有量１０％以下）４００ｇ〜６００ｇを合成反応器に投入して２０ｍｍ内外に厚さを均等に押し固めて１００℃〜８００℃で３時間の間熱を徐々に加熱しながら反応器の内部の塩表面温度が２９０±３０℃になるように連続加熱して水分及び不純物を除去し、室温で５時間の間冷却させる。

原料物質であるＡｓ_２Ｏ_３（純度９８％以上、製造社YUNNAN WENSHAN JINCHI ARSENIC CO., LTD.）１００ｇを合成反応器内の太い塩の上に入れて、合成機の上部に位置した昇華される砒素が捕集できるフィルター（濾過紙）を各フィルターとフィルターとの間の間隔が２〜６ｍｍになるように３〜６個のクランプを装着する。この時に使われるフィルターは、平量（basic weight）７０〜１００ｇ／ｍ２、厚さ（thickness）０．１７〜０．２５ｍｍ、濾過速度（filtration speed）２２〜３０ｓ／１００ｍｌ、及び保留粒子径（retention rate）５〜１０μｍのものを使用することが好ましい。

クランプを用いてフィルターを固定させ、合成反応器の下部に熱を加えて１００℃から１，０００℃まで段階的に温度を上げる。まず、合成反応器の下部の外部温度を３５０℃±１００℃位になるように１時間の間加熱し、以後に合成反応器の下部の外部温度を６００〜６５０℃、及び７００〜１，０００℃位になるように加熱して、総５時間〜１０時間の間加熱してフィルターの最上部の濾過紙の中心部の温度が１５０℃±１００℃を維持するようにした後、常温で５〜７時間位冷却する。この過程で、合成反応器の塩の上に上げている粉末Ａｓ_２Ｏ_３は合成反応器の内部で気体に変わって上昇してから、合成反応器の外部の上部温度が相対的に低いので、液体に変わり、以後、固体に結晶化されてフィルター上に白色結晶体が生成される。

採取した白色結晶体を合成反応器の太い塩の上に入れて、また加熱及び冷却し、結晶を採取する工程をまた４回繰り返して最終的に結晶１２．０ｇを得た。得られた砒素化合物の結晶の構造を確認した結果、大部分Ａｓ_４Ｏ_６−ａであり、Ａｓ_４Ｏ_６−ａが９９重量％以上であり、Ａｓ_４Ｏ_６−ｂが１重量％未満であることが確認された。

ＤＳＣ（示差走査熱分析）値が昇温速度が１０℃／ｍｉｎの時、Ａｓ_４Ｏ_６−ａは２８２．６７℃である点で吸熱ピーク（融点）が示されることが確認されており、Ａｓ_４Ｏ_６−ｂは２８６．７７℃である点で吸熱ピーク（融点）が示されることが確認された。

Ａｓ_４Ｏ_６−ａ及びＡｓ_４Ｏ_６−ｂの粉末Ｘ線回折分光図を図１に図示し、Ａｓ_４Ｏ_６−ａ及びＡｓ_４Ｏ_６−ｂの回折データは次の表２の通りである。

図１及び表２から確認できるように、Ａｓ_４Ｏ_６−ａは２θ値１３．８と２７．９で示される主ピークの割合が１：１．３で、Ａｓ_４Ｏ_６−ｂは２θ値１３．８と２７．９で示される主ピークの割合が１：２．５であることを特徴とする。製造された化合物のＤＳＣ分析、構造結晶、及びＸ線回折分析は、次のような方法により遂行した。

（１）ＤＳＣ分析

ＤＳＣ装備（SDT Q600 V20.9 Build 20）で、Ｎ_２１００ｍＬ／ｍｉｎを流しながら１０℃／ｍｉｎ昇温速度で３１０℃まで上昇させながら試料２０．０ｍｇを分析した。

（２）Ｘ線結晶学

六酸化四砒素（Ａｓ_４Ｏ_６、ＭＷ＝３９５．６）の単結晶をglass fiberの上に上げた後、X-ray beamを照射して回折されて出る写真紋と回折データの体系性の有無を観察して空間群（space group）を決定し、単位格子定数（cell parameter）を決定する。回折強さは１０゜＜２θ＜５０゜範囲で収集する。このデータを構造結晶プログラム（ＳＨＥＬＸＴＬプログラム）を使用して重原子方法（Patterson方法）によりＡｓ_４Ｏ_６の結晶構造を確認する。

（３）Ｘ線回折分析法

収得した結晶を粉砕して１０μｍ〜３０μｍ（−３２５メッシュ）の粒子に作り、Ｘ線回折分析用ガラスホルダー（２０ｍｍ×１６ｍｍ×１ｍｍ）に充填させた後、ガラススライドなどで圧着させ、検体面とホルダー面が平行になるように滑らかにして試料を準備した。ＸＲＤのＣｕＫα_１（１．５４０６０Å）を用いて２θ １０°〜５０°範囲で１°／ｍｉｎの速度（scan step ０．０２°）で結晶のＸ−線回折分光図を描く。

比較例１：六酸化四砒素の製造

高嶺土で特殊製作された合成反応器（高さ１００ｍｍ、直径１９０ｍｍ）と、３〜６個のフィルターが装着できるクランプを準備する。クランプは合成反応器から５０ｍｍ離れて１次クランプを設置し、前記１次クランプから２〜６ｍｍ間隔でその上部に２次〜６次クランプを設置し、この時の各クランプの規格は直径２１０ｍｍ及び厚さ１０ｍｍである。

称量した太い塩（水分含有量１０％以下）４００ｇ〜６００ｇを合成反応器に投入して２０ｍｍ内外に厚さを均等に押し固めて１００℃〜８００℃３時間の間熱を徐々に加熱しながら反応器の内部の塩表面温度が２９０±３０℃になるように連続加熱して水分及び不純物を除去し、室温で５時間の間冷却させる。

クランプを用いてフィルターを固定させ、合成反応器の下部に熱を加えて１００℃から１，０００℃まで段階的に温度を上げる。まず、合成反応器の下部の外部温度を３５０℃±１００℃位になるように１時間の間加熱し、以後に合成反応器の下部の外部温度を６００〜６５０℃、及び７００〜１，０００℃位になるように加熱して、総５時間〜１０時間の間加熱してフィルターの最上部の濾過紙の中心部の温度が１５０℃±１００℃を維持するようにした後、常温で５〜７時間位冷却する。この過程で、合成反応器の塩の上に上がった粉末Ａｓ_２Ｏ_３は合成反応器の内部で気体に変わって上昇してから、合成反応器の外部の上部温度が相対的に低いので液体に変わり、以後、固体に結晶化されてフィルター上に白色結晶体が生成される。フィルターから４８．５ｇの結晶を採取した。採取した砒素化合物の結晶構造を確認した結果、９９重量％以上がＡｓ_４Ｏ_６−ｂであることが確認された。

比較例２乃至４：六酸化四砒素の製造

実施例１（結晶多形Ａｓ_４Ｏ_６−ａが９９％以上である組成物）と比較例１（結晶多形Ａｓ_４Ｏ_６−ｂが９９％以上である組成物）を各々４：１、及び１：１に混合して、各々比較例２及び比較例３にした。

実験例１：ヒト癌細胞（cancer cell）増殖抑制効果実験

（１）実験材料及び細胞培養

牛胎兒血清（ＦＢＳ）と細胞培養培地を準備し（Hyclone社）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、３−（４，５−ジメチル−チアゾール−２イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（３−（４，５−dimetyl-thiazol-2yl）−２，５−diphenyltetrazolium bromide、ＭＴＴ）を準備した（Amresco LLC、ＵＳＣ）。

ヒトの癌細胞株であって、ヒト肺癌細胞株（human lung cancer cells）であるＮＣＬ−Ｈ２２６及びＳＫ−ＭＥＳ−１、ヒト食道癌細胞株（human esophageal cancer cell）であるＫＹＳＥ−１５０及びＴＥ−１、ヒト胃癌細胞株（human gastric cancer cell）であるＡＧＳ、ヒト大腸癌細胞株（human colon cancer cell）であるＨＴ２９及びＨＣＴ１１６、ヒト前立腺癌細胞株（human prostate cancer cell）であるＰＣ−３、ヒト膵贓癌細胞株（human pancreatic cancer cell）であるＢｘＰＣ−３及びＰＡＮＣ−１、ヒト子宮頚部癌細胞株（human cervical cancer cell）であるＳｉＨａ及びＨｅＬａ、ヒト卵巣癌細胞株（human ovarian cancer cell）であるＳＫ−ＯＶ−３と、ヒト子宮内膜癌細胞株（human endometrial cancer cell）であるIshikawa、ＨＥＣ−１Ａ及びＨＥＣ−１Ｂ細胞を中国科学アカデミーの上海細胞銀行から分譲を受けて、細胞は１０％のＦＢＳ、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンが含まれた各細胞培養に適合した培地（RPMI-1640(NCL-H226, TE-1, BxPC-3, Ishikawa), MEM(SK-MES-1, SiHa, HeLa, HEC-1B), Ham's F-12K(AGS), Ham's F-12(PC-3), McCOY's 5A(HT29, HCT116, SK-OV-3, HEC-1A), RPMI-1640:Ham's F-12=1:1(v:v)(KYSE-150), DMEM(PANC-1)）を用いて５％ＣＯ_２及び９５％空気と湿気がある状態の培養器で細胞を培養した。培地は３日毎に交替した。

（２）細胞増殖アッセイ（ＭＴＴアッセイ）

実施例１、及び比較例１乃至３の細胞増殖に対する効果をＭＴＴアッセイを用いて評価した。ＭＴＴアッセイは、ＭＴＴに対して生きている細胞が不溶性暗青色ホルマザン反応物を生成する能力に基盤する。トリプシンを処理して細胞を培地に浮遊させて集めた後、４×１０^３細胞／ウェル（cells／well）の密度で９６−ウェル培養ディッシュ（Costar、Cambridge、ＭＡ、ＵＳＡ）に分株される。２４時間後に、実施例１、及び比較例１乃至３の各々を０、０．６２５、１．２５、２．５、５、１０、２０、４０、または８０μMになるように１０％ＦＢＳを含む培地が入っている細胞に処理して培養した。この際、実施例１、及び比較例１乃至３は、１Ｍ水酸化ナトリウムに５×１０^−２Ｍ濃度で溶解させた貯蔵溶液を用いた。細胞増殖に対するＭＴＴアッセイを遂行するために、試料処理後、２４時間、４８時間、及び７２時間の間培養した細胞から上澄液を除去し、ウェル（well）当たり５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ溶液を２０μｌずつ添加してからホルマザン結晶を形成するために３７℃で４時間の間インキュベーションした。インキュベーション後に、上澄液をまた除去し、ＤＭＳＯを全てのウェルに１００μｌずつ添加し、暗青色結晶を完全に溶解するように混合した。室温で１５分間放置して全ての結晶が完全に溶解されるようにし、５７０ｎｍ（Ａ_{５７０ｎｍ}）波長でマイクロ−プレート機で吸光度を測定した。

（３）統計分析

試料を処理しない対照群の吸光度値を１００に計算し、前記対照群対比試料を処理した処理群の吸光度値を較正（calibration）し、細胞増殖抑制率を以下の式によって計算した。

細胞増殖抑制率（％）＝（（対照群細胞の平均吸光度−処理群細胞の平均吸光度）／対照群細胞の平均吸光度）×１００

全てのデータは平均±標準誤差（means±ＳＥＭ）で表現される。１元配置分散分析（one-way analysis of variance、ＡＮＯＶＡ）後、ダネットの事後検証（Dunnett’s post-test）により多重比較を遂行した。留意水準はｐ＜０．０５であり、各実験は３回ずつ反復された。

（４）肺癌細胞株の増殖抑制確認結果

実施例１、及び比較例１乃至３をヒト肺癌細胞株であるＮＣＬ−Ｈ２２６及びＳＫ−ＭＥＳ−１に処理してから、２４時間、４８時間、及び７２時間の間培養し、ＭＴＴアッセイを遂行し、ＮＣＬ−Ｈ２２６を用いて得た結果を図２及び図３に示した。

実施例１及び比較例１乃至３をＮＣＬ−Ｈ２２６に処理した後、４８時間（図２Ａ）及び７２時間（図２Ｂ）の間培養した実験結果全てで、比較例１乃至３を処理した場合に比べて実施例１を処理した場合が肺癌細胞株であるＮＣＬ−Ｈ２２６の増殖抑制率の高いことが確認された。

また、１０ｕＭの実施例１をＮＣＬ−Ｈ２２６及びＳＫ−ＭＥＳ−１に処理し、処理時間に従う癌細胞増殖抑制を確認した結果（図３）、肺癌細胞株であるＮＣＬ−Ｈ２２６及びＳＫ−ＭＥＳ−１全て、処理時間によって細胞の増殖抑制率が増加することが確認された。

（５）食道癌細胞株の増殖抑制確認結果

実施例１、及び比較例１乃至３をヒト食道癌細胞株であるＫＹＳＥ−１５０及びＴＥ−１に処理してから、２４時間、４８時間、及び７２時間の間培養し、ＭＴＴアッセイを遂行し、図４に示した。

１０ｕＭの実施例１をＫＹＳＥ−１５０及びＴＥ−１に処理し、処理時間に従う癌細胞増殖抑制を確認した結果（図４Ａ）、食道癌細胞株であるＴＥ−１は処理時間によって細胞増殖抑制率が増加し、ＫＹＳＥ−１５０の場合には２４時間及び４８時間で細胞増殖抑制率が大差がなかったが、７２時間で細胞増殖抑制率が大きく増加したことが確認された。

また、実施例１及び比較例１乃至３をＴＥ−１に処理した後、７２時間（図４Ｂ）の間培養した実験結果全てで、比較例１乃至３を処理した場合に比べて実施例１を処理した場合が食道癌細胞株であるＴＥ−１の増殖抑制率の高いことが確認された。

（６）胃癌細胞株の増殖抑制確認結果

実施例１、及び比較例１乃至３をヒト胃癌細胞株であるＡＧＳに処理してから、２４時間、４８時間、及び７２時間の間培養し、ＭＴＴアッセイを遂行し、図５に示した。

実施例１を胃癌細胞株であるＡＧＳに濃度別に処理し、処理時間に従う癌細胞増殖抑制を確認した結果（図５Ａ）、各処理濃度で処理時間によって細胞増殖抑制が増加し、４８時間だけ処理しても胃癌細胞の増殖抑制率が高く示されることが確認された。

また、実施例１及び比較例１乃至３をＡＧＳに処理した後、７２時間（図５Ｂ）の間培養した実験結果全てで、比較例１乃至３を処理した場合に比べて実施例１を処理した場合が胃癌細胞株であるＡＧＳの増殖抑制率の高いことが確認された。

（７）大腸癌細胞株の増殖抑制確認結果

実施例１、及び比較例１乃至３をヒト大腸癌細胞株であるＨＴ２９及びＨＣＴ１１６に処理してから、２４時間、４８時間、及び７２時間の間培養し、ＭＴＴアッセイを遂行し、図６に示した。

１０ｕＭの実施例１をＨＴ２９及びＨＣＴ１１６に処理し、処理時間に従う癌細胞増殖抑制を確認した結果（図６Ａ）、ＨＴ２９及びＨＣＴ１１６細胞全て、処理時間によって細胞の増殖抑制率が増加したことが確認された。

また、実施例１及び比較例１乃至３をＨＴ２９に処理した後、７２時間（図６Ｂ）の間培養した実験結果全てで、比較例１乃至３を処理した場合に比べて実施例１を処理した場合が大腸癌細胞株であるＨＴ２９の増殖抑制率の高いことが確認された。

（８）前立腺癌細胞株の増殖抑制確認結果

実施例１、及び比較例１乃至３をヒト前立腺癌細胞株であるＰＣ−３に処理してから、４８時間及び７２時間の間培養し、ＭＴＴアッセイを遂行し、図７に示した。

実施例１及び比較例１乃至３をＰＣ−３に処理した後、４８時間（図７Ａ）及び７２時間（図７）の間培養した実験結果全てで、比較例１乃至３を処理した場合に比べて実施例１を処理した場合が前立腺癌細胞株であるＰＣ−３の増殖抑制率の高いことが確認された。

（９）膵贓癌細胞株の増殖抑制確認結果

実施例１、及び比較例１乃至３をヒト膵贓癌細胞株であるＢｘＰＣ−３及びＰＡＮＣ−１に処理してから、２４時間、４８時間、及び７２時間の間培養し、ＭＴＴアッセイを遂行し、図８に示した。

実施例１及び比較例１乃至３をＢｘＰＣ−３に処理した後、７２時間（図８Ａ）の間培養した実験結果全てで、比較例１乃至３を処理した場合に比べて実施例１を処理した場合が膵贓癌細胞株であるＢｘＰＣ−３の増殖抑制率の高いことが確認された。

また、膵贓癌細胞株であるＢｘＰＣ−３及びＰＡＮＣ−１に実施例１を濃度別に処理して７２時間の間培養した実験結果（図８Ｂ）で、両細胞全て実施例１の濃度依存的に細胞増殖抑制率が増加することが確認された。

（１０）卵巣癌、子宮頚部癌、及び子宮内膜癌細胞増殖抑制確認結果

実施例１、及び比較例１乃至３をヒト卵巣癌細胞株であるＳＫ−ＯＶ−３、ヒト子宮頚部癌細胞株であるＳｉＨａ及びＨｅＬａとヒト子宮内膜癌細胞株であるIshikawa、ＨＥＣ−１Ａ、及びＨＥＣ−１Ｂに処理してから、７２時間の間培養し、ＭＴＴアッセイを遂行した結果を図９に示した。

実施例１及び比較例１乃至３をヒト卵巣癌細胞株であるＳＫ−ＯＶ−３（図９Ａ）、ヒト子宮頚部癌細胞株であるＨｅＬａ（図９Ｂ）、及びヒト子宮内膜癌細胞株であるＨＥＣ−１Ｂ（図９Ｃ）に処理した後、７２時間の間培養した実験結果全てで、比較例１乃至３を処理した場合に比べて実施例１を処理した場合が卵巣癌細胞株、子宮頚部癌細胞株、及び子宮内膜癌細胞株の増殖抑制率の高いことが確認された。

（１１）多様な癌細胞株での細胞増殖抑制活性比較

前記ヒト肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、前立腺癌、膵贓癌、卵巣癌、子宮頚部癌、及び子宮内膜癌細胞の増殖抑制実験を通じて得た結果で、実施例１を７２時間処理した結果に基づいて実施例１のＩＣ_５０値を分析し、表３及び図１０にその結果を示した。

前記表３及び図１０から分かるように、癌細胞増殖抑制活性と関連した実施例１のＩＣ_５０値が全ての癌で低い濃度で示されることを確認した。

また、本発明で示してはいないが、本発明の六酸化四砒素が脳癌、乳癌、肝癌、皮膚癌など、多様な癌細胞の増殖を抑制することを確認した。

これを通じて、実施例１が肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、前立腺癌、膵贓癌、子宮頚部癌、卵巣癌、及び子宮内膜癌のように、多様な癌で、癌細胞の成長を抑制することによって、優れる坑癌効果を示すことが分かった。

Claims

有効成分として六酸化四砒素（Ａｓ_４Ｏ_６）を含む癌予防または治療用薬学組成物であって、
前記癌は、肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、前立腺癌、膵贓癌、子宮頚部癌、卵巣癌、及び子宮内膜癌からなる群より選択されるものであり、
前記六酸化四砒素は、以下の（i）乃至（iii）の特性
（i）格子定数：
ａ＝ｂ＝ｃ＝１１．０７３４Å
α＝β＝γ＝９０゜
Ｖ＝１３５７．８２Å^３
（ii）Ａｓ−Ｏ結合長さ：１．７８６Å
（iii）Ｏ−Ａｓ−Ｏ結合角：９８．３６゜
を有する六酸化四砒素の結晶多形ａが９９重量％以上である
ことを特徴とする癌予防または治療用薬学組成物。
請求項１に記載の癌予防または治療用薬学組成物の製造方法であって、
前記癌は、肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、前立腺癌、膵贓癌、子宮頚部癌、卵巣癌、及び子宮内膜癌からなる群より選択されるものであり、
前記六酸化四砒素は、
塩化ナトリウムを１００〜８００℃に加熱した後、冷却する第１工程；
塩化ナトリウムの上に三酸化二砒素（Ａｓ_２Ｏ_３）を上げた後、密閉状態で１００℃から１０００℃まで加熱した後、冷却する第２工程；
昇華された砒素を捕集する濾過紙で結晶化された結晶を分離する第３工程；及び
前記第３工程で得た結晶を第２工程の三酸化二砒素の代わりに使用して第２工程及び第３工程を４〜１０回繰り返して六酸化四砒素結晶を得る第４工程；
を通じて製造され、
前記第４工程で得られる六酸化四砒素は、前記結晶多形ａが９９重量％以上である
ことを特徴とする癌予防または治療用薬学組成物の製造方法。
前記六酸化四砒素は純度が９９．９％以上である
請求項１に記載の癌予防または治療用薬学組成物。
前記結晶多形ａはＸ−線粉末回折分光図で、光源波長が１．５４０６Åの時、回折角２θ １０°〜５０°範囲で１°／ｍｉｎの速度（scan step ０．０２°）で表示されたピークが１３．８４、２７．８８、３２．３２、３５．３、３９．８４、４２．３８、４６．３４、４８．６、及び４９．３４と示される
請求項１に記載の癌予防または治療用薬学組成物。