WO2018093215A1 - 육산화사비소의 결정다형을 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

육산화사비소의 결정다형을 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 이의 제조방법 Download PDF

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arsenic
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of breast cancer comprising polymorphic form of arsenic hexaoxide.
  • Cancer is characterized by uncontrolled cell growth, which results in the formation of cell masses called tumors that infiltrate surrounding tissues and, in severe cases, metastasize to other organs in the body. Academia is also called neoplasia. Cancer affects all tissues and organs of the body with varying degrees of prevalence.
  • Breast cancer ranks first among female tumors due to an increase in incidence due to improved living standards, economic changes and westernization, and changes in birth and feeding methods due to economic growth (Kamangar F., et al. , 2006).
  • Breast cancer is a malignant tumor that can spread to other organs and be life-threatening, unlike benign tumors that stay in the breast, and have a wide variety of biological characteristics, from metastatic breast cancer to solid tumors, and thus have various therapeutic options and prognosis.
  • the arsenic arsenic purified from the natural nephrite containing arsenic already showed a cancer metastasis inhibitory effect in animal experiments, and at the end of uterine cancer, bladder cancer, lung cancer, maxillary sinus cancer, kidney cancer, etc. It has received a patent registration (Korean Patent Registration No. 272835) as a technical feature that it has an excellent anti-cancer treatment effect when administered to cancer patients.
  • the present inventors can produce hexaarsenic hexaoxide which has a polymorphic a of 99% or more of arsenic hexaoxide by a novel manufacturing method different from the method disclosed in the above patent.
  • the composition comprising the present invention has been found to have a particularly significant effect in the prevention or treatment of breast cancer, to complete the present invention.
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of breast cancer comprising a polymorphic crystal of arsenic hexaoxide (As 4 O 6 ) as an active ingredient.
  • Another object of the present invention to provide a method for preparing a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of breast cancer comprising a polymorph of arsenic hexaoxide (As 4 O 6 ) as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition for inhibiting breast cancer metastasis comprising a polymorphic form of arsenic hexaoxide (As 4 O 6 ) as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating breast cancer, including arsenic hexaoxide as an active ingredient, wherein the arsenic hexaoxide is a composition for preventing or treating breast cancer, wherein the arsenic hexaoxide is polymorphic a (As 4 O 6 -a) of 99% or more. It is about.
  • the arsenic hexaoxide in the composition is a first step of cooling after heating sodium chloride to 100 ⁇ 800 °C; A second step of placing arsenic trioxide (As 2 O 3 ) on sodium chloride and then heating it from 100 ° C. to 1000 ° C. in a sealed state, followed by cooling; A third step of separating the crystallized crystals from the filter paper collecting the sublimed arsenic; And a fourth step of using the crystal obtained in the third step in place of the arsenic trioxide in the second step to obtain the arsenic hexaoxide hexadecimal crystal by repeating the second step and the third step 4 to 10 times. It can be prepared through.
  • the arsenic hexaoxide in the composition may contain less than 1% polymorphic b (As 4 O 6 -b) of arsenic hexaoxide.
  • the arsenic hexaoxide may be at least 99.9% pure.
  • As 4 O 6 -a and As 4 O 6 -b may have the following characteristics (i) to (iii):
  • O 6 -a is a peak represented by a velocity of 1 o / min (scan step 0.02 o ) in a diffraction angle 2 ⁇ 10 o to 50 o when the light source wavelength is 1.5406 ⁇ in X-ray powder diffraction spectrogram. Is 13.84, 27.88, 32.32, 35.3, 39.84, 42.38, 46.34, 48.6, and 49.34. In addition, the ratio of the main peak at 2 ⁇ values 13.8 and 27.9 is 1: 1.3.
  • O 6 -b is a peak represented by a velocity of 1 o / min (scan step 0.02 o ) in a diffraction angle 2 ⁇ 10 o to 50 o when the light source wavelength is 1.5406 ⁇ in X-ray powder diffraction spectrogram.
  • the ratio of the main peak at 2 ⁇ values 13.8 and 27.9 is 1: 2.5.
  • a pharmaceutical composition for inhibiting breast cancer metastasis comprising arsenic hexaoxide as an active ingredient, wherein the arsenic hexaoxide is a metabolite of arsenic hexaoxide oxidized polymorph a (As 4 O 6 -a) of 99% or more It relates to a pharmaceutical composition for inhibition.
  • the present invention is a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of breast cancer comprising arsenic hexaoxide (As 4 O 6 ) as an active ingredient, wherein the arsenic hexaoxide is 99% crystalline polymorph a (As 4 O 6 -a) It relates to a pharmaceutical composition as described above.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating breast cancer comprising a polymorphic form of arsenic hexaoxide (As 4 O 6 ) as an active ingredient
  • sodium chloride is cooled to 100 to 800 °C after heating First step;
  • It is prepared by a method comprising the hexaarsenic hexaoxide crystal obtained in the fourth step is a pharmaceutical for preventing or treating breast cancer, characterized in that containing more than 99% polymorphic a (As 4 O 6 -a) of arsenic hexaoxide. It relates to a method for preparing the composition.
  • a kaolin synthesis reactor and a clamp for mounting a filter on the top of the reactor are prepared, and sodium chloride is placed in the reactor to proceed with heating and cooling.
  • the reason why sodium chloride is used in the production method of the present invention is that in the second step, arsenic trioxide is placed on sodium chloride and heated to help sublimate the arsenic compound while transferring heat evenly to the arsenic compound. In order to remove impurities and moisture of the sodium chloride through 2 ⁇ 6 hours is heated to 100 ⁇ 800 °C. In the first step, sodium chloride is heated and cooled at room temperature for 3 to 10 hours.
  • the second step of heating from 100 ° C to 1000 ° C in a sealed state and then cooling is performed.
  • three to six filters (filter papers) capable of collecting arsenic sublimated in the clamp after mounting arsenic trioxide are mounted so that the distance between each filter and the filter is 2 mm to 6 mm.
  • the filter used at this time is a basic weight of 70 ⁇ 100g / m2, thickness 0.17 ⁇ 0.25mm, filtration speed 22 ⁇ 30s / 100ml, and retention rate of 5 ⁇ 10 ⁇ m It is preferable to use one.
  • the filter After the filter is installed and sealed, it is heated for 3 to 10 hours while gradually raising the temperature from 100 °C to 1000 °C in the lower part of the synthesis reactor to maintain the temperature of the top center of the filter paper at 150 °C ⁇ 100 °C. Allow arsenic hexaoxide to crystallize. Then, the mixture is cooled at room temperature for at least 5 hours, preferably 5 hours to 10 hours.
  • the pharmaceutical composition comprising the polymorphic form of arsenic hexaoxide of the present invention can be usefully used for preventing or treating breast cancer and inhibiting metastasis of breast cancer.
  • compositions of the present invention may be used in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, oral dosage forms, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions, respectively, according to a conventional method. .
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose , Methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, and such solid preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose in the hexaarsenic oxide of the present invention. Prepared with a mixture of tods and gelatin. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Oral liquid preparations include suspensions, solvents, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • the non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the dosage of the pharmaceutical composition will vary depending on the age, sex, weight of the subject to be treated, the particular disease or pathology to be treated, the severity of the disease or pathology, the route of administration and the judgment of the prescriber. Dosage determination based on these factors is within the level of those skilled in the art, and generally dosages range from 0.01 mg / kg / day to approximately 500 mg / kg / day. More preferred dosage is 0.1 mg / kg / day to 100 mg / kg / day. Administration may be once a day or may be divided several times. The dosage does not limit the scope of the invention in any aspect.
  • the pharmaceutical composition may be administered to mammals such as mice, livestock, humans, and the like by various routes. All modes of administration can be expected, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine mucosal or cerebrovascular injections.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating breast cancer of the present invention has an excellent anticancer effect by including arsenic hexaoxide having a polymorphic form a of arsenic hexaoxide of 99% or more.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is excellent in the effect of inhibiting breast cancer metastasis.
  • Example 2 is treated with Example 1 and Comparative Examples 1 to 3 in MCF-7 cells and cultured for 48 hours (FIG. 2A) and 72 hours (FIG. 2B) and evaluated for cell proliferation inhibitory effect by MTT assay. It is a graph.
  • Example 3 is treated with Example 1 and Comparative Examples 1 to 3 in SK-BR-3 cells and evaluated for cell proliferation inhibitory effect by MTT assay after 48 hours (FIG. 3A) and 72 hours (FIG. 3B) of culture.
  • FIG. 3A 48 hours
  • FIG. 3B 72 hours
  • FIG. 4 shows the results of detecting annexin V and PI labeled on cells with flow cytometry (4A) and annexin V compared to PI by treating Example 1 to MCF-7 cells by concentration. Analysis of the amount of cell death rate (4B) was confirmed.
  • Example 5 is a result of confirming the expression changes of genes related to cell cycle and apoptosis according to the concentration of Example 1 by treating Example 1 to MCF-7 cells by concentration.
  • Figure 6 is a pulmonary CT picture before and after administration of Example 1 to the patients with metastatic breast cancer in clinical trials confirming that the size of the tumor metastasized according to the administration of Example 1 is reduced.
  • 400g ⁇ 600g of weighed coarse salt (water content less than 10%) is added to the synthesis reactor, and the thickness is evenly squeezed to about 20mm and then heated slowly at 100 °C ⁇ 800 °C for 3 hours while the salt surface temperature inside the reactor is increased. Heat continuously to 290 ⁇ 30 °C to remove moisture and impurities and cool for 5 hours at room temperature.
  • the filter used at this time is a basic weight of 70 ⁇ 100g / m2, thickness 0.17 ⁇ 0.25mm, filtration speed 22 ⁇ 30s / 100ml, and retention rate of 5 ⁇ 10 ⁇ m It is preferable to use one.
  • the external temperature of the lower part of the reactor is heated to 350 ° C. ⁇ 100 ° C. for 1 hour, and then the external temperature of the lower part of the reactor is heated to 600 to 650 ° C. and 700 to 1,000 ° C. for a total of 5 hours.
  • the powder As 2 O 3 put on the salt of the synthesis reactor turns into gas and rises inside the synthesis reactor, and then turns into a liquid because the upper temperature outside the synthesis reactor is relatively low, and then crystallizes into a solid and white crystals on the filter. Is generated.
  • Powder X-ray diffraction spectrograms of As 4 O 6 -a and As 4 O 6 -b are shown in FIG. 1, and diffraction data of As 4 O 6 -a and As 4 O 6 -b are shown in Table 2 below. .
  • As 4 O 6 -a is the ratio of the main peak appearing at 2 ⁇ values 13.8 and 27.9 is 1: 1.3
  • As 4 O 6 -b is the note appearing at 2 ⁇ values 13.8 and 27.9.
  • the ratio of peaks is 1: 2.5.
  • DSC analysis, structure determination and X-ray diffraction analysis of the prepared compound were carried out in the following manner.
  • the obtained crystals were pulverized into particles of 10 ⁇ m to 30 ⁇ m (-325 mesh), filled in a glass holder (20 mm x 16 mm x 1 mm) for X-ray diffraction analysis, pressed with a glass slide, etc. Samples were prepared by smoothing the surfaces in parallel. Using XRD Cu K ⁇ 1 (1.54060 Hz), the X-ray diffraction spectra of the crystal are drawn at a rate of 1 o / min (scan step 0.02 o ) in the range of 2 ⁇ 10 o to 50 o .
  • 400g ⁇ 600g of weighed coarse salt (water content less than 10%) is added to the synthesis reactor, and the thickness is spread evenly within 20mm.
  • the salt surface temperature inside the reactor is heated to 290 °C ⁇ 800 °C for 3 hours. Continue heating to ⁇ 30 °C to remove moisture and impurities and allow to cool at room temperature for 5 hours.
  • the filter used at this time is a basic weight of 70 ⁇ 100g / m2, thickness 0.17 ⁇ 0.25mm, filtration speed 22 ⁇ 30s / 100ml, and retention rate of 5 ⁇ 10 ⁇ m It is preferable to use one.
  • the external temperature of the lower part of the reactor is heated to 350 ° C. ⁇ 100 ° C. for 1 hour, and then the external temperature of the lower part of the reactor is heated to 600 to 650 ° C. and 700 to 1,000 ° C. for a total of 5 hours.
  • the powder As 2 O 3 put on the salt of the synthesis reactor turns into gas and rises inside the synthesis reactor, and then turns into a liquid because the upper temperature outside the synthesis reactor is relatively low, and then crystallizes into a solid and white crystals on the filter. Is generated. 48.5 g of crystals were collected from the filter. As a result of checking the crystal structure of the collected arsenic compounds, it was confirmed that more than 99% were mostly As 4 O 6 -b.
  • Example 1 composition with more than 99% of the polymorphic As 4 O 6 -a
  • Comparative Example 1 composition with more than 99% of the polymorphic As 4 O 6 -b
  • Fetal bovine serum (FBS) and cell culture medium were prepared (Hyclone), dimethyl sulfoxide (DMSO), 3- (4,5-dimethyl-thiazol-2yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (3- (4,5-dimetyl-thiazol-2yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT) was prepared (Amresco LLC, USC).
  • human cancer cell lines human breast cancer cells, MCF-7 cells and SK-BR-3 cells, were distributed from Shanghai Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, and MCF-7 cells were 10% FBS, 100U / Minimum Essential Media (MEM) medium containing ml penicillin, and 100 ⁇ g / ml streptomycin
  • MCF-7 cells 10% FBS, 100U / Minimum Essential Media (MEM) medium containing ml penicillin, and 100 ⁇ g / ml streptomycin
  • SK-BR-3 cells were treated with DMEM (10% FBS, 100 U / ml penicillin, and 100 ⁇ g / ml streptomycin).
  • Cells were incubated in Dulbecco's modified Eagle's medium (5% CO 2) and 95% air and moisture incubators. Medium was changed every 3 days.
  • Example 1 The effect on the cell proliferation of Example 1, and Comparative Examples 1 to 3 was evaluated using the MTT assay.
  • the MTT assay is based on the ability of living cells to produce insoluble dark blue formazan reactants for MTT. After trypsin treatment, the cells were suspended in the medium and collected. 3 Cells / well are dispensed in 96-well culture dishes (Costar, Cambridge, MA, USA) at a density of cells / well. After 24 hours, each of Example 1 and Comparative Examples 1 to 3 was treated with cells containing medium containing 10% FBS so as to be 0, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40 or 80 ⁇ M and cultured. It was.
  • Example 1, and Comparative Examples 1 to 3 are 5 ⁇ 10 in 1M sodium hydroxide -2
  • a stock solution dissolved at M concentration was used.
  • the supernatant was removed from cells incubated for 48 and 72 hours after sample treatment and 20 ⁇ l of 5 mg / ml MTT solution per well was added, followed by formazan. Incubate at 37 ° C. for 4 hours to form crystals. After incubation, the supernatant was removed again, DMSO was added 100 ⁇ l per well and mixed to dissolve the dark blue crystals completely. Leave at room temperature for 15 minutes to ensure complete dissolution of all crystals, 570 nm (A 570 nm Absorbance was measured with a micro-plate at) wavelength.
  • the absorbance value of the control group not treated with the sample was calculated as 100, the absorbance value of the treated group treated with the sample compared to the control group was calibrated, and the inhibition of cell proliferation was calculated according to the following equation.
  • Example 1 and Comparative Examples 1 to 3 were treated with MCF-7 cells, which are human breast cancer cell lines, cultured for 48 hours and 72 hours, and MTT assays were shown in FIG. 2.
  • FIG. 2A the proliferation inhibition rate of MCF-7 cells, which are breast cancer cell lines, was higher than that of Comparative Example 1. It became.
  • the inhibition rate of proliferation of MCF-7 cells was higher than that of Comparative Example 2 in which Example 1 and Comparative Example 1 were mixed at 4: 1 or Comparative Example 3 mixed at 1: 1.
  • Example 1 and Comparative Examples 1 to 3 were treated with SK-BR-3 cells, which are human breast cancer cell lines, and then cultured for 48 hours and 72 hours, and MTT assay was performed.
  • SK-BR-3 cells which are human breast cancer cell lines
  • FIG. 3B MTT assay
  • Fetal bovine serum (FBS) and cell culture medium were prepared (Hyclone).
  • RT-PCR Kit and Trizol were obtained from Takara Biotechnology CO., LTD.
  • Annexin V-FITC was obtained from Shanghai Biyuntian Biological Technology Co., LTD. Primers were designed and synthesized by Beijing Aodingkangsheng Biological Technology Co., LTD.
  • MCF-7 cells human breast cancer cells
  • MCF-7 cells were distributed from Shanghai Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, and MCF-7 cells were 10% FBS, 100U / ml penicillin, and 100 ⁇ g / Cells were incubated in a 5% CO 2 and 95% air and moisture incubator using MEM (Minimum Essential Media) medium containing ml streptomycin. Medium was changed every 3 days.
  • MEM Minimum Essential Media
  • Example 1 The effect on the induction of apoptosis of Example 1 was evaluated using a flow cytometer. 1 ⁇ 10 in a 6-well culture dish 5 Cells / well were aliquoted and incubated for 24 hours. After 24 hours, Example 1 was treated with cells containing MEM medium containing 10% FBS to 0, 1, 3, 6, 9, 12 or 15 ⁇ M and incubated for 24 hours. After 24 hours, cells were treated with annexin V-FITC kit to confirm cell death, and PI (propidium iodide) was also treated to distinguish from natural cell death. At this time, the experiment was conducted according to the use method of PI and annexin V-FITC kit.
  • Cells treated with Annexin V-FITC kit were analyzed for cell death by BD FACS calibur flow cytometer, and the results are shown in FIG. 4.
  • the cells labeled with annexin V and PI were analyzed by flow cytometry (4A) and the amount of annexin V compared to PI was analyzed to confirm cell death rate (4B). It was found that cell death increased with increasing concentration.
  • Example 1 In order to confirm the effect on the induction of cell death of Example 1, mRNA expression levels of caspase-3, p21, cycline E1, and cyclin A2, which are genes related to cell cycle and cell death, were checked using RT-PCR. 1 ⁇ 10 in a 6-well culture dish 5 Cells / well were aliquoted and incubated for 24 hours. After 24 hours, Example 1 was treated with cells containing MEM medium containing 10% FBS to 0, 1, 3, 6, 9, 12 or 15 ⁇ M and incubated for 24 hours. After 24 hours, cells were collected and RNA was extracted using Trizol reagent.
  • RNA expression of p21 and Cyclin E1 which are genes that regulate cell cycles associated with cell death, and caspase-3, associated with cell death, increased with increasing concentration of Example 1, whereas cell proliferation
  • Cyclin A2 a cell cycle regulator associated with
  • Example 1 hexaarsenic hexaoxide in Example 1 can treat breast cancer by inducing death of breast cancer cells.
  • mice were safe from certain pathogens and respiratory diseases, and babl / c-nu male nude mice having a body weight of about 18-20 g at 5 weeks of age were used. Nude mice were given free intake of food and water, and bred for 7 days with 12 hours of night and 12 hours of daytime.
  • mice were implanted subcutaneously with human breast cancer cell line MDA-MB-231 cells and bred for 7 days. After 7 days, the mice were randomly divided, and each mouse was orally administered to the mice of the composition of Example 1 and Comparative Example 1 for 7 days to 4.5 mg / kg. At this time, mice treated with nothing after breast cancer cell transplantation were used as controls. Lung tissues were taken from the mice 7 days after administration of the composition, and cancer cells metastasized to the lungs were counted to compare the degree of inhibition of breast cancer metastasis.
  • the transplanted breast cancer cells mostly metastasized to the lung, whereas in the group treated with Comparative Example 1 and the group treated with Example 1, metastasis to the lungs occurred.
  • the cancer metastasis inhibition rate was 90% or more, and it was confirmed that the cancer metastasis inhibitory effect was remarkably superior to Comparative Example 1 showing a 50% cancer metastasis inhibition rate.
  • Example 1 Using the composition of Example 1 was conducted a clinical trial as follows.
  • Example 1 CT images of 8 months, 13 months, 17 months, and 22 months before and after administration of Example 1 of this patient are shown in FIG. 6.
  • the airways were closed due to metastasis to the right and left lungs, but after 8, 13, 17, and 22 months of administration, the size of the cancer in both lungs decreased as the administration period increased. It was confirmed.
  • compositions of the present invention have a therapeutic effect on metastatic breast cancer.

Abstract

본 발명은 육산화사비소의 결정다형 a(As4O6-a)가 99% 이상인 육산화사비소를 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 이의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명의 조성물은 우수한 암세포 증식 억제 및 전이 억제 효과를 나타내어 항암제로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

육산화사비소의 결정다형을 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 이의 제조방법
본 발명은 육산화사비소의 결정다형을 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
암은 제어되지 않은 세포성장으로 특징지어지며, 이러한 비정상적인 세포성장에 의해 종양(tumor)이라고 불리는 세포 덩어리가 형성되어 주위의 조직으로 침투하고 심한 경우에는 신체의 다른 기관으로 전이되기도 한다. 학문적으로는 신생물(neoplasia)이라고도 불린다. 암은 다양한 정도의 유병률로 신체의 모든 조직 및 장기에 영향을 미친다.
유방암(breast cancer)은 경제적 성장에 따른 생활수준의 향상, 식생활의 변화와 서구화, 출산 및 수유방법의 변화 등으로 발생률이 점차 증가하여 여성 종양 중 1위를 차지한다(Kamangar F., et al., 2006). 유방암은 유방 안에 머무는 양성 종양과 달리 다른 기관으로 퍼져 생명을 위협할 수 있는 악성 종양으로, 전이성 유방암에서부터 고형 종양까지 매우 다양한 생물학적 특성을 가지고 있어, 다양한 치료적 선택과 예후를 가진다.
최근 근치적 절제술, 항암화학요법 및 호르몬 요법 등의 발전으로 유방암의 치료결과가 상당히 향상되었음에도 불구하고 아직도 액과 림프절 전이가 없는 환자의 약 25~30%에서, 액과 림프절 전이가 있는 환자의 약 75~80%에서 10년 내에 재발이 일어나고 있으며, 이들 중 대부분은 전이성 유방암으로 사망하고 있다. 꾸준한 유방암 환자의 증가에 따라 전이성 유방암 환자도 역시 증가하고 있어 조기 유방암 환자와 함께 이들 환자의 치료방법, 예후, 이에 영향을 미치는 인자에 대한 연구가 지속되고 있으나 아직 미미한 실정이다.
따라서, 유방암의 치료와 관련하여 유방암의 전이 유무와 상관없이 우수한 항암 효과를 가진 치료제의 개발이 지속적으로 요구되고 있는 실정이다.
한편, 본 발명자들은 이미 비소가 함유된 자연산 신석으로부터 분리정제 기술을 통하여 정제된 육산화사비소가 동물실험에서 암전이 억제효과를 나타냈으며, 아울러 자궁암, 방광암, 폐암, 상악동암, 신장암 등의 말기 암환자에게 투여하였을 때 뛰어난 항암 치료효과가 있다는 기술적 특징으로 특허등록(한국특허등록 제272835호)을 받은 바 있다.
본 발명자들이 비소에 대한 지속적인 연구 결과, 상기 특허등록에 개시된 방법과 다른 신규한 제조방법에 의해, 육산화사비소의 결정다형 a가 99% 이상인 육산화사비소를 제조할 수 있고, 이러한 육산화사비소를 포함하는 조성물이 특히 유방암 예방 또는 치료에 현저한 효과가 있음을 밝혀 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 유효성분으로서 육산화사비소(As4O6)의 결정다형을 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 유효성분으로서 육산화사비소(As4O6)의 결정다형을 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 목적은 유효성분으로서 육산화사비소(As4O6)의 결정다형을 포함하는 유방암 전이 억제용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명은 유효성분으로 육산화사비소를 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물로서, 상기 육산화사비소는 육산화사비소 결정다형 a(As4O6-a)가 99% 이상인 유방암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
상기 조성물의 육산화사비소는 염화나트륨을 100~800℃로 가열한 후 냉각하는 제1공정; 염화나트륨 위에 삼산화이비소(As2O3)를 올려놓은 후 밀폐 상태에서 100℃에서 1000℃까지 가열한 후 냉각하는 제2공정; 승화된 비소를 포집하는 여과지에서 결정화된 결정을 분리하는 제3공정; 및 상기 제3공정에서 얻은 결정을 제2공정의 삼산화이비소 대신 사용하여 제2공정 및 제3공정을 4~10회 반복해서 육산화사비소 결정을 얻는 제4공정; 을 통해 제조될 수 있다.
상기 조성물의 육산화사비소는 육산화사비소의 결정다형 b(As4O6-b)가 1% 미만으로 포함될 수 있다.
상기 육산화사비소는 순도가 99.9% 이상일 수 있다.
상기 As4O6-a 및 As4O6-b는 하기 (i) 내지 (iii)의 특성을 갖는 것일 수 있다:
Figure PCTKR2017013148-appb-T000001
상기 As4O6-a는 X-선 분말 회절 분광도에서, 광원파장이 1.5406Å일 때, 회절각 2θ 10o~50o 범위에서 1o/min의 속도(scan step 0.02o)로 표시된 피크가 13.84, 27.88, 32.32, 35.3, 39.84, 42.38, 46.34, 48.6, 및 49.34로 나타나는 것을 특징으로 하는 결정형이다(도 1 참조). 또한, 2θ값 13.8과 27.9에서 나타나는 주피크의 비율이 1:1.3인 것을 특징으로 한다.
상기 As4O6-b는 X-선 분말 회절 분광도에서, 광원파장이 1.5406Å일 때, 회절각 2θ 10o~50o 범위에서 1o/min의 속도(scan step 0.02o)로 표시된 피크가 13.86, 27.92, 32.36, 35.34, 39.9, 42.44, 46.4, 48.66, 및 49.4로 나타나는 것을 특징으로 하는 결정형이다(도 1 참조). 또한, 2θ값 13.8과 27.9에서 나타나는 주피크의 비율이 1:2.5인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 유효성분으로 육산화사비소를 포함하는 유방암 전이 억제용 약학 조성물로서, 상기 육산화사비소는 육산화사비소 결정다형 a(As4O6-a)가 99% 이상인 유방암 전이 억제용 약학 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 더 상세하게 설명한다.
본 발명은 유효성분으로서 육산화사비소(As4O6)를 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물로서, 상기 육산화사비소는 육산화사비소의 결정다형 a(As4O6-a)가 99% 이상인 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 유효성분으로서 육산화사비소(As4O6)의 결정다형을 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조방법으로서, 염화나트륨을 100~800℃로 가열한 후 냉각하는 제1공정; 염화나트륨 위에 삼산화이비소(As2O3)를 올려놓은 후 밀폐 상태에서 100℃에서 1000℃까지 가열한 후 냉각하는 제2공정; 승화된 비소를 포집하는 여과지에서 결정화된 결정을 분리하는 제3공정; 및 상기 제3공정에서 얻은 결정을 제2공정의 삼산화이비소 대신 사용하여 제2공정 및 제3공정을 4~10회 반복해서 육산화사비소 결정을 얻는 제4공정; 을 포함하는 방법으로 제조되며, 상기 제4공정에서 얻은 육산화사비소 결정이 육산화사비소의 결정다형 a(As4O6-a)를 99% 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
고령토 재질의 합성반응기, 및 합성반응기의 상부에 필터를 장착할 수 있는 클램프를 준비하고, 합성반응기 내에 염화나트륨을 올려놓고 가열 및 냉각을 진행한다. 본 발명의 제조방법에서 염화나트륨을 사용하는 이유는, 제2공정에서 삼산화이비소를 염화나트륨 위에 올려놓고 가열함으로써 비소 화합물에 열이 골고루 전달되면서 비소 화합물이 승화하는 데에 도움이 되기 때문이며, 제1공정을 통해 이러한 염화나트륨의 불순물 및 수분을 제거하기 위해 100~800℃로 2~6시간 동안 가열한다. 제1공정에 있어서 염화나트륨을 가열한 후 실온에서 3~10시간 동안 냉각한다.
다음으로, 염화나트륨 위에 삼산화이비소(As2O3)를 올려놓은 후 밀폐 상태에서 100℃에서 1000℃까지 가열하고, 이후 냉각하는 제2공정을 진행한다. 여기서, 삼산화이비소를 올려놓은 후 클램프에 승화되는 비소를 포집할 수 있는 필터(여과지)를 각 필터와 필터 사이의 간격이 2mm~6mm가 되도록 3~6개 장착한다. 이때 사용되는 필터는, 평량(basic weight) 70~100g/㎡, 두께(thickness) 0.17~0.25㎜, 여과속도(filtration speed) 22~30s/100ml, 및 보류입자경(retention rate) 5~10㎛인 것을 사용하는 것이 바람직하다.
필터를 장착하고 나서 밀폐시킨 후 합성반응기 하부에 100℃에서 1000℃까지 단계적으로 올려주면서 3시간~10시간 동안 가열해서 여과지의 최상부 중심부의 온도는 150℃±100℃ 유지되도록 하며, 여과지를 통과하면서 육산화사비소가 결정화되도록 한다. 그리고 나서 상온에서 5시간 이상, 바람직하게는 5시간~10시간 동안 냉각한다.
다음으로, 이격하여 적층으로 설치된 3~6개의 여과지에 포집된 백색결정을 분리하는 3공정을 수행한다.
합성반응기의 염화나트륨 위에 잔류하는 미량의 삼산화이비소를 제거한 후 상기 포집된 백색결정을 올려놓은 후 제2공정 및 제3공정을 동일 조건으로 4~10회 반복해서 최종적으로 육산화사비소 결정을 수득한다. 본 발명의 제조방법에 따라 얻어진 결정구조를 확인한 결과 대부분 As4O6-a였으며, As4O6-a가 99% 이상인 것으로 확인되었다.
본 발명의 육산화사비소의 결정다형을 포함하는 약학 조성물은 유방암 예방 또는 치료 및 유방암 전이 억제에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 육산화사비소에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토즈, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물의 투여량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 500㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 0.1㎎/㎏/일 내지 100㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 점막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물은, 육산화사비소의 결정다형 a가 99% 이상인 육산화사비소를 포함함으로써, 우수한 항암 효과를 갖는다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은, 유방암 전이를 억제하는 효과가 우수한 것으로 확인되었다.
도 1은 As4O6-a 및 As4O6-b의 X-선 분말 회절 분광도이다.
도 2는 MCF-7 세포에 실시예 1, 및 비교예 1 내지 3를 처리하고 48시간(도 2A) 및 72시간(도 2B) 배양한 후 MTT 어세이에 의해 세포 증식 억제 효과를 평가한 결과 그래프이다.
도 3은 SK-BR-3 세포에 실시예 1, 및 비교예 1 내지 3를 처리하고 48시간(도 3A) 및 72시간(도 3B) 배양한 후 MTT 어세이에 의해 세포 증식 억제 효과를 평가한 결과 그래프이다.
도 4는 MCF-7 세포에 실시예 1을 농도별로 처리하여 실시예 1의 농도에 따른 세포 사멸 효과를 유세포 분석기로 세포에 표지된 annexin V 및 PI를 검출한 결과(4A) 및 PI 대비 annexin V의 양의 분석하여 세포 사멸률(4B)을 확인한 결과이다.
도 5는 MCF-7 세포에 실시예 1을 농도별로 처리하여 실시예 1의 농도에 따른 세포주기 및 세포사멸에 관련된 유전자의 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 6은 임상시험의 전이성 유방암 환자에 대한 실시예 1의 투여 전 및 투여 후의 폐 CT사진으로서 실시예 1의 투여에 따라 전이된 종양의 크기가 작아지는 것을 확인한 결과이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명한다. 하지만 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않으며, 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지며, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
실시예 1: 본 발명의 육산화사비소 제조
고령토로 특수 제작된 합성반응기(높이 100mm, 지름 190mm)와, 3~6개의 필터를 장착할 수 있는 클램프를 준비한다. 클램프는 합성반응기로부터 50mm 떨어져서 1차 클램프를 설치하고, 상기 1차 클램프로부터 2~6mm 간격으로 그 상부에 2차~6차 클램프를 설치하며, 이때 각 클램프의 규격은 지름 210mm 및 두께 10mm이다.
칭량한 굵은 소금(수분함량 10%이하) 400g~600g을 합성반응기에 투입하여 20mm 내외로 두께를 고르게 펴서 다져주고 100℃~800℃에서 3시간 동안 열을 서서히 가열하면서 반응기 내부의 소금표면 온도가 290±30℃가 되도록 연속 가열하여 수분 및 불순물을 제거하고 실온에서 5시간 동안 냉각 시킨다.
원료물질인 As2O3(순도 98% 이상, 제조사 YUNNAN WENSHAN JINCHI ARSENIC CO., LTD.) 100g을 합성반응기 내의 굵은 소금 위에 넣어주고, 합성기의 상부에 위치한 승화되는 비소를 포집할 수 있는 필터(여과지)를 각 필터와 필터 사이의 간격이 2~6㎜가 되도록 3~6개 클램프를 장착한다. 이때 사용되는 필터는, 평량(basic weight) 70~100g/㎡, 두께(thickness) 0.17~0.25㎜, 여과속도(filtration speed) 22~30s/100ml, 및 보류입자경(retention rate) 5~10㎛인 것을 사용하는 것이 바람직하다.
클램프을 이용하여 필터를 고정시키고 합성반응기 하부에 열을 가하여 100℃에서 1,000℃까지 단계적으로 온도를 올려준다. 먼저 합성반응기 하부의 외부온도를 350℃±100℃ 정도가 되도록 1시간 동안 가열하고, 이후에 합성반응기 하부의 외부온도를 600~650℃, 및 700~1,000℃ 정도가 되도록 가열하여, 총 5시간에서 10시간 동안 가열하여 필터의 최상부 여과지의 중심부온도가 150℃±100℃를 유지하도록 한 후, 상온에서 5~7시간 정도 냉각한다. 이 과정에서 합성반응기의 소금 위에 올려진 분말 As2O3는 합성반응기 내부에서 기체로 변하여 상승하다가, 합성반응기 외부의 상부 온도가 상대적으로 낮기 때문에 액체로 변하고 이후 고체로 결정화되어 필터 상에 백색결정체가 생성된다.
채취한 백색결정체를 합성반응기의 굵은 소금 위에 넣고 다시 가열 및 냉각하고, 결정을 채취하는 공정을 다시 4회 반복해서 최종적으로 결정 12.0g을 얻었다. 얻어진 비소화합물 결정의 구조를 확인한 결과 대부분 As4O6-a였으며 As4O6-a가 99중량% 이상이며 As4O6-b가 1중량% 미만인 것으로 확인되었다.
DSC(시차주사 열분석) 값이 승온 속도가 10℃/min일 때, As4O6-a는 282.67℃인 점에서 흡열피크(융점)가 나타나는 것으로 확인되었으며, As4O6-b는 286.77℃인 점에서 흡열피크(융점)가 나타나는 것으로 확인되었다.
As4O6-a 및 As4O6-b의 분말 X선 회절 분광도를 도 1에 도시하였고, As4O6-a 및 As4O6-b의 회절 데이터는 다음의 표 2와 같다.
Figure PCTKR2017013148-appb-T000002
도 1 및 표 2에서 확인되는 바와 같이, As4O6-a는 2θ값 13.8과 27.9에서 나타나는 주피크의 비율이 1:1.3이고, As4O6-b는 2θ값 13.8과 27.9에서 나타나는 주피크의 비율이 1:2.5인 것을 특징으로 한다. 제조된 화합물의 DSC 분석, 구조결정 및 X선 회절분석은 다음과 같은 방법으로 수행하였다.
(1) DSC 분석
DSC 장비(SDT Q600 V20.9 Build 20)에서, N2 100mL/min을 흘려주면서 10℃/min 승온 속도로 310℃까지 상승시키면서 시료 20.0mg을 분석하였다.
(2) X선 결정학
육산화사비소(As4O6, MW=395.6)의 단결정을 glass fiber위에 올린 후, X-ray beam를 쪼여 회절 되어 나오는 사진 무늬와 회절 데이터의 체계성의 유무를 관찰하여 공간군(space group)을 결정하고, 단위세포상수(cell parameter)를 결정한다. 회절세기는 10°<2θ<50° 범위에서 수집한다. 이 데이터를 구조결정 프로그램(SHELXTL 프로그램)을 사용하여 중원자방법(Patterson 방법)으로 As4O6의 결정구조를 확인한다.
(3) X선 회절 분석법
수득한 결정을 분쇄하여 10㎛~30㎛ (-325 메시)의 입자로 만들고 X-선 회절 분석용 유리 홀더 (20mm×16mm×1mm)에 충진시킨 후, 유리 슬라이드 등으로 압착시키고 검체 면과 홀더 면이 평행을 이루도록 매끈하게 하여 시료를 준비하였다. XRD의 Cu Kα1 (1.54060 Å)을 이용하여 2θ 10o~50o 범위에서 1o/min의 속도(scan step 0.02o)로 결정의 X-선 회절분광도를 그린다.
비교예 1: 육산화사비소 제조
고령토로 특수 제작된 합성반응기(높이 100mm, 지름 190mm)와, 3~6개의 필터를 장착할 수 있는 클램프를 준비한다. 클램프는 합성반응기로부터 50mm 떨어져서 1차 클램프를 설치하고, 상기 1차 클램프로부터 2~6mm 간격으로 그 상부에 2차~6차 클램프를 설치하며, 이때 각 클램프의 규격은 지름 210mm 및 두께 10mm이다.
칭량한 굵은 소금(수분함량 10%이하) 400g~600g을 합성반응기에 투입하여 20mm 내외로 두께를 고르게 펴서 다져주고 100℃~800℃ 3시간 동안 열을 서서히 가열하면서 반응기 내부의 소금표면 온도가 290±30℃가 되도록 연속 가열하여 수분 및 불순물을 제거하고 실온에서 5시간 동안 냉각 시킨다.
원료물질인 As2O3(순도 98% 이상, 제조사 YUNNAN WENSHAN JINCHI ARSENIC CO., LTD.) 100g을 합성반응기 내의 굵은 소금 위에 넣어주고, 합성기의 상부에 위치한 승화되는 비소를 포집할 수 있는 필터(여과지)를 각 필터와 필터 사이의 간격이 2~6㎜가 되도록 3~6개 클램프를 장착한다. 이때 사용되는 필터는, 평량(basic weight) 70~100g/㎡, 두께(thickness) 0.17~0.25㎜, 여과속도(filtration speed) 22~30s/100ml, 및 보류입자경(retention rate) 5~10㎛인 것을 사용하는 것이 바람직하다.
클램프을 이용하여 필터를 고정시키고 합성반응기 하부에 열을 가하여 100℃에서 1,000℃까지 단계적으로 온도를 올려준다. 먼저 합성반응기 하부의 외부온도를 350℃±100℃ 정도가 되도록 1시간 동안 가열하고, 이후에 합성반응기 하부의 외부온도를 600~650℃, 및 700~1,000℃ 정도가 되도록 가열하여, 총 5시간에서 10시간 동안 가열하여 필터의 최상부 여과지의 중심부온도가 150℃±100℃를 유지하도록 한 후, 상온에서 5~7시간 정도 냉각한다. 이 과정에서 합성반응기의 소금 위에 올려진 분말 As2O3는 합성반응기 내부에서 기체로 변하여 상승하다가, 합성반응기 외부의 상부 온도가 상대적으로 낮기 때문에 액체로 변하고 이후 고체로 결정화되어 필터 상에 백색결정체가 생성된다. 필터로부터 48.5g의 결정을 채취하였다. 채취한 비소화합물의 결정구조를 확인한 결과 99% 이상 대부분 As4O6-b인 것으로 확인되었다.
비교예 2 내지 4: 육산화사비소 제조
실시예 1(결정다형 As4O6-a가 99% 이상인 조성물)과 비교예 1(결정다형 As4O6-b가 99% 이상인 조성물)을 각각 4:1, 및 1:1로 혼합하여, 각각 비교예 2 및 비교예 3으로 하였다.
실험예 1: 인간 유방암(human breast cancer) 세포 증식 억제 효과 실험
(1) 실험재료 및 세포 배양
소태아혈청(FBS)과 세포 배양 배지를 준비하였고(Hyclone사), 디메틸 설폭사이드(DMSO), 3-(4,5-디메틸-티아졸-2일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(3-(4,5-dimetyl-thiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT)를 준비하였다(Amresco LLC, USC).
인간의 암 세포주로서, 인간 유방암 세포주(human breast cancer cells)인 MCF-7 세포 및 SK-BR-3 세포를 중국과학아카데미의 상하이 세포 은행으로부터 분양받았고, MCF-7세포는 10% FBS, 100U/㎖ 페니실린, 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신이 포함된 MEM(Minimum Essential Media) 배지를, SK-BR-3 세포는 10% FBS, 100U/㎖ 페니실린, 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지를 이용하여 5% CO2 및 95% 공기와 습기가 있는 상태의 배양기에서 세포를 배양하였다. 배지는 3일마다 교체하였다.
(2) 세포 증식 어세이(MTT 어세이)
실시예 1, 및 비교예 1 내지 3의 세포 증식에 대한 효과를 MTT 어세이를 이용해 평가하였다. MTT 어세이는 MTT에 대해 살아있는 세포가 불용성 암청색 포마잔 반응물을 생성하는 능력에 기반 한다. 트립신을 처리하여 세포들을 배지에 부유시켜 모은 후, 4×103 세포/웰(cells/well)의 밀도로 96-웰 배양 디쉬(Costar, Cambridge, MA, USA)에 분주된다. 24시간 후에, 실시예 1, 및 비교예 1 내지 3 각각을 0, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40 또는 80μM이 되도록 10% FBS를 포함하는 배지가 들어가 있는 세포에 처리하여 배양하였다. 이때, 실시예 1, 및 비교예 1 내지 3은 1M 수산화나트륨에 5×10-2M 농도로 용해시킨 저장용액을 이용하였다. 세포 증식에 대한 MTT 어세이를 수행하기 위해, 시료 처리 후 48시간 및 72시간 동안 배양한 세포에서 상등액을 제거하고 웰(well)당 5㎎/㎖의 MTT 용액을 20㎕씩 첨가하고 나서 포마잔 결정을 형성하기 위해 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션 하였다. 인큐베이션 후에, 상등액을 다시 제거하고, DMSO를 모든 웰 당 100㎕씩 첨가하고, 암청색 결정을 완전히 용해하도록 혼합하였다. 실온에서 15분 동안 방치하여 모든 결정이 완전히 용해되도록 하고, 570nm(A570nm) 파장에서 마이크로-플레이트기로 흡광도를 측정하였다.
(3) 통계 분석
시료를 처리하지 않은 대조군의 흡광도 값을 100으로 계산하고, 상기 대조군 대비 시료를 처리한 처리군의 흡광도 값을 교정(calibration) 하였고, 세포 증식 억제율을 하기 식에 따라 계산하였다.
세포 증식 억제율 (%) = ((대조군 세포의 평균 흡광도 - 처리군 세포의
평균 흡광도)/대조군 세포의 평균 흡광도) × 100
모든 데이터는 평균±표준오차(means±SEM)으로 표현된다. 일원배치 분산분석(one-way analysis of variance, ANOVA) 후 던넷의 사후 검증(Dunnett’s post-test)에 의해 다중비교를 수행하였다. 유의수준은 p<0.05였고, 각 실험은 3번씩 반복되었다.
(4) MCF-7 세포 이용 결과
실시예 1, 및 비교예 1 내지 3을 인간 유방암 세포주인 MCF-7 세포에 처리하고 나서, 48시간 및 72시간 배양하고 MTT 어세이를 수행한 결과를 도 2에 나타내었다. 실시예 1을 처리한 후 48시간(도 2A) 및 72시간(도 2B) 배양한 실험결과 모두에서, 비교예 1을 처리한 경우에 비해 유방암 세포주인 MCF-7 세포의 증식 억제율이 높은 것으로 확인되었다. 또한, 실시예 1과 비교예 1이 4:1로 혼합된 비교예 2나, 1:1로 혼합된 비교예 3에 비해, MCF-7 세포의 증식 억제율이 높은 것으로 확인되었다.
(5) SK-BR-3 세포 이용 결과
실시예 1, 및 비교예 1 내지 3을 인간 유방암 세포주인 SK-BR-3 세포에 처리하고 나서, 48시간 및 72시간 배양하고 MTT 어세이를 수행한 결과를 도 3에 나타내었다. 실시예 1을 처리한 후 48시간(3A) 및 72시간(도 3B) 배양한 실험결과 모두에서, 비교예 1에 비해 유방암 세포주인 SK-BR-3 세포의 증식 억제율이 높은 것으로 확인되었다. 또한, 실시예 1과 비교예 1이 4:1로 혼합된 비교예 2나, 1:1로 혼합된 비교예 3에 비해, SK-BR-3 세포의 증식 억제율이 높은 것으로 확인되었다.
실험예 2: 인간 유방암(human breast cancer) 세포 사멸 유도 효과 실험
(1) 실험재료 및 세포 배양
소태아혈청(FBS)과 세포 배양 배지를 준비하였고(Hyclone사) 하였다. RT-PCR Kit 및 Trizol은 Takara Biotechnology CO., LTD.로부터, Annexin V-FITC는 Shanghai Biyuntian Biological Technology Co., LTD., 로부터 입수 하였다. 프라이머는 Beijing Aodingkangsheng Biological Technology Co., LTD., 사에 의뢰하여 디자인 및 합성하였다.
인간의 암 세포주로서, 인간 유방암 세포주(human breast cancer cells)인 MCF-7 세포를 중국과학아카데미의 상하이 세포 은행으로부터 분양받았고, MCF-7세포는 10% FBS, 100U/㎖ 페니실린, 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신이 포함된 MEM(Minimum Essential Media) 배지를 이용하여 5% CO2 및 95% 공기와 습기가 있는 상태의 배양기에서 세포를 배양하였다. 배지는 3일마다 교체하였다.
(2) 유세포 분석기(flow cytometry) 이용
실시예 1의 세포 사멸(apoptosis) 유도에 대한 효과를 유세포 분석기를 이용해 평가하였다. 6-웰 배양 디쉬에 1×105 세포/웰(cells/well)를 분주하고, 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후에, 실시예 1을 0, 1, 3, 6, 9, 12 또는 15μM이 되도록 10% FBS를 포함하는 MEM 배지가 들어가 있는 세포에 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후에 세포 사멸을 확인하기 위해 annexin V-FITC kit를 이용하여 세포에 처리하였고, 자연적인 세포 죽음과의 구별을 위해 PI(propidium iodide)도 함께 처리하였다. 이때, PI와 annexin V-FITC kit의 이용방법에 따라 실험을 진행하였다. Annexin V-FITC kit로 처리한 세포를 BD FACS calibur 유세포 분석기를 통해 세포 사멸 정도를 분석하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 실시예 1을 처리한 후 annexin V와 PI로 표지된 세포를 유세포 분석기로 분석한 결과(4A) 및 PI 대비 annexin V의 양을 분석하여 세포 사멸률(4B)을 확인한 결과, 실시예 1의 처리 농도가 증가함에 따라 세포 사멸이 증가되는 것으로 확인되었다.
(3) 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR) 이용
실시예 1의 세포 사멸 유도에 대한 영향을 확인하기 위해 RT-PCR을 이용해 세포주기 및 세포 사멸과 관련된 유전자인 caspase-3, p21, cycline E1, 및 cyclin A2의 mRNA 발현 정도를 확인하였다. 6-웰 배양 디쉬에 1×105세포/웰(cells/well)를 분주하고, 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후에, 실시예 1을 0, 1, 3, 6, 9, 12 또는 15μM 되도록 10% FBS를 포함하는 MEM 배지가 들어가 있는 세포에 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후에 세포를 수집한 다음 Trizol 시약을 이용해 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 주형으로 하고, 하기 표 3의 프라이머 및 RT-PCR kit를 이용하여 유전자 증폭을 수행하였고, 아가로스 겔에 전기 영동하여 caspase 3, p21, cycline E1, cyclin A2의 mRNA 발현량의 변화를 확인하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 이때, 로딩 대조군으로 β-actin의 발현량도 함께 확인하였다. 실시예 1을 처리한 결과, 세포 사멸과 관련된 세포주기를 조절하는 유전자인 p21과 Cyclin E1 및 세포 사멸과 관련된 caspase-3의 mRNA 발현이 실시예 1의 농도 증가에 따라 증가하는 반면에, 세포 증식에 관련된 세포주기 조절 인자인 Cyclin A2의 mRNA 발현은 감소되는 것으로 확인되었다.
이를 통해, 실시예 1의 육산화사비소가 유방암 세포의 사멸을 유도함으로써 유방암을 치료할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
Figure PCTKR2017013148-appb-T000003
실험예 3: 유방암 전이 억제 효과 확인 시험
실험동물은 특정 병원균 및 호흡기 질환으로부터 안전하고, 5주령의 체중 체중이 18~20g정도인 babl/c-nu 수컷 누드마우스(nude mouse)를 이용하였다. 누드마우스는 음식과 물을 자유롭게 섭취하도록 하였고, 12시간의 밤과 12시간의 낮을 주기로 하여 7일 동안 사육하였다.
마우스에 인간 유방암 세포주인 MDA-MB-231 세포를 피하 주사하여 이식하고 7일 동안 사육하였다. 7일 후에 마우스를 무작위적으로 나눈 후, 각각의 마우스에 실시예 1 및 비교예 1의 조성물을 4.5㎎/㎏이 되도록 7일 동안 경구 투여 하였다. 이때, 유방암 세포 이식 후 아무것도 처리하지 않은 마우스를 대조군으로 이용하였다. 조성물 투여 7일 후에 마우스로부터 폐 조직을 취하여 폐로 전이된 암 세포를 세어 유방암 전이 억제 정도를 비교하였다.
그 결과, 유방암 세포를 이식하고 아무것도 처리하지 않은 대조군의 경우에는 이식된 유방암 세포가 대부분 폐로 전이된 반면에, 비교예 1를 처리한 군과 실시예 1을 처리한 군의 경우, 폐로의 전이가 억제된 것을 확인하였고, 특히나 실시예 1의 경우, 암 전이 억제율이 90% 이상으로, 50% 암 전이 억제율을 나타내는 비교예 1에 비해 암 전이 억제 효과가 현저히 우수하다는 것을 확인하였다.
실험예 4: 임상시험
실시예 1의 조성물을 이용하여 다음과 같이 임상시험을 시행하였다.
2006년에 유방암이 발견되어 병원 치료와 민간요법 등을 시행하였으나 폐, 흉막, 뼈 및 간으로 전이되었고, 2014년 5월에 흉수와 복막에 복수가 고여서 여러 차례에 걸쳐 흉수를 뽑아주었다. 그러나 악성 흉수로 인한 극심한 호흡곤란으로 응급실 및 호스피스 병동에서 산소호흡기를 통해 호흡하였으나, 산소부족으로 인해 창백증이 나타나기 시작하여 생존기간 1주일 정도를 남긴 상태에서 실시예 1을 매일 5㎎씩 3회(15㎎/일) 경구 복용하였다.
이 환자의 실시예 1의 투여 전 및 투여 후 8개월, 13개월, 17개월, 22개월의 CT 사진은 도 6에 나타내었다. 실시예 1의 투여 전에는 우측폐와 좌측폐로의 전이로 인해 기도가 폐쇄되어 있었으나, 투여 8개월, 13개월, 17개월 및 22개월 후에는 투여 기간이 늘어남에 따라 양쪽 폐에 있던 암의 크기가 줄어드는 것을 확인하였다.
임상시험 결과를 통해, 본 발명의 조성물은 전이성 유방암의 치료 효과가 있는 것으로 확인되었다.

Claims (5)

  1. 유효성분으로서 육산화사비소(As4O6)를 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
    상기 육산화사비소는, 하기 (i) 내지 (iii)의 특성을 갖는 육산화사비소의 결정다형 a가 99중량% 이상인 것을 특징으로 하는 유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
    (i) 단위세포상수:
    a = b = c = 11.0734 Å
    α = β = γ = 90°
    V = 1357.82 Å3
    (ii) As-O 결합길이: 1.786 Å
    (iii) O-As-O 결합각: 98.36°
  2. 제1항에 있어서,
    상기 육산화사비소는,
    염화나트륨을 100~800℃로 가열한 후 냉각하는 제1공정;
    염화나트륨 위에 삼산화이비소(As2O3)를 올려놓은 후 밀폐 상태에서 100℃에서 1000℃까지 가열한 후 냉각하는 제2공정;
    승화된 비소를 포집하는 여과지에서 결정화된 결정을 분리하는 제3공정; 및
    상기 제3공정에서 얻은 결정을 제2공정의 삼산화이비소 대신 사용하여 제2공정 및 제3공정을 4~10회 반복해서 육산화사비소 결정을 얻는 제4공정;
    을 통해 제조되는 것을 특징으로 하는 유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 육산화사비소는 순도가 99.9% 이상인 것을 특징으로 하는 유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 결정다형 a는 X-선 분말 회절 분광도에서, 광원파장이 1.5406Å일 때, 회절각 2θ 10o~50o 범위에서 1o/min의 속도(scan step 0.02o)로 표시된 피크가 13.84, 27.88, 32.32, 35.3, 39.84, 42.38, 46.34, 48.6, 및 49.34로 나타나는 것을 특징으로 하는 유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 유효성분으로서 육산화사비소(As4O6)를 포함하는 유방암 전이 억제용 약학 조성물로서,
    상기 육산화사비소는, 하기 (i) 내지 (iii)의 특성을 갖는 육산화사비소의 결정다형 a가 99중량% 이상인 것을 특징으로 하는 유방암 전이 억제용 약학 조성물.
    (i) 단위세포상수:
    a = b = c = 11.0734 Å
    α = β = γ = 90°
    V = 1357.82 Å3
    (ii) As-O 결합길이: 1.786 Å
    (iii) O-As-O 결합각: 98.36°
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