CN104203261B - 用于预防或治疗免疫相关疾病和氧化应激相关疾病的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于预防或治疗免疫相关疾病的组合物，并且更具体地，涉及一种用于预防或治疗免疫相关疾病或氧化应激相关疾病的组合物，其中有效抑制了砷组合物的毒性，然而同时使其免疫功能增强效应最大化。根据本发明的所述组合物在预防或治疗各种免疫相关疾病或氧化应激相关疾病中有用，因为所述组合物降低了传统上由于毒性而难以用于临床实践中的砷组合物的毒性，然而同时使其药理效应最大化。

Description

用于预防或治疗免疫相关疾病和氧化应激相关疾病的组合物

技术领域

本发明涉及一种用于预防或治疗免疫相关疾病或氧化应激相关疾病的组合物，并且更具体地，涉及一种用于预防或治疗免疫相关疾病的组合物，其中有效抑制了砷化合物的毒性，同时使其免疫功能增强效应和抗氧化效应最大化。

背景技术

免疫相关疾病和炎性疾病是在正常生理上对创伤或损伤作出响应，发起创伤或损伤修复和加强对外来生物的先天和获得性防御至关重要的相当复杂、往往多个相互关联的生物途径的表现或结果。当这些正常生理途径因为与响应强度直接相关，由于调节异常或过度刺激，作为对自身的反应或这些的组合引起附加创伤或损伤时，发生疾病或病理。许多免疫相关疾病已知并且已得到广泛研究。这种疾病包括(例如)免疫介导的炎性疾病、非免疫介导的炎性疾病、传染病、免疫缺陷疾病等。已知免疫功能的降低导致包括癌症在内的各种疾病，因为不当处理来自外部的抗原打破了维持活体平衡的体内平衡。特别地，据报道免疫功能随年龄而逐渐降低并且因此，患癌症的可能性增加，特别是肝脏和呼吸系统癌症的发病率大大增加。

此外，抗氧化指预防几种氧化在人体中出现。作为生物膜或脂蛋白存在的脂质受活体中出现的自由基攻击形成很多种过氧化物。过氧化物和降解产物具有高反应性，因此使外周生物分子的结构和功能变化，从而导致几种慢性疾病。在体内存在几种抗氧化防御系统，可中和这些自由基并保护机体。然而，将这些抗氧化防御系统降低到不能调节自由基的产生的程度时，利于组织的氧化应激和损伤，并且体内产生的过量自由基和脂质过氧化物导致由于氧化应激引起的创伤增加，例如蛋白质氧化和DNA损伤(见Kumar CT.等，Mol.Cell Biochem.,111，第109-115页，1992)。已知活性氧(ROS)可能是诱导慢性退行性疾病例如心血管疾病、糖尿病、癌症、退行性神经病变和老化的主要原因，并且抗氧化剂可以帮助预防慢性退行性疾病(Bray,T.M.Nutrition.16，第578-581页，2000)。

另一方面，砷被称为有效致癌物，常常影响皮肤和肺，但是从约公元前2000年开始砷就是用于治疗人类疾病的药品。在中医学，包括韩医学中，砷化合物已经长期处方用于治疗一些绝症。在韩国和中国的古老医学文献中，TongEuiBoGam描述砷处方用作名为Bisang的中药并且砷在去除其毒性后使用时对管理choongak或呕吐有效。同样，在古老的中医文献(BonChoKangMok)中，描述了名为HwangWoong的砷的用途和药理效应。

此外，在西医中，Hippocrates,公元前460-377年和Galen，公元130-200年描述，砷化合物处方用作治疗一些疾病的药品。砷化合物处方用于治疗几种疾病，包括风湿病、梅毒、牛皮癣等并且已知低浓度的砷化合物对人体的生理功能起有益作用，包括刺激造血。如上所述砷的生理活性已得到长时间公认并且实际上已用于临床目的。然而，在韩国，已将砷作为重金属管制并且其使用变得非常有限。

最近，基于砷的这些药理性质，已经积极进行在临床上将其用于抗癌药物的尝试。1997年公开，三氧化二砷(As₂O₃)，一种砷化合物，在治疗急性前髓细胞性白血病中具有优良效果(见Shen ZX等，Blood,98:3354-3360,1997)。随后，证明了其功效。此外，在韩国专利申请No.1998-16486中，详细描述了在使用小鼠模型的体内实验中，砷化合物表现出抑制恶性肿瘤生长和有效抑制肿瘤转移的活性。

然而，上面提到的研究结果已经表明砷化合物例如三氧化二砷可作为新药品的可能性，但是仍然需要改善砷化合物在实际应用中对人体引起的毒性和对低浓度砷的敏感性。

发明内容

相应地，本发明的一个目的是提供一种用于预防或治疗免疫相关疾病或氧化应激相关疾病的组合物，其中有效抑制了砷化合物的毒性，同时使其药理效应增加。

为了实现以上目的，本发明提供了一种预防或治疗免疫相关疾病或氧化应激相关疾病的组合物，其中有效降低了砷化合物的毒性，所述组合物包含丁香、蝎子、朱砂、牛黄、僵蚕、关白附子、Alunitum Siccus.、紫河车、冰片和砷化合物。

本发明还提供了一种抗氧化组合物或一种用于降低砷化合物毒性的组合物，所述组合物包含丁香、蝎子、朱砂、牛黄、僵蚕、关白附子、Alunitum Siccus.、紫河车、冰片和砷化合物。

根据本发明所述的组合物可降低传统上由于毒性而难以用于临床实践中的砷组合物的毒性，并且还使其药理效应最大化。通过这样做，本组合物通过其免疫功能增强效应，在预防或治疗各种免疫相关疾病，包括肝炎、肝硬化、癌症、获得性免疫缺陷综合征、哮喘和特应性中有效。此外，本组合物通过砷化合物的抗氧化作用在预防或治疗氧化应激相关疾病中有用。

附图说明

参考附图，本发明的以上及其它目的和特征将从以下描述显而易见：

图1为其中通过苏木精伊红染色鉴定出正常大鼠肝脏的组织病理学损伤的照片。此处，pt表示肝门三体而V表示中央静脉。

图2为其中通过苏木精伊红染色鉴定出经四氯化碳处理的对照组大鼠肝脏的组织病理学损伤的照片。

图3为其中通过苏木精伊红染色鉴定出经低剂量样品(实例1的丸剂)和四氯化碳预处理的大鼠肝脏的组织病理学损伤的照片。

图4为其中通过苏木精伊红染色鉴定出经高剂量样品(实例1的丸剂)和四氯化碳预处理的大鼠肝脏的组织病理学损伤的照片。

图5为其中通过苏木精伊红染色鉴定出经水飞蓟素(silymarin)和四氯化碳预处理的对照大鼠肝脏的组织病理学损伤的照片。

图6为其中通过苏木精伊红染色鉴定出正常大鼠肝脏的组织病理学损伤的照片。

图7为其中通过苏木精伊红染色鉴定出经高剂量样品(实例1的丸剂)预处理的大鼠肝脏的组织病理学损伤的照片。

图8为表示样品(实例1的丸剂)的DPPH自由基清除活性的测量结果的图表(IMO.8：样品0.8mg/ml处理组，IM4：样品4mg/ml处理组，IM20：样品20mg/ml处理组，IM100：样品100mg/ml处理组，和IM200：样品200mg/ml处理组)。

图9为表示样品(实例1的丸剂)对氧化氮生成的抑制作用的图表(IMO.8：样品0.8mg/ml处理组，IM4：样品4mg/ml处理组，IM20：样品20mg/ml处理组，IM100：样品100mg/ml处理组，和IM200：样品200mg/ml处理组)。

图10为鉴定样品(实例1的丸剂)在巨噬细胞中的细胞毒性的图表(IMO：未处理组，IM15.6：样品15.6μg/ml处理组，IM31.3：样品31.3μg/ml处理组，IM62.5：样品62.5μg/ml处理组，IM125：样品125μg/ml处理组和IM250：样品250μg/ml处理组)。

图11为示出了对样品(实例1的丸剂)在巨噬细胞中的吞噬作用的影响的图表(空白：未处理组，对照：LPS处理组，IM10：LPS+样品10μg/ml处理组，IM50：LPS+样品50μg/ml处理组，IM100：LPS+样品100μg/ml处理组和IM200：LPS+样品200μg/ml处理组)。

图12为确认了对样品(实例1的丸剂)在巨噬细胞中的吞噬作用的影响的图表(A：未处理组，B：LPS处理组，C：LPS+样品10μg/ml处理组，D：LPS+样品50μg/ml处理组，E：LPS+样品100μg/ml处理组和F：LPS+样品200μg/ml处理组)。

图13为确认了样品(实例1的丸剂)对氧化氮生成的抑制作用的图表(空白：未处理组，IMO：LPS处理组，IM10：LPS+样品10μg/ml处理组，IM50：LPS+样品50μg/ml处理组，IM100：LPS+样品100μg/ml处理组和IM200：LPS+样品200μg/ml处理组)。

图14为确认了根据本发明所述的组合物的组胺分泌作用的图表(空白：未处理组，对照：化合物48/80处理组，IM50化合物48/80+样品50μg/ml处理组，IM100：化合物48/80+样品100μg/ml处理组和IM200：化合物48/80+样品200μg/ml处理组)。

图15为表示样品(实例1的丸剂)对支气管上皮细胞的细胞毒性的测量结果的图表(IMO：未处理组，IM10：样品10mg/ml处理组，IM50：样品50mg/ml处理组，IM100：样品100mg/ml处理组和IM200：样品200mg/ml处理组)。

图16使用RayBiop人细胞因子抗体测定试剂盒确认了实例1的丸剂对细胞因子分泌的影响(A：未处理组，B：LPS处理组，C：LPS+样品50μg/ml处理组和D：LPS+样品200μg/ml处理组，①：IL-1α，②：IL-2，③：IL-10，④：TNF-β)。

具体实施方式

现将详细描述本发明。

本发明涉及一种用于预防或治疗免疫相关疾病或氧化应激相关疾病的组合物，其中有效降低了砷化合物的毒性，所述组合物包含丁香、蝎子、朱砂、牛黄、僵蚕、关白附子、枯矾、紫河车、冰片和砷化合物。

如本文所使用，术语“免疫相关疾病”指其中哺乳动物免疫系统的任何组成部分在哺乳动物中诱导或介导疾病或有助于其发病率的疾病。同样，免疫相关疾病包括具有通过刺激或干预免疫反应加速疾病进程的作用的疾病。以上免疫相关疾病进一步包括免疫介导的炎性疾病、非免疫介导的炎性疾病、传染病、免疫缺陷疾病、瘤形成等。

可根据本发明治疗的免疫相关疾病的具体实例包括但不限于炎性疾病例如获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、肝炎和肝硬化，及变应性疾病例如每种类型的癌症、哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、食物过敏和荨麻疹。

另一方面，如本文所使用的术语“氧化应激相关疾病”指在氧和营养物质反应和代谢过程中，在活体内产生的活性氧(自由基)引起的疾病。具体地，氧化应激相关疾病包括(例如)脂质代谢疾病(例如高脂血症)、心脏病(例如血管硬化、心力衰竭、高血压性心力衰竭、心律不齐、心肌梗塞和心绞痛)、老化、免疫性疾病和癌症。

如下，举例说明了根据本发明所述的组合物的每个组分。

用于本发明中的砷化合物指可在药学上使用的砷化合物。其实例包括但不限于三氧化二砷(As₂O₃)、六氧化四砷(As₄O₆)、三溴化砷(AsBr₃)、三氯化砷(AsCl₃)、三碘化砷(AsI₃)和美拉胂醇(命名为Bisang)。

用于本发明中的丁香是热带常绿乔木丁香树(Syringavelutinavar.kamibayshii)的花蕾，并且其粉末或油用于食用和药用。丁香处方用于治疗呕吐、胃癌、腹痛、消化不良、性功能障碍、牙龈发炎、牙龈疼痛等。据报道其药理作用具有促进胃液分泌、止痛、抗痉挛、抗炎、抗氧化、抗血栓、抗菌、驱虫和抗高血压活性。

用于本发明中的蝎子是通过干燥属于蝎子科的蝎子身体获得的蝎子。蝎子具有祛痰作用并且还具有治疗面瘫和去除中风的功能。

用于本发明中的朱砂由晶体组成并且是包含硫化合物例如硫化汞(HgS)作为主要组分的天然矿石。朱砂具有促进精神稳定，终止痉挛，降低热量和中和毒物的功能。朱砂处方用于治疗例如惊跳、心悸、失眠、健忘、惊厥、癫痫、精神病、高烧、精神错乱或谵妄等症状。

用于本发明中的牛黄是栖居于印度、伊朗、中国等地的反刍动物例如牛、山羊和羚羊的胆囊内异常提供的凝集物。这主要通过从牛胆囊或胆管中提取，去除外膜并且阴干使用。外观为一小块黄褐色球体，直径约2cm，光亮且易碎。味微苦。其主要组分包括胆酸、胆红素、麦角固醇、维生素D等。在中医中，将其用作退热药、解毒剂、镇静剂、止痛剂和强心剂。

用于本发明中的僵蚕指其中在其吐丝之前通过球孢白僵菌(Bals.)感染突发性杀伤蚕(家蚕(Bombyx mori L.))，然后干燥的僵蚕。僵蚕具有去除中分和湿气的功能、祛痰作用和去除肿胀毒物的功能。

用于本发明中的关白附子指属于毛茛科的多年生黄花乌头(Aconitumkoreanum)、独角莲(Typhonium giganteum)的块茎。这处方用于去除中风和痰，从而治疗由于中风引起的面瘫、惊厥、危象(突发)、中风、破伤风、偏头痛、头痛、神经痛四肢麻痹、关节痛、绣球风、皮肤瘙痒和颈淋巴结炎。此外，其在被蛇咬时具有解毒功能。

用于本发明中的Alunitum Siccus.指枯矾。即，这是通过加热和脱水钾矾(KAI(SO₄)₂.12H₂O)获得的。Alunitum Siccus.用作例如止血剂和收敛剂等药品。此外，这已知具有脱水作用。

用于本发明中的紫河车为人胎盘，无毒并且主要处方用作强壮剂(滋补剂)以治疗慢性疲劳综合征、神经衰弱、贫血、慢性支气管炎、哮喘、咳嗽和结核。此外，这具有收缩子宫和利于乳线和女性生殖器官发育的功能。

用于本发明中的冰片指通过将属于龙脑香科(Dipterocarpaceae)的常绿乔木，龙脑香树(Dryobalanops aromatica GAERTNER)的树脂树干切片并将其蒸汽蒸镏获得的白色晶体。冰片对治疗精神错乱和意识障碍，降低热量和肿胀，缓解疼痛和治疗儿童高烧、惊厥和癫痫有效。这也用于治疗各种炎症，包括咽喉炎、口腔炎、眼病(应为ophthalmopathy)、瘙痒、充血及眼部和鼻部炎症。

根据本申请所述的组合物可能分别包含治疗有效量的丁香、蝎子、朱砂、牛黄、僵蚕、关白附子、Alunitum Siccus.、紫河车、冰片和砷化合物。

根据本发明所述的组合物优选包含1-7重量份的砷化合物、15-25重量份的丁香、200-270重量份的蝎子、20-30重量份的朱砂、25-35重量份的牛黄、50-65重量份的僵蚕、38-48重量份的关白附子、50-65重量份的Alunitum Siccus.、200-270重量份的紫河车和0.5-6重量份的冰片。

根据本发明所述的组合物更优选包含3-5重量份的砷化合物、17-22重量份的丁香、220-250重量份的蝎子、22-27重量份的朱砂、27-31重量份的牛黄、55-62重量份的僵蚕、41-46重量份的关白附子、55-62重量份的Alunitum Siccus.、220-250重量份的紫河车和2-4重量份的冰片。

根据本发明用于预防或治疗免疫相关疾病的组合物可配制成供口服或肠胃外施用的各种形式。供口服施用的组合物的实例可包括片剂、胶囊、颗粒、丸剂等。

根据本发明的此类组合物可与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合制备。本文使用的适合载体、稀释剂或赋形剂可包括(例如)赋形剂例如淀粉、糖和甘露醇；填料和膨胀剂例如磷酸钙和硅酸衍生物；纤维素衍生物例如羧甲基纤维素或羟丙基纤维素；粘合剂例如明胶(应为gelatin)、藻酸盐或聚乙烯吡咯烷酮；润滑剂例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、氢化蓖麻油和固体聚乙二醇；崩解剂例如聚烯吡酮、交联羧甲基纤维素钠和交联聚维酮；和表面活性剂例如聚山梨醇酯、鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯。此外，当所述组合物为丸剂时，为了与丸剂组分结合，可以包括粘合剂例如蜂蜜。

为防止制备的丸剂相互粘连、发霉、水分蒸发或进行搭配或调味，可以包括撒粉剂例如石松粉、滑石、淀粉、高岭土、甘草粉、肉桂粉和鸢尾根。

另外，可根据已知常规方法制备包含预定量的活性成分，有或无添加剂例如载体、稀释剂或赋形剂的各种药物组合物。例如，当以上组合物制备成片剂形式时，可向组合物中添加添加剂例如载体、稀释剂或赋形剂，然后直接或在制成颗粒后进行压缩成型。在为胶囊的情况下，以上组合物可呈液体、悬浮剂或颗粒形式装入胶囊中或封装在胶囊基质中。在为丸剂的情况下，可向组合物中添加添加剂例如载体、稀释剂或赋形剂并混合均匀以制成塑性物质。然后将所得物质分开并模制成球形以制成所需丸剂。

正如由下列实例可确认，这样获得的本发明的组合物表现出能够显著降低传统上已知砷化合物的毒性的优良效果。同样，本发明的组合物通过使砷化合物的免疫功能增强效应最大化在预防或治疗免疫相关疾病上表现出显著效果。此外，本发明的组合物表现出优良的抗氧化效果并且因此对预防或治疗各种氧化应激相关疾病有用，包括脂质代谢疾病(例如高脂血症)、心脏病(例如血管硬化、心力衰竭、高血压性心力衰竭、心律不齐、心肌梗塞和心绞痛)、老化、免疫性疾病和癌症。

将参考下列实施例详细描述本发明。所述实施例仅旨在说明，但不得视为对本发明的限制。

实施例1

含砷化合物的丸剂的制备

为了根据本发明制备含砷化合物的丸剂，从汉城的京东市场(GyeongDongMarket)选择并购买每种药用成分(Bisang(三氧化二砷)如砷化合物、丁香、蝎子、朱砂、牛黄、僵蚕、关白附子、Alunitum Siccus.、紫河车和冰片)。随后，分别称取40g Bisang、200g丁香、2400g蝎子、250g朱砂、300g牛黄、600g僵蚕、450g关白附子、600g Alunitum Siccus.、2400g紫河车和30g冰片，磨碎，然后用混合器(G&S Korea)混合。为使混合的药用成分结合在一起，添加适量蜂蜜制成面团。将这样获得的面团从制丸机(由DaeSung制药机械厂订单生产，PM TECH自动化机器)中取出，然后放入切丸机(由DaeSung制药机械厂订单生产，PMTECH自动化机器)中以制成丸剂。将这样制备的丸剂用于以下实验中。

实验示例1

保肝作用和安全性的分析

四氯化碳(CCl₄)是广泛用于肝细胞损伤相关研究的典型肝毒性化学物质。四氯化碳在肝细胞中积聚酶代谢过程中生成的自由基，从而以细胞膜脂质过氧化、蛋白质氧化修饰和DNA损伤引起的氧化应激诱导细胞损伤。

相应地，为了确定根据本发明的药物组合物的保肝作用，向大白鼠施用实施例1中制备的丸剂，同时施用四氯化碳。随后，比较血清学指数(应为serological index)或因为肝细胞损伤的组织病理学变形和与氧化应激相关的脂质过氧化水平并且鉴定提供的丸剂在其口服施用后对肝细胞损伤的防御作用和安全性。

实验动物

购买8周龄雄性史-道二氏大鼠(Spargue-Dawley rat)(Samtako,Korea)并且在韩国世明大学动物育种卫生所(Sanitary Animal Breeding Facilities of SemyungUniversity,Korea)，在23±1℃、湿度50±5％和12h光照/12h黑暗条件下适应5天。当其重量达到平均235g时，将大鼠用于实验。整个实验期间，饲料(来自JeilJedang,Korea)和饮水可随意得到。动物实验经世明大学动物实验伦理委员会(Animal Experiment EthicsCommission of Semyung University)批准进行。

实验组的分类及处理

从实验开始之日起7天，正常组每天口服施用1ml蒸馏水。最后施用1h后，腹膜内施用橄榄油(1ml/kg体重)。

从实验开始之日起7天，对照组每天口服施用1ml蒸馏水。最后施用1h后，腹膜内施用CCl₄溶液(50％于橄榄油中的CCl₄)(1ml/kg体重)。

从实验开始之日起7天，低剂量组每天口服施用低剂量丸剂溶液(300mg/kg体重)。最后施用1h后，腹膜内施用CCl₄溶液(50％于橄榄油中的CCl₄)(1ml/kg体重)。

从实验开始之日起7天，高剂量组每天口服施用高剂量丸剂溶液(1500mg/kg体重)。最后施用1h后，腹膜内施用CCl₄溶液(50％于橄榄油中的CCl₄)(1ml/kg体重)。

从实验开始之日起7天，水飞蓟素组每天口服施用水飞蓟素溶液(Sigma Co.,USA)(100mg/kg体重)。最后施用1h后，腹膜内施用CCl₄溶液(50％于橄榄油中的CCl₄)(1ml/kg体重)。

从实验开始之日起7天，以与正常组相同的方式，安全测试组每天口服施用高剂量丸剂溶液(1500mg/kg体重)以便评估提供的丸剂的安全性。最后施用1h后，腹膜内施用橄榄油(1ml/kg体重)。

下面表1中示意性示出了以上试验组的分类和试验程序。

[表1]

检验项目

1)重量和增重率

从实验开始之日(第1天)起第4天、第7天和实验结束之日(第8天)测量所有试验动物的重量。按(7天增重/实验开始之日的重量)×100计算其增重率。

2)肝脏重量和肝脏/重量比的测量

进行试验动物的尸体解剖以取出肝脏。小心去除外周结缔组织，然后测量肝脏重量。按(肝脏重量/重量)×100计算肝脏/重量比。

3)血清丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶的活性检验

向大白鼠腹膜内施用橄榄油或CCl₄。用醚轻度麻醉大白鼠并通过心脏收集血液，然后引入血清分离管中。在冷藏状态下，在3,500rpm速度下离心血清分离管10min以分离血清。通过改良的IFCC方法，使用自动生化分析仪(Hitachi modulator,Japan)测量血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)。用于测量的试剂为AST(Roche,USA)和ALT(Roche,USA)。

4)肝脏组织中脂质过氧化水平的测量

测量肝脏的重量，然后取出中叶右侧部位的一部分并用于肝脏组织中脂质过氧化水平的测量。

根据Ohkawan法(Ohkawa等，J.Med.Chem.,40，第559-573页，1997)进行脂质过氧化水平的测量。使用硫代巴比妥酸测定法将丙二醛，脂质过氧化的最终产物量化为指数。即，将肝脏组织与10倍(v/w)剂量的1.15％氯化钾溶液一起搅匀以制备均质液体。然后将0.2ml均质液体与0.2ml的8.1％十二烷基硫酸钠(SDS)、1.5ml的20％醋酸pH 3.5)、0.5ml的5％丁羟甲苯和1.5ml的0.8％硫代巴比妥酸混合。使混合物于恒温器中在100℃下反应60min。然后任反应在室温下1h并且在3,000rpm下离心10min以得到上清液。用紫外光谱法在532nm下测量其吸光度。

5)肝脏组织的组织病理学检验

将取出中叶的左侧部位固定于10％中性缓冲福尔马林(NBF)溶液1天，并且进行一般酒精脱水和二甲苯透明工艺以制成石蜡块。制备厚度为5μm的石蜡薄碎片并进行苏木精伊红染色。用光学显微镜比较和观察病理学发现。

结论

A.保肝作用

1)重量差

正常组的重量在实验期不断增加。由于禁食物，在实验第8天重量减轻。

在对照组中，到实验第7天，观察到与正常组相似水平的增重。然而，由于禁食和施用CCl₄，在实验第8天，与正常组相比，增重明显降低，并且与正常组相比，增重率明显降低。

在低剂量组、高剂量组和水飞蓟素组中，重量和增重率与对照组相比高一点，但是无显著差异(表2)。

[表2]

在CCl₄诱导的大鼠肝毒性上样品材料的预处理对重量的影响

2)肝脏重量和肝脏/重量比的差异

在实验结束之日测量的肝脏重量和肝脏/重量比显示，与正常组相比，对照组明显更高。

在低剂量组中，与对照组相比，肝脏重量和肝脏/重量比均明显更高。

在高剂量组和水飞蓟素组中，与对照组相比，肝脏重量和肝脏/重量比低一点，但是无显著差异(表3)。

[表3]

在CCl₄诱导的大鼠肝毒性上样品材料的预处理对肝脏重量和肝脏/重量比的影响

3)血液ALT和AST活性的差异

与正常组相比，对照组的血液ALT和AST活性明显更高。

与对照组相比，低剂量组的血液ALT明显更低。与对照组相比，低剂量组的血液AST明显更低，但是未观察到显著差异。

与对照组相比，高剂量组的血液ALT和AST明显更低。

甚至在水飞蓟素组中，与对照组相比，血液ALT也明显更低，但是未观察到显著差异(表4)。

[表4]

在CCl₄诱导的大鼠肝毒性上样品材料的预处理对血液ALT和AST活性的影响

4)肝脏组织中脂质过氧化物水平的差异

与正常组相比，对照组肝脏组织中丙二醛(MDA)，即脂质过氧化物的水平明显更高。

相反，在低剂量组、高剂量组和水飞蓟素组中，与对照组相比，肝脏组织中的MDA水平明显更低。

[表5]

在CCl₄诱导的大鼠肝毒性上样品材料的预处理对肝脏组织的MDA含量的影响

5)组织病理学发现的差异

保持的正常组的肝脏组织显示，中央静脉、门三角、肝细胞板和东方毛细管的所有组织均如图1(a)和1(b)所示，保持良好并且肝细胞还有正常组织。在对照组的肝脏组织中，观察到中央静脉周围的广泛肝细胞坏死。在坏死肝细胞周围，观察到不同大小的血管变性和脂质变化。在坏死部位中，确认了大量炎性细胞浸润。门三角周围的肝细胞保持了相对正常的组织(见图2(a)和2(b))。

另一方面，正如从图3(a)和(b)可以确认，在低剂量组中观察到的肝脏组织的组织病理学变化与对照组相同，但是中央静脉周围的肝细胞坏死和变性水平极轻微并且炎性细胞的浸润水平与对照组相比明显降低。甚至在高剂量中，也仅在中央静脉周围确认了肝细胞坏死和变性。很少观察到炎性细胞浸润并且经证实与正常组相似(见图4(a)和4(b))。在水飞蓟素组中，观察到组织病理学发现和水平与高剂量组相似(见图5(a)和5(b))。

如上所示，在来自实施例1的丸剂的低剂量组(300mg/kg重量)中，经证实与对照组相比，血液ALT显著，而不认为血液AST具有显著差异，但是经证实与对照组相比明显更低。在组织病理学上，与对照组相比，损害水平减轻。同样，在以上丸剂的高剂量组(1,500mg/kg重量)中，与对照组相比，血液ALT和AST明显更低。在组织病理学上，与对照组相比，损害的发现和水平减轻。相应地，认为本发明的组合物可以浓度依赖性方式预防肝细胞损伤，并且还可有效预防和治疗肝病例如可能由氧化应激等引起的肝炎和肝硬化。

B.安全性分析

1)重量差异

在用于评估实施例1中制备的丸剂的安全性的安全测试组中，重量和增重率与正常组相比高一点，但是无显著差异(表6)。

[表6]

高剂量样品处理后对大鼠重量的影响(安全测试组)

2)肝脏重量和肝脏/重量比的差异

在用于评估实施例1中制备的丸剂的安全性的安全测试组中，经证实重量和增重率与正常组相似(表7)。

[表7]

高剂量样品处理后对大鼠重量的影响(安全测试组)

3)血液ALT和AST活性的差异

在用于评估实施例1中制备的丸剂的安全性的安全测试组中，经证实血液ALT和AST与正常组相似(表8)。

[表8]

高剂量样品处理后对大鼠血液ALT和AST的影响(安全测试组)

组别	血液ALT(IU/L)	血液AST(IU/L)
			正常组	40.0±4.7	73.6±5.6
安全测试组	36.4±3.7	72.3±4.5

4)肝脏组织的脂质过氧化物水平的差异

在用于评估实施例1中制备的丸剂的安全性的安全测试组中，肝脏组织中MDA水平与正常组相比显著更低(表9)。

[表9]

高剂量样品处理后对大鼠肝脏组织中MDA水平的影响(安全测试组)

5)组织病理学发现的差异

作为确认结果，正常组的肝脏组织显示中央静脉、门三角、肝细胞板和东方毛细管的所有组织均保持良好并且肝细胞还有正常组织(见图6(a)和6(b))。甚至在仅施用了高剂量丸剂的安全测试组中，肝脏组织也保持和正常组织一样(见图7(a)和7(b))。

如上所示，本发明实施例1中制备的丸剂的安全测试结果显示，虽然以高剂量施用本发明的丸剂，但是确认所有项目例如重量、肝脏重量、血液ALT和AST、MDA和组织病理学发现与正常组相似并且本发明的丸剂具有不会导致肝细胞损伤的优良安全性。

实验示例2

抗氧化效应、免疫增强效应和免疫相关疾病治疗效应的分析

通过可以了解抗氧化效应的方法，使用2,2-二苯基-1-苦肼基(DPPH)，一种化学稳定的自由基进行自由基清除活性的实验。因此，DPPH在大约515nm-520nm具有最大吸光度。如果这种自由基遇到电子，则自由基(DPPH)在赠电子的同时被消除并且颜色改变。化学稳定的DPPH可分析含有几种抗氧化成分的提取物、饮料和油、纯苯酚化合物等的抗氧化效应。

另一方面，活性氮的自由基，一氧化氮(NO)与活性氧一起导致氧化应激。硝酸钠在520nm下具有最大吸光度。如果这种自由基遇到具有抗氧化活性的物质，则自由基(DPPH)在赠电子的同时被清除并且颜色改变。

相应地，在本实验中，为了测量实施例1中制备的丸剂的抗氧化功效，使用DPPH和硝酸钠测定自由基清除活性。

在本实验中，评估巨噬细胞的浸润作用以测定样品的免疫增强功效。脂多糖(LPS)诱导一氧化氮生成，然后用根据本发明所述的丸剂样品处理，从而评估抑制一氧化氮生成的功效。因此，评估了抑制过敏反应的功效。

此外，用根据本发明所述的丸剂样品处理为主要由变态反应产生的免疫细胞的肥大细胞以评估抑制组胺分泌的功效。通过这样做，测量了抑制变态反应的功效。为了分析在变态反应下与哮喘相关的效应，用LPS刺激支气管上皮细胞。然后测量分泌的炎性细胞因子的量，从而评估样品抑制支气管哮喘的抑制作用。

方法和材料

1)实验材料的准备

精确量取200g实施例1中制备的丸剂，向其中加2L蒸馏水以用热水萃取。然后使用减压浓缩器浓缩萃取物并且冻干以获得产量为46.08％的精细粉末。将这种粉末在后续实验中用作样品。

2)抗氧化功能性的评估

2-1)DPPH自由基清除活性

按0.8、4、20、100和200mg/ml的浓度制备冻干样品以制成试验溶液。向每个孔添加40μl的EtOH，然后添加2.5mM DPPH。使混合物反应30min。通过测量515nm下的吸光度计算这种反应溶液的自由基清除活性(％)。

2-2)NO分析

按0.8、4、20、100和200mg/ml的浓度制备冻干样品以制成试验溶液。将试验溶液(1ml)分别分配于15ml管中。向每支管分别添加2ml的1mM硝酸钠溶液。向每支管添加7ml pH1.2的盐酸溶液、pH 3.0的柠檬酸缓冲溶液和pH 6.0的柠檬酸缓冲溶液并且在37℃下反应1h。向1ml这种反应溶液添加2％醋酸溶液和格里斯试剂(Griess reagent)。使混合物再反应15min。通过测量520nm下的吸光度计算亚硝酸清除活性(％)。

3)样品在巨噬细胞中的细胞毒性测定

用样品处理RAW 264.7细胞(小鼠巨噬细胞)以确认样品对免疫细胞的细胞毒性。

从韩国细胞系库(Korean Cell Line Bank)购买细胞，在37℃和CO₂气氛下于DMEM(杜尔贝科改良伊格尔培养基)中传代培养3次。然后将1x10⁴个细胞/孔分配于96孔板中，培育24h。按15.6、31.3、62.5、125和250μg/ml的浓度用样品处理(根据上下文和生化实验内容，此处及下文相关内容应该是用样品或试剂处理细胞，而不是处理样品，所以个人觉得原文表达有误)。24h后，使用MTT测定法评估细胞毒性。

根据MTT测定法，从Sigma购买3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基溴化四唑试剂并且用作MTT试剂。用浓度为0.5mg/ml的MTT试剂处理每个细胞。进一步培育4h后，将所得晶体溶于二甲亚砜(Sigma)中并测量595nm下的吸光度。将细胞存活率转化为与正常组相比的百分比(％)并以图表示出。

4)巨噬细胞中的吞噬作用测定

将每孔0.5x10⁴个RAW 264.7细胞(小鼠巨噬细胞)分配于96孔板中并且培育24h。然后用1μg/ml LPS和与荧光珠粒连接的IgP处理每个孔。按10、50、100和200μg/ml的浓度用样品处理。24h后，去除每个孔的培养基并用40μg/ml的台盼蓝(Trypan Blue)溶液洗涤。在485nm激发荧光波长和535nm发射荧光波长下测量洗涤板中的吞噬作用。将吞噬作用转化为与正常组相比的百分比(％)。结果用图表示出。

5)对巨噬细胞亚硝酸根分泌的影响

将每孔1x10⁴个RAW 264.7细胞(小鼠巨噬细胞)分配于96孔板中并且培育24h。然后用1μg/ml LPS处理每个孔。按0、10、50、100和200μg/ml的浓度用样品处理。4h后，取100μl每个孔的培养基，向其中添加格里斯试剂并且再反应15min。然后测量540nm下的吸光度并且计算亚硝酸根清除活性(％)。

6)样品对组胺分泌的影响

为了确认样品对组胺分泌的影响，使用HMC细胞，一种人肥大细胞，测量组胺分泌水平。

分别将1x10⁵个HMC细胞分配于24孔板中，然后稳定化3h。样品按每个孔0.8、4、20、100和200mg/ml的浓度处理并且培育。30min后，用1mg/ml的化合物48/80处理。15min后，收获每个孔中的培养基。向100μl培养基，添加50μl的1M NaOH，然后添加100μl的1mg/ml邻苯二甲醛。4min后，测量360/40激发荧光和460/40发射荧光，然后与标准溶液比较。

7)样品在支气管上皮细胞中的细胞毒性测定

使用A549细胞作为人支气管上皮细胞确认了样品对支气管上皮细胞的细胞毒性。

从韩国细胞系库购买细胞，在37℃和CO₂气氛下于DMEM(杜尔贝科改良伊格尔培养基)中传代培养3次。然后将1x10⁴个细胞/孔分配于96孔板中并且培育24h。按10、50、100和200μg/ml浓度用样品处理。24h后，使用MTT测定法评估细胞毒性。

根据MTT测定法，从Sigma购买3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基溴化四唑试剂并且用作MTT试剂。每个细胞用浓度为0.5mg/ml的MTT试剂处理。进一步培育4h后，将所得晶体溶于二甲亚砜(Sigma)中并测量595nm下的吸光度。将细胞存活率转化为与正常组相比的百分比(％)并以图表示出。

8)样品在支气管上皮细胞中对炎症相关细胞因子分泌的影响

为了确认对炎症相关细胞因子分泌的影响，将A549细胞用作人支气管上皮细胞。将每孔1x10⁵个细胞分配于24孔板中并且培育24h。按50和200μg/ml浓度用样品处理。使用LPS诱导炎症反应。

培育24h后，取培养基并且使用RayBio人细胞因子抗体测定试剂盒测量细胞因子分泌水平。将培养基添加到使用封闭缓冲液封闭2h的膜中，然后使其反应2h。随后，用缓冲液1和2洗涤5次5min，然后和与1ml生物素合并的一次抗体反应3h。再进行洗涤5次5min后，添加与HRP合并的链霉亲和素稀释液并使其反应2h。2h后，洗涤膜，然后与ECL缓冲液反应以使用化学发光成像装置量化。

9)统计分析

实验结果表示为平均值±SEM。使用单向ANOVA进行统计分析。当置信区间(P值)不大于0.05时，判断为有显著性。

结论

1)DPPH自由基清除活性

根据添加的DPPH浓度将每个样品制备成试验溶液。测量自由基清除活性。因此，正如图8中可确认，显示在0.8mg/ml、4mg/ml、20mg/ml、100mg/ml和200mg/ml的浓度下，自由基清除活性分别为6.7±2.0％、17.9±1.6％、49.9±8.7％、76.1±6.9％和92.3±11.0％。可以确认，随着样品浓度增加，DPPH自由基清除活性增加。

2)NO分析

为了确认样品抑制亚硝酸根生成的效果，使用浓度为0.8、4、20、100和200mg/ml的样品测量在pH 1.2盐酸溶液、pH 3.0的柠檬酸缓冲液和pH 6.0的柠檬酸缓冲液中的亚硝酸根清除活性。

正如图9中可确认，在pH 1.2的盐酸溶液中抑制NO生成的活性分别为4.0±0.7％、14.1±2.2％、40.6±1.0％、97.9±0.2％和99.2±0.2％。在pH 3.0的柠檬酸缓冲液中抑制NO生成的活性分别为5.8±0.7％、11.6±0.2％、16.5±0.7％、44.1±0.7％和64.7±0.7％。在pH 6.0的柠檬酸缓冲液中抑制NO生成的活性分别为8.5±2.4％、4.9±3.0％、6.1±2.7％、7.4±3.6％和10.8±3.1％。此外，可以确认，在pH 1.2和pH 3.0气氛下抑制NO生成的活性根据施用剂量而增加并且样品100mg/ml和200mg/ml处理组在pH 1.2气氛下大体上抑制大部分NO生成。

3)样品在巨噬细胞中的细胞毒性测定

与小鼠巨噬细胞一样，用样品处理RAW 264.7细胞，以确认样品对免疫细胞的细胞毒性。

正如图10中可见，未处理组(IMO)表现出100±2.5％的细胞存活率。施用了15.6μg/ml、31.3μg/ml、62.5μg/ml、125μg/ml和250μg/ml样品的组分别表现出95.9±3.0％、95.6±2.5％、94.0±2.2％、101.4±3.7％和94.8±1.5％的细胞毒性。作为实验的结果，不能确认在整个施用间隔期有统计上显著的细胞毒性。

4)巨噬细胞中的吞噬作用测定

用与荧光珠粒连接的IgP处理RAW 264.7细胞(小鼠巨噬细胞)。根据测量样品对巨噬细胞活性的影响的浓度用样品处理。

正如从图11和12可见，LPS处理组(对照)表现出100.0±1.9％的吞噬作用。未处理组(空白)表现出93.3±1.1％的吞噬作用。施用了10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml样品的组分别表现出102.7±0.7％、102.7±7.3％、110.5±3.7％和103.8±1.8％的吞噬作用。

已经证实经样品处理，巨噬细胞的吞噬作用增加了一点。施用了100μg/ml样品的组(IM100)表现出统计上显著的吞噬作用(*p＜0.05)。

5)对巨噬细胞的亚硝酸根分泌的影响

用LPS处理RAW 264.7细胞(小鼠巨噬细胞)。根据测量样品对NO生成的影响的浓度用样品处理。

正如从图13可见，未处理组(空白)生成1.2±0.0μg/ml的NO。用LPS刺激后，施用了0μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml样品的组分别生成14.6±0.4μg/ml、15.6±0.4μg/ml、14.8±0.2μg/ml、14.8±0.2μg/ml和13.0±0.4μg/ml的NO。作为实验的结果，施用了200μg/ml样品的组表现出统计上显著的抑制NO生成的活性(*p＜0.05)。

6)对组胺分泌的影响

为了确认样品对组胺分泌的影响，使用HMC细胞作为人肥大细胞测量组胺分泌水平。

正如从图14可见，经化合物48/80刺激的实验组(对照)表现出100±3.8％的组胺分泌水平。未处理组(空白)表现出25.7±0.4％的组胺分泌水平。施用了50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml样品的组分别表现出90.9±8.0％、72.4±6.9％和72.2±8.3％的组胺分泌水平。作为实验的结果，施用了100μg/ml和200μg/ml样品的组表现出组胺分泌水平在统计上显著降低(*p＜0.05)。

7)样品在支气管上皮细胞中的细胞毒性测定

用样品处理A549细胞，即人支气管上皮细胞。确认样品对支气管上皮细胞的细胞毒性。

正如从图15可见，未处理组(IMO)表现出100.0±12.7％的细胞存活率。施用了10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml样品的组分别表现出96.4±6.7μg/ml、96.4±0.8μg/ml、96.7±5.5％和96.6±1.9％的细胞存活率。作为实验的结果，可以确认在整个施用间隔期有统计上显著的细胞毒性。

8)样品在支气管上皮细胞中对炎症相关细胞因子分泌的影响

为了确认样品对炎症相关细胞因子分泌的影响，在使用LPS刺激的A549细胞中引入浓度为50μg/ml和200μg/ml的样品。然后使用RayBio人细胞因子抗体测定试剂盒测量细胞因子分泌水平。

因此，如图16所示，施用了200μg/ml样品的组(D)表现出对IL-1α、IL-2、IL-10和TNF-β分泌的抑制。

虽然已经参考具体实施例公开了本发明，但是本领域的技术人员将认识到，在不背离所附权利要求中公开的本发明范围和精神的前提下，各种修改、增加和替代是可能的。

Claims (6)

1.一种用于预防或治疗免疫或氧化应激相关疾病、或降低砷化合物毒性的组合物，由丁香15至25重量份、蝎子200至270重量份、朱砂20至30重量份、牛黄25至35重量份、僵蚕50至65重量份、关白附子38至48重量份、枯矾50至65重量份、紫河车200至270重量份、冰片0.5至6重量份和砷化合物1至7重量份制成。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述免疫相关疾病选自免疫介导的炎性疾病、非免疫介导的炎性疾病、传染病、免疫缺陷疾病和瘤形成组成的组。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述免疫相关疾病为获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、肝炎、肝硬化、癌症、哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、食物过敏或荨麻疹。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述氧化应激相关疾病为脂质代谢疾病、血管硬化、心力衰竭、高血压性心力衰竭、心律不齐、心肌梗塞、心绞痛、老化、免疫性疾病或癌症。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述砷化合物选自三氧化二砷(As₂O₃)、六氧化四砷(As₄O₆)、三溴化砷(AsBr₃)、三氯化砷(AsCl₃)、三碘化砷(AsI₃)和美拉胂醇(melarsoprol)组成的组。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物由3-5重量份的砷化合物、17-22重量份的丁香、220-250重量份的蝎子、22-27重量份的朱砂、27-31重量份的牛黄、55-62重量份的僵蚕、41-46重量份的关白附子、55-62重量份的枯矾、220-250重量份的紫河车和2-4重量份的冰片制成。