JP6117333B2 - 免疫関連疾患及び酸化的ストレス関連疾患の予防または治療用組成物 - Google Patents

Description

本発明は免疫関連疾患または酸化的ストレス関連疾患の予防または治療用組成物に関するもので、より詳しくは、砒素化合物の毒性を効果的に抑制させながらもその免疫機能の強化効果及び抗酸化効果を極大化させた免疫関連疾患の予防または治療用組成物に関するものである。

免疫関連疾患及び炎症疾患は、正常的な生理状態では傷害または損傷に対する反応、傷害または損傷の復旧開始及び外来有機体に対抗する先天性または後天性防御の開始に重要な、非常に複雑で度々複合的に相互連関された生物学的経路の兆しまたは結果である。このような正常な生理的経路が反応の強度に直接連関されたり、非正常的な調節または過度な刺激の結果として、自己（ｓｅｌｆ）に対する反応で、またはこれらの組合せでさらなる傷害または損傷をもたらす場合、疾患または病気が発生する。このような免疫関連疾患として様々な疾患が知られて広範に研究されて来たが、その例として、免疫介在性炎症疾患、非免疫介在性炎症疾患、感染症及び免疫不全疾患などがある。また、免疫機能の低下は外部から流入された抗原を適切に処理することができなくて、生体の均衡を保持する恒常性が崩れながら、癌を含めた多様な疾病の原因になると知られている。特に、年を取るほど免疫機能が漸進的に低下されて、癌にかかる確率も高くなり、特に肝臓及び呼吸器系統の癌の発生頻度が大きく増加していると報告されている。

また、抗酸化（ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎ）は体内で起きる様々な酸化作用を防止することを言い、生体膜やリポタンパク質として存在する脂質は体内で発生するフリーラジカル（ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ）の攻撃を受けて、多種の過酸化物を形成する。過酸化物と分解産物などは反応性が高くて周辺の生体分子の構造と機能を変換させて様々な慢性疾患をもたらす。生体内にはこのようなフリーラジカル（ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ）を中和させて体を保護することができる多くの抗酸化防御機構がある。しかし、このような抗酸化防御係がフリーラジカルの生成を調節することができないほどに低下される時、組織の酸化的ストレスと損傷が促進され、体内で生成された過剰のフリーラジカルと脂質過酸化物はタンパク質の酸化、ＤＮＡ損傷のような酸化的ストレスによる傷害を増加させる（Ｋｕｍａｒ ＣＴ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍ．，１１１，ｐｐ．１０９−１１５，１９９２）。活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ、ＲＯＳ）は心血管疾患、糖尿病、癌、退行性神経病、老化など慢性退行性疾患を誘発する主要要因になることがあり、抗酸化物質は慢性退行性疾患の予防に役に立つことができると知られている（Ｂｒａｙ、Ｔ．Ｍ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ．１６，ｐｐ．５７８−５８１，２０００）。

一方、砒素（ａｒｓｅｎｉｃ）は肌と肺に癌を誘発する強力な発癌物質と知られて来たが、Ｂ．Ｃ．２０００年頃からヒトの疾病の治療のために使われた薬物として、韓国を含めた東洋の伝統医学では昔から砒素化合物を各種不治病の治療に応用して来た。韓国及び中国の漢方古書で言及した内容を見ると、東医宝監では砒素を「砒霜」と名づけて漢方医薬剤として用い、毒を除去して使用すれば中悪及び腹痛の治療に効果があると記述されている。また、中国の本草綱目にも黄雄という名前で砒素の利用方法及び活性に関する事実が記述されている。

一方、西欧でも砒素化合物は一部疾病の治療剤として、ヒポクラテス（Ｈｉｐｐｏｃｒａｔｅｓ、４６０〜３７７ＢＣ）及びガレン（Ｇａｌｅｎ、１３０〜２００ＡＤ）などが使用したという記録があり、リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｓｉｓ）、梅毒（ｓｙｐｈｉｌｉｓ）及び乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）などの各種疾病の治療剤として利用されて来た。低い濃度では、人の造血作用（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ）を促進するなどの機能を果たすことと知られている。このように、砒素の生理活性は昔から認められており、実際に臨床に使われて来た。現在韓国の場合、重金属物質に規定されて、その使用が極めて制限されている実情である。

最近には、砒素の薬理作用に基づいてこれを癌治療剤として臨床的に応用しようとする試みが活発に行われている。砒素化合物（ａｒｓｅｎｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）の一種である三酸化砒素（Ａｓ_２Ｏ_３）が急性前骨髄球性白血病（Ａｃｕｔｅ ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）に効果があるという事実が１９９７年に発表され（Ｓｈｅｎ ＺＸ ｅｔ．ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９８：３３５４〜３３６０、１９９７）、その後、その効能も証明された。また、大韓民国特許出願第１９９８−１６４８６号にはマウスを利用した生体内実験で悪性腫瘍の増殖を抑制し、腫瘍の転移を効率的に抑制する活性を表すことが詳しく開示されている。

しかし、上記各種研究結果は、三酸化砒素などの砒素化合物の新しい治療剤として利用されることができる可能性を提示したが、実際人体に適用する時に発生することができる砒素化合物の毒性及び低濃度での砒素に対する感受性の向上は克服しなければならない課題として残っている。

本発明の目的は、砒素化合物の毒性を効果的に減少させながらも、砒素化合物の薬理学的効果を増大させることができる免疫関連疾患または酸化的ストレス関連疾患の予防または治療用組成物を提供することにある。

上述した目的を達するために、本発明は丁香、全蠍、鏡面朱砂、牛黄、ビャッキョウサン、白附子、枯白礬、紫河車、竜脳及び砒素化合物を含む、砒素化合物の毒性が効果的に減少された免疫関連疾患または酸化的ストレス関連疾患の予防または治療用組成物を提供する。

また、本発明は丁香、全蠍、鏡面朱砂、牛黄、ビャッキョウサン、白附子、枯白礬、紫河車、竜脳及び砒素化合物を含む、抗酸化組成物及び砒素化合物の毒性低減用組成物を提供する。

本発明による組成物は、従来には毒性があることから臨床的に適用することが困難であった砒素化合物の毒性を低減させながらもその薬理効果を極大化することによって、免疫増強効果を通じた肝炎、肝硬変、癌、後天性免疫不全性疾患、喘息及びアトピーを含めた多様な免疫関連疾患の予防または治療、及び抗酸化効果を通じた酸化的ストレス関連疾患の予防または治療に有用である。

本発明の上記及び他の目的と特徴は添付された図面と以下の本発明の説明から明確になる。
正常ラット間の組織病理学的病変をヘマトキシリン及びエオシン染色で確認した写真である。ｐｔは門脈三管（ｐｏｒｔａｌ ｔｒｉａｄ）、Ｖは中心静脈（ｃｅｎｔｒａｌ ｖｅｉｎ）を表す。 四塩化炭素処理された対照群ラット間の組織病理学的病変をヘマトキシリン及びエオシン染色で確認した写真である。 低濃度の試料（実施例１の丸薬）及び四塩化炭素で前処理されたラット間の組織病理学的病変をヘマトキシリン及びエオシン染色で確認した写真である。 高濃度の試料（実施例１の丸薬）及び四塩化炭素で前処理されたラット間の組織病理学的病変をヘマトキシリン及びエオシン染色で確認した写真である。 シリマリン及び四塩化炭素で前処理されたラット間の組織病理学的病変をヘマトキシリン及びエオシン染色で確認した写真である。 正常ラット間の組織病理学的病変をヘマトキシリン及びエオシン染色で確認した写真である。 高濃度の試料（実施例１の丸薬）を処理したラット間の組織病理学的病変をヘマトキシリン及びエオシン染色で確認した写真である。 試料（実施例１の丸薬）のＤＰＰＨフリーラジカル消去能の測定結果を示したグラフである（ＩＭ０．８：試料０．８ｍｇ／ｍｌ処理群、ＩＭ４：試料４ｍｇ／ｍｌ処理群、ＩＭ２０：試料２０ｍｇ／ｍｌ処理群、ＩＭ１００：試料１００ｍｇ／ｍｌ処理群及びＩＭ２００：試料２００ｍｇ／ｍｌ処理群を意味する）。 試料（実施例１の丸薬）の窒素酸化物生成抑制効果を示したグラフである（ＩＭ０．８：試料０．８ｍｇ／ｍｌ処理群、ＩＭ４：試料４ｍｇ／ｍｌ処理群、ＩＭ２０：試料２０ｍｇ／ｍｌ処理群、ＩＭ１００：試料１００ｍｇ／ｍｌ処理群及びＩＭ２００：試料２００ｍｇ／ｍｌ処理群を意味する）。 試料（実施例１の丸薬）の大食細胞に対する細胞毒性を確認したグラフである（ＩＭ０：非処理群、ＩＭ１５．６：試料１５．６μｇ／ｍｌ処理群、ＩＭ３１．３：試料３１．３μｇ／ｍｌ処理群、ＩＭ６２．５：試料６２．５μｇ／ｍｌ処理群、ＩＭ１２５：試料１２５μｇ／ｍｌ処理群、ＩＭ２５０：試料２５０μｇ／ｍｌ処理群）。 試料（実施例１の丸薬）の大食細胞の大食能に及ぼす影響を示したグラフである（Ｂｌａｎｋ：非処理群、Ｃｏｎｔｒｏｌ：ＬＰＳ処理群、ＩＭ１０：ＬＰＳ＋試料１０μｇ／ｍｌ処理群、ＩＭ５０：ＬＰＳ＋試料５０μｇ／ｍｌ処理群、ＩＭ１００：ＬＰＳ＋試料１００μｇ／ｍｌ処理群、ＩＭ２００：ＬＰＳ＋試料２００μｇ／ｍｌ処理群）。 試料（実施例１の丸薬）の大食細胞の大食能に及ぼす影響を確認したグラフである（Ａ：非処理群、Ｂ：ＬＰＳ処理群、Ｃ：ＬＰＳ＋試料１０μｇ／ｍｌ処理群、Ｄ：ＬＰＳ＋試料５０μｇ／ｍｌ処理群、Ｅ：ＬＰＳ＋試料１００μｇ／ｍｌ処理群、Ｆ：ＬＰＳ＋試料２００μｇ／ｍｌ処理群）。 試料（実施例１の丸薬）のＮＯ生成抑制に対する効果を確認したグラフである（Ｂｌａｎｋ：Ｎｏｎ−ｔｒｅａｔｅｄ群、Ｃｏｎｔｒｏｌ：ＬＰＳ処理群、ＩＭ１０：ＬＰＳ＋試料１０μｇ／ｍｌ処理群、ＩＭ５０：ＬＰＳ＋試料５０μｇ／ｍｌ処理群、ＩＭ１００：ＬＰＳ＋試料１００μｇ／ｍｌ処理群、ＩＭ２００：ＬＰＳ＋試料２００μｇ／ｍｌ処理群）。 本発明による組成物のヒスタミン（ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）分泌に対する効果を確認したグラフである（Ｂｌａｎｋ：非処理群、Ｃｏｎｔｒｏｌ：ｃｏｍｐｏｕｎｄ４８／８０処理群、ＩＭ５０：ｃｏｍｐｏｕｎｄ４８／８０＋試料５０μｇ／ｍｌ処理群、ＩＭ１００：ｃｏｍｐｏｕｎｄ４８／８０＋試料１００μｇ／ｍｌ処理群、ＩＭ２００：ｃｏｍｐｏｕｎｄ４８／８０＋試料２００μｇ／ｍｌ処理群）。 試料（実施例１の丸薬）の気管支上皮細胞に対する細胞毒性測定結果を示したグラフである（ＩＭ０：非処理群、ＩＭ１０：試料１５．６μｇ／ｍｌ処理群、ＩＭ５０：試料３１．３μｇ／ｍｌ処理群、ＩＭ１００：試料６２．５μｇ／ｍｌ処理群、ＩＭ２００：試料１２５μｇ／ｍｌ処理群）。 ＲａｙＢｉｏヒトサイトカイン抗体アレイキットを利用して実施例１の丸薬のサイトカイン分泌に対する影響を確認した図である（Ａ：非処理群、Ｂ：ＬＰＳ処理群、Ｃ：ＬＰＳ＋試料５０μｇ／ｍｌ処理群、Ｄ：ＬＰＳ＋試料２００μｇ／ｍｌ処理群、（１）：ＩＬ−１α、（２）：ＩＬ−２、（３）：ＩＬ−１０、（４）：ＴＮＦ−β）。

以下、本発明についてより具体的に説明すれば次の通りである。
本発明は丁香、全蠍、鏡面朱砂、牛黄、ビャッキョウサン、白附子、枯白礬、紫河車、竜脳及び砒素化合物を含む、砒素化合物の毒性が効果的に減少された免疫関連疾患または酸化的ストレス関連疾患の予防または治療用組成物に関するものである。

本発明で用いられる用語「免疫関連疾患」とは、哺乳動物免疫系のある構成成分がその哺乳動物での疾患を引き起こしたり、媒介したりまたはその発病率に寄与する疾患を意味する。また、免疫反応の刺激または介入がその疾患の進行を加速する効果を有する疾患も含む。上記用語には免疫介在性炎症疾患、非免疫介在性炎症疾患、感染症、免疫不全疾患及び新生物（ｎｅｏｐｌａｓｉａ）などが含まれる。

本発明によって処理されることができる免疫関連疾患には制限がないが、具体的な例として、後天性兔疫不全症（ＡＩＤＳ）、肝炎及び肝硬変のような炎症疾患、各種癌、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及びじんま疹のようなアレルギー性疾患などがある。

一方、本発明で用いられる用語「酸化的ストレス関連疾患」とは、酸素と栄養物質が反応して代謝する過程で体内で発生する活性酸素種（フリーラジカル）によって誘発される酸化的ストレスによって発生する疾患で、具体的には、高脂血症などの脂質代謝疾患、動脈硬化症、心不全症、高血圧性心臓疾患、不整脈、心筋梗塞症、狭心症などの心臓疾患、老化、免疫疾患及び癌などを例示することができる。

本発明による組成物の各構成成分を説明すれば次の通りである。

本発明で用いられる砒素化合物は薬理学的に用いられることができる砒素化合物で、砒霜とも呼ばれる三酸化砒素（Ａｓ_２Ｏ_３）、六酸化砒素（Ａｓ_４Ｏ_６）、三臭化砒素（ＡｓＢｒ_３）、三塩化砒素（ＡｓＣｌ_３）、三ヨウ化砒素（ＡｓＩ_３）及びメラルソプロール（Ｍｅｌａｒｓｏｐｒｏｌ）などがある。

丁香は熱帯常緑性亜高木のチョウジノキのつぼみで、粉末や丁香油を食用及び薬用に用いる。丁香は嘔吐、胃癌、腹痛、消化不良及び性機能増大、歯肉炎及び歯肉痛症などに使われる。薬理作用として胃液分泌促進、鎮痛、抗痙攣、抗炎症、抗酸化、抗血栓、抗菌、駆虫及び血圧降下作用などが報告されている。

全蠍（全虫、Ｓｃｏｒｐｉｏ）はキョクトウサソリ科に属するキョクトウサソリの全身を乾かしたもので、化痰作用、カシャ症（口が歪む症状）を治療し、去風作用をする。

鏡面朱砂（Ｃｉｎｎａｂａｒ）とは、結晶体からなる朱砂を意味し、硫黄化合物で硫化水銀（ＨｇＳ）を主成分とする天然鉱石である。精神を安定させて驚風を止め、解熱、解毒作用をする。ささいな出来事にも驚いて胸がドキドキする症状、睡眠障害、健忘症、驚風、てんかん、精神病、 熱に浮かされてうわごとを言う症状に用いる。

牛黄（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ ｖａｒ．ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ Ｇｍｅｌｉｎ）とは、インド、イラン及び中国などに棲息する哺乳動物である牛、山羊及び羚羊などの反芻類の胆嚢の中に病的に生じた凝結物で、主に牛の胆嚢や胆管で取出して外部で膜質を取り除いて陰干して用いる。形態は黄褐色球状の小さな固まりで、直径は約２ｃｍであり、軽くて壊れやすい。味はやや苦くて、コール酸、ビリルビン、エルゴステロール及びビタミンＤなどを主成分として含む。漢方では解熱剤、解毒剤、鎮静剤、鎮痛剤及び強心剤として用いられる。

ビャッキョウサン（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｌ，Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ）は、糸を取る前にビャッキョウサン菌の感染により硬直死させた虫体を乾かしたものを言い、去風湿、化痰機能及び腫脹の毒を取り除く作用をする。

白附子は、キンポウゲ科の多年草のキバナトリカプト（Ａｃｏｎｉｔｕｍ ｋｏｒｅａｎｕｍ、Ｔｙｐｈｏｎｉｕｍ Ｇｉｇａｎｔｅｕｍ）の塊茎で、燥湿化痰、中風による口眼歪斜、痙攣、発作、中風、破傷風、偏頭痛、頭痛及び風湿性四肢麻痺、関節痛、陰嚢湿疹、肌かゆみ及び頸部リンパ節炎に使用され、蛇にかまれたとき解毒作用がある。

枯白礬（Ａｌｕｎｉｔｕｍ Ｓｉｃｃｕｓ）はミョウバン、即ちカリウムミョウバン（ＫＡｌ（ＳＯ_４）_２・１２Ｈ_２Ｏ）を加熱して脱水させたものを言う。止血剤、収斂剤などの医薬品として使われ、水分を奪う性質があると知られている。

紫河車とは、ヒトの胎盤で、無毒で、主に強壮薬として慢性疲労症侯群や神経衰弱、貧血、慢性気管支炎、喘息、咳嗽及び結核などの症状に活用する。子宮を収縮させて乳腺と女性生殖器、卵巣の発育を促進したりする。

竜脳は、竜脳香科（Ｄｉｐｔｅｒｏｃａｒｐａｃｅａｅ）に属した常緑高木である竜脳香樹（Ｄｒｙｏｂａｌａｎｏｐｓ ａｒｏｍａｔｉｃａ ＧＡＥＲＴＮＥＲ）の樹脂あるいは樹幹と枝を切って水蒸気で蒸溜して得た白色の結晶体を言う。精神昏蒙、意識障害などを熱と浮腫を下げて痛症を緩和させ、高熱、痙攣、小児驚風に効果があり、咽喉炎と口内炎、眼病、かゆみ症、充血、目と鼻の炎症など各種炎症に利用される。

本発明の組成物は、砒素化合物１〜７重量部、丁香１５〜２５重量部、全蠍２００〜２７０重量部、鏡面朱砂２０〜３０重量部、牛黄２５〜３５重量部、ビャッキョウサン５０〜６５重量部、白附子３８〜４８重量部、枯白礬５０〜６５重量部、紫河車２００〜２７０重量部及び竜脳０．５〜６重量部を含むことが好ましい。

さらに好ましくは、本発明の組成物は、砒素化合物３〜５重量部、丁香１７〜２２重量部、全蠍２２０〜２５０重量部、鏡面朱砂２２〜２７重量部、牛黄２７〜３１重量部、ビャッキョウサン５５〜６２重量部、白附子４１〜４６重量部、枯白礬５５〜６２重量部、紫河車２２０〜２５０重量部及び竜脳２〜４重量部を含むことができる。

本発明による免疫関連疾患予防または治療用組成物は、経口投与用または非経口投与用の多様な形態に製剤化されることができる。経口投与用組成物の例としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤及び丸剤などを挙げることができる。

このような本発明の組成物は、薬剤学的に通常使われる担体、希釈剤または賦形剤と混合して製造されることもできる。この時用いられる適合な担体、希釈剤または賦形剤の実例としては、澱粉、糖及びマンニトールのような賦形剤；リン酸カルシウム及びケイ酸誘導体のような充填剤及び増量剤；カルボキシメチルセルロースまたはヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース誘導体、ゼラチン、アルギン酸塩、及びポリビニルピロリドンのような結合剤；滑石、ステアリン酸カルシウムまたはマグネシウム、水素化ひまし油、及び固相ポリエチレングリコールのような潤滑剤；ポビドン、クロスカルメロースナトリウム及びクロスポビドンのような崩壊剤；ポリソルベート、セチル（ｃｅｔｙｌ）アルコール、及びグリセロールモノステアレートなどのような界面活性剤などを挙げることができる。また、上記組成物が丸剤である場合、丸剤成分を結合させるために、蜂蜜のような結合剤を含むことができ、調製された丸剤の相互粘着、かびの発生、水気の蒸散を防止したり、矯味または矯臭のために石松子、タルク、澱粉、カオリン、甘草粉末、桂皮粉末及びオリス根粉末などの散粉（ｄｕｓｔｉｎｇ ｐｏｗｄｅｒ）を含むことができる。

また、上記担体、希釈剤または賦形剤のような添加剤なしにまたは添加剤と一緒に特定量の有効成分を含む多様な薬学組成物は公知された通常的な方法によって製造することができる。例えば、上記組成物を錠剤の形態に製造する場合、組成物に上記担体、希釈剤または賦形剤のような添加剤を加えて直接または顆粒状にした後圧縮して成形することができ、カプセル剤の場合、上記組成物を液状、懸濁状または顆粒状などの形でカプセルに充填するか、カプセル基剤で被包成型することができ、丸剤の場合、上記組成物に担体、希釈剤または賦形剤のような添加剤を加えて均等に混和して塑性の塊にした後分割して球状に成型するなどの方法を通じて製造されることができる。

このように得られた本発明の組成物は、以下の実施例から確認することができるように、従来知られた砒素化合物の毒性を顕著に減少させるという卓越な効果を現わす。さらに、砒素化合物の免疫機能強化効果を極大化させて、免疫関連疾患の予防または治療に卓越な効果を現わす。また、本発明の組成物は卓越な抗酸化効果を現わして、高脂血症などの脂質代謝疾患、動脈硬化症、心不全症、高血圧性心臓疾患、不整脈、心筋梗塞症、狭心症などの心臓疾患、老化、免疫疾患及び癌のような多様な酸化的ストレス関連疾患の予防または治療に有用である。

以下、本発明を以下の実施例によって詳しく説明する。ただ、以下の実施例は本発明の例示的に示したものに過ぎなく、本発明の内容が以下の実施例によって限定されるのではない。

砒素化合物含有丸薬の製造
本発明による砒素化合物含有丸薬を製造するために、それぞれの薬剤（砒素化合物として砒霜（三酸化砒素）、丁香、全蠍、鏡面朱砂、牛黄、ビャッキョウサン、白附子、枯白礬、紫河車、竜脳）を京東市場で選別して購入した。その後、砒霜４０ｇ、丁香２００ｇ、全蠍２４００ｇ、鏡面朱砂２５０ｇ、牛黄３００ｇ、ビャッキョウサン６００ｇ、白附子４５０ｇ、枯白礬 ６００ｇ、紫河車２４００ｇ及び竜脳３０ｇをそれぞれ秤量して粉砕した後、混合機（Ｇ＆Ｓ Ｋｏｒｅａ）で混合する。その後、混合した薬剤の結合のために、適量の蜂蜜を投入して攪拌し、製造された練り物を製丸機（大成製薬機械製作所で注文制作、ＰＭ ＴＥＣＫ自動化機器）で抜いた後、切断機（大成製薬機械製作所で注文制作、ＰＭ ＴＥＣＫ自動化機器）に投入して丸薬を製造した。上記のように製造された丸薬を以下の試験で用いた。

実施例１．肝保護効果及び安全性分析
四塩化炭素（ＣＣｌ_４）は代表的な肝毒性化学物質で肝細胞の損傷に係わる研究に広く利用されている。四塩化炭素は肝細胞内での酵素性代謝過程で生成されるフリーラジカルが蓄積して、細胞膜の脂質過酸化（ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ）、タンパク質の酸化的変形またはＤＮＡ損傷をもたらす酸化的ストレス（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ）で細胞損傷を誘発する。

従って、本発明による薬学的組成物の肝保護効果を測定するために、ラットに四塩化炭素の投与し、同時に実施例１で製造された丸薬を投与した後、肝細胞損傷の血清学的指標と病理組織学的変化、そして酸化的ストレスに係わる脂質過酸化程度を比較して提供された丸薬の肝細胞損傷防御効果及び経口投与による安全性を確認した。

実験動物
８週齢の雄Ｓｐａｒｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ Ｒａｔ（ｓａｍｔａｋｏ、韓国）を購入して、世明大学清浄動物飼育室で、温度２３±１℃、湿度５０±５％で、明るいところで１２時間、暗いところで１２時間の条件で５日間適応させながら、体重が平均２３５ｇに達したとき実験に利用した。全実験期間中、飼料（第一製糖 韓国）と飲水は自由に摂取するようにした。本動物実験は世明大学動物実験倫理委員会の承認（ｓｍｅａｃ１１−０８−０１）を得て実施された。

実験群の分類及び処置
正常群（ｎｏｒｍａｌ群）は実験開始日から毎日蒸溜水１ｍｌを７日間経口投与し、最終投与１時間の後にオリーブオイル（１ｍｌ／体重ｋｇ）を腹腔内投与した。

対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ群）は実験開始日から毎日蒸溜水１ｍｌを７日間経口投与し、最終投与１時間の後にＣＣｌ_４溶液（５０％ＣＣｌ_４ ｉｎ ｏｌｉｖｅ ｏｉｌ）１ｍｌ／体重ｋｇを腹腔内投与した。

低濃度群は実験開始日から毎日低濃度丸薬液（３００ｍｇ／体重ｋｇ）を７日間経口投与し、最終投与１時間の後にＣＣｌ_４溶液（５０％ＣＣｌ_４ ｉｎ ｏｌｉｖｅ ｏｉｌ）１ｍｌ／体重ｋｇを腹腔内投与した。

高濃度群は実験開始日から毎日高濃度丸薬液（１５００ｍｇ／体重ｋｇ）を７日間経口投与して、最終投与１時間の後にＣＣｌ_４溶液（５０％ＣＣｌ_４ ｉｎ ｏｌｉｖｅ ｏｉｌ）１ｍｌ／体重ｋｇを腹腔内投与した。

シリマリン群は実験開始日から毎日シリマリン（ＳｉｇｍａＣｏ．、ＵＳＡ）液（１００ｍｇ／体重ｋｇ）を７日間経口投与し、最終投与１時間の後にＣＣｌ_４溶液（５０％ＣＣｌ_４ ｉｎ ｏｌｉｖｅ ｏｉｌ）１ｍｌ／体重ｋｇを腹腔内投与した。

安全性試験群（ｓａｆｅｔｙ ｔｅｓｔ群）は提供された丸薬の安全性を評価するために正常群と一緒に実験開始日から毎日高濃度丸薬液（１５００ｍｇ／体重ｋｇ）を７日間経口投与して、最終投与１時間後にオリーブオイル（１ｍｌ／体重ｋｇ）を腹腔内投与した。

以上の実験群の分類及び実験過程を表１に示した。

検査項目
１）体重及び体重増加率
すべての動物の体重を実験開始日（１日）から４日、７日及び実験終了日（８日）に測定した。体重増加率は（７日間増加された体重／実験開始日の体重）×１００で計算した。

２）肝臓重量及び肝臓／体重比の測定
実験終了日に剖検して肝臓を摘出し、周辺結合織を注意深く除去した後、肝臓重量を測定した。肝臓／体重比（肝臓重量／体重）×１００で計算した。

３）血清アラニンアミノ基転移酵素及びアスパラギン酸アミノ基転移酵素活性検査
オリーブオイルまたはＣＣｌ_４を腹腔内投与した後２４時間目にラットをエーテルで軽く麻酔し、心臓を通じて血液を採取して血清分離管に注入した。血清分離管を冷蔵状態で３，５００ｒｐｍの速度で１０分間遠心して血清を分離し、自動生化学分析器（Ｈｉｔａｃｈｉｍｏｄｕｌａｒ、Ｊａｐａｎ）を利用してｍｏｄｉｆｉｅｄ ＩＦＣＣ方法で血清ＡＬＴ及びＡＳＴを測定した。測定の時、ＡＳＴ（Ｒｏｃｈｅ、ＵＳＡ）及びＡＬＴ（Ｒｏｃｈｅ、ＵＳＡ）試薬を利用した。

４）肝組織の脂質過酸化（ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ）含量測定
肝臓の重量を測定した後、中葉（ｍｅｄｉａｎ ｌｏｂｅ）の右側部位の一部を摘出して肝組織内脂質過酸化含量測定に用いた。
脂質過酸化含量測定はＯｈｋａｗａの方法（Ｏｈｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４０，ｐｐ．５５９−５７３、１９９７）に準じてチオバルビツール酸法（Ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙ）を利用して脂質過酸化の最終産物であるマロンジアルデヒドを指標で定量した。即ち、肝組織を１０倍（ｖ／ｗ）用量の１．１５％塩化カリウム溶液に均質化して均質液を製造した。続いて、上記均質液０．２ｍｌ、８．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）０．２ｍｌ、２０％酢酸（ｐＨ３．５）１．５ｍｌ、５％ブチル化ヒドロキシトルエン（Ｂｕｔｙｌａｔｅｄ ｈｙｄｒｏｘｙｔｏｌｕｅｎｅ）０．５ｍｌ及び０．８％チオバルビツール酸１．５ｍｌを混合し、１００℃が保持される恒温槽で６０分間反応させて、室温で１時間放置した後３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上層液を取って５３２ｎｍでのＵＶ分光器で吸光度を測定した。

５）肝組織の病理組織学的検査
摘出された中葉の左側部位を１０％中性緩衝ホルマリン（Ｎｅｕｔｒａｌ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｆｏｒｍａｌｉｎ：ＮＢＦ）溶液に１日間固定し、一般のアルコール脱水過程とキシレン透明化過程を経た後パラフィンブロックを作った。５μｍ厚さのパラフィン薄切片を製作して、ヘマトキシリン及びエオシン染色して光学顕微鏡で病理学的所見を比較して観察した。

結果
Ａ．肝保護効果
１）体重の差
正常群での体重は実験期間の間増加しつづあり、実験８日には絶食によって体重が減少した。

対照群は実験７日まで正常群と類似するほどに体重が増加したが、絶食及びＣＣｌ_４投与によって実験８日目には正常群に比べて有意に低くなり、体重増加率も正常群に比べて有意に低かった。

低濃度群、高濃度群及びシリマリン群での体重及び体重増加率は対照群に比べてやや高く現われたが、差はなかった（表２）。

［表２］
ラットのＣＣｌ_４-誘導された肝毒性での体重に対する試料物質前処理が及ぼす影響

２）肝臓重量及び肝臓／体重比の差
実験終了日に測定した肝臓重量及び肝臓／体重比は対照群が正常群に比べて全部有意に高く現われた。

低濃度群では対照群に比べて肝臓重量及び肝臓／体重比が有意に低かった。

高濃度群及びシリマリン群では、対照群に比べて肝臓重量及び肝臓／体重比がやや低く現われたが、有意な差はなかった（表３）。

［表３］
ラットのＣＣｌ_４で誘導された肝毒性での肝臓重量及び肝臓／体重比に対する試料物質前処理が及ぼす影響
３）血中ＡＬＴ及びＡＳＴ活性の差
対照群の血中ＡＬＴ及びＡＳＴ活性は正常群に比べて全部有意に高かった。

低濃度群の血中ＡＬＴは対照群に比べて有意に低く、血中ＡＳＴは対照群に比べて顕著に低かったが、有意な差は観察されなかった。

高濃度群の血中ＡＬＴ及びＡＳＴは対照群に比べて有意に低かった。

シリマリン群でも血中ＡＬＴは対照群に比べて有意に低く、血中ＡＳＴは対照群に比べて低かったが、有意な差は観察されなかった（表４）。

［表４］
ラットのＣＣｌ_４-誘導された肝毒性での血中ＡＬＴ及びＡＳＴ活性に対する試料物質前処理が及ぼす影響
４）肝組織の脂質過酸化物含量の差異
対照群の肝組織中で、脂質過酸化物であるマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）の含量は正常群に比べて有意に高かった。

これに対し、低濃度群、高濃度群、シリマリン群では、肝組織の中でマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）の含量は対照群に比べて有意に低かった（表５）。

［表５］
ラットのＣＣｌ_４で誘導された肝毒性での肝組織の脂質過酸化物含量に対する試料物質前処理が及ぼす影響
５）病理組織学的所見の差
正常群の肝組織は、図１のａ及びｂから確認することができるように、中心静脈、門脈三管、肝細胞板及び洞様毛細血管のすべての構造がよく維持されており、肝細胞も正常な構造を取っていた。対照群の肝組織では中心静脈の周りに広範囲な肝細胞壊死が観察され、壊死周辺の肝細胞は多様な大きさの恐怖変性及び脂肪変化が観察された。壊死した部位では多量の炎症細胞の浸潤が確認された。門脈三管の周りの肝細胞は比較的正常な構造を保持していた（図２のａ及びｂ参照）。

一方、図３のａ及びｂで確認することができるように、低濃度群で観察された肝組織の病理組織学的変化は対照群と同じであったが、中心静脈の周りの肝細胞壊死及び変性程度は非常に微弱であった。炎症細胞の浸潤程度も対照群に比べて著しく減少された。高濃度群でも肝細胞壊死及び変性は中心静脈周りの一部のみで確認された。炎症細胞の浸潤は非常に少なく観察されて、正常群と類似する程度に現われた（図４のａ及びｂ参照）。シリマリン群での病理組織学的所見及び程度は高濃度群と類似するように観察された（図５のａ及びｂ参照）。

以上のように、実施例１による丸薬の低濃度群（３００ｍｇ／体重ｋｇ）では、対照群に比べて血中ＡＬＴが低く有意に現われ、血中ＡＳＴは有意な差が認められなかったが、対照群に比べて顕著に低く現われた。病理組織学的でも対照群に比べて病変の程度が緩和されていた。また、上記丸薬の高濃度群（１５００ｍｇ／体重ｋｇ）では対照群に比べて血中ＡＬＴ及びＡＳＴが全部有意に低く、病理組織学的にも病変の所見及び程度が対照群に比べて緩和されていた。本発明の組成物は濃度依存的に肝細胞の損傷を予防し、酸化的ストレスなどによって発生する肝炎、肝硬変などのような肝疾患に対する予防及び治療効果を現わすことができるものと考えられる。
Ｂ．安全性分析
１）体重の差
実施例１の丸薬の安全性を評価するための安全性試験群での体重及び体重増加率は正常群に比べてやや高く現われたが、有意な差はなかった（表６）。

［表６］
ラットの体重に対する高濃度試料処理時（安全性試験群）の効果
２）肝臓重量及び肝臓／体重比の差
実施例１の丸薬の安全性を評価するための安全性試験群での肝臓重量及び肝臓／体重比は正常群と類似に現われた（表７）。

［表７］
ラット肝臓重量及び肝臓／体重比に対する高濃度試料処理時（安全性試験群）の効果
３）血中ＡＬＴ及びＡＳＴ活性の差
実施例１の丸薬の安全性を評価するための安全性試験群での血中ＡＬＴ及びＡＳＴは全部正常群と類似するように現れた（表８）。

［表８］
ラットの血中ＡＬＴ及びＡＳＴ活性に対する高濃度試料処理時（安全性試験群）の効果
４）肝組織の脂質過酸化物含量の差
実施例１の丸薬の安全性を評価するための安全性試験群での肝組織の中でマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）の含量は正常群に比べて有意に低かった（表９）。

［表９］
ラットの肝組織内のＭＤＡ含量に対する高濃度試料処理時（安全性試験群）の効果
５）病理組織学的所見の差
確認の結果、正常群の肝組織は、中心静脈、門脈三管、肝細胞板及び洞様毛細血管のすべての構造がよく保持されており、肝細胞も正常な構造を取っていた（図６のａ及びｂ参照）。高濃度の丸薬のみを投与した安全性試験群でも肝組織は全部正常な構造を保持していた（図７のａ及びｂ参照）。

以上のように、本発明による実施例１で製造された丸薬の安全性試験の結果、本発明による丸薬を高濃度で投与しても体重、肝臓重量、血中ＡＬＴ及びＡＳＴ、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）及び組織病理学的所見などのすべての項目で正常群と類似するように確認されて、肝細胞の損傷を発生しない卓越な安全性を現わすことが確認された。

抗酸化効果と免疫増強及び免疫関連疾患治療効果分析
フリーラジカル消去活性試験は化学的に安定したフリーラジカルである２，２−ジフェニル−１−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）を利用して抗酸化効果を分かることができる方法として、上記ＤＰＰＨは５１５ｎｍ〜５２０ｎｍの付近で最大吸光度を有し、抗酸化活性のある物質と遇うと電子を供与しラジカル（ＤＰＰＨ）が消滅されて色が変わる。化学的に安定性のあるＤＰＰＨは各種抗酸化成分が内在された抽出物、飲料とオイル、純粋フェノール化合物などの抗酸化効果を分析することができる。

一方、活性窒素窒素酸化物（ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ；ＮＯ）のフリーラジカルは活性酸素と一緒に酸化的ストレスの原因になる。亜硝酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｎｉｔｒｉｔｅ）は５２０ｎｍで最大吸光度を有し、抗酸化活性のある物質と遇うと電子を押し出しながらラジカルが消滅されて色が変わる。

従って、本実験では実施例１で製造された丸薬の抗酸化効能を測定するためにフリーラジカル消法能をＤＰＰＨと亜硝酸ナトリウムを利用して測定した。

本実験では大食細胞の貪食作用を評価して試料の免疫増進効果を評価し、リポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ＬＰＳ）で窒素酸化物の生成を誘発した後、本発明による丸薬試料を処理して、窒素酸化物の生成を抑制する効果を評価して、過敏反応抑制効果を評価した。

また、アレルギーの主要因となる免疫細胞である肥満細胞（ｍａｓｔ ｃｅｌｌ）に本発明による丸薬試料を処理して、ヒスタミン分泌抑制効果を評価して、アレルギー反応抑制効果を測定し、アレルギー反応で喘息に関する効果を分析するために、気管支上皮細胞をＬＰＳで刺激した後、分泌された炎症性サイトカインの量を測定して試料の気管支喘息抑制効果を評価した。

材料及び方法
１）実験材料の準備
実施例１で製造された丸薬２００ｇを精密に取った後蒸溜水２Ｌを添加して熱水抽出した。その後、減圧濃縮器を用いて濃縮した後、凍結乾燥して収率４６．０８％のきれいな粉末を製造した。この粉末を以後の実験で試料として用いた。

２）試料の抗酸化機能性評価
２−１）ＤＰＰＨフリーラジカル消法能
凍結乾燥した試料を０．８、４、２０、１００及び２００ｍｇ／ｍｌの濃度になるように試液を調剤した後、９６ウェルプレートに１０μｌずつ添加した。各ウェルに４０μｌのＥｔＯＨを添加した後、ＤＰＰＨ２．５ｍＭを添加して３０分間反応させた。この反応液を５１５ｎｍで吸光度を測定してフリーラジカル消法能（％）を計算した。

２−２）ＮＯ分析
凍結して乾燥された試料を０．８、４、２０、１００及び２００ｍｇ／ｍｌの濃度になるように試液を調剤した後、各試液を１ｍｌずつ１５ｍｌのチューブに分注した。各チューブに１ｍＭ硝酸ナトリウム溶液を２ｍｌずつ添加した後、ｐＨ１．２の塩酸溶液、ｐＨ３．０のクエン酸緩衝液及びｐＨ６．０のクエン酸緩衝液を各チューブに７ｍｌずつ添加し、３７℃で１時間反応させた。この反応液を１ｍｌの２％酢酸溶液及びグリス（ｇｒｉｅｓｓ）試薬を添加し、さらに１５分間反応させた後、５２０ｎｍで吸光度を測定して亜硝酸消法能（％）を計算した。

３）大食細胞に対する試料の細胞毒性評価
マウスの大食細胞であるＲＡＷ２６４．７細胞に試料を処理して免疫細胞に対する試料の細胞毒性を確認した。

細胞は韓国細胞株銀行で購入し、５％ＦＢＳ及びペニシリン、ストレトマイシンを含んだＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）培地で３７℃及び５％のＣＯ_２の環境で３回継代培養した。その後、９６ウェルプレートに各ウェル当たり１×１０^４個の細胞を分注して、２４時間培養した後、試料を濃度別（１５．６、３１．３、６２．５、１２５、２５０μｇ／ｍｌ）に処理し、再び２４時間後ＭＴＴ分析方法を利用して細胞毒性を評価した。

ＭＴＴ分析方法は３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド試薬をシグマ（Ｓｉｇｍａ）社から購入してＭＴＴ試薬として、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で各細胞に処理した。さらに４時間培養した後生成された結晶をジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ）に溶かして５９５ｎｍで吸光度と測定し、細胞生存率を正常群に対する比率（％）で換算してグラフで表した。

４）大食細胞の貪食作用の評価（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ａｓｓａｙ）
大食細胞であるＲＡＷ２６４．７細胞を９６ウェルプレートに各ウェル当たり０．５×１０^４個ずつプレートに分注して２４時間培養した。その後、各ウェルにＬＰＳ１μｇ／ｍｌ及び蛍光ビッドが付着されたＩｇＧを処理し、試料を濃度別（１０、５０、１００及び２００μｇ／ｍｌ）で処理した。２４時間後、各ウェルの培地を取り除いた後、４０μｇ／ｍｌのトリパンブルー溶液で洗浄した。洗浄されたプレートを励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）４８５ｎｍ及び放出（ｅｍｉｓｓｉｏｎ）５３５ｎｍの蛍光波長で測定し、正常群に対する大食能の比率（％）で換算してグラフで表した。

５）大食細胞の亜硝酸塩（Ｎｉｔｒｉｔｅ）分泌に及ぼす影響
マウス大食細胞であるＲＡＷ２６４．７細胞を各ウェル当たり１×１０^４個ずつ９６ウェルプレートに分注して２４時間培養した。その後、各ウェルに１μｇ／ｍｌのＬＰＳを処理し、試料を濃度別（０、１０、５０、１００及び２００μｇ／ｍｌ）で処理した。４時間後各ウェルの培地を１００μｌずつ取ってグリス試薬を添加し、さらに１５分間反応させた後、５４０ｎｍで吸光度を測定して亜硝酸除去能（％）を計算した。

６）試料のヒスタミン分泌に対する効果
ヒスタミン分泌に対する試料の影響を確認するために、ヒト肥満細胞であるＨＭＣ細胞を利用してヒスタミン分泌量を測定した。

１×１０^５個のＨＭＣ細胞を２４ウェルプレートにそれぞれ分注した後、３時間安定化させた。その後、０．８、４、２０、１００及び２００ｍｇ／ｍｌの濃度の試料を各ウェルに処理して培養した。３０分後１ｍｇ／ｍｌのＣｏｍｐｏｕｎｄ４８／８０を処理した後、１５分後に各ウェルで培地を収去した。１００μｌの培地に１Ｍ ＮａＯＨ溶液５０μｌを入れた後、１ｍｇ／ｍｌのｏ−フタルアルデヒド溶液を１００μｌ添加した。４分後励起３６０／４０及び放出４６０／４０で蛍光を測定した後、標準液と比べて定量した。

７）気管支上皮細胞に対する試料の細胞毒性評価
ヒト気管支上皮細胞であるＡ５４９細胞を利用して気管支上皮細胞に対する試料の細胞毒性を確認した。

細胞は韓国細胞株銀行で購入し、５％ＦＢＳ及びペニシリン、ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地で３７℃及び５％のＣＯ_２の環境で３回継代培養した。その後、９６ウェルプレートに各ウェル当たり１×１０^４個の細胞を分注して２４時間培養した後、試料を濃度別（１０、５０、１００及び２００）で処理し、再び２４時間後ＭＴＴ分析方法を利用して細胞毒性を評価した。

ＭＴＴ分析方法は、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド試薬をシグマ（Ｓｉｇｍａ）社から購入してＭＴＴ試薬として用い、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で各細胞に処理した。さらに４時間培養した後、生成された結晶をジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ）に溶かして５９５ｎｍで吸光度と測定し、正常群に対する比率（％）で換算してグラフで表した。

８）気管支上皮細胞に対する試料の炎症関連サイトカイン分泌に対する効果
ヒト気管支上皮細胞であるＡ５４９細胞を２４ウェルプレートに１×１０^５個ずつ分注して２４時間培養した。その後、試料を各濃度別（５０及び２０μｇ／ｍｌ）で処理し、ＬＰＳを利用して炎症反応を誘導した。

２４時間培養した後培地を取ってＲａｙＢｉｏヒトサイトカイン抗体アレイキット（Ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｒｒａｙ ｋｉｔ）を利用してサイトカイン分泌量を測定した。ブロッキング緩衝溶液（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）を利用して２時間ブロッキング処理したメンブレインに培地を添加して２時間反応させた。その後、洗浄緩衝溶液１及び２を利用して５分ずつ５回洗浄し、１ｍｌのビオチンと結合された１次抗体と２時間反応させた。再び５分ずつ５回洗浄した後、ＨＲＰと結合されたストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）希釈液を入れて２時間反応させた。２時間後メンブレインを洗浄した後、ＥＣＬ緩衝溶液に反応させて化学発光撮影（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｅ ｉｍａｇｉｎｇ）装置を利用して定量した。

９）統計処理
実験結果は平均±ＳＥＭで表し、一方向分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を利用して統計処理した後、信頼区間（Ｐ ｖａｌｕｅ）が０．０５より小さい場合、有意性があることと判定した。

結果
１）ＤＰＰＨフリーラジカル消法能
それぞれの試料を濃度別に試液を調剤した後、ＤＰＰＨを添加してフリーラジカル消法能を測定した結果、図８で確認することができるように、０．８、４、２０、１００及び２００ｍｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ６．７±２．０、１７．９±１．６、４９．９±８．７、７６．１±６．９及び９２．３±１１．０％のフリーラジカル消法能を示した。試料の投与濃度が増加するほどＤＰＰＨフリーラジカル消去能が増加することを確認することができた。

２）ＮＯ分析
試料の亜硝酸塩（ｎｉｔｒｉｔｅ）の生成抑制に対する効果を確認するために、０．８、４、２０、１００及び２００ｍｇ／ｍｌの試料をｐＨ１．２の塩酸溶液、ｐＨ３．０のクエン酸緩衝液及びｐＨ６．０のクエン酸緩衝液での亜硝酸塩の消去能力を測定した。

図９から確認することができるように、ｐＨ１．２の塩酸溶液ではそれぞれ４．０±０．７、１４．１±２．２、４０．６±１．０、９７．９±０．２及び９９．２±０．２％のＮＯ生成抑制率を示し、ｐＨ３．０のクエン酸緩衝液ではそれぞれ５．８±０．７、１１．６±０．２、１６．５±０．７、４４．１±０．７及び６４．７±０．７％のＮＯ生成抑制率を示し、ｐＨ６．０のクエン酸緩衝液ではそれぞれ８．５±２．４、４．９±３．０、６．１±２．７、７．４±３．６及び１０．８±３．１％のＮＯ生成抑制率を示した。また、ｐＨ１．２及びｐＨ３．０の環境でＮＯ生成抑制能は試料の投与濃度によって増加したことを確認することができ、ｐＨ１．２の環境で試料１００及び２００ｍｇ／ｍｌ処理群はほとんど大部分のＮＯ生成を抑制した。

３）大食細胞に対する試料の細胞毒性評価
マウス大食細胞であるＲＡＷ２６４．７細胞に試料を処理して、免疫細胞に対する試料の細胞毒性を確認した。

図１０から確認することができるように、非処理群（ＩＭＯ）は１００．０±２．５％の細胞生存率を示し、１５．６、３１．３、６２．５、１２５及び２５０μｇ／ｍｌの試料投与群ではそれぞれ９５．９±３．０、９５．６±２．５、９４．０±２．２、１０１．４±３．７及び９４．８±１．５％の細胞生存率を示した。本実験の結果、全試料投与区間で統計的に有意な細胞毒性は確認することができなかった。

４）大食細胞の貪食作用評価
マウス大食細胞であるＲＡＷ２６４．７細胞に蛍光ビッドが付着されたＩｇＧを処理し、試料を濃度別に処理して試料の大食細胞活性に対する影響を測定した。

図１１及び図１２から確認することができるように、ＬＰＳ処理群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）１００．０±１．９％の大食能を示し、非処理群（Ｂｌａｎｋ）は９３．３±１．１％の大食能を示した。試料１０、５０、１００及び２００μｇ／ｍｌ投与群ではそれぞれ１０２．７±０．７％、１０２．７±７．３％、１１０．５±３．７％及び１０３．８±１．８％の大食能を示した。

試料の処理によって大食細胞の大食能が少しずつ増加する傾向が認められ、１００μｇ／ｍｌの試料投与群（ＩＭ１００）で統計的に有意な（＊ｐ＜０．０５）の大食能増加効果が認められた。

５）大食細胞の亜硝酸塩（Ｎｉｔｒｉｔｅ）の分泌に及ぶ影響
マウス大食細胞であるＲＡＷ２６４．７細胞をＬＰＳを処理し、試料を濃度別に処理してＮＯ生成に対する試料の影響を確認した。

図１３に示すように、非処理群（Ｂｌａｎｋ）は、１．２±０．０μｇ／ｍｌのＮＯを生成し、ＬＰＳで刺激した後の試料０、１０、５０、１００及び２００μｇ／ｍｌの投与群ではそれぞれ１４．６±０．４、１５．６±０．４、１４．８±０．２、１４．８±０．２及び１３．０±０．４μｇ／ｍｌのＮＯを生成した。この実験の結果、２００μｇ／ｍｌの試料投与群で統計的に有意な（＊ｐ＜０．０５）ＮＯ生成抑制能を確認することができた。

６）ヒスタミン分泌に対する効果
ヒスタミン分泌に対する試料の影響を確認するために、ヒト肥満細胞であるＨＭＣ細胞を利用してヒスタミン分泌量を測定した。

図１４に示すように、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ４８／８０で刺激を加えた試験群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）では１００±３．８％のヒスタミン分泌量を示し、非処理群（Ｂｌａｎｋ）では２５．７±０．４％のヒスタミン分泌量を示した。試料５０、１００及び２００μｇ／ｍｌの投与群ではそれぞれ９０．９±８．０、７２．４±６．９及び７２．２±８．３％のヒスタミン分泌量を示した。この実験の結果、１００及び２００μｇ／ｍｌの試料投与群で統計的に有意な（＊ｐ＜０．０５）のヒスタミン分泌量を減少させたことが確認された。

７）気管支上皮細胞に対する試料の細胞毒性評価
ヒト気管支上皮細胞であるＡ５４９細胞に試料を処理して気管支上皮細胞に対する試料の細胞毒性を確認した。

図１５に示すように、非処理群（ＩＭＯ）は１００．０±１２．７％の細胞生存率を示し、試料１０、５０、１００及び２００μｇ／ｍｌの投与群ではそれぞれ９６．４±６．７、９６．４±０．８、９６．７±５．５及び９６．６±１．９μｇ／ｍｌの細胞生存率を示した。本実験の結果、全試料投与区間では統計的に有意な細胞毒性は確認することができなかった。

８）気管支上皮細胞に対する試料の炎症関連サイトカイン分泌に対する効果
試料のサイトカイン分泌に対する影響を調べるために、ＬＰＳを利用して刺激したＡ５４９細胞に試料を５０及び２００μｇ／ｍｌを投与した。その後、ＲａｙＢｉｏヒトサイトカイン抗体アレイキットを利用してサイトカイン分泌量を測定した。

その結果、図１６に示すように、試料２００μｇ／ｍｌ投与群（Ｄ）でＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−１０及びＴＮＦ−βの分泌を抑制することを確認することができた。

本発明を上述した具体的な実施例と関連して記述したが、添付された特許請求の範囲によって定義された本発明の範囲内で本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者であれば本発明を多様に変形及び変化させることができる。

Claims (9)

1. 丁香、全蠍、鏡面朱砂、牛黄、ビャッキョウサン、白附子、枯白礬、紫河車、竜脳及び砒素化合物を含む免疫関連疾患予防または治療用組成物であって、
   前記組成物が砒素化合物１〜７重量部、丁香１５〜２５重量部、全蠍２００〜２７０重量部、鏡面朱砂２０〜３０重量部、牛黄２５〜３５重量部、ビャッキョウサン５０〜６５重量部、白附子３８〜４８重量部、枯白礬５０〜６５重量部、紫河車２００〜２７０重量部及び竜脳０．５〜６重量部を含むことを特徴とする組成物。
2. 前記免疫関連疾患は、免疫介在性炎症疾患、非免疫介在性炎症疾患、感染症、免疫不全疾患及び新生物（ｎｅｏｐｌａｓｉａ）からなる群で選択されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
3. 前記免疫関連疾患は、後天性免疫欠乏症（ＡＩＤＳ）、肝炎、肝硬化、癌、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症またはじんま疹であることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
4. 丁香、全蠍、鏡面朱砂、牛黄、ビャッキョウサン、白附子、枯白礬、紫河車、竜脳及び砒素化合物を含む酸化的ストレス関連疾患予防または治療用組成物であって、
   前記組成物が砒素化合物１〜７重量部、丁香１５〜２５重量部、全蠍２００〜２７０重量部、鏡面朱砂２０〜３０重量部、牛黄２５〜３５重量部、ビャッキョウサン５０〜６５重量部、白附子３８〜４８重量部、枯白礬５０〜６５重量部、紫河車２００〜２７０重量部及び竜脳０．５〜６重量部を含むことを特徴とする組成物。
5. 前記酸化的ストレス関連疾患は、脂質代謝疾患、動脈硬化症、心不全症、高血圧性心臓疾患、不整脈、心筋梗塞症、狭心症、老化、免疫疾患または癌であることを特徴とする請求項４に記載の組成物。
6. 前記砒素化合物は、三酸化砒素（Ａｓ_２Ｏ_３）、六酸化砒素（Ａｓ_４Ｏ_６）、三臭化砒素（ＡｓＢｒ_３）、三塩化砒素（ＡｓＣｌ_３）、三ヨウ化砒素（ＡｓＩ_３）及びメラルソプロール（Ｍｅｌａｒｓｏｐｒｏｌ）からなる群で選択されることを特徴とする請求項１または４に記載の組成物。
7. 前記組成物が、砒素化合物３〜５重量部、丁香１７〜２２重量部、全蠍２２０〜２５０重量部、鏡面朱砂２２〜２７重量部、牛黄２７〜３１重量部、ビャッキョウサン５５〜６２重量部、白附子４１〜４６重量部、枯白礬５５〜６２重量部、紫河車２２０〜２５０重量部及び竜脳２〜４重量部を含むことを特徴とする請求項１または４に記載の組成物。
8. 丁香、全蠍、鏡面朱砂、牛黄、ビャッキョウサン、白附子、枯白礬、紫河車、竜脳及び砒素化合物を含む抗酸化組成物であって、
   前記組成物が砒素化合物１〜７重量部、丁香１５〜２５重量部、全蠍２００〜２７０重量部、鏡面朱砂２０〜３０重量部、牛黄２５〜３５重量部、ビャッキョウサン５０〜６５重量部、白附子３８〜４８重量部、枯白礬５０〜６５重量部、紫河車２００〜２７０重量部及び竜脳０．５〜６重量部を含むことを特徴とする組成物 を含むことを特徴とする組成物。
9. 丁香、全蠍、鏡面朱砂、牛黄、ビャッキョウサン、白附子、枯白礬、紫河車、竜脳及び砒素化合物を含む、砒素化合物の毒性低減用組成物であって、
   前記組成物が砒素化合物１〜７重量部、丁香１５〜２５重量部、全蠍２００〜２７０重量部、鏡面朱砂２０〜３０重量部、牛黄２５〜３５重量部、ビャッキョウサン５０〜６５重量部、白附子３８〜４８重量部、枯白礬５０〜６５重量部、紫河車２００〜２７０重量部及び竜脳０．５〜６重量部を含むことを特徴とする組成物 を含むことを特徴とする組成物。