KR100399657B1

KR100399657B1 - 혈관신생 억제제

Info

Publication number: KR100399657B1
Application number: KR10-2000-0036452A
Authority: KR
Inventors: 이창훈; 배일주; 서강문
Original assignee: 배일주; 서강문; 이창훈
Priority date: 2000-06-29
Filing date: 2000-06-29
Publication date: 2003-09-29
Also published as: CA2342059A1; CN1329891A; TW518227B; EP1166789A3; KR20020002033A; US20020001630A1; JP2002029976A; RU2001118219A; US6703049B2; EP1166789A2

Abstract

본 발명은 신규한 혈관신생 억제제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 육산화사비소로 이루어진 혈관신생 억제제 및 이를 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르는 혈관신생 억제제는 혈관 내피세포의 형성 및 맥관 형성을 억제함으로써 혈관신생과 관련된 각종 질환의 치료제로서 사용할 수 있다.

Description

혈관신생 억제제 {Angiogenesis Inhibitor}

본 발명은 육산화사비소(solid As₄O₆)의 혈관신생 억제제로서의 새로운 용도및 그 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 종래에 천지산이라는 상표명으로 알려진 육산화사비소가 혈관신생과 관련된 다양한 질병에 대한 치료제로서 사용할 수 있는 새로운 용도에 관한 것이다.

일반적으로 내피세포에 의해 새로운 혈관이 형성되는 과정은 종양의 성장에 있어서 매우 중요한 과정(Folkman J. Watson K, Ingber D, Hanahan D, Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia. Nature 1989 May 4;339(6219);58-61)이기도 하지만 당뇨성 망막증, 관절염, 혈관종 및 건선과 같은 다양한 맥관형성성 질환에 있어서 중요한 특징이다(Klagsbrun M Folkman J in Peptide Growth Factors and Their Receptors II(eds Sporn M. B Roberts, A. B.) 549-586 (Springer, Berlin, 1990)).

특히 혈관신생 및 맥관 침윤은 스티븐스-존슨 증후군(Stevens-Johnson syndrome) 및 그 유사 질환 환자, 안구 유천포창(ocular pemphigoid) 및 그 유사 질환 환자, 알카리, 산, 세제, 각종 용매 치 휘발성 가스 등의 세포 독성을 갖는 각종 화학 물질에 의한 각막 손상 환자, 트라코마(trachoma) 환자, 바이러스 감염환자, 수포성 각막염(phlyctenula keratitis) 환자, 각막 이식환자 및 장기간 콘텍트 렌즈를 사용한 환자에서 관측되는 것으로 알려져 있다. 안방(眼房, aqueous chamber), 수정체, 유리체(vitreous)는 원래 혈관이 없는 투명한 조직이며, 이들 조직에 혈관이 생성될 경우 심각한 시각 장애를 유발한다. 그러므로 혈관신생을 억제하기 위한 각종 의약품들이 최근 연구되고 있다.

기존에 알려진 혈관형성 억제제로는 프로타민제제(Taylor, S. et al.,Nature, 297, 307, 1982), 헤파린 및 코르티손 복합제제(Folkman, J. et al., Science, 221, 71, 1983), 프레드니솔론 아세테이트(Robin, J. B., Arch. Opthalmol., 103, 284, 1985), 설폰화된 폴리사카라이드(일본 특허공개공보 소63-119500), 헤르비마이신 A(Herbimycin A, 일본특허공개공보 소63-295509), 푸마질린(Fumagillin, 일본특허공개공보 평1-279828), 인터페론 베타(미국특허 제5,948,403호)가 있다. 그러나 이들 대부분이 혈관형성 억제활성이 충분하지 못하고 특히 인체에 사용시 부작용이 동반되기 때문에 만족스럽지 못하였다.

비소(arsenic)는 피부와 폐에 암을 유발하는 강력한 환경성 암유발물질로 알려져왔다. 그러나, 전통 의학에서는 비소 화합물이 건선, 매독 및 류마티즘 치료제로서 사용되어 왔다. 1970년대에 중국에서는 삼산화비소(As₂O₃)가 급성 전골수세포성 백혈병(APL; acute promyelocytic leukemia) 치료제로 도입되어 놀라운 효능을 갖는 것으로 보고된 후 현재 미국을 비롯하여 전 세계적으로 비소화합물의 새로운 작용기전 및 그 활용에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는 중이다(Zhang TD: Treatment of acute granulocytic leukemia with "Ai Ling No. 1"- Clinical analysis and experimental research. Chin J Integrated Chin West Med 4:19, 1984)(Li YS, Zhang TD, Li CHW, Zhao XL, Wei ZHR, Tan W, Li RL, Mao YY:Traditional Chinese and Western Medicine in the treatment of 27 patients with mailgnant lymphoma. Chin J Oncol 10:61, 1988) (Sun HD, Ma L, Hu XC, Zhang TD: Ai-Lin I treated 32 cases of acute promyelocytic leukemia. Chin JIntegrated Chin West Med 12:170, 1992, Blood 1997 May 1;89(9):3354-60 Use of arsenic trioxide (As2O3) in the treatment of acute promyelocytic leukemia (APL): II. Clinical efficacy and pharmacokinetics in relapsed patients. Shen ZX, Chen GQ, Ni JH, Li XS, Xiong SM, Qiu QY, Zhu J, Tang W, Sun GL, Yang KQ, Chen Y, Zhou L, Fang ZW, Wang YT, Ma J, Zhang P, Zhang TD, Chen SJ, Chen Z, Wang ZY).

서양에서는 비소 화합물이 매독 치료제로서 사용된 적이 있으며, 현재는 유기 비소화합물인 멜라소프롤(Melasoprol)이 수면병(trypanosomiasis) 치료제로서 유일하게 사용되고 있다. In vitro 실험에 따르면, 비소화합물, 즉 삼산화비소 및 멜라소프롤은 APL 세포뿐만 아니라 Bcl-2 단백질의 다운레귤레이션(down regulation) 및/또는 카스페이즈(caspase)의 활성을 통해 세포사(apoptosis)를 유발함으로써 다른 유형의 백혈병 세포에 대해서도 세포사를 일으켰다는 사실이 확인되었다(Blood 1998 Sep 1;92(5):1497-504 Arsenic trioxide and melarsoprol induce programmed cell death in myeloid leukemia cell lines and function in a PML and PML-RARalpha independent manner. Wang ZG, Rivi R, Delva L, Konig A, Scheinberg DA, Gambacorti-Passerini C, Gabrilove JL, Warrell RP Jr, Pandolfi PP, Blood 1996 Aug 1;88(3):1052-61 In vitro studies on cellular and molecular mechanisms of arsenic trioxide (As2O3) in the treatment of acute promyelocytic leukemia: As2O3 induces NB4 cell apoptosis with downregulation of Bcl-2 expression and modulation of PML-RAR alpha/PML proteins. Chen GQ,Zhu J, Shi XG, Ni JH, Zhong HJ, Si GY, Jin XL, Tang W, Li XS, Xong SM, Shen ZX, Sun GL, Ma J, Zhang P, Zhang TD, Gazin C, Naoe T, Chen SJ, Wang ZY, Chen Z, Blood 1997 May 1;89(9):3345-53 Use of arsenic trioxide (As2O3) in the treatment of acute promyelocytic leukemia (APL): I. As2O3 exerts dose-dependent dual effects on APL cells. Chen GQ, Shi XG, Tang W, Xiong SM, Zhu J, Cai X, Han ZG, Ni JH, Shi GY, Jia PM, Liu MM, He KL, Niu C, Ma J, Zhang P, Zhang TD, Paul P, Naoe T, Kitamura K, Miller W, Waxman S, Wang ZY, de The H, Chen SJ, Chen Z, Br J Haematol 1998 Sep;102(4):1055-60 Arsenic induces apoptosis in B-cell leukaemic cell lines in vitro: activation of caspases and down-regulation of Bcl-2 protein. Akao Y, Mizoguchi H, Kojima S, Naoe T, Ohishi N, Yagi K, Blood 1997 Jul 15;90(2):562-70, Comparative activity of melarsoprol and arsenic trioxide in chronic B-cell leukemia lines., Konig A, Wrazel L, Warrell RP Jr, Rivi R, Pandolfi PP, Jakubowski A, Gabrilove JL).

육산화사비소(고체 As₄O₆)는 삼산화비소 및 대부분의 다른 비소 화합물을 제조하기 위한 기초원료 물질로서 사용되어 왔으며 살충제나 유리 제조시 탈색제 또는 가죽제품의 보존제로서 사용된다. 이러한 육산화사비소는 삼산화비소와 마찬가지로 암을 유발하는 독성 물질로서만 알려져왔으며, 그 화학적 구조에 관한 것만이 화학자들의 관심의 대상이 되어 왔다.(Becker K.A., Plieth K., and Stranski I.N. The polymorphic modifications of arsenic trioxide. Prog. Inorg. Chem. 4,1-72 (1962), Pupp C, Lao R.C., Murray J.J., pottie R.F., Equilibrium vapor concentrations of some polycyclic aromatic hydrocarbons, As4O6 and SeO2 and the collection efficiencies of these air pollutants. Atmospheric Environment Vol. 8, pp 915-925, 1974, Grzechnik A. Compressibility and vibrational modes in solid As4O6 Journal of Solid State Chemistry. 144(2):416-422, 1999 May.)

한편, 본 발명자는 자연산 신석으로부터 육산화사비소를 분리정제하여 항암효과를 확인하여 대한민국 특허출원 제1998-16486호로 특허출원하였으며, 1999년에는 이 육산화사비소의 항암제로서의 용도에 대하여 일본 특허청으로부터 특허(일본특허 제3007627호)를 받은 바 있다.

특히 삼산화비소는 경구투여할 경우 심각한 위장관 및 간 부작용이 보고된 바 있으나(Shen ZX, Chen GQ, Ni JH, Li XS, Xiong SM, Qiu QY, Zhu J, Tang W, Sun GL, Yang KQ, Chen Y, Zhou L, Fang ZW, Wang YT, Ma J, Zhang P, Zhang TD, Chen SJ, Chen Z, Wang ZY Use of arsenic trioxide (As2O3) in the treatment of acute promyelocytic leukemia (APL): II. Clinical efficacy and pharmacokinetics in relapsed patients. Blood 1997 May 1;89(9):3354-60), 이건 발명자는 상기 특허를 통해서 약 200g의 스프라그 돌리(Sprague-Dawley) 랫트에 고용량, 즉 약 100mg/kg 용량의 육사화사비소를 28일간 경구투여한 경우 신장에만 미세한 조직학적 변화를 일으켰을 뿐 위장관 및 간에 부작용을 일으키지 않았으며, 중간용량(약 10mg/kg) 및 저용량(1mg/kg)에서는 전혀 부작용이 나타나지 않는다는 것을 확인하였다.

따라서 본 발명은 육산화사비소로 된 신규한 혈관신생 억제제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 육산화사비소를 함유하는 혈관신생 억제효과를 갖는 약제학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 본 발명에 따르는 혈관신생 억제제의 입체적 구조모델.

도 2는 본 발명에 따르는 혈관신생 억제제의 BCE 세포 증식에 대한 억제 효과를 보여주는 그래프.

도 3은 본 발명에 따르는 혈관신생 억제제의 BCE 세포 주화성에 대한 억제 효과를 보여주는 그래프.

도 4(A) 내지 도 4(C)는 본 발명에 따르는 혈관신생 억제제의 맥관형성 억제효과를 보여주는 사진.

도 5(A) 내지 도 5(B)는 본 발명에 따르는 혈관신생 억제제를 랫트에 경구투여한 경우의 각막 혈관신생을 억제효과를 보여주는 사진.

도 5(D) 및 도 5(E)는 본 발명에 따르는 혈관신생 억제제를 랫트에 경구투여한 경우의 각막 신생혈관의 길이, 분포 및 면적을 대비한 그래프.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명자는 첨부된 도 1과 같은 구조를 갖는 육산화사비소를 이용하여 실험동물을 이용하여 in vitro 및 in vivo 실험을 통해 확인한 결과 육산화사비소가 bFGF(basic Fibroblast Growth Factor)에 의해 유발된 모세혈관 내피세포의 증식 및 맥관 형성을 억제하는 사실을 통하여 혈관형성 억제 효과를 갖는다는 것을 확인하게 되었다.본 발명에서 정상혈관내피세포에서는 세포독성(apoptosis)이 없으면서 혈관 신생 억제만을 유발하는 농도로 20-200nM의 육산화사비소를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따르는 육산화사비소는 일명 천지산으로 알려져 있는 물질로서, 특히 그 제조방법에 대해서는 본 발명자의 특허출원 제1998-16486호를 통해 알려져 있다. 즉, 본 발명에 따르는 혈관형성 억제효과를 갖는 육산화사비소는 비소를 함유하는 천연산 신석 및 시약용 비소 등을 다단계의 가열처리를 통하여 백색의 천연 화학물질인 육산화사비소를 제조할 수 있으며, 본 발명에서는 보다 상세한 제조방법에 대한 기술은 생략하겠다.

또한, 본 발명에 따르는 혈관형성 억제 효과를 갖는 육산화사비소는 상기 제조방법 이외에 다른 제조방법에 의해 제조된 것이라도 첨부된 도 1의 구조를 갖는 것이라면 사용할 수 있다.

본 발명에 따르는 혈관형성 억제제는 실험동물인 랫트에서 약 50mg/kg/day의 용량으로 경구투여한 결과 bFGF(basic Fibroblast Growth Factor)에 의해 유발된 각막의 혈관신생을 현저하게 억제하는 것으로 확인되었으며, 이를 인체에 적용할 경우에는 질환의 종류, 환자의 연령, 성별, 건강상태 등에 따라 그 용량을 증감 조절할 수 있다.

본 발명에 따르는 혈관신생 억제제는 단독으로 또는 다른 혈관신생 억제효과를 갖는 제제와 복합제제로서 사용될 수 있으며, 부형제, 붕해제, 방향제, 활택제 등 기타 약제학적으로 허용되는 각종 첨가물과 혼합하여 산제, 정제, 액제 등 각종 경구 또는 비경구용 제제로 제제화할 수 있다.

본 발명에 따르는 혈관신생 억제제는 혈관신생 기전과 관련있는 것으로 알려져 있는 각종 질환, 예컨대 각종 암종양혈관신생, 당뇨성 망막증, 관절염, 혈관종, 건선 등의 치료제로서 적용이 가능하다. 이 경우에는 본 발명에 따르는 혈관신생 억제제는 해당 질환과 관련된 다른 치료제와 병행 또는 혼합하여 사용할 수 있다.

이하 실시예를 통해 본 발명에 따르는 혈관신생 억제제에 대하여 보다 상세하게 설명하며 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 혈관 내피세포 증식 억제효과 실험

본 발명에 따르는 혈관형성 억제제가 소 모세혈관 내피(bovine capillary endothelial, BCE) 세포의 증식을 억제하는지 여부를 확인하는 실험을 하였다.

1) 실험 동물, 시약 및 실험세포

실험동물로는 약 200g의 수컷 스프라그-돌리 랫트를 사용하였다. 육산화사비소를 물에 교반하여 녹여 1mM 농도의 스톡 용액으로 만들어 실온에서 보관하였다. BCE 세포는 이태희 박사(Lee, T. H., Rhim, T., and Kim, S. S. (1998). Prothrombin kringle-2 domain has a growth inhibitory activity against basic fibroblast growth factor-stimulated capillary endothelial cells. J. Biol.Chem. 273, 28805-28812)로부터 입수하여 10% 열-불활성화된 BCS(bovine calf serum; Hyclone Laboratories, Logan, UT), L-글루타민 (2mM), 페니실린 (110units/ml), 스트렙토마이신 (100μg/ml) 및 1.5 ng/ml의 재조합 인체 bFGF(R D Systems, Minneapolis, MN)을 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에 보관하였다. 세포는 10% CO₂조건하에서 37℃에서 인큐베이션하여 10-15 계대 배양한 것을 실험에 사용하였다.

2) 내피세포 증식 측정검사

내피세포 증식 측정검사는 카오 등(Cao, Y., Chen, A., An, S. S. A., Ji, R. W., Davodson, D., Cao, Y., and Llinas, M. (1997) Kringle 5 of plasminogen is a novel inhibitor for endothelial cell growth. J. Biol. Chem. 271, 22924-22928.)이 사용한 방법으로 수행하였다. 젤라틴이 코팅된 플레이트에 BCE 세포를 생장시켜 0.05% 트립신 용액에 분산시킨 다음 10% BCS을 함유하는 DMEM에 재현탁시켰다. 젤라틴 코팅된 24-웰 플레이트의 각 웰마다 대략 12.500 개의 세포를 넣어 37℃(10% CO₂)에서 24 시간동안 배양하였다. 배지를 5% BCS를 함유하는 신선한 DMEM배지 0.25ml로 교환하였다. 30분간 배양한 후에 5% BCS 및 3ng/ml의 bFGF를 함유하는 DMEM 를 가하여 전체 배지량이 0.5ml이 되도록 하였다. 72시간동안 배양한 다음, 세포를 트립신효소로 분해시켜 헤모사이토미터를 사용하여 계수하였다. 각 실험조건에 따라 3배수로 3회씩 실험하였다.

본 발명에 따르는 육산화사비소가 내피세포 증식을 억제하는지 여부에 대하여 확인하기 위하여 3ng/ml bFGF로 자극시킨 BCE 세포를 육산화사비소(농도 10nM, 20nM, 50nM, 100nM 및 200nM)와 함께 배양하여 상기와 같은 방법으로 내포세포 증식을 측정한 결과를 도 2의 그래프로 나타냈다. 대조군으로는 bFGF를 넣지 않은 군과 bFGF를 넣되 육산화사비소를 넣지 않은 군에 대하여 실험하였다.

도 2로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따르는 육산화사비소는 100nM 농도에서 BCE 세포의 증식을 현저하게 억제하였으며 내피세포의 증식 억제는 용량 의존적인 양상을 보여주었다.(IC₅₀= 99nM). 3일동안 배양한 후에 세포에 조직학적인 변형은 관찰되지 않았다.

실시예 2: 혈관 내피세포의 침윤성 억제효과 실험

본 발명에 따르는 혈관형성 억제제가 소 모세혈관 내피(bovine capillary endothelial, BCE) 세포의 침윤성을 억제하는지 여부를 확인하는 실험을 하였다.

1) 실험 동물 및 실험세포

상기 실시예 1의 실험동물 및 실험세포와 동일한 것을 사용하였다.

2) 내피세포 주화성(chemotaxis) 측정검사

주화성 측정검사는 폴리카보네이트 누클레오포어 멤브레인을 구비한 개량된 보이든 챔버(Boyden Chamber, Corning, Corning, NY)을 사용하여 문헌(Veronique Rigot, Maxime Lehmann, Frederic andre, Noucha Daemi, Jacques Marvaldi and Jose Luis: Integrin ligation and PKC activation are required for migration of colon carcinoma cells. Journal of cell science 111, 3119-3127 (1998))에 기재되어 있는 방법에 따라 수행하였다. 미리 코팅된 필터(6.5 직경, 8㎛ 구경, Matrigel 100 μg/㎠)를 250 ml 의 배지에 재수화시킨 다음 200 ml 의 배지에 육산화사비소를 넣거나 넣지 않은 상태(농도는 10nM, 20nM, 50nM, 100nM 및 200nM로 하여 각 삼배수씩 )에서 1 x 10⁵개의 세포수 만큼씩 각 챔버의 상단에 접종하고, 하단부에는 0.1 % BSA 및 10 ng/ml의 bFGF을 화학주성인자(chemoattractant)로서 양성 대조군에서는 넣고 음성 대조군에서는 넣지 않은 200 uL의 무혈청 DMEM 를 채워 넣었다. 37^oC에서 72시간 동안 배양한 다음, 필터 하층면으로 이동한 세포를 고정시켜 0.125%의 쿠마시 블루(Cumassie Blue)(메탄올: 아세트산: 물= 45:10:45 v/v/v) 로 염색하였다. 웰당 다섯개의 현미경 구간에 있는 세포수를 계수함으로써 주화성을 측정하였으며 이동도는 각 현미경 구간당 평균 세포수로 나타내어 도 3의 그래프에 표시하였다.

도 3으로부터 확인할 수 있는 바와 같이 bFGF 처리한 경우에는 세포가 현저하게 침윤된다는 사실을 알 수 있다. 그러나, 육산화사비소로 사전에 처리한 경우에는 이 침윤성이 농도-의존적인 양상으로 차단됨을 확인할 수 있다. 그 침윤성은 100nM에서 83.4%가 차단되었으며, IC₅₀는 48nM이다. 한편, 상기 실험에서 세포들에서 조직학적 변형은 발견되지 않았다.

실시예 3: 맥관형성 억제효과 실험

본 발명에 따르는 혈관형성 억제제가 혈관형성의 성숙, 즉 모세혈관의 내피세포의 관상구조의 형성을 억제하는지 여부를 확인하기 위하여 BCE 세포를 피브린 겔상에서 삼차원 배양하여 관찰하였다.

1) 실험 동물 및 실험세포

2) 맥관 형성 측정검사

맥관형성 측정검사는 문헌(Bastaki M, Nelli EE, Dell'Era P, Rusnati M, Molinari-Tosatti MP, Parolini S, Auerbach R, Ruco LP, Possati L, Presta M, Basic fibroblast growth factor-induced angiogenic phenotype in mouse endothelium. A study of aortic and microvascular endothelial cell lines. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1997 Mar;17(3):454-64)에 기재되어 있는 방법에 따라 수행하였다. 요컨대, 2.5 mg/ml의 피브리노겐(Calbiochem, San Diego, CA)을 DMEM에 에 용해하여 배양된 BCE 세포를 넣어 최종 농도가 10⁵cells/ml이 되도록 한 다음, 트롬빈(0.5 unit/ml)를 첨가하여 응고가 개시되도록 하였다. 혼합물을즉시 24-웰 플레이트에 옮기고 37^oC에서 5분간 겔이 형성되도록 하였다. 겔이 형성된 다음 bFGF (10 ng/ml) 및 육산화사비소 (100 nM)를 넣거나 넣지 않은 배지를 0.5 ml씩 웰마다 첨가하였다. 48 또는 96시간후에 역광 현미경을 사용하여 맥관 형성을 관찰하였다. 그 결과를 도 4A 내지 4C의 사진으로 나타냈다.

도 4A 및 4B로부터 확인되는 바와 같이 BCE 세포는 피브린 겔상에서 맥관 구조를 형성하며 배열하였다. 그러나, 본 발명에 따르는 육산화사비소를 처리한 경우에는 도4C로부터 확인되는 바와 같이 맥관 형성이 억제되었으며, 이로부터 육산화사비소가 3차원 배양에서 내피세포 분화를 억제한다는 사실을 알 수 있다.

실시예 4: 각막 혈관신생 억제효과 실험

본 발명에 따르는 혈관형성 억제제가 in vivo에서 bFGF에 의해 유발된 혈관신생에 미치는 영향을 실험하였다.

각막 마이크로포켓 측정검사는 문헌(Polverini PJ, Bouck NP, Rastinejad F. Assay and purification of naturally occurring inhibitor of angiogenesis. Methods Enzymol. 1991;198:440-450)에 기재된 대로 수행하였다. 즉, 케타민으로 랫트를 마취시켰다. 백내장 나이프를 삽입하여 각막윤부부터 포켓 연부가 1-1.5mm가 되도록 각막 포켓을 만들었다. 2㎍의 재조합 bFGF (R D Systems, Minneapolis, MN, U.S.A.)를 함유하는 식염수 30㎕를 300㎍의 수크랄페이트(Sucralfate; Sigma, St. Louis, MO, U.S.A.)와 혼합한 펠릿을 만들어이 현탁액을 폴리(2-하이드록시에틸 메트아크릴레이트) (Sigma, St. Louis, MO, U.S.A.)을 에탄올에 녹여 12% (wt/vol) 농도로 만든 용액 30㎕에 가하였다. 이 혼합물중의 일부를 테플론 페그(Teflon peg)에 피펫팅하여 건조시켜 대략 17 펠릿을 만들되, 각 펠릿에는 대략 100ng의 bFGF가 함유되도록 하였다.

이 펠릿을 마취시킨 스프라그 돌리 랫트의 각 눈의 각막 마이크로포켓에 이식한 다음, 각막 표면에 에리스로마이신 연고를 일회 국소 도포하였다. 육산화사비소 투여군은 이식일로부터 50mg/kg의 육산화사비소 분말로 위장관세척방법에 의한 경구투여를 하였으며, 대조군에서는 육산화사비소를 투여하지 아니하고 음식과 물을 공급하였다. 모든 동물의 양안을 매일 슬릿 램프로 검진하여 각막 혈관신생을 검진하고 7일째에 혈관신생정도를 평가하였다. 각막의 신생혈관의 면적은 각막연부로부터의 혈관 길이(L) 및 각막연부의 클록 아워수(C)(clock hour: 신생혈관의 분포 각도를 시간 단위로 표시한 것, 예컨대 30도 각도에 걸치는 분포는 1이 됨, 이를 길이로 표현하여 대조군과 비교하였음)를 측정하여 문헌 (D'Amato RJ, Loughnan MS, Flynn E, Folkman J, Thalidomide is an inhibitor of angiogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A 1994 Apr 26;91(9):4082-5 )에 기재된 방법으로 산출하였다. 환형 밴드대(circular band segment)의 면적 산출공식은 C/12×3.1416 [r2-(r-L)2]이며 이때에 r = 5 mm로서 랫트 각막의 직경이다. 측정된 사진 및 측정값을 도 5A 내지 5E로 나타냈다.

도 5A 및 5B로부터 확인되는 바와 같이 육산화사비소를 50mg/kg/day 용량으로 7일간 경구투여한 랫트에서 bFGF에 의해 유발된 각막 혈관신생이 현저하게 억제된다는 사실을 알 수 있다. 또한, 도 5C 및 5D로부터 각막 주변 혈관신생 길이 및 분포가 60%이상 억제됨을 알 수 있으며, 도5E로부터 육산화사비소를 투여함으로써 신생된 혈관 면적이 약 90%정도 감소하는 것으로 확인되었다. 육산화사비소를 투여한 랫트에서는 각막 혈관의 밀도 역시 대조군에 비하여 현저하게 감소하였음을 확인할 수 있었다. 한편, 육산화사비소를 투여한 랫트에서는 체중감량이나 비정상적인 동태가 관찰되지 않았는데 이는 본 실험에 사용된 용량에서는 육산화사비소가 독성을 나타내지 않음을 다시 한 번 확인하여 준다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따르는 육산화사비소로 된 혈관신생 억제제는 in vivo 및 in vitro에서 매우 우수한 혈관신생 억제효과를 나타냈다. 따라서, 본 발명에 따르는 혈관신생 억제제는 혈관신생과 관련된 다양한 질환에 대한 치료제로서 널리 적용할 수 있는 유용한 발명이다.

Claims

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20∼200nM의 육산화비소로 이루어진 것을 특징으로 하는 당뇨성 망막증 치료제.
20∼200nM의 육산화비소로 이루어진 것을 특징으로 하는 관절염 치료제.
20∼200nM의 육산화비소로 이루어진 것을 특징으로 하는 혈관종 치료제.
20∼200nM의 육산화비소로 이루어진 것을 특징으로 하는 건선 치료제.