KR20130110466A

KR20130110466A - 면역 관련 질환 및 산화적 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20130110466A
Application number: KR1020120032471A
Authority: KR
Inventors: 김학범
Original assignee: 옥경윤; 옥은희
Priority date: 2012-03-29
Filing date: 2012-03-29
Publication date: 2013-10-10
Also published as: JP2015511636A; US9072721B2; US20150017253A1; JP6117333B2; CN104203261A; KR101391148B1; WO2013147513A1; CN104203261B

Abstract

본 발명은 면역관련질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비소 화합물의 독성을 효과적으로 억제시키면서도 이의 면역 기능 강화 효과를 극대화시킨 면역관련질환 또는 산화적 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 종래 독성때문에 임상적 적용이 어려웠던 비소화합물의 독성을 저감시키면서도 그 약리효과를 극대화함으로써 다양한 면역 관련 질환 또는 산화적 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용하다.

Description

면역 관련 질환 및 산화적 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating immune-related and oxidative stress-related diseases}

본 발명은 면역 관련 질환 또는 산화적 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비소 화합물의 독성을 효과적으로 억제시키면서도 이의 면역 기능 강화 효과 및 항산화 효과를 극대화시킨 면역 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

면역 관련 질환 및 염증 질환은 정상적인 생리 상태에서는 상해 또는 손상에 대한 반응, 상해 또는 손상의 복구 개시 및 외래 유기체에 대항하는 선천성 또는 후천성 방어의 개시에 중요한, 아주 복잡하고 종종 복합적으로 상호연관된 생물학적 경로들의 징후 또는 결과이다. 이러한 정상적인 생리적 경로들이 반응의 강도에 직접적으로 연관되거나, 비정상적인 조절 또는 과도한 자극의 결과로서, 자가 (self)에 대한 반응으로, 또는 이들의 조합으로 추가의 상해 또는 손상을 초래하는 경우, 질환 또는 병이 발생한다. 이러한 면역 관련 질환으로서 많은 질환들이 알려져 광범위하게 연구되어 왔는데, 그 예로써, 면역매개성 염증 질환, 비면역매개성 염증 질환, 감염증 및 면역결핍질환 등이 있다. 또한, 면역기능의 저하는 외부로부터 유입된 항원을 적절히 처리하지 못함으로써 생체의 균형을 유지하는 항상성이 깨지면서 암을 비롯한 다양한 질병의 원인이 된다고 알려져 있다. 특히, 나이가 들수록 면역 기능이 점진적으로 저하되어, 암에 걸릴 확률도 높아지며, 특히 간장 및 호흡기 계통의 암의 발생 빈도가 크게 증가하고 있다고 보고되고 있다.

또한, 항산화(antioxidation)는 체내에서 일어나는 여러 산화작용을 방지하는 것을 말하며, 생체막이나 지단백질로서 존재하는 지질은 체내에서 발생하는 자유 라디칼(free radical)의 공격을 받아 여러 종류의 과산화물을 형성하는데, 과산화물들과 분해산물 등은 반응성이 높아 주변의 생체분자들의 구조와 기능을 변환시켜 여러 가지 만성질환을 초래한다. 생체 내에는 이러한 자유 라디칼(free radical)을 중화시키고 몸을 보호할 수 있는 여러 항산화 방어기구가 있다. 그러나 이러한 항산화 방어계가 자유 라디칼 생성을 조절할 수 없을 정도로 저하될 때 조직의 산화적 스트레스와 손상이 촉진되며 체내에서 생성된 과잉의 자유 라디칼과 지질 과산화물은 단백질의 산화, DNA 손상과 같은 산화적 스트레스에 의한 상해를 증가시킨다(Kumar CT., et al., Mol. Cell Biochem., 111, pp.109-115, 1992). 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 심혈관질환, 당뇨병, 암, 퇴행성 신경병, 노화 등 만성퇴행성 질환을 유발하는 주요 요인이 될 수 있으며, 항산화 물질은 만성퇴행성의 예방에 도움을 줄 수 있다고 알려져 있다(Bray, T.M. Nutrition. 16, pp.578-581, 2000).

한편, 비소(arsenic)는 피부와 폐에 암을 유발하는 강력한 발암물질로 알려져 왔으나, 기원전 2000년경부터 인간 질병의 치료를 위해 사용된 약물로서, 우리나라를 비롯한 동양의 전통 의학에서는 오래 전부터 비소 화합물을 여러 불치병의 치료에 응용하여 왔다. 우리나라 및 중국의 한방고서에서 언급한 내용을 보면 동의보감에서는 비소를 「비상」이라는 이름으로 하여 한방의 약제로 사용하였으며, 독을 죽여서 사용하게 되면 중악과 복통을 다스리는데 효과가 있는 것으로 기술되어 있다. 또한, 중국의 본초강목에도 황웅이란 이름으로 비소의 이용방법 및 활성에 관한 사실이 기술되어 있다.

한편 서구에서도 비소 화합물은 일부 질병의 치료제로서 히포크라테스(Hippocrates, 460∼377 BC) 및 가렌(Galen, 130∼200 AD) 등이 사용하였다는 기록이 있고, 류머티스(rheumatosis), 매독(syphilis) 및 건선(psoriasis) 등의 여러 질병의 치료제로 이용되어 왔으며, 낮은 농도에서는 사람의 조혈작용(hematopoiesis)을 촉진하는 등 인체에 유익한 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 이처럼 비소의 생리활성은 오래 전부터 인정되어 실제로 임상에 사용되어 왔으나, 현재 우리나라의 경우 중금속 물질로 규정되어 그 사용이 극히 제한되어 있는 실정이다.

최근에는 비소의 약리작용에 의거하여 이를 암치료제로서 임상적으로 응용하려는 시도들이 활발히 진행되고 있는 추세이다. 비소 화합물(arsenic compounds)의 일종인 삼산화비소(As₂O₃)가 급성전골수성 백혈병(Acute Promyelocytic Leukemia)에 효과가 있다는 사실이 중국 상해의료원의 Shen 등에 의해 1997년에 발표되었고(Shen ZX et.al., Blood, 98 : 3354∼3360, 1997), 그 후 다른 연구자들에 의하여 그 효능이 증명되었다. 또한, 대한민국 특허출원 제 1998-16486호에는 마우스를 이용한 생체내 실험에서 악성종양의 증식을 억제하고, 종양의 전이를 유효하게 억제하는 활성을 나타내는 것이 상세히 개시되어 있다.

그러나, 상기의 여러 연구 결과들은 삼산화비소 등의 비소화합물의 새로운 치료제로서 이용될 수 있는 가능성을 제시하긴 하였으나, 실제 인체의 적용시에 발생할 수 있는 비소화합물들의 독성 및 저농도에서의 비소에 대한 감수성의 향상은 아직까지도 극복하여야 할 과제로 남아 있다.

본 발명의 목적은 비소 화합물의 독성을 효과적으로 감소시키면서도, 비소 화합물의 약리학적 효과를 증대시킬 수 있는 면역 관련 질환 또는 산화적 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라 본 발명은 정향, 전충, 경면 주사, 우황, 백간잠, 백부자, 고백반, 자하거, 용뇌 및 비소 화합물을 포함하는, 비소 화합물의 독성이 효과적으로 감소된 면역 관련 질환 또는 산화적 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 조성물은 종래 독성때문에 임상적 적용이 어려웠던 비소 화합물의 독성을 저감시키면서도 그 약리효과를 극대화함으로써, 면역 증강 효과를 통한 간염, 간경화, 암, 후천성 면역결핍성 질환, 천식 및 아토피를 비롯한 다양한 면역 관련 질환의 예방 또는 치료, 및 항산화 효과를 통한 산화적 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용하다.

도 1은 정상 래트 간의 조직병리학적 병변을 헤마톡실린 및 에오신 염색으로 확인한 사진이다. pt는 문맥삼각(Portal Triad), V는 중심정맥(central vein)을 나타낸다.
도 2는 사염화탄소 처리된 대조군 래트 간의 조직병리학적 병변을 헤마톡실린 및 에오신 염색으로 확인한 사진이다.
도 3은 저농도의 시료(실시예 1의 환약) 및 사염화탄소로 전처리된 래트 간의 조직병리학적 병변을 헤마톡실린 및 에오신 염색으로 확인한 사진이다.
도 4는 고농도의 시료(실시예 1의 환약) 및 사염화탄소로 전처리된 래트 간의 조직병리학적 병변을 헤마톡실린 및 에오신 염색으로 확인한 사진이다.
도 5는 실리마린 및 사염화탄소로 전처리된 래트 간의 조직병리학적 병변을 헤마톡실린 및 에오신 염색으로 확인한 사진이다.
도 6은 정상 래트 간의 조직병리학적 병변을 헤마톡실린 및 에오신 염색으로 확인한 사진이다.
도 7은 고농도의 시료(실시예 1의 환약)를 처리한 래트 간의 조직병리학적 병변을 헤마톡실린 및 에오신 염색으로 확인한 사진이다.
도 8은 시료(실시예 1의 환약)의 DPPH 자유 라디칼 소거능 측정 결과를 나타낸 그래프이다. IM0.8은 시료 0.8 mg/ml 처리군, IM4는 시료 4 mg/ml 처리군, IM20은 시료 20 mg/ml 처리군, IM100은 시료 100 mg/ml 처리군 및 IM200은 시료 200 mg/ml 처리군을 의미한다.
도 9는 시료(실시예 1의 환약)의 질소산화물 생성 억제 효과를 나타낸 그래프이다. IM0.8은 시료 0.8 mg/ml 처리군, IM4는 시료 4 mg/ml 처리군, IM20은 시료 20 mg/ml 처리군, IM100은 시료 100 mg/ml 처리군 및 IM200은 시료 200 mg/ml 처리군을 의미한다.
도 10은 시료(실시예 1의 환약)의 대식세포에 대한 세포 독성을 확인한 그래프이다(IM0 : 비처리군, IM15.6 : 시료 15.6 ug/ml 처리군, IM31.3 : 시료 31.3 ug/ml 처리군, IM62.5 : 시료 62.5 ug/ml 처리군, IM125 : 시료 125 ug/ml 처리군, IM250 : 시료 250 ug/ml 처리군).
도 11은 시료(실시예 1의 환약)의 대식세포의 대식능에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다(Blank : 비처리군, Control : LPS 처리군, IM10 : LPS + 시료 10 ug/ml 처리군, IM50 : LPS + 시료 50 ug/ml 처리군, IM100 : LPS + 시료 100 ug/ml 처리군, IM200 : LPS + 시료 200 ug/ml 처리군).
도 12는 시료(실시예 1의 환약)의 대식세포의 대식능에 미치는 영향을 확인한 그래프이다(A : 비처리군, B : LPS 처리군, C : LPS + 시료 10 ug/ml 처리군, D : LPS + 시료 50 ug/ml 처리군, E : LPS + 시료 100 ug/ml 처리군, F : LPS + 시료 200 ug/ml 처리군).
도 13은 시료(실시예 1의 환약)의 NO 생성 억제에 대한 효과를 확인한 그래프이다(Blank : Non-treated group, Control : LPS 처리군, IM10 : LPS + 시료 10 ug/ml 처리군, IM50 : LPS + 시료 50 ug/ml 처리군, IM100 : LPS + 시료 100 ug/ml 처리군, IM200 : LPS + 시료 200 ug/ml 처리군).
도 14는 본 발명에 따른 조성물의 히스타민(histamine) 분비에 대한 효과를 확인한 그래프이다(Blank : 비처리군, Control : compound 48/80 처리군, IM50 : compound 48/80 + 시료 50 ug/ml 처리군, IM100 : compound 48/80 + 시료 100 ug/ml 처리군, IM200 : compound 48/80 + 시료 200 ug/ml 처리군).
도 15는 시료(실시예 1의 환약)의 기관지 상피 세포에 대한 세포 독성 측정 결과를 나타낸 그래프이다(IM0 : 비처리군, IM10 : 시료 15.6 ug/ml 처리군, IM50 : 시료 31.3 ug/ml 처리군, IM100 : 시료 62.5 ug/ml 처리군, IM200 : 시료 125 ug/ml 처리군).
도 16은 RayBio 인간 사이토카인 항체 어레이 키트를 이용하여 실시예 1의 환약의 사이토카인 분비에 대한 영향을 확인한 것이다(A : 비처리군, B : LPS 처리군, C : LPS + 시료 50 ug/ml 처리군, D : LPS + 시료 200 ug/ml 처리군, ① : IL-1α, ② : IL-2, ③ : IL-10, ④ : TNF-β).

이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 정향, 전충, 경면 주사, 우황, 백간잠, 백부자, 고백반, 자하거, 용뇌 및 비소 화합물을 포함하는, 비소 화합물의 독성이 효과적으로 감소된 면역 관련 질환 또는 산화적 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어 "면역 관련 질환" 이란 포유동물 면역계의 어떤 구성성분이 그 포유동물에서의 질환을 야기하거나, 매개하거나 또는 그의 발병률에 기여하는 질환을 의미한다. 또한, 면역 반응의 자극 또는 개입이 그 질환의 진행을 가속하는 효과를 갖는 질환도 포함한다. 상기 용어에는 면역매개성 염증 질환, 비면역매개성 염증 질환, 감염증, 면역결핍질환 및 신생물(neoplasia) 등이 포함된다.

본 발명에 따라 처리될 수 있는 면역 관련 질환에는 제한이 없으나, 구체적인 예로서, 후천성 면역결핍증(AIDS), 간염 및 간경화와 같은 염증 질환, 각종 암, 천식, 알러지성 비염, 아토피성 피부염, 음식물 과민증 및 두드러기와 같은 알러지성 질환 등이 있다.

한편, 본 발명에서 사용되는 용어 "산화적 스트레스 관련 질환"이란, 산소와 영양물질이 반응하여 대사하는 과정 중에 체내에서 발생하는 활성산소종(자유라디칼)에 의해 유발되는 산화적 스트레스로 인해 발생하는 질환으로서, 구체적으로는 고지혈증 등의 지질대사질환, 동맥경화증, 심부전증, 고혈압성 심장질환, 부정맥, 심근경색증, 협심증 등의 심장 질환, 노화, 면역질환 및 암 등을 예시할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 각 구성성분을 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서 사용되는 비소 화합물은 약리학적으로 사용될 수 있는 비소 화합물로서, 비상이라고도 불리우는 삼산화비소(As₂O₃), 육산화비소(As₄O₆), 아르세닉 트리브로마이드(AsBr₃), 아르세닉 트리클로라이드(AsCl₃), 아르세닉 트리아이오다이드(AsI₃) 및 멜라소프롤(Melarsoprol) 등이 있다.

정향(丁香)은 열대 상록성 아교목의 정향 나무의 꽃봉오리로서, 분말이나 정향유를 식용 및 약용으로 사용한다. 정향은 맛과 향이 강하고 혀를 마비시키며 맛은 맵고 성질은 따뜻한데, 위가 차가워서 생기는 구토, 위암, 복통, 소화불량과 성기능 증대, 잇몸염증 및 잇몸통증 등에 쓰인다. 약리작용으로 위액분비촉진, 진통, 항경련, 항염, 항산화, 항혈전, 항균, 구충 및 혈압강하작용 등이 보고되어 있다.

전충(全蟲)은 전갈과에 속하는 전갈의 충체를 건조한 것으로 그 맛은 약간 짜고 매우며 약간의 독이 있다. 거담 작용, 와사증(입이 비뚤어지는 증상)을 치료하고, 풍을 제거하는 작용을 한다.

경면 주사(朱砂)란 결정체로 된 주사를 의미하며, 황화합물로 황화수은(HgS)을 주성분으로 하는 천연광석이다. 성질은 달고 짜며 차고, 정신을 안정시키고 경풍을 멈추며 열을 내리고 독을 푸는 작용을 한다. 잘 놀라고 가슴이 두근거리는 증상, 수면 장애, 건망증, 경풍, 경간, 정신병, 열이 심하고 정신이 흐리며 헛소리를 하는 증상에 사용한다.

우황(牛黃)이란 인도, 이란 및 중국 등에 서식하는 포유동물인 소, 산양 및 영양(羚羊) 등의 반추류의 담낭 속에 병적으로 생긴 응결물로서, 주로 소의 담낭이나 담관에서 취출(取出)하여 외부로 막질을 제거하고 음건(陰乾)하여 사용한다. 생김새는 황갈색 구상의 작은 덩어리로서 지름 약 2cm이며, 가볍고 쉽게 부서진다. 맛은 약간 쓰고 콜릭산, 빌리루빈, 에르고스테롤 및 비타민 D 등을 주요 성분으로서 포함한다. 한방에서는 해열제, 해독제, 진정제, 진통제 및 강심제로 쓰인다.

백간잠(白干蠶)은 실을 뽑기 전에 백간잠균의 감염에 의해 강직사시킨 누에를 말린 것을 말하며, 풍 및 습을 제거하고, 거담 기능 및 종창의 독을 제거하는 작용을 한다.

백부자(白附子)는 미나리아재비과의 여러해살이풀인 노랑돌쩌귀(Aconitum koreanum, Typhonium giganteum)의 덩이줄기로, 냄새가 없고 혀끝을 마비시키며 맛은 맵고 성질은 따뜻하며 독이 있다. 백부자는 풍과 담을 제거하여 중풍으로 인한 안면신경마비, 경련, 발작, 중풍, 파상풍, 편두통, 두통 및 풍습성 사지마비, 관절통, 음낭습진, 피부가려움증 및 경부림프절염에 쓰이며 뱀에 물렸을 때 해독작용이 있다.

고백반(枯白礬)은 명반, 즉 칼륨명반(KAl(SO₄)₂·12H₂O)을 가열하여 탈수시킨 것을 말하는데, 모든 독을 해독한다고 하며, 명반과 마찬가지로 지혈제(止血劑), 수렴제 등 의약품으로 사용되는데, 수분을 빼앗는 성질이 있다고 알려져 있다.

자하거(紫河車)란 인간의 태반으로 무독하고 성질이 따뜻하여 기운을 돋우고, 피를 보양하고, 정(精)을 보하는 효과가 있다. 주로 강장약으로서 만성피로증후군이나 신경쇠약, 빈혈, 만성기관지염, 천식, 해수 및 결핵 등의 증세에 활용한다. 자궁을 수축시키고 유선과 여성생식기, 난소의 발육을 촉진하기도 한다.

용뇌(龍腦)는 용뇌향과(龍腦香科: Dipterocarpaceae)에 속한 상록교목인 용뇌향수(龍腦香樹, Dryobalanops aromatica GAERTNER)의 수지(樹脂) 혹은 수간(樹幹)과 가지를 썰어 수증기 증류하여 얻은 백색의 결정체를 말한다. 맛은 맵고 쓰며 성질은 서늘하고, 막힌 것을 통하게 하고 정신을 맑게 하여 정신혼몽, 의식장애 등을 열과 부기를 내리고 통증을 완화시켜 주며, 고열, 경련, 소아 경기에 효과가 있으며 인후염과 구내염, 눈병, 가려움증, 충혈, 귀코의 염증 등 각종 염증에 이용된다.

본 발명의 조성물은, 비소 화합물 1 내지 7 중량부, 정향 15 내지 25 중량부, 전충 200 내지 270 중량부, 경면 주사 20 내지 30 중량부, 우황 25 내지 35 중량부, 백간잠 50 내지 65 중량부, 백부자 38 내지 48 중량부, 고백반 50 내지 65 중량부, 자하거 200 내지 270 중량부 및 용뇌 0.5 내지 6 중량부를 포함하는 것이 바람직하다.

더욱 바람직하게 본 발명의 조성물은, 비소 화합물 3 내지 5 중량부, 정향 17 내지 22 중량부, 전충 220 내지 250 중량부, 경면 주사 22 내지 27 중량부, 우황 27 내지 31 중량부, 백간잠 55 내지 62 중량부, 백부자 41 내지 46 중량부, 고백반 55 내지 62 중량부, 자하거 220 내지 250 중량부 및 용뇌 2 내지 4 중량부를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 면역 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물은 경구투여용 또는 비경구투여용의 다양한 형태로 제제화될 수 있다. 경구투여용 조성물의 예로서는 정제, 캡슐제, 과립제 및 환제 등을 들 수 있다.

이러한 본 발명의 조성물은 약제학적으로 통상 사용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합하여 제조될 수도 있는데, 이때 사용되는 적합한 담체, 희석제 또는 부형제의 실례로는 전분, 당, 및 만니톨과 같은 부형제; 칼슘 포스페이트 및 규산 유도체와 같은 충전제 및 증량제; 카복시메틸셀룰로스 또는 하이드록시프로필셀룰로오스 등의 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 알긴산염, 및 폴리비닐 피롤리돈과 같은 결합제; 활석, 스테아린산 칼슘 또는 마그네슘, 수소화 피마자유, 및 고상 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제; 포비돈, 나트륨 크로스카멜로스, 및 크로스포비돈과 같은 붕해제; 폴리소르베이트, 세틸(cetyl) 알코올, 및 글리세롤 모노스테아레이트 등과 같은 계면활성제 등을 들 수 있다. 또한, 상기 조성물이 환제인 경우, 환제 성분을 결합시키기 위해 꿀과 같은 결합제를 포함할 수 있고, 조제된 환제의 상호점착, 곰팡이의 발생, 수분의 증산을 방지하거나, 교미 또는 교취를 위해 석송자, 탈크, 전분, 카올린, 감초가루, 계피가루 및 이리스근 가루 등의 환의(dusting powder)를 포함할 수 있다.

또한, 상기 담체, 희석제 또는 부형제와 같은 첨가제 없이 또는 첨가제와 함께 특정량의 유효성분을 포함하는 다양한 약학 조성물은 공지된 통상적인 방법에 따라 제조할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물을 정제의 형태로 제조하는 경우, 조성물에 상기 담체, 희석제 또는 부형제 같은 첨가제를 가해서 직접 또는 과립상으로 한 후 압축 성형할 수 있고, 캡슐제의 경우 상기 조성물을 액상, 현탁상 또는 과립상 등의 형태로 캡슐에 충전하거나 캡슐기제로 피포성형할 수 있으며, 환제의 경우, 상기 조성물에 담체, 희석제 또는 부형제 같은 첨가제를 가해서 균등하게 혼화하여 소성의 덩어리로 한 후 분할하여 구상으로 성형하는 등의 방법을 통해 제조될 수 있다.

이렇게 얻어진 본 발명의 조성물은 하기 실시예로부터도 확인할 수 있는 바와 같이 종래 알려진 비소 화합물의 독성을 현저하게 감소시켰다는 탁월한 효과를 나타낸다. 나아가, 비소 화합물의 면역 기능 강화 효과를 극대화시켜 면역 관련 질환의 예방 또는 치료에 탁월한 효과를 나타낸다. 또한, 본 발명의 조성물은 탁월한 항산화 효과를 나타내어 고지혈증 등의 지질대사질환, 동맥경화증, 심부전증, 고혈압성 심장질환, 부정맥, 심근경색증, 협심증 등의 심장 질환, 노화, 면역질환 및 암과 같은 다양한 산화적 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용하다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시에는 본 발명의 예시에 불과하며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 비소 화합물 함유 환약의 제조

본 발명에 따른 비소 화합물 함유 환약을 제조하기 위하여, 각각의 약재(비소화합물로서 비상(삼산화비소), 정향, 전충, 경면 주사, 우황, 백간잠, 백부자, 고백반, 자하거, 용뇌)를 경동시장에서 선별하여 구입하였다. 이후, 비상 40g, 정향 200g, 전충 2400g, 경면 주사 250g, 우황 300g, 백간잠 600g, 백부자 450g, 고백반 600g, 자하거 2400g 및 용뇌 30g을 각각 칭량하여 분쇄한 후, 혼합기에서 혼합한다. 이후, 혼합된 약제의 결합을 위해 적당량의 꿀을 투입하여 반죽하고, 제조된 반죽을 장환기에서 뽑은 후, 환 절단기에 투입하여 제환하여 환약을 제조하였다. 상기와 같이 제조된 환약을 이하의 시험에서 사용하였다.

실험예 1. 간보호 효과 및 안전성 분석

사염화탄소(CCl₄)는 대표적인 간독성 화학물질로 간세포손상과 관련된 연구에 널리 이용되고 있다. 사염화탄소는 간세포내에서의 효소성 대사과정에서 생성되는 자유 라디칼이 축적되어 세포막의 지질과산화, 단백질의 산화적 변형 또는 DNA 손상을 초래하는 산화적 스트레스(oxidative stress)로 세포손상을 유발하게 된다.

따라서, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 간보호 효과를 측정하기 위하여, 흰쥐에 사염화탄소의 투여와 함께 실시예 1에서 제조된 환약을 투여한 후 간세포손상의 혈청학적 지표와 병리조직학적 변화, 그리고 산화적 스트레스와 관련된 지질과산화(lipid peroxidation) 정도를 비교하여 제공된 환약의 간세포손상 방어효과 및 경구투여에 따른 안전성 여부를 확인하였다.

실험동물

8주령의 수컷 Spargue-Dawley Rat(샘타코, 한국)를 구입하여 세명대학교 청정동물사육실(온도 23±1 ℃, 습도 50±5 %, 12h light/ 12h dark)에서 5일간 적응시키면서 체중이 평균 235 g에 달할 때 실험에 사용하였다. 전 실험기간 중 사료(제일제당, 한국)와 음수는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 본 동물실험은 세명대학교 동물실험윤리위원회의 승인(smeac 11-08-01)하에 실시되었다.

실험군의 분류 및 처치

정상군(normal group)은 실험개시일부터 매일 증류수 1㎖을 7일간 경구투여하고, 최종투여 1시간후에 올리브 오일(1㎖/체중 ㎏)을 복강내투여 하였다.

대조군(control group)은 실험개시일부터 매일 증류수 1㎖을 7일간 경구투여하고, 최종투여 1시간후에 CCl₄ 용액(50% CCl₄ in olive oil) 1㎖/체중 ㎏을 복강내투여 하였다.

저농도군(low-dose group)은 실험개시일부터 매일 저농도환약액(300㎎/체중 ㎏)을 7일간 경구투여하고, 최종투여 1시간후에 CCl₄ 용액(50% CCl₄ in olive oil) 1㎖/체중 ㎏을 복강내투여 하였다.

고농도군(high-dose group)은 실험개시일부터 매일 고농도환약액(1500㎎/체중 ㎏)을 7일간 경구투여하고, 최종투여 1시간후에 CCl₄ 용액(50% CCl₄ in olive oil) 1㎖/체중 ㎏을 복강내투여 하였다.

실리마린군(silymarin group)은 실험개시일부터 매일 실리마린(Sigma Co., USA)액(100㎎/체중 ㎏)을 7일간 경구투여하고, 최종투여 1시간후에 CCl₄ 용액(50% CCl₄ in olive oil) 1㎖/체중 ㎏을 복강내 투여 하였다.

안전성시험군(safety test group)은 제공된 환약의 안전성을 평가하기 위해서 정상군과 같이 실험개시일부터 매일 고농도환약액(1500㎎/체중 ㎏)을 7일간 경구투여하고, 최종투여 1시간 후에 olive oil(1㎖/체중 ㎏)을 복강내 투여 하였다.

이상의 실험군의 분류 및 실험과정을 표 1에 도식화하였다.

검사항목

1) 체중 및 체중증가율

모든 동물의 체중을 실험개시일부터(1일), 4일, 7일 및 실험종료일(8일)에 측정하였다. 체중증가율은 (7일간 증가된 체중/실험개시일 체중)×100으로 계산하였다.

2) 간장 중량 및 간장/체중 비의 측정

실험종료일에 부검하여 간장을 적출하고 주변 결합조직을 세심히 제거한 후 간장 중량을 측정하였다. 간장/체중 비는 (간장 중량/체중)×100으로 계산하였다.

3) 혈청 알라닌 아미노트랜스퍼라제 ( ALT ) 및 아스파테이트 아미노트렌스퍼라제( AST ) 활성 검사

올리브 오일 또는 CCl₄를 복강내 투여한 후 24시간째에 흰쥐를 에테르로 가볍게 마취하고 심장을 통해서 혈액을 채취하고 혈청분리관에 주입하였다. 혈청분리관을 냉장상태에서 3,500rpm의 속도로 10분간 원심하여 혈청을 분리하였으며, 자동생화학분석기(Hitachi modular, Japan)를 이용하여 Modified IFCC 방법으로 혈청 ALT 및 AST를 측정하였다. 측정 시 사용된 시약은 AST(Roche, USA) 및 ALT(Roche, USA)를 이용하였다.

4) 간조직의 지질과산화(lipid peroxidation) 함량 측정

간장의 무게를 측정한 후 가운데엽(median lobe)의 우측 부위 일부를 적출하여 간조직내 지질과산화 함량 측정에 사용하였다.

지질과산화 함량 측정은 Ohkawa의 방법(Ohkawa et al., J. Med. Chem., 40, pp.559-573, 1997)에 준하여 치오바비투릭산 어세이법 (Thiobarbituric acid assay)를 이용하여 지질과산화의 최종산물인 말론디알데히드를 지표로 정량하였다. 즉, 간조직을 10배(v/w) 용량의 1.15% 염화칼륨 용액으로 균질화한 후, 균질액 0.2 ml, 8.1% SDS 0.2 ml, 20% 초산 (pH 3.5) 1.5 ml, 5% 부틸화 하이드록시톨루엔(Butylated hydroxytoluene) 0.5 ml 및 0.8% 치오바비투릭산 1.5 ml을 가하여 혼합하고, 100℃가 유지되는 항온조에서 60분간 반응시켜, 실온에서 1시간 동안 방치한 다음 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하고 상층액을 취하여 532 nm에서의 UV 분광기로 흡광도를 측정하였다.

5) 간조직의 병리조직학적 검사

적출된 가운데엽의 좌측 부위를 10% NBF 용액에 1일간 고정하고 일반적인 알콜탈수과정과 크실렌투명화과정을 거친 후 파라핀 블록을 만들었다. 5㎛ 두께의 파라핀 박절편을 제작하여 헤마톡실린 및 에오신 염색하고 광학현미경으로 병리학적 소견을 비교 관찰하였다.

결과

A. 간보호 효과

1) 체중의 차이

정상군에서의 체중은 실험기간 동안 꾸준히 증가되었으며, 실험 8일에는 절식으로 인하여 체중이 감소되었다. 대조군은 실험 7일까지 정상군과 유사한 정도의 체증 증가가 있었으나, 절식 및 CCl₄ 투여로 인해서 실험 8일째에는 정상군에 비해서 유의성 있게 낮았으며 체중증가율도 정상군에 비해서 유의성 있게 낮았다. 저농도군, 고농도군 및 실리마린군에서의 체중 및 체중증가율은 대조군에 비해서 다소 높게 나타났으나 유의성 있는 차이는 없었다(표 2).

2) 간장중량 및 간장/체중 비의 차이

실험종료일에 측정한 간장중량 및 간장/체중 비는 대조군이 정상군에 비해서 모두 유의성 있게 높게 나타났다. 저농도군에서는 대조군에 비해서 간장중량 및 간장/체중 비가 모두 유의성 있게 낮았다. 고농도군 및 실리마린군에서는 대조군에 비해서 간장중량 및 간장/체중 비가 다소 낮게 나타났으나 유의성 있는 차이는 없었다(표 3).

3) 혈중 ALT 및 AST 활성의 차이

대조군의 혈중 ALT 및 AST 활성은 정상군에 비해서 모두 유의성 있게 높았다. 저농도군의 혈중 ALT는 대조군에 비해서 유의성 있게 낮았으며, 혈중 AST는 대조군에 비해서 현저히 낮았으나 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 고농도군의 혈중 ALT 및 AST는 모두 대조군에 비해서 유의성 있게 낮았다. 실리마린군에서도 혈중 ALT는 대조군에 비해서 유의성 있게 낮았으며, 혈중 AST는 대조군에 비해서 낮았으나 유의한 차이는 관찰되지 않았다(표 4).

4) 간조직의 지질과산화물( 말론디알데히드; MDA ) 함량의 차이

대조군의 간조직중 MDA 함량은 정상군에 비해서 유의성 있게 높았다. 저농도군의 간조직중 MDA 함량은 대조군에 비해서 유의성 있게 낮았다. 고농도군의 간조직중 MDA 함량은 대조군에 비해서 유의성 있게 낮았다. 실리마린군에서도 간조직중 MDA 함량은 대조군에 비해서 유의성 있게 낮았다(표 5).

5) 병리조직학적 소견의 차이

정상군의 간조직은 도 1의 a 및 b로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 중심정맥, 문맥삼각, 간세포판 및 동양모세혈관의 모든 구조가 잘 유지되어 있었으며 간세포도 정상적인 구조를 취하고 있었다. 대조군의 간조직에서는 중심정맥 주위로 광범위한 간세포괴사가 관찰되었으며 괴사주변의 간세포는 다양한 크기의 공포변성 및 지방변화가 관찰되었다. 괴사된 부위에서는 다량의 염증세포 침윤이 확인되었다. 문맥삼각 주위의 간세포는 비교적 정상적인 구조를 유지하고 있었다(도 2의 a 및 b 참조).

한편, 도 3의 a 및 b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 저농도군에서 관찰된 간조직의 병리조직학적 변화는 대조군과 동일하였으나 중심정맥 주위의 간세포괴사 및 변성의 정도는 매우 미약하였으며, 염증세포의 침윤정도도 대조군에 비해서 현저하게 감소되었다. 고농도군에서도 간세포괴사 및 변성은 중심정맥 주위의 일부에서만 확인되었으며, 염증세포의 침윤은 대단히 드물게 관찰되어 정상군과 유사한 정도로 나타났다(도 4의 a 및 b 참조). 실리마린군에서의 병리조직학적 소견 및 정도는 고농도군에서와 유사하게 관찰되었다(도 5의 a 및 b 참조).

이상과 같이, 실시예 1에 따른 환약의 저농도군(300㎎/체중 ㎏)에서는 대조군에 비해서 혈중 ALT가 유의성 있게 낮게 나타났으며, 혈중 AST는 유의한 차이가 인정되지는 않았으나 대조군에 비해서 현저히 낮게 나타났다. 병리조직학적으로도 대조군에 비해서 병변의 정도가 완화되어 있었다. 또한, 상기 환약의 고농도군(1500㎎/체중 ㎏)에서는 대조군에 비해서 혈중 ALT 및 AST 모두 유의성 있게 낮았으며, 병리조직학적으로도 병변의 소견 및 정도가 대조군에 비해서 완화되어 있었는바, 본 발명의 조성물은 농도 의존적으로 간세포 손상을 예방하고, 산화적 스트레스 등에 의해 발생할 수 있는 간염, 간경화 등과 같은 간질환에 대한 예방 및 치료효과를 나타낼 수 있을 것으로 사료된다.

B. 안전성 분석

1) 체중의 차이

실시예 1의 환약의 안전성을 평가하기 위한 안전성시험군에서의 체중 및 체중증가율은 정상군에 비해서 다소 높게 나타났으나 유의성 있는 차이는 없었다(표 6).

2) 간장 중량 및 간장/체중 비의 차이

환약의 안전성을 평가하기 위한 안전성시험군에서의 간장 중량 및 간장/체중 비는 정상군과 유사하게 나타났다(표 7).

3) 혈중 ALT 및 AST 활성의 차이

환약의 안전성을 평가하기 위한 안전성시험군에서의 혈중 ALT 및 AST는 모두 정상군과 유사하게 나타났다(표 8).

4) 간조직의 지질과산화물( MDA ) 함량의 차이

환약의 안전성을 평가하기 위한 안전성시험군에서의 간조직중 MDA 함량은 정상군에 비해서 유의성 있게 낮았다(표 9).

5) 병리조직학적 소견의 차이

확인결과 정상군의 간조직은 중심정맥, 문맥삼각, 간세포판 및 동양모세혈관의 모든 구조가 잘 유지되어 있었으며 간세포도 정상적인 구조를 취하고 있었으며(도 6의 a 및 b 참조) 고농도의 환약만을 투여한 안전성 시험군에서도 간조직은 모두 정상적인 구조를 유지하고 있었다(도 7의 a 및 b 참조).

이상과 같이, 실시예 1에서 제조된 본 발명에 따른 환약의 안전성시험 결과, 본 발명에 따른 환약을 고농도로 투여한다 하여도 체중, 간장 중량, 혈중 ALT 및 AST, MDA 및 조직병리학적 소견 등의 모든 항목에서 정상군과 유사하게 확인되어 간세포손상을 초래하지 않는 탁월한 안전성을 나타냄을 확인하였다.

실험예 2. 항산화 효과와 면역 증강 및 면역 관련 질환 치료 효과 분석

항산화 효과를 알아볼 수 있는 자유 라디칼 소거 활성 시험은 화학적으로 안정한 자유 라디칼인 2,2-디페닐-1-피크릴하이드라질(DPPH)를 이용하는 방법으로, 515 nm~ 520 nm 부근에서 최대 흡광도를 가지며, 항산화활성이 있는 물질과 만나면 전자를 내어주면서 라디칼(DPPH)이 소멸되고 색깔이 변한다. 화학적으로 안정성 있는 DPPH는 여러 종의 항산화 성분이 내재된 추출물, 음료와 오일, 순수 페놀화합물 등의 항산화 효과를 분석할 수 있다.

한편, 활성질소 질소산화물(nitric oxide; NO)의 자유기는 활성산소와 더불어 산화적 스트레스의 원인이 되는데, 소듐 나이트라이트(Sodium nitrite)는 520 nm에서 최대 흡광도를 가지며, 항산화활성이 있는 물질과 만나면 전자를 내어주면서 라디칼이 소멸되고 색깔이 변한다.

따라서, 본 실험에서는 실시예 1에서 제조된 환약의 항산화 효능을 측정하기 위하여 자유라디칼 소거능을 DPPH와 소듐 나이트라이트를 이용하여 측정하였다.

한편, 본 실험에서는 대식세포의 탐식작용을 평가하여 시료의 면역증진 효능을 평가하였고, 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide; LPS)로 NO생성을 유발한 후 시료를 처리하여 NO생성을 억제하는 효능을 평가하여 과민반응 억제 효능을 평가하였다.

또한, 본 실험에서는 알레르기의 주요인이 되는 면역 세포인 비만 세포(mast cell)에 시료를 처리하여 히스타민 분비 억제효능을 평가하여 알레르기 반응 억제효능을 측정하였고, 알레르기 반응 중 천식에 관한 효과를 분석하기 위해 기관지상피세포를 LPS로 자극한 후 분비된 염증성 사이토카인을 측정하여 시료의 기관지천식 억제효능을 평가하였다.

재료 및 방법

1) 실험 재료의 준비

실시예 1에서 제조된 환약 200 g을 정밀하게 취한 후 증류수 2 L를 첨가하여 열수 추출하였다. 이후 감압농축기를 사용하여 농축한 후 동결 건조하여 수율 46.08%의 고운 분말을 제조하였다. 이 분말을 이후 실험에서의 시료로 사용하였다.

2) 시료의 항산화 기능성 평가

2-1) DPPH 자유기 소거능

동결 건조된 각각의 시료를 0.8, 4, 20, 100 및 200 mg/ml의 농도가 되도록 시액을 조제한 후 96 웰 플레이트 10 ul 씩 첨가하였다. 각 웰에 40 ul의 EtOH를 첨가한 후 2.5 mM DPPH를 첨가하여 30분간 반응시켰다. 이 반응액을 흡광도 515 nm에서 측정하여 자유기 소거능을 계산하였다.

2-2) NO 분석

각각의 시료를 0.8, 4, 20, 100 및 200 mg/ml의 농도가 되도록 시액을 조제한 후 각 시액을 1 ml 씩 15 ml 튜브에 분주하였다. 각 튜브에 1mM 아질산 나트륨 용액을 2 ml씩 첨가한 후 pH 1.2의 염산 용액, pH 3.0의 구연산 완충액 및 pH 6.0의 구연산 완충액을 각 튜브에 7 ml씩 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. 이 반응액을 1 ml씩 취하여 2% 초산 용액 및 그리스(griess) 시약을 첨가하였으며, 15분간 더 반응시킨 후 흡광도 520 nm에서 측정하여 아질산 소거능을 계산하였다.

3) 대식 세포에 대한 시료의 세포 독성 평가

마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포에 시료를 처리하여 면역 세포에 대한 시료의 세포독성을 확인하였다. 세포는 한국 세포주 은행에서 구입하였으며, 5% FBS 및 페니실린, 스트레토마이신을 함유한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)으로 37 ℃ 5% CO₂의 환경에서 3회 계대배양 하였다. 이후 96 웰 플레이트에 각 웰당 1×10⁴개의 세포를 분주하여 24시간 배양 후 시료를 농도별로 처리하였으며 다시 24시간 후 MTT 분석 방법을 이용하여 세포 독성을 평가하였다. 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 시그마(Sigma)사로부터 구입하여 MTT 시약으로 사용하였으며, 0.5 mg/ml의 농도로 각 세포에 처리하였다. 4시간 동안 추가 배양 후 생성된 결정을 디메틸 설폭사이드(Sigma)에 녹여 흡광도 595 nm에서 측정하였으며 정상군 대비 %로 환산하여 그래프로 나타내었다.

4) 대식세포의 탐식작용 평가( phagocytosis assay )

대식세포인 RAW 264.7 세포를 96 웰 플레이트에 각 웰당 0.5×10⁴개의 세포를 분주하여 24시간 배양하였다. 이후 각 웰에 LPS 1 ug/ml 및 형광 비드가 부착된 IgG를 처치하고, 시료를 농도별로 처리하였다. 24시간 후 각 웰의 배지를 제거한 뒤 40 ug/ml의 트립판 블루 용액으로 세척하였다. 세척된 플레이트를 여기(excitation) 485 nm 및 방출(emission) 535 nm의 형광 파장에서 측정하였으며, 정상군 대비 %로 환산하여 그래프로 나타내었다.

5) 대식 세포의 아질산염( Nitrite) 분비에 미치는 영향

대식세포인 RAW 264.7 세포를 96 웰 플레이트에 각 웰당 1×10⁴개의 세포를 분주하여 24시간 배양하였다. 이후 각 웰에 1 ug/ml 의 LPS를 처리하고, 시료를 농도별로 처리하였다. 4시간 후 각 웰의 배지를 100 ul씩 취하여 그리스(griess) 시약을 첨가하였으며, 15분간 더 반응시킨 후 흡광도 540 nm에서 측정하여 아질산 소거능을 계산하였다.

6) 시료의 히스타민 분비에 대한 효과

히스타민 분비에 대한 시료의 영향을 확인해보기 위하여 인간 비만세포인 HMC 세포를 이용하여 히스타민 분비량을 측정하였다. 1×10⁵개의 HMC 세포를 24 웰 플레이트에 각각 분주한 후 3시간동안 안정화시켰다. 이후 0.8, 4, 20, 100 및 200 mg/ml의 농도의 시료를 전처리하여 배양하였다. 30분 후 1 mg/ml의 compound 48/80을 처리한 후 15분 후에 각 웰에서 배지를 수거하였다. 100 ul의 배지에 1M NaOH 용액 50 ul를 넣은 후 1 mg/ml의 o-프탈디알데하이드 용액을 100 ul 첨가하였다. 4분 후 여기 360/40 및 방출 460/40에서 형광을 측정한 후 표준액과 비교하여 정량하였다.

7) 기관지 상피 세포에 대한 시료의 세포 독성 평가

인체 기관지 상피 세포인 A549 세포에 시료를 처리하여 기관지 상피 세포에 대한 시료의 세포독성을 확인하였다. 세포는 한국 세포주 은행에서 구입하였으며, 5% FBS 및 페니실린, 스트렙토마이신을 함유한 DMEM 배지에서 37 ℃ 5% CO₂의 환경에서 3회 계대배양 하였다. 이후 96 웰 플레이트에 각 웰당 1×10⁴개의 세포를 분주하여 24시간 배양 후 시료를 농도별로 처리하였으며 다시 24시간 후 MTT 분석 방법을 이용하여 세포 독성을 평가하였다. 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 시그마(Sigma)사로부터 구입하여 MTT 시약으로 사용하였으며, 0.5 mg/ml의 농도로 각 세포에 처리하였다. 4시간 동안 추가 배양 후 생성된 결정을 디메틸 설폭사이드(Sigma)에 녹여 흡광도 595 nm에서 측정하였으며 정상군 대비 %로 환산하여 그래프로 나타내었다.

8) 기관지 상피 세포에 대한 시료의 염증 관련 사이토카인 분비에 대한 효과

인체 기관지 상피 세포인 A549 세포를 24 웰 플레이트에 1×10⁵개씩 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 그 후 시료를 각 농도별로 처치하고 LPS를 이용하여 염증반응을 유도하였다. 24시간 배양 후 배지를 취하여 RayBio 인간 사이토카인 항체 어레이 키트(Human cytokine antibody array kit)를 이용하여 사이토카인 분비량을 측정하였다. 블록킹 완충용액(Blocking buffer)을 이용하여 2시간 동안 블록킹 처리한 멤브레인에 배지를 첨가하여 2시간 동안 반응시켰다. 이후 세척 완충용액 1 및 2를 이용하여 5분간씩 5회 세척하고 1 ml의 바이오틴과 결합된 1차 항체와 2시간 동안 반응시켰다. 다시 5분간씩 5회 세척 후 HRP와 결합된 스트렙타비딘(streptavidin) 희석액을 넣고 2시간 동안 반응시켰다. 2시간 후 멤브레인을 세척한 다음 ECL 완충용액에 반응시켜 화학발광이미지(chemiluminescene imaging) 장치를 이용하여 정량하였다.

9) 통계 처리

실험결과는 평균±SEM으로 나타내었고 one-way ANOVA를 이용하여 통계처리한 후 신뢰구간(P value)이 0.05보다 작은 경우 유의성이 있는 것으로 판정하였다.

결과

1) DPPH 자유 라디칼 소거능

각각의 시료를 농도별로 시액을 조제한 후 DPPH를 첨가하여 자유 라디칼 소거능을 측정한 결과, 도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, 0.8, 4, 20, 100 및 200 mg/ml의 농도에서 각각 6.7 ± 2.0, 17.9 ± 1.6, 49.9 ± 8.7, 76.1 ± 6.9 및 92.3 ± 11.0%의 자유 라디칼 소거능을 나타내었다. 시료의 투여 농도가 증가할수록 DPPH 자유 라디칼 소거능이 증가함을 확인할 수 있었다.

2) NO 분석

시료의 아질산염(nitrite) 생성 억제에 대한 효과를 확인하고자 0.8, 4, 20, 100 및 200 mg/ml의 시료를 pH 1.2의 염산 용액, pH 3.0의 구연산 완충액 및 pH 6.0의 구연산 완충액에서의 아질산염 소거 능력을 측정한 결과 pH 1.2의 염산 용액에서는 각각 4.0 ± 0.7, 14.1 ± 2.2, 40.6 ± 1.0, 97.9 ± 0.2 및 99.2 ± 0.2%의 NO 생성 억제율을 나타내었으며, pH 3.0의 구연산 완충액에서는 각각 5.8 ± 0.7, 11.6 ± 0.2, 16.5 ± 0.7, 44.1 ± 0.7 및 64.7 ± 0.7%의 NO 생성 억제율을 나타내었고, pH 6.0의 구연산 완충액에서는 각각 8.5 ± 2.4, 4.9 ± 3.0, 6.1 ± 2.7, 7.4 ± 3.6 및 10.8 ± 3.1%의 NO 생성 억제율을 나타내었다. pH 1.2 및 pH 3.0의 환경에서 NO 생성 억제능은 시료의 투여 농도에 따라 증가함을 확인할 수 있었으며 pH 1.2의 환경에서 시료 100 및 200 mg/ml 처리군은 거의 대부분의 NO 생성을 억제하였다 (도 9 참조).

3) 대식 세포에 대한 시료의 세포 독성 평가

마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포에 시료를 처리하여 면역 세포에 대한 시료의 세포독성을 확인한 결과, 아무것도 처리하지 않은 군은 100.0 ± 2.5%의 세포 생존율을 나타내었으며, 15.6, 31.3, 62.5, 125 및 250 ug/ml의 시료 투여군에서는 각각 95.9 ± 3.0, 95.6 ± 2.5, 94.0 ± 2.2, 101.4 ± 3.7, 및 94.8 ± 1.5%의 세포 생존율을 나타내었다. 본 실험 결과 전 시료 투여구간에서 통계적으로 유의한 세포 독성은 확인할 수 없었다 (도 10 참조).

4) 대식세포의 탐식작용 평가

대식세포인 RAW 264.7 세포에 형광 비드(bead)가 부착된 IgG를 처리하고, 시료를 농도별로 처리하여 시료의 대식 세포 활성에 대한 영향을 측정하였다. 그 결과 LPS로 자극만 준 실험군은 100.0 ± 1.9%의 대식능을 나타내었으며, 아무것도 처리하지 않은 정상군은 93.3 ± 1.1%의 대식능을 나타내었다. 그리고 시료 10, 50, 100, 및 200 ug/ml 투여군에서는 각각 102.7 ± 0.7%, 102.7 ±7.3%, 110.5 ± 3.7% 및 103.8 ± 1.8%의 대식능을 나타내었다. 시료의 처리에 의해 대식세포의 대식능이 조금씩 증가하는 경향을 나타내었으며, 100 ug/ml의 시료 투여군에서 통계적으로 유의한(*p<0.05) 대식능 증가 효과를 나타내었다 (도 11 및 12 참조).

6) 대식 세포의 아질산염( Nitrite) 분비에 미치는 영향

대식세포인 RAW 264.7 세포에 LPS를 처치하고, 시료를 농도별로 처리하여 NO 생성에 대한 시료의 영향을 확인하였다. 그 결과 도 13에 나타난 바와 같이 아무것도 처리하지 않은 정상군은 1.2 ± 0.0 ug/ml의 NO를 생성하였으며 LPS로 자극 후 시료 0, 10, 50 100, 및 200 ug/ml 투여군에서는 각각 14.6 ± 0.4, 15.6 ± 0.4, 14.8 ± 0.2, 14.8 ± 0.2, 및 13.0 ± 0.4 ug/ml의 NO를 생성하였다. 이 실험 결과 200 ug/ml의 시료 투여군에서 통계적으로 유의한(*p<0.05) NO 생성 억제능을 확인할 수 있었다.

7) 히스타민 분비에 대한 효과

히스타민 분비에 대한 시료의 영향을 확인해 보기 위하여 인간 비만세포인 HMC 세포를 이용하여 히스타민 분비량을 측정한 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, compound 48/80으로 자극을 가한 실험군에서는 100 ± 3.8%의 히스타민 분비량을 나타내었으며, 아무것도 처리하지 않은 정상군에서는 25.7 ± 0.4%의 히스타민 분비량을 나타내었다. 시료 50, 100, 및 200 ug/ml 투여군에서는 각각 90.9 ± 8.0, 72.4 ± 6.9, 및 72.2 ± 8.3%의 히스타민 분비량을 나타내었다. 이 실험 결과 100 및 200 ug/ml의 시료 투여군에서 통계적으로 유의하게(*p<0.05) 히스타민의 분비량을 감소시켰음을 확인할 수 있었다.

8) 기관지 상피 세포에 대한 시료의 세포 독성 평가

인체 기관지 상피 세포인 A549 세포에 시료를 처리하여 기관지 상피 세포에 대한 시료의 세포독성을 확인하였다. 그 결과 도 15에 나타난 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 정상군은 100.0 ± 12.7%의 세포 생존율을 나타내었으며, 시료 10, 50, 100, 및 200 ug/ml 투여군에서는 각각 96.4 ±6.7%, 96.4 ± 0.8%, 96.7 ± 5.5%, 및 96.6 ± 1.9%의 세포 생존율을 나타내었다. 본 실험 결과 전 시료 투여구간에서 통계적으로 유의한 세포 독성은 확인할 수 없었다.

9) 기관지 상피 세포에 대한 시료의 염증 관련 사이토카인 분비에 대한 효과

시료의 사이토카인 분비에 대한 영향을 알아보고자 LPS를 이용하여 자극한 A549 세포에 시료를 50 및 200 ug/ml을 투여하였다. 이후 RayBio 인간 사이토카인 항체 어레이 키트를 이용하여 사이토카인 분비량을 측정한 결과, 도 16에 나타난 바와 같이, 시료 200 ug/ml 투여군에서 IL-1α, IL-2, IL-10, 및 TNF-β의 분비를 억제함을 확인할 수 있었다.

Claims

정향, 전충, 경면 주사, 우황, 백간잠, 백부자, 고백반, 자하거, 용뇌 및 비소 화합물을 포함하는 면역 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 면역 관련 질환은 면역매개성 염증 질환, 비면역매개성 염증 질환, 감염증, 면역결핍질환 및 신생물(neoplasia)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2 항에 있어서,
상기 면역 관련 질환은 후천성 면역결핍증(AIDS), 간염, 간경화, 암, 천식, 알러지성 비염, 아토피성 피부염, 음식물 과민증 또는 두드러기인 것을 특징으로 하는 조성물.
정향, 전충, 경면 주사, 우황, 백간잠, 백부자, 고백반, 자하거, 용뇌 및 비소 화합물을 포함하는 산화적 스트레스 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물.
제 4 항에 있어서,
상기 산화적 스트레스 관련 질환은 지질대사질환, 동맥경화증, 심부전증, 고혈압성 심장질환, 부정맥, 심근경색증, 협심증 또는 노화인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 또는 제 4 항에 있어서,
상기 비소 화합물은 삼산화비소(As₂O₃), 육산화비소(As₄O₆), 아르세닉 트리브로마이드(AsBr₃), 아르세닉 트리클로라이드(AsCl₃), 아르세닉 트리아이오다이드(AsI₃) 및 멜라소프롤(Melarsoprol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 또는 제 4 항에 있어서,
상기 조성물이 비소 화합물 1 내지 7 중량부, 정향 15 내지 25 중량부, 전충 200 내지 270 중량부, 경면 주사 20 내지 30 중량부, 우황 25 내지 35 중량부, 백간잠 50 내지 65 중량부, 백부자 38 내지 48 중량부, 고백반 50 내지 65 중량부, 자하거 200 내지 270 중량부 및 용뇌 0.5 내지 6 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 또는 제 4 항에 있어서,
비소 화합물 3 내지 5 중량부, 정향 17 내지 22 중량부, 전충 220 내지 250 중량부, 경면 주사 22 내지 27 중량부, 우황 27 내지 31 중량부, 백간잠 55 내지 62 중량부, 백부자 41 내지 46 중량부, 고백반 55 내지 62 중량부, 자하거 220 내지 250 중량부 및 용뇌 2 내지 4 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
정향, 전충, 경면 주사, 우황, 백간잠, 백부자, 고백반, 자하거, 용뇌 및 비소 화합물을 포함하는 항산화 조성물.
정향, 전충, 경면 주사, 우황, 백간잠, 백부자, 고백반, 자하거, 용뇌 및 비소 화합물을 포함하는, 비소화합물의 독성 저감용 조성물.