BR102016023358A2

BR102016023358A2 - Agentes antitumorais a base de chalconas para terapêutica do câncer de mama

Info

Publication number: BR102016023358A2
Application number: BR102016023358-5A
Authority: BR
Inventors: Veiras Collares Tiago; Kömmling Seixas Fabiana; Mastelari Martins Rosiane; Rech Begnini Karine; Martin Pereira De Pereira Claudio; Ritter Marina; Carapina Da Silva Caroline; Bilhalva Fogaca Tatiane
Original assignee: Universidade Federal De Pelotas
Priority date: 2016-10-06
Filing date: 2016-10-06
Publication date: 2018-05-02

Abstract

agentes antitumorais a base de chalconas para terapêutica do câncer de mama . campo da invenção e setor técnico: biotecnologia aplicada à saúde (a61p 35/00) agentes antitumorais a base de chalconas para terapêutica do câncer de mama, correspondendo a agentes antitumorais de uso humano e veterinário para terapêutica do câncer de mama contendo 3-(4-bromofenil)-1-(tiofen-2-il)-prop-2-en-1-ona ou 3-fenil-1-(tiofen-2-il)-prop-2-en-1-ona ou 3-(2-nitrofenil)-1-(tiofen-2-il)-prop-2-en-1-ona ou 3-(4-metoxifenil)-1-(tiofen-2-il)-prop-2-en-1-ona ou possíveis combinações entre elas.

Description

(54) Título: AGENTES ANTITUMORAIS A BASE DE CHALCONAS PARA TERAPÊUTICA DO CÂNCER DE MAMA (51) Int. Cl.: C07D 333/16; A61K 31/381; A61P 35/00 (73) Titular(es): UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS (72) Inventor(es): TIAGO VEIRAS COLLARES; FABIANA KÕMMLING SEIXAS; ROSIANE MASTELARI MARTINS; KARINE RECH BEGNINI; CLÁUDIO MARTIN PEREIRA DE PEREIRA; MARINA RITTER; CAROLINE CARAPINA DA SILVA; TATIANE BILHALVA FOGAÇA (57) Resumo: AGENTES ANTITUMORAIS A BASE DE CHALCONAS PARA TERAPÊUTICA DO CÂNCER DE MAMA . CAMPO DA INVENÇÃO E SETOR TÉCNICO: Biotecnologia aplicada à saúde (A61P 35/00) AGENTES ANTITUMORAIS A BASE DE CHALCONAS PARA TERAPÊUTICA DO CÂNCER DE MAMA, correspondendo a agentes antitumorais de uso humano e veterinário para terapêutica do câncer de mama contendo 3-(4-bromofenil)-l-(tiofen-2il)-prop-2-en-l-ona ou 3-fenil-l-(tiofen-2-il)-prop2-en-l-ona ou 3-(2-nitrofenil)-l-(tiofen-2-il)-prop2-en-l-ona ou 3-(4-metoxifenil)-l-(tiofen-2-il)prop-2-en-l-ona ou possíveis combinações entre elas.

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AGENTES ANTITUMORAIS A BASE DE CHALCONAS PARA TERAPÊUTICA DO CÂNCER DE MAMA

RELATÓRIO DESCRITIVO

Campo da Invenção [0001] A presente Invenção refere-se ao uso de uma classe de chalconas substituídas, bem como possíveis combinações entre elas, como agentes antitumorais para terapêutica do câncer de mama de pacientes humanos e veterinários; pertencendo ao setor da saúde, nas áreas médicas e veterinárias de interesse. A eficácia, ín vítro, dessas moléculas para o tratamento do câncer de mama é demonstrada na presente invenção.

Estado da Técnica [0002] 0 câncer é uma doença na qual células anormais se multiplicam sem controle e podem invadir os tecidos próximos. As células cancerígenas também podem disseminar-se até outras partes do corpo através da corrente sanguínea e o sistema linfático. 0 câncer de mama é a proliferação acelerada e não controlada de células pertencentes a distintos tecidos de uma glândula mamária.

[0003] No atual estado da arte ou técnica, o tratamento do câncer compreende cinco métodos ou modalidades principais: 1Remoção física do tumor ou células ou tecidos tumorais, através de técnicas cirúrgicas;

2-Destruição do tumor processo cancerígeno através da utilização de substâncias biológica ou e

ou medicamentos (quimioterapia); 3-Terapia imunoterapia; 4-Destruição do tumor ou células tumorais por meio de utilização de ondas de energia, calor e/ou radiação (radioterapia, fototerapia, crioterapia, eletroterapia); 5Transplantes de populações celulares (transplante de células da medula óssea e células tronco). Todas estas modalidades ou tipos

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2/11 de tratamentos no atual estado da técnica, podem ser utilizados isoladamente ou de forma combinada ou associada.

[0004] A efetividade destes tratamentos é frequentemente limitada, visto que as células de câncer que foram disseminadas desde o local do tumor original, evadem a cirurgia e a radiação. Por outro lado, a quimioterapia, que consiste na administração de medicamentos citostáticos ou citotóxicos, tem a grande limitação de sua escassa especificidade. 0 mecanismo de ação destes medicamentos consiste em provocar uma alteração celular na síntese de ácidos nucléicos, divisão celular ou síntese de proteínas. Devido à sua falta de especificidade, afetam outras células e tecidos normais do organismo, sendo que os efeitos secundários estão relacionados com estas células e tecidos afetados. Os efeitos secundários dependem do agente quimioterápico, sendo os mais importantes: náuseas, vômitos, diarréia, prisão de ventre, anemia, imunossupressão, hemorragia, cardiotoxicidade, hepatotoxicidade, nefrotoxicidade, entre outros. Um tratamento específico direcionado somente para tais células, evitaria o dano aos tecidos sadios.

[0005] 0 câncer de mama triplo negativo (CMTN) é um subgrupo de tumores que não expressa níveis significativos de receptores de estrogênio (ER) , de progesterona (PR) e de fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER-2). Este tipo de câncer é responsável por aproximadamente 15 - 20% dos casos de câncer de mama e é frequentemente um tumor agressivo quando comparado a outros cânceres de mama, uma vez que tende a crescer mais rapidamente com alta taxa de metástase e recidivas. Em geral, CMTN está associado a um pior prognóstico e parte da razão para isso está associada à falta de tratamentos específicos para esse tipo de câncer. Por essa razão, no campo da prevenção ou tratamento preventivo dos diferentes tipos de cânceres de mama, ainda existe grande necessidade de inovações.

[0006] Chalconas são cetonas a_rβ-insaturadas com um anel aromático ligado a carbonila e outro ligado a insaturação. Estas moléculas são encontradas em produtos naturais ou obtidas por

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3/11 processos sintéticos. 0 método clássico para a síntese de chalconas é a reação de Claisen-Schmitd, que ocorre pela condensação entre uma cetona e um aldeído aromático na presença de catalisador. Chalconas são moléculas extremamente versáteis devido à possibilidade de variação nas estruturas dos anéis aromáticos, que podem conter ou não heteroátomos em sua estrutura, bem como diferentes substituintes.

[0007] da arte.

potencial terapêutico de chalconas é conhecido patentária mostra alguns

A busca na literatura documentos relevantes, porém nenhum deles antecipa ou sugere qualquer dos objetivos da presente invenção. 0 documento PI 0610211-5 A2 descreve o uso de chalconas para o tratamento de distúrbios virais, enquanto que o documento PI 0204079-4 A2 descreve a síntese e uso de chalconas para tratamento de doenças parasitárias.

[0008] A patente W02015166040 (A2) refere-se à aplicação de uma classe de chalconas para a prevenção e / ou tratamento de câncer de pulmão, cólon, pâncreas, fígado e / ou rins. 0 documento EP0288794A2 descreve o controle do crescimento de de chalconas US7112698B2,

As patentes US7598294B2, aplicação de câncer. No tecidos tumorais por derivados NZ311995(A), HU225501(BI) ,

BR1020160184118, US7326734B2 também descrevem a diferentes chalconas em diferentes células de entanto, as estruturas moleculares das chalconas em questão diferem das reivindicadas na presente invenção.

[0009] Como pode ser visto, há patentes que protegem o uso de diferentes chalconas em diferentes setores, no entanto, todas as estruturas moleculares reivindicadas diferem das referidas na presente invenção e, até o momento não é reportado a aplicação das chalconas da presente invenção como agentes antitumorais para tratamento do câncer de mama.

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Sumário da Invenção [0010] A novidade da presente invenção refere-se a composições que contêm chalconas da Fórmula geral I e a processos para utilizações de tais chalconas como agentes antitumorais para terapêutica do câncer de mama. Inclusive estereoisômeros isolados, mistura de estereoisômeros e sais farmacêuticamente aceitáveis dos mesmos.

O

3a-d

Fórmula geral I

Em que R¹ representa:

R¹ = H <3a)

4-ΒΓ (3b)

2-N O₂ <3c>

4-OCH_s(3d)

Descrição Detalhada da Invenção

Procedimento para síntese das chalconas [0011] Em um balão volumétrico adicionou-se 0,01 mol de

2-acetiltiofeno, 0,01 mol de diferentes benzaldeídos substituídos e 50 mL de etanol. Adicionou-se posteriormente lentamente 10 mL solução de hidróxido de potássio (KOH) 5%. Manteve-se a reação sob agitação à temperatura ambiente por 6 horas, e, após, neutralizada com ácido clorídrico. 0 precipitado sólido é filtrado, lavado com água, seco e recristalizado com etanol. A Tabela 1 demonstra a nomenclatura das diferentes chalconas sintetizadas.

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5/11 [0012] As moléculas dessa invenção contêm duplas ligações entre carbonos, dessa forma um isomerismo geométrico é possível. Moléculas cis e trans estão incluídas nessa invenção.

Tabela 1: Nomenclatura das chalconas estudadas na presente invenção

Chalcona Nomenclatura

3a 3-fenil-1-(tiofen-2-il)-prop-2-en-1-ona

3b 3-(4-bromofenil)-1-(tiofen-2-il)-prop-2-en-1-ona

3c 3-(2-nitrofenil)-1-(tiofen-2-il)-prop-2-en-1-ona

3d 3-(4-metoxifenil)-1-(tiofen-2-il)-prop-2-en-1-ona

Detecção da atividade antitumoral das chalconas sintetizadas [0013] As chalconas sintetizadas são úteis como agentes antitumorais para terapêutica do câncer de mama. A base para essa invenção encontra-se nos resultados obtidos em testes de citotoxicidade - FiguraS 2 e 3.

[0014] Para tal propósito, as moléculas são diluídas em

DMSO (Dimetilsulfóxido) . Para o teste de citotoxidade, foram utilizadas células câncer de mama humano hormônio responsivas (MCF-7) e triplo negativa (MDAMB-231) obtidas do Banco de Células do Rio e Janeiro, RJ, Brasil. A suspensão de células é plaqueada em uma concentração de 2 x 10⁴ células por poço e distribuídas em uma placa de cultura celular de 96 poços com 100 pL de meio DMEM em cada cavidade. A placa então é incubada a 37°C, em ambiente de 5% CO2, por 24 h. Após, as células são submetidas ao tratamento com as diferentes moléculas nas diferentes concentrações, que variaram de 5 a 80pM. Nos poços controles, 100 pL de DMEM são adicionados.

[0015] Após os períodos de incubação de 24, 48 e 72 horas, os meios devem ser removidos e a análise de citotoxicidade deve ser feita através da técnica colorimétrica utilizando MTT (Sigma), conforme instruções do fabricante. As absorbâncias de cada poço devem ser lidas preferencialmente em leitor de microplacas a um comprimento de onda de 492 nm. A

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6/11 porcentagem de inibição da proliferação celular deverá ser determinada através da seguinte fórmula: inibição do crescimento = (1 - Absorbância das células tratadas / Absorbância das células controle) x 100%. Todas as observações precisam ser validadas por pelo menos três experimentos independentes.

[0016] A citotoxicidade das moléculas é confirmada por ensaios fluorimétricos. O ensaio LIVE/DEAD (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) consiste em um kit comercial que utiliza corantes fluorescentes capazes de diferenciar células vivas e mortas. As células são tratadas com 20 μΜ das diferentes chalconas e a citotoxicidade é exposição aos tratamentos. As avaliada após 24 horas imagens são obtidas de por de microscopia de fluorescência. Células vivas são capazes internalizar a calceína e podem ser visualizadas por emissão de luz fluorescente verde (488 nm) enquanto células mortas podem ser visualizadas pelo sinal fluorescente vermelho (546 nm), uma vez que o homodímero de brometo de etídio difunde-se através da membrana permeável de células mortas e liga-se ao DNA.

[0017] O efeito apoptótico das moléculas sintetizadas é investigado através do ensaio de coloração por DAPI. O corante DAPI possui baixa permeabilidade em células viáveis e alta permeabilidade em células apoptóticas, resultando em alta fluorescência e possibilitando a visualização das alterações nucleares. As células de câncer de mama são tratadas com 20 μΜ das diferentes chalconas e as taxas de apoptose avaliadas após 24 horas de exposição aos tratamentos. Controle não tratado e controle tratado com doxorrubicina são incluídos. As imagens são obtidas por microscopia de fluorescência e analisadas no software Cell-F (Cell-F, Nova Iorque, EUA).

[0018] Para avaliar o efeito das chalconas em combinação com fármacos comerciais as células são tratadas com 0,5; 1 e 2μΜ de doxorrubicina (DOX), com 10; 20 e 40μΜ das diferentes chalconas e com combinações dessas concentrações de tratamento. A citotoxicidade é avaliada após 24 horas de exposição aos tratamentos. Como controle negativo são utilizados poços com

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7/11 células sem tratamento. A porcentagem de inibição do crescimento é determinada através do ensaio colorimétrico de reduação do MTT. O efeito das combinações de tratamentos é avaliado através do índice de combinação (Cl) . O CI é amplamente utilizado para quantificar o sinergismo entre drogas com base na equação: Cl = (D1) / (DX1) + (D2) / (DX2), onde D1 e D2 são as concentrações utilizadas de DOX e da chalcona em combinação e DX1 e DX2 são as concentrações dessas moléculas que quando utilizadas isoladamente apresentam o mesmo efeito obtido na combinação dos tratamentos. Dessa forma, CI<0,9 indica sinergismo, CI=0,9-1,10 indica efeito aditivo, e CI>1,10 indica antagonismo.

Breve descrição dos desenhos [0019] A Figura 1 demonstra o processo de síntese das chalconas da presente invenção.

[0020] A Figura 2 mostra os resultados doses/resposta de inibição da viabilidade celular das linhagens de células de câncer de mama mediante a utilização das diferentes chalconas em diferentes concentrações e tempos medidos pelo ensaio de MTT. As Figuras 2A, 2B, 2C e 2D mostram respectivamente os resultados dose/resposta das chalconas 3a, 3b, 3c e 3d sobre a linhagem

MCF-7. As Figuras 2E, 2F, 2G e 2H mostram respectivamente os resultados dose/resposta das chalconas 3a, 3b, 3c e 3d sobre a linhagem MDA-MB-231. Os dados são expressos como média ± EPM. Diferentes letras indicam diferença significativa entre os diferentes tratamentos. Valores de p<0,05 foram considerados significativos.

[0021] A Figura 3 mostra o efeito das chalconas 3b e 3c sobre a morte celular e inibição do crescimento celular das linhagens MCF-7 e MDA-MB-231 medido pelos ensaios fluorimétricos LEAD/DEAD e DAPI. As Figuras 3A e 3B mostram o efeito apoptótico células MCF-7 e MDA-MB-231, das chalconas respectivamente, sobre as medido pela coloração DAPI. Os dados são expressos como média ± EPM. Diferentes letras indicam diferença

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8/11 significativa entre os diferentes tratamentos. Valores de p<0,05 foram considerados significativos.

[0022] A Figura 4 mostra o efeito inibidor da proliferação celular sobre a linhagem celular de câncer de mama (MCF-7) medido pelo ensaio MTT, utilizando combinações das diferentes chalconas com doxorrubicina. As figuras 4A,4B, 4C e 4D mostram a inibição do crescimento (%) das células MCF-7 tratadas com DOX e com as chalconas 3a (A) , 3b (B) , 3c (C) , 3d (D) isoladamente e em combinação após 24h de exposição aos tratamentos. Os dados são expressos como Média ± EPM. Diferentes letras indicam diferenças significativas entre os grupos de tratamento. P <0,05 foram considerados significativos.

Aplicação como agentes antitumorais [0023] Os testes de validação desta invenção mostram que as chalconas sintetizadas possuem capacidade antitumoral frente a duas linhagens de câncer de mama humano (MCF-7 e MDA-MB-231). Conforme demonstrado na Fig. 2, a inibição do crescimento celular é dose e tempo dependente para todas as moléculas testados. As imagens obtidas pelo ensaio LIVE/DEAD, demostradas na Fig. 3 demonstram um aumento de células mortas (fluorescência vermelha) após o tratamento com as diferentes chalconas quando comparado ao controle não tratado. Além disso, uma redução no número total de células pode claramente ser observado após os tratamentos. A coloração por DAPI demonstrou que as chalconas 3b e 3c são capazes de induzir a apoptose em células MCF-7 e MDAMB-231 em comparação ao controle não tratado.

[0024] Os ensaios também mostram que as chalonas sintetizadas podem ser utilizadas em combinação com fármacos comerciais (Fig. 4) . DOX na concentração de 2gM foi capaz de inibir 32,23% do crescimento das celulas; por outro lado, em combinação com potencializado respectivamente 67,75;

40gM das chalconas 3a-d, esse efeito foi e as inibições do crescimento foram de 64,65; 84,20 e 44,86%. O efeito das combinações de tratamentos avaliado pelos valores dos índices de combinação demostraram que as chalconas 3b e 3d exibiram efeito

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9/11 sinérgico (Cl <0,9) nas combinações de 10 e 20μΜ das chalconas com 0,5 e ΙμΜ de DOX; enquanto um efeito sinérgico foi observado na combinação de 40 μΜ da chalcona 3c com 2μΜ de DOX.

[0025] O modelo terapêutico utilizando as diferentes chalconas dessa invenção possui potencial para uma futura aplicação clinica em tratamento de câncer de mama.

Exemplos [0026] Em uma modalidade, as moléculas da invenção são administradas em uma quantidade terapeuticamente eficaz, por exemplo uma dosagem suficiente para fornecer tratamento para os estados de doença descritos anteriormente. A administração das moléculas da invenção ou dos sais farmaceuticamente aceitáveis das mesmas pode ser por qualquer um dos modos de administração aceitos para agentes que servem para utilidades similares. Os tipos de composições farmacêuticas que podem ser utilizados incluem: tabletes ou comprimidos, tabletes mastigáveis, cápsulas (incluindo micro-cápsulas), pós, pós para reconstituição, soluções, soluções parenterais, soluções para aerossóis, unguentos (cremes e géis), supositórios, suspensões, e outros tipos, a partir da especificação e conhecimento geral na técnica. Os compostos utilizados na presente invenção podem ser levados a formas adequadas para administração por meio de processos comuns, utilizando substâncias auxiliares tais como ingredientes líquidos ou sólidos, em pó, tais como os recheios líquidos ou sólidos farmaceuticamente usuais e extensores, solventes, emulsificantes, lubrificantes, flavorizantes, corantes e/ou substâncias tampão (buffers).

[0027] A título exemplificativo e não limitativo, são dadas a seguir possíveis formulações farmacêuticas, que compreendem a composição da invenção.

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Exemplo 1 - Preparação de uma formulação parenteral [0028] Uma formulação parenteral é preparada em dose unitária tendo a seguinte composição:

Componentes	Quantidade
3-(2-nitrofenil)-1-(tiofen-2-il)-prop-2-en-1-ona	1, 0g
Polyoxyethylene Sorbitan Monooleate	2,0g
Sodium Chloride	0,128g
Água para injetáveis qsp	2 0,0mL

Exemplo 2 - Preparação de uma formulação oral [0029] Formulação de 3 doses diárias

Componentes	Quantidade (mg)
3-(4-bromofenil)-1-(tiofen-2-il)-prop-2-en-1-ona	1,5
Lactose	148,5
Celulose Microcristalina	75
Croscarmelose Sódica	10
PVP K30	10
Talco	15
Estearato de Magnésio	5

Exemplo 3 - Associação com outros modelos terapêuticos [0030] Em geral, os agentes antitumorais comercialmente disponíveis são utilizados em associação com outros modelos terapêuticos na prática clínica do tratamento do câncer de mama. [0031] As chalconas da presente invenção podem ser utilizadas sozinhas, combinadas entre elas, ou em associação com outros modelos terapêuticos atualmente disponíveis.

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11/11 [0032] Uma chalcona da fórmula geral I, pode ser administrada juntamente à excisão cirúrgica do tumor ou associada à radioterapia ou imunoterapia.

[0033] Uma ou mais chalconas da Fórmula geral I também podem ser administradas em combinação com um ou mais fármacos antitumorais atualmente disponíveis como: doxorrubicina cisplatina, gencitabina, taxanos, paclitaxel, docetaxel, metotrexato, ciclofosfamida, 5-fluorouracil e ifosfamida.

[0034] Quando em associação com outros modelos terapêuticos, o efeito citotóxico das chalconas pode ser potencializado devido a um possível efeito sinérgico ou aditivo. Dessa forma, a dose de administração das chalconas em combinação com outros modelos terapêuticos deve ser menor, ou em intervalos de administrações maiores, quando comparada à administração das chalconas administradas isoladamente.

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AGENTES ANTITUMORAIS A BASE DE CHALCONAS PARA TERAPÊUTICA DO CÂNCER DE MAMA

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. AGENTES ANTITUMORAIS A BASE DE CHALCONAS PARA TERAPÊUTICA DO

CÂNCER DE MAMA, caracterizado por possuírem em sua composição: 3-(4-bromofenil)-1-(tiofen-2-il)-prop-2-en-1ona ou 3-fenil-1-(tiofen-2-il)-prop-2-en-1-ona ou 3-(2nitrofenil)-1-(tiofen-2-il)-prop-2-en-1-ona ou 3-(4metoxifenil)-1-(tiofen-2-il)-prop-2-en-1-ona ou possíveis combinações entre elas; incluindo estereoisômeros isolados, mistura de estereoisômeros e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos;
2. AGENTES ANTITUMORAIS A BASE DE CHALCONAS PARA TERAPÊUTICA DO CÂNCER DE MAMA, como reivindicado em 1, caracterizado por serem administrados isolados ou em mistura com qualquer veículo farmacêutico selecionado em função da via de administração oral e parenteral em concentrações que variam de 0,1% a 50% da formulação.
3. AGENTES ANTITUMORAIS A BASE DE CHALCONAS PARA TERAPÊUTICA DO CÂNCER DE MAMA, como reivindicado em 1 e 2, caracterizado por serem administrados isoladamente, combinados entre eles, ou em associação com outros modelos terapêuticos atualmente disponíveis, como técnicas cirúrgicas, radioterapia e imunoterapia;
4. AGENTES ANTITUMORAIS A BASE DE CHALCONAS PARA TERAPÊUTICA DO

CÂNCER DE MAMA, como reivindicado em 1 e 2, caracterizado por serem administrados em combinação com um ou mais fármacos antitumorais atualmente disponíveis como: doxorrubicina, cisplatina, gencitabina, taxanos,

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2/2 paclitaxel, fluorouracil docetaxel, metotrexato, ciclofosfamida, 5e ifosfamida.

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DESENHOS