CZ309542B6 - Komplexy platiny a jejich použití pro léčbu mnohočetného myelomu - Google Patents

Komplexy platiny a jejich použití pro léčbu mnohočetného myelomu Download PDF

Info

Publication number
CZ309542B6
CZ309542B6 CZ2021-444A CZ2021444A CZ309542B6 CZ 309542 B6 CZ309542 B6 CZ 309542B6 CZ 2021444 A CZ2021444 A CZ 2021444A CZ 309542 B6 CZ309542 B6 CZ 309542B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
complex
cells
diiodo
phenyl
alkyl
Prior art date
Application number
CZ2021-444A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2021444A3 (cs
Inventor
Kateřina Smešný Trtková
Smešný Trtková Kateřina Ing., Ph.D.
Denisa Weiser Drozdková
Drozdková Denisa Mgr. Weiser
Katarína Ondrušková
Katarína Bc. Ondrušková
Ivan NEMEC
Nemec Ivan Ing., Ph.D.
Lukáš Masaryk
Lukáš Mgr. Masaryk
Pavel Ĺ tarha
Štarha Pavel doc. Mgr., Ph.D.
Original Assignee
Univerzita Palackého v Olomouci
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univerzita Palackého v Olomouci filed Critical Univerzita Palackého v Olomouci
Priority to CZ2021-444A priority Critical patent/CZ309542B6/cs
Priority to PCT/CZ2022/050095 priority patent/WO2023046221A1/en
Publication of CZ2021444A3 publication Critical patent/CZ2021444A3/cs
Publication of CZ309542B6 publication Critical patent/CZ309542B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F15/00—Compounds containing elements of Groups 8, 9, 10 or 18 of the Periodic Table
    • C07F15/0006—Compounds containing elements of Groups 8, 9, 10 or 18 of the Periodic Table compounds of the platinum group
    • C07F15/0086—Platinum compounds
    • C07F15/0093—Platinum compounds without a metal-carbon linkage
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/243—Platinum; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D233/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F13/00—Compounds containing elements of Groups 7 or 17 of the Periodic Table
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F15/00—Compounds containing elements of Groups 8, 9, 10 or 18 of the Periodic Table
    • C07F15/0006—Compounds containing elements of Groups 8, 9, 10 or 18 of the Periodic Table compounds of the platinum group
    • C07F15/0086—Platinum compounds

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Předkládané řešení poskytuje elektroneutrální cis-dijodo komplexy platiny v oxidačním stavu +II s deriváty 1H-imidazolu vzorce C, jejich přípravu, jejich použití k přípravě léčiv pro léčbu mnohočetného myelomu, v jehož buňkách po aplikaci vyvolávají apoptickou buněčnou smrt, a farmaceutická kompozice je obsahující.

Description

Vynález spadá do oblasti protinádorových léčiv na bázi platiny a týká se dijodoplatnatých komplexů obecného vzorce czs-fPthl^], kde L představuje V-donorový heterocyklický ligand na bázi l//-imidazolu, a jejich využití k přípravě léčiv pro léčbu mnohočetného myelomu.
Dosavadní stav techniky
Cisplatina (czs-diammin-dichloroplatnatý komplex; vzorec A) je již více než čtyřicet let používaným protinádorovým chemoterapeutikem na bázi platiny (Rosenberg et al., Nature 205 (1965) 698; Kelland, Nat. Rev. Cancer 7 (2007) 573). Její klinické použití je nicméně spojeno s četnými vedlejšími účinky (např. nefrotoxicita nebo myelosuprese), problémem je také rezistence některých typů nádorů vůči jejímu účinku, ať už se jedná o rezistenci přirozenou nebo získanou. Možnost vylepšení aktivity a celkového farmakologického profilu cisplatiny a jejích klinicky používaných derivátů (např. karboplatina (diammin-cyklobutan-l,l'-dikarboxylatoplatnatý komplex) nebo oxaliplatina (1 R,2R-diaminocyklohexan-oxalatoplatnatý komplex)) vedla k rozsáhlému vývoji mnoha typů sloučenin na bázi platiny (např. vysoce účinné multi-cílové Pt(IV) komplexy; Gibson, J. Inorg. Biochem. 217 (2021) 111353), sloučenin odvozených od jiných přechodných kovů (Anthony et al., Chern. Sci. 11 (2020) 12888) nebo hybridním formulacím pro cílený transport léčiv na bázi platiny (Wang a Guo, Chern. Soc. Rev. 42 (2013) 202).
Ve stavu techniky bylo navrženo několik dijodoplatnatých komplexů obecného vzorce czs-fPthl^] (vzorec B). Komplexy tohoto typu, kde L = např. 7-azaindol, 4-azaindol nebo jejich deriváty, vykazují výraznou antiproliferativní aktivitu (Starha et al., PLoS ONE 11 (2016) eO 165062; Starha et al., J. Biol. Inorg. Chem. 24 (2019) 257). Pro komplexy czs-[Ptl2L2] obsahující 7-azaindol nebo jeho deriváty bylo prokázáno, že oproti svým dichloro- nebo karboxylato-analogům působí na nádorové buňky odlišným mechanismem účinku, jak je popsáno v přehledovém článku Starha et al., Coord. Chem. Rev. 380 (2019) 103. Jiné doposud připravené dijodoplatnaté komplexy naopak antiproliferativní aktivitu nevykazovaly (např. Messori et al., Inorg. Chem. 51 (2012) 1717).
B
Dále byl, v rámci sloučenin obecného vzorce cis-[Ptl2L2] (vzorec B), kde L představuje heterocyklický V-donorový ligand monodentátně koordinovaný přes endocyklický atom dusíku, připraven komplex cis-[Ptl2(1 H-benzimidazol)2], jehož geometrie je autory předpokládána na základě provedeného syntetického postupu. Komplex cis-[PtL(1 H-benzimidazol)2] byl méně cytotoxický (IC50 = 41,8, >100 a >100 μM) než cisplatina (IC50 = 1,3, 3,5 a 15,8 μM) a karboplatina (IC50 = 14,8, 27,5 a >100 μM) vůči nádorovým buněčným liniím karcinomu děložního čípku (HeLa), prsu (MCF-7) a hrtanu (HEp-2) (Utku et al., J. Enzym. Inhib. Med. Chem. 25 (2010) 502); IC50 = poloviční maximální inhibiční koncentrace látky. Stejní autoři (Utku et al., Turkish J. Chem. 31 (2007) 503) připravili analogické komplexy obsahující 5(6)-chlor-2-hydroxymethyl-1 Hbenzimidazol a 2-hydroxymethyl-1 H-benzimidazol, jejichž geometrie však nebyla v publikaci specifikována.
Mnohočetný myelom, který patří mezi nevyléčitelná onemocnění, je označován také jako plazmocelulární myelom. Jedná se o nádorové onemocnění plazmatických buněk lokalizovaných v kostní dřeni, způsobujících osteolytické léze či osteoporózu a ve většině případů je spojeno s přítomností M-proteinu/paraproteinu v krevním séru. Zahájení léčby nastává, pokud pacient splňuje kritéria mnohočetného myelomu. V současné době jsou stanovena dvojí diagnostická kritéria mnohočetného myelomu. První kritéria jsou schválena světovou zdravotnickou organizací (WHO - World Health Organization). Druhá kritéria byla vydána International Myeloma Working Group (IMWG; Br. J. Haematol. 121 (2003) 749). V posledních letech došlo k pokroku v léčbě symptomatického mnohočetného myelomu, zejména s příchodem inhibitorů proteazomu bortezomib, karfilzomib a ixazomib (Wong et al., Cancers 12 (2020) 2203) a imunomodulačních látek (jako je lenalidomid). Léčba začíná chemoterapií a hlavními léčebnými látkami jsou bortezomib a dexamethason. Potlačení funkce proteazomu blokuje mechanismus ERAD (Endoplasmic reticulum-associated protein degradation), což vede k akumulaci nesprávně složených proteinů. To vyvolává stres endoplazmatického retikula, a pokud tento stav trvá déle, může vést k zastavení buněčného cyklu a indukci apoptózy (Vrábel et al., Blood Rev. 34 (2019) 56; Jing et al., Mol. Med. Rep. 20 (2019) 2410). Dosavadní léčba mnohočetného myelomu je založena na aplikaci inhibitorů proteáz, přičemž z nich u nejčastěji používaného bortezomibu dochází k buněčné smrti myelomových buněk jen jako vedlejší důsledek léčby. Velmi často jsou však léčivé látky na principu inhibitorů proteazomu kvůli lepší účinnosti kombinovány s cyklofosfamidem nebo doxorubicinem (adriamycin) (Tabchi et al., Clin. Lymphoma Myeloma Leuk. 19 (2019) 560; Adam et al., Vnitr. Lek. 58 (2012) 896).
Mnohočetný myelom je patologickým důsledkem interakce mezi imunitním a kostním systémem, a jako nádorové onemocnění krve postihuje mikroprostředí kostní dřeně, které je silně spojeno s nadměrnou expresí Interleukinu-6 (IL-6) a úbytkem kostní hmoty. Myelomové buňky proliferují a přežívají v kostní dřeni fyziologickými a funkčními interakcemi se stromálními buňkami kostní dřeně a okolním mikroprostředím kostní dřeně (Bianchi a Munshi, Blood 125 (2015) 3049; Abe, Int. J. Hematol. 94 (2011) 334; Meads et al., Clin. Cancer Res. 14 (2008) 2519). Stromální buňky kostní dřeně produkují zánětlivé cytokiny, jako je IL-6, a u myelomových buněk regulují expresi inhibitorů buněčného cyklu - cyklin dependentních kináz p21WAF1 a p27Kip1, anti-apoptických členů rodiny Bcl-2 nebo transportních ABC proteinů (Furukawa a Kikuchi, Int. J. Clin. Oncol. 20 (2015) 413). Interleukin-6 je pleiotropní cytokin, jedná se o růstový faktor, který má zásadní význam pro homeostázu kostního skeletu (Harmer et al., Front. Endocrinol. 9 (2019) 788), a u mnohočetného myelomu funguje jako anti-apoptický faktor (Klein et al., Blood 85 (1995) 863; Lichtenstein et al., Cell Immunol. 162 (1995) 248). Protože identifikace IL-6 byla v minulosti používána jako hlavní růstový faktor pro myelomové buňky, existuje skupina lidských buněčných myelomových linií, které vznikly extramedulární kultivací primárních myelomových buněk s expresí IL-6 od pacientů s mnohočetným myelomem (Zhang et al., Blood 83 (1994) 3654). Myelomová buněčná linie U266 (U266B1) je nezávislá na IL-6, která sice blokuje Interleukinem6 inhibovaný růst buněk, nicméně buňky U266 exprimují IL-6 (Ingersoll et al., Med. Chem. 7 (2011) 473).
- 2 CZ 309542 B6
Podstata vynálezu
Předmětem předkládaného vynálezu jsou v oxidačním stupni +11 obecného vzorce C, elektroneutrální czs-dijodo komplexy platiny
R2
R1
Pt
R1
R2 kde:
- substituent R1 je nezávisle vybrán ze skupiny atom vodíku a C1-C4 alkyl;
- substituent R2 je nezávisle vybrán ze skupiny C1-C4 alkyl, fenyl a fenyl-substituovaný C1-C2 alkyl, kde fenyl může být nesubstituovaný nebo substituovaný halogenem nebo C1-C4 alkoxy skupinou;
- přičemž, je-li substituent R2 methyl, je substituent R1 jiný než atom vodíku, popřípadě ve formě farmaceuticky přijatelných solvátů.
Termín „C1-C4 alkyl“ zahrnuje nerozvětvený uhlovodíkový řetězec tvořený z 1 až 4 atomů uhlíku.
Termín „C1-C2 alkyl“ zahrnuje nerozvětvený uhlovodíkový řetězec tvořený 1 nebo 2 atomy uhlíku.
Termín „alkoxy skupina“ zahrnuje alkyl jedno vazně vázaný na atom kyslíku.
Termín „halogen“ zahrnuje fluor, chlor nebo brom. S výhodou je halogenem fluor nebo chlor.
S výhodou je R1 atom vodíku nebo methyl.
S výhodou je R2 fenyl nebo benzyl, kde fenylový kruh může být nesubstituovaný nebo substituovaný fluorem, chlorem nebo methoxyskupinou.
Nejvýhodněji je R2 fluorfenyl.
Předmětem předkládaného vynálezu jsou dále elektroneutrální czs-dijodo komplexy platiny v oxidačním stupni +11 obecného vzorce C,
-3CZ 309542 B6
kde:
- substituent RI je nezávisle vybrán ze skupiny atom vodíku a C1-C4 alkyl;
- substituent R2 je nezávisle vybrán ze skupiny C1-C4 alkyl, fenyl a fenyl-substituovaný C1-C2 alkyl, kde fenyl může být nesubstituovaný nebo substituovaný halogenem nebo C1-C4 alkoxyskupinou;
popřípadě ve formě farmaceuticky přijatelných solvátů;
pro použití v medicíně, především pro použití v léčbě mnohočetného myelomu.
Předmětem vynálezu je také příprava komplexů obecného vzorce C, a to postupem, který vychází z tetrachloroplatnatanu, jehož reakcí sjodidem alkalického kovu se připraví in situ tetrajodoplatnatan, který se následně podrobí reakci s ekvimolárním množstvím příslušného derivátu 1 //-imidazolu (prekurzoru ligandu).
Reakce přípravy komplexů obecného vzorce C se s výhodou provádí při laboratorní teplotě po dobu 12 až 36 h, s výhodou 24 h.
Reakce se s výhodou provádí v prostředí rozpouštědla vybraného ze skupiny: primární alkohol, voda, a jejich směsi.
Ve výhodném provedení se produkt vysráží nebo vykrystalizuje, a oddělí se od matečného louhu filtrací nebo centrifůgací. Následně se oddělený produkt může s výhodou promýt vodou a rozpouštědlem vybraným ze skupiny: primární alkohol, sekundární alkohol, aceton, w-hexan, diethylether, a jejich směsi. Izolovaný produkt lze následně vysušit v exsikátoru nebo pod infralampou.
Komplex vzorce C, kdy R1 je vodík a R2 methyl, byl již v literatuře popsán, a lze jej tedy připravit také postupem podle literatury, nebyla u něj však studována biologická aktivita (Graves et al., Inorg. Chem. 17(1978) 3007).
V některých provedeních mohou být sloučeniny obecného vzorce C ve formě krystalosolvátů. Krystalosolváty lze zapsat například vzorcem czs-fPtLI^J-wSolv, kde L je substituovaný 1Himidazol, symbol n udává počet krystalově vázaných částic, především 1 až 4, a Solv je molekula rozpouštědla. Molekula rozpouštědla je s výhodou vybraná ze skupiny voda, primární alkohol, sekundární alkohol, aceton, w-hexan, diethylether, a jejich směsi.
Předmětem vynálezu je dále farmaceutický přípravek obsahující terapeuticky účinné množství dijodoplatnatého komplexu obecného vzorce C, a alespoň jednu pomocnou látku. Pomocnými látkami mohou být zejména plniva, pojivá, rozpouštědla, kluzné látky, rozvolňovadla, stabilizátory, a/nebo chuťová a čichová korigencia. Farmaceutický přípravek je s výhodou kapalný, například ve formě injekčního nebo infúzního roztoku.
-4CZ 309542 B6
Objasnění výkresů
Konkrétní příklady provedení technického řešení vynálezu jsou doloženy připojenými výkresy, kde:
- Obr. 1 je molekulová struktura komplexu cis-[Ptl2(L4)2] (4*); L4 = 1-fenyl-1 H-imidazol. Vodíkové atomy nejsou zobrazeny.
- Obr. 2 zobrazuje počty živých buněk myelomové linie U266 (U266B1) po aplikaci 1 μΜ, 2 μΜ a 3 μΜ koncentrací komplexů 1 až 7. Koncentrace 1 μΜ způsobila snížení podílu živých buněk pod 20 % po jejich ovlivnění komplexem 7, zatímco k podobnému snížení podílu živých buněk došlo u koncentrace 2 μΜ komplexů 5, 6 a 7. Podíl živých buněk nižší než 10 % byl detekován po použití koncentrace 3 μΜ komplexů 3 až 7.
- Obr. 3 zobrazuje počty živých buněk myelomové linie KMSI2-PE po aplikaci 1 μΜ, 2 μΜ a 3 μΜ koncentrací komplexů 1 až 7. Asi 10 % a nižší zastoupení živých buněk způsobilo jejich ovlivnění komplexy 6 a 7, přičemž k podobnému snížení živých buněk došlo po aplikaci 2 μΜ koncentrace komplexů 2 až 7. Koncentrace 3 μΜ testovaných komplexů 1 až 7 vedla k méně než 10 % zastoupení živých buněk.
- Obr. 4 zobrazuje počty živých buněk myelomových linií U266 (U266B1) a KMS12-PE, a linie fibroblastů HS-5 po aplikaci 1 μΜ, 2 μΜ a 3 μΜ koncentrací komplexu 6. 2 μΜ a 3 μΜ koncentrace komplexu 6 způsobily snížení podílu živých buněk u obou testovaných myelomových linií pod 20 % a 10 %. Podíl živých buněk linie HS-5 se pohybuje okolo 80 % po aplikaci 1 μΜ koncentrace, ke snížení na 50 až 60 % dochází po aplikaci 2 μΜ a 3 μΜ koncentrací komplexu 6.
- Obr. 5 je poměr fází buněčného cyklu u buněk myelomové linie U266 (U266B1). Ovlivnění buněk 2 μΜ a 3 μΜ koncentracemi komplexu 6 vede k indukci apoptózy, jak je doloženo 6,6 % a 14,7 % zastoupením buněk ve sub-G1 fázi buněčného cyklu. Počty kontrolních neovlivněných myelomových buněk (DMF) se signifikantně (p <0,01) liší od počtu buněk ovlivněných 2 μΜ a 3 μΜ koncentracemi komplexu 6 pro sub-G1 (p = 0,002 a p = 0,001) a G1 (p = 0,007 a p = 0,007) fáze buněčného cyklu. 1 μΜ koncentrace komplexu 6 není dostatečně účinná pro vznik apoptózy u buněk linie U266, ale je dostatečná pro zastavení buněčného cyklu v G1 fázi.
- Obr. 6 je poměr fází buněčného cyklu u buněk myelomové linie KMSI2-PE. Již 1 μΜ koncentrace komplexu 6 způsobuje nárůst počtu buněk v sub-G1 fázi buněčného cyklu. U 2 μΜ a 3 μΜ koncentrací komplexu 6 nelze dostatečně rozeznat fáze buněčného cyklu, což může souviset s potenciální toxicitou těchto koncentrací pro ovlivněné myelomové buňky. U buněčné linie fibroblastů HS-5 je vliv 2 μΜ a 3 μΜ koncentrací komplexu 6 na charakter buněčného cyklu minimální (data nejsou uváděna). Větší počet opakování experimentů s buněčnou linií KMS12-PE je důsledkem obtížné kultivace tohoto typu myelomových buněk, což se projevuje vysokými hodnotami směrodatných odchylek (SD).
- Obr. 7 je počet životaschopných buněk myelomové linie U266 (U266B1), který se sníží po aplikaci 2 μΜ koncentrace komplexu 6 na 43,3 % stanovením kaspáz 3 a 7 (37,4 % Annexin V/7-AAD) a po aplikaci 3 μΜ koncentrace komplexu 6 na 7,0 % stanovením kaspáz 3 a 7 (9,7 % Annexin V/7-AAD) při porovnání s neovlivněnými buňkami (DMF - 87,1 % stanovením kaspáz 3 a 7 (80,0 % Annexin V/7-AAD)). Počty životaschopných buněk jsou signifikantně (p <0,01) nižší po ovlivnění 2 μΜ (p = 0,001 pro Annexin; p <0,001 pro kaspázy 3 a 7) a 3 μΜ (p <0,0001 pro Annexin; p <0,001 pro kaspázy 3 a 7) koncentrací komplexu 6 porovnáním s počty životaschopných buněk kultivovaných v médiu s kontrolním DMF. Ovlivnění 1 μΜ koncentrací nemá na apoptózu vliv.
- 5 CZ 309542 B6
- Obr. 8 je počet životaschopných buněk myelomové linie KMS12-PE, který se sníží po aplikaci 1 μΜ koncentrace komplexu 6 na 38,2 % stanovením kaspáz 3 a 7, při porovnání s 86,4 % neovlivněných životaschopných buněk (DMF), a vede k apoptóze ovlivněných myelomových buněk. U snížených počtů životaschopných buněk po aplikaci 2 μΜ a 3 μΜ koncentrací komplexu 6 na 17,2 % a 26,4 % ukazuje charakter histogramů, že probíhající buněčná smrt je nezávislá na kaspázách (konkrétně na kaspázách 3 a 7).
- Obr. 9 je poměr fází buněčného cyklu u buněk myelomové linie U266 (U266B1) a buněk linie fibroblastů HS-5 kultivovaných společně systémem ko-kultivace. Ovlivnění buněk 2 μΜ a 3 μΜ koncentracemi komplexu 6 vede k indukci apoptózy nárůstem počtu buněk v sub-G1 fázi buněčného cyklu. Počty kontrolních neovlivněných buněčných suspenzí (DMF) se signifikantně liší od počtu buněk ovlivněných 2 μΜ (p <0,05) a 3 μΜ (p <0,01) koncentrací komplexu 6 v sub-G1 fázi buněčného cyklu (p = 0,029 a p = 0,002). 1 μΜ koncentrace komplexu 6 není dostatečně účinná pro vznik apoptózy, ale je dostatečná pro zastavení buněčného cyklu v G1 fázi.
- Obr. 10 je poměr fází buněčného cyklu u buněk myelomové linie KMS12-PE a buněk linie fibroblastů HS-5 kultivovaných ko-kultivačním systémem. 1 μΜ koncentrace komplexu 6 způsobuje nárůst počtu buněk v sub-G1 fázi buněčného cyklu, 2 μΜ a 3 μΜ koncentrace se zdají být pro ko-kultivované buňky toxické.
- Obr. 11 je počet životaschopných buněk v ko-kultuře myelomové linie U266 (U266B1) a linie fibroblastů HS-5, který se sníží po aplikaci 2 μΜ a 3 μΜ koncentrací komplexu 6 při porovnání s neovlivněnými buňkami. Počty životaschopných buněk jsou signifikantně nižší po ovlivnění 2 μΜ (p = 0,0003 pro Annexin; p = 0,006 pro kaspázy 3 a 7) a 3 μΜ (p <0,0001 pro Annexin; p = 0,017 pro kaspázy 3 a 7) koncentracemi komplexu 6 porovnáním s počty životaschopných buněk kultivovaných v médiu s kontrolním DMF. 1 μM koncentrace komplexu 6 nemá na apoptózu vliv.
- Obr. 12 je počet životaschopných buněk kultivovaných v ko-kultuře myelomové linie KMS12PE a linie fibroblastů HS-5, který se sníží po aplikaci 1 μΜ koncentrace komplexu 6, při porovnání s neovlivněnými životaschopnými buňkami (DMF) (p <0,01 pro Annexin). 1 μΜ koncentrace komplexu 6 způsobuje apoptózu u ovlivněných ko-kultivovaných buněčných linií. 2 μΜ a 3 μΜ koncentrace komplexu 6 vedou k jinému typu buněčné smrti, než je apoptóza nebo je buněčná smrt nezávislá na kaspázách (konkrétně na kaspázách 3 a 7).
Příklady uskutečnění vynálezu
V níže uvedených příkladech byly připravené látky charakterizovány těmito fyzikálně-chemickými metodami:
• elementární analýza (Flash 2000 CHNS).
• nukleární magnetická rezonance (NMR; Varian-400 spektrometr) - byly provedeny 1H, 13C, 195Pt, 1H-1H gs-COSY, 1H-13C gs-HMQC, 1H-13C gs-HMBC experimenty na roztocích studovaných látek v DMF-dy při teplotě 298 K. Spektra byla referencována na residuální signály použitého rozpouštědla, a to 8,03 ppm (pro 1H NMR) a 163,2 (pro 13C NMR), nebo vůči K2[PtCl6] v D2O (δ = 0 ppm; pro 195Pt NMR) použitému jako externí reference. Štěpení signálů v 1H NMR spektrech je definováno jako: s = singlet, d = dublet, dd = dublet dubletů, t = triplet a m = multiplet.
• hmotnostní spektra byla zaznamenána po ionizaci elektrosprejem v pozitivním módu (ESI+) na přístroji LCQ Fleet. Studované komplexy pro ESI+ MS experimenty byly rozpuštěny v methanolu.
- 6 CZ 309542 B6 • infračervená spektra byla zaznamenaná na spektrometr A Jasco FT/IR-4700 (Jasco, Easton, MD, USA) v rozmezí 400 až 4000 cm4 za použití oslabeného celkového odrazu (ATR) technika na diamantové desce.
• monokrystalová rentgenová strukturní analýza - monokrystalový difraktometr XtaLAB Synergy-I, HyPix3000 detektor, mikrofokusovaný zdroj rentgenového záření PhotonJet-I (Cu Ka), při teplotě 293 K. Pozn.: Pro potřeby monokrystalové rentgenové strukturní analýzy byly připraveny krystaly sloučeniny cis-[Ptl2(L4)2] (4*), přičemž sloučenina 4* je, na rozdíl od předmětné sloučeniny cis-[Ptl2(L4)2]-H2O (4), nesolvatovaná, a tedy neobsahuje žádné krystalově vázáné částice. Rentgenová difrakce umožnila určit, že krystaly 4* jsou monoklinické s prostorovou grupou P2\/c a následovnými parametry Bravaisovy mřížky: a = 10.04470(10) Á, b = 16.4650(2) Á, c = 13.0144(2) Á, β = 110.464(2), V = 2016.56(5) Á3. Krystalová difrakce prokázala, že v krystalové struktuře 4* mají molekuly [Ptl2(L4)2] přibližně čtvercově planární geometrii koordinačního polyedru s cA-konformací ligandů. Vazby Pt-I (2.5879(6) a 2.5861(7) Á) jsou významně delší než Pt-N vazby (2.050(7) a 2.046(7) Á).
Příklad 1
Přípravy a charakterizace komplexů vzorce 1 až 7
Pro syntézu komplexů byly využity komerčně dostupné organické sloučeniny I-methyl-1//imidazol (L1), 1 -benzyl-\H-imidazol (L2), I-bcnzyl-2-mcthyl-1//-imidazol (L3), 1 -fenyl-1 //imidazol (L4), I-(4-mcthoxyfcnyl)-1//-imidazol (L5), l-(4-fluorfenyl)-1/7-imidazol (L6) a l-(4chlorfenyl)-\H-imidazol (L7), které byly zakoupeny od společnosti Sigma-Aldrich (Praha, Česka republika).
Komplexy cA-fPtEÍL1^] (1), cA-[Ptl2(L2)2]-H2O (2), cA-[Ptl2(L3)2] (3), cA-[Ptl2(L4)2]-H2O (4), cA-[Ptl2(L5)2]-2H2O (5), cA-[Ptl2(L6)2] (6) a cA-[Ptl2(L7)2] (7) obsahující deriváty imidazolu L1 až L7, byly připraveny syntetickým postupem (schéma A), na jehož počátku byl výchozí komplex tetrachloroplatnatan draselný (^[PtCU]; 41,2 mg; 0,1 mmol) rozpuštěn v 1 ml deionizované vody a vzniklý roztok byl zahřát na 50 °C. Za stálého míchání bylo následně do tohoto vodného roztoku K2[PtCl4] přidáno 5 molárních ekvivalentů jodidu draselného (KI; 83 mg; 0,5 mmol) rozpuštěných v dalším 1 ml deionizované vody. Reakční směs byla míchána po dobu 10 min při 50 °C za vzniku medziproduktu tetrajodoplatnatanu draselného (K2[Ptl4])· Následně byly do reakční směsi přidány 0,2 mmol příslušného derivátu 177-imidazolu L1 až L7 (16,4 mg pro L1, 31,6 mg pro L2, 34,4 mg pro L3, 28,8 mg pro L4, 34,8 mg pro L5, 32,4 mg pro L6, 35,6 mg pro L7) rozpuštěných v 5 ml methanolu. Reakční směs byla následně 24 h míchaná magnetickým míchadlem za pokojové teploty, což vedlo ke změně reakční směsi z černého roztoku na žlutou suspenzi. Vzniklý žlutý produkt byl odfiltrován, promyt vodou (1 ml) a diethyletherem (2 * 1 ml), a vysušen v exsikátoru za sníženého tlaku po dobu 24 h.
K2[PtCI4] + KI voda vod a/meth anal ’C min pokojová teplota 24 h
Schéma A
Komplex 1: Žlutá pevná látka. Výtěžek 90 %. Analyticky vypočítané pro CgHnh^Pt: C, 15,69; H, 1,97; N, 9,14 %; změřené: C, 15,48; H, 2,07; N, 8,94 %. 'HNMR (400 MHz, DMF-ď/, 298 K,
-7 CZ 309542 B6 ppm): δ 8,23 (s, 1H, C2-H), 7,35 (s, 1H, C5-H), 7,09 (s, 1H, C4-H), 3,81 (s, 3H, C6-H). 13CNMR (101 MHz, DMM, 298 K,ppm): δ 140,0 (C2), 129,1 (C4), 121,7 (C5), 34,2 (C6). 195PtNMR(86 MHz, DMF4 298 K, ppm): δ -3108. ESI+ MS (MeOH, m/z): 652,0 (vypočítané 652,2; 100 %; {[Pt^L1^] + H+}+). IR (ATR, v, cm'1): 353s, 615w, 649w, 757w, 809w, 1093m, 1234w, 1283w, 1420w, 1520m, 1616w, 1721w, 3106m.
Komplex 1
Komplex 2H2O: Žlutá pevná látka. Výtěžek 92 %. Analyticky vypočítané pro C2oH22l2N40Pt: C, 30,67; H, 2,83; N, 7,15 %; změřené: C, 30,62; H, 3,02; N, 6,90 %. Ή NMR (400 MHz, DMF-í/7, 298 K, ppm): δ 8,45 (s, 1H, C2-H), 7,43-7,27 (m, 6H, C5-H, C8-H, C9-H, C10-H, Cll-H, ΟΠΗ), 7,10 (s, 1H, C4-H), 5,40 (s, 2H, C6-H). 13C NMR (101 MHz, DMF-í/7, 298 K, ppm): δ 139,8 (C2), 136,9 (C7), 129,5 (C4), 129,1 (C9, Cil), 128,4 (CIO), 128,0 (C8, C12), 120,7 (C5), 51,2 (C6). 195Pt NMR (86 MHz, DMF-í/7, 298 K, ppm): δ -3119. ESI+ MS (MeOH, m/z): 788,0 (vypočítané 788,3; 100 %; {[PtI2(L2)2] + Na+}+). IR (ATR, v, cm-1): 340s, 442w, 569w, 628w, 674w, 700w, 743s, 762s, 1020w, 1161m, 1199w, 1253w, 1421m, 1439w, 1501s, 1550w, 1594w, 3097m, 3121w.
Komplex 2
Komplex 3: Žlutá pevná látka. Výtěžek 85 %. Analyticky vypočítané pro C22H24l2N4Pt: C, 33,31; H, 3,05; N, 7,06 %; změřené: C, 33,64; H, 3,35; N, 7,48 %. Ή NMR (400 MHz, ΟΜΕ-ώ,298 K, ppm): δ 7,37-7,28 (m, 4H, C5-H, C9-H, C10-H, Cll-H), 7,24 (s, 1H, C4-H), 7,08-7,03 (m, 2H, C8-H, C12-H), 5,32 (s, 2H, C6-H), 2,68 (s, 3H, C13-H). 13C NMR (101 MHz, DMF-ώ, 298 K, ppm): δ 145,4 (C2), 136,2 (C7), 128,7 (C9, Cil), 127,7 (CIO), 127,5 (C4), 126,6 (C8, C12), 121,2 (C5), 49,95 (C6), 13,6 (C13). 195Pt NMR (86 MHz, ΟΜΕ-ώ,298 K, ppm): δ -3185. ESI+ MS (MeOH, m/z)·. 666,1 (vypočítané 666,1; 45 %; [PtI(L3)2]+), 832,1 (vypočteno 831,9; 40 %; {[PtI2(L3)2] + K+}+). IR (ATR, v, cm4): 345s, 447w, 575w, 632w, 670w, 695m, 723s, 75Is, 945w, 1160m, 1278m, 1352w, 1430m, 1444m, 1497s, 1549w, 1602w, 3026w, 3114m, 3136w, 3444w.
-8CZ 309542 B6
Komplex 3
Komplex 4H2O: Žlutá pevná látka. Výtěžek 89 %. Analyticky vypočteno pro CisHishN^Pt: C, 28,63; H, 2,40; N, 7,42 %; změřené: C, 28,33; H, 2,59; N, 7,44 %. Ή NMR (400 MHz, DMF-ώ, 298 K, ppm): δ 9,02 (s, 1H, C2-H), 8,02 (s, 1H, C5-H), 7,77 (d, J = 8.0 Hz, 2H, C7-H, Cll-H), 7,58 (t, J= 8.0 Hz, 2H, C8-H, C10-H), 7,51 - 7,40 (m, 2H, C4-H, C9-H). 13C NMR (101 MHz, DMF-ώ, 298 K, ppm): δ 137,9 (C2), 136,3 (C6), 130,7 (C4), 130,3 (C8, CIO), 128,6 (C9), 121,2 (C7, Cil), 119,3 (C5). 195Pt NMR (86 MHz, DMF-ď7,298 K, ppm): δ -3114. ESI+ MS (MeOH, m/z): 482,3 (vypočteno 482,4; 5 %; {[Pt(L4)2] - H+}+), 610,1 (vypočteno 610,3; 66 %; [PtI(L4)2]+), 664,3 (vypočteno 664,4; 100 %; {[PtI(L4)2] + 3H2O}+), 755,1 (vypočteno 755,3; 100 %; {[PtI2(L4)2] + NH4+}+), 775,9 (vypočteno 776,3; 50 %; {[PtI2(L4)2] + K+}+). IR (ATR, v, cm4): 396w, 455w, 516w, 644w, 685m, 731m, 747s, 812w, 904w, 963w, 1061m, 1109w, 1132w, 1181w, 1244w, 1307m, 1457w, 1514s, 3045w, 3120m, 3142w.
Komplex 4
Komplex 52H2O: Žlutá pevná látka. Výtěžek 85 %. Analyticky vypočteno pro C2oH24l2N404Pt: C, 30,13; H, 2,53; N, 7,03 %; změřené: C, 30,46; H, 2,61; N, 7,11 %. Ή NMR (400 MHz, DMF-ώ, 298 K, ppm): δ 8,83 (s, 1H, C2-H), 7,90 (s, 1H, C5-H), 7,70-7,64 (m, 2H, C7-H, Cll-H), 7,36 (s, 1H, C4-H), 7,16-7,09 (m, 2H, C8-H, C10-H), 3,86 (s, 3H, C13-H). 13CNMR (101 MHz, DMF-ώ, 298 K, ppm): δ 159,7 (C9), 137,8 (C2), 130,3 (C4), 129,6 (C6), 122,9 (C7, Cl 1), 119,6 (C5), 115,2 (C8, CIO), 55,6 (C13). 195Pt NMR (86 MHz, ΟΜΕ-ώ,298 K, ppm): δ -3150. ESI+ MS (MeOH, m/z): 670,2 (vypočteno 670,4; 35 %; [PtI(L5)2]+), 753,1 (vypočteno 753,5; 90 %; {[PÚ2(L5)2] + 2MeOH + H2O + H+}+), 820,0 (vypočteno 820,3; 100 %; {[PtI2(L5)2] + Na+}+). IR (ATR, v, cm4):
-9CZ 309542 B6
526w, 614w, 645w, 724w, 797w, 823m, 864w, 1024m, 1061m, 1133w, 1181w, 1252s, 1304w, 1361w, 1458w, 1518vs, 2836w, 2955w, 3118m.
Komplex 5
Komplex 6: Žlutá pevná látka. Výtěžek 91 %. Analyticky vypočteno pro CisHi4l2F2N4Pt: C, 27,96; H, 1,82; N, 7,25 %; změřené: C, 27,57; H, 1,79; N, 6,93 %. Ή NMR (400 MHz, DMF-c?7,298 K, ppm): δ 8,95 (s, 1H, C2-H), 7,98 (s, 1H, C5-H), 7,86-7,75 (m, 2H, C7-H, Cll-H), 7,45-7,37 (m, 3H, C4-H, C8-H, C10-H). 13CNMR (101 MHz, DMF-ώ, 298 K, ppm): δ 163,3 (C9), 160,9 (C9), 138,1 (C2), 132,9 (C6), 130,7 (C4), 123,8 (C7, Cil), 119,6 (C5), 117,1 (C8), 116,8 (CIO). 195Pt NMR (86 MHz, DMF-c?7,298 K, ppm): δ -3152. ESI+ MS (MeOH, m/z): 646,2 (vypočteno 646,3; 15 %; [PtI(L6)2]+), 706,1 (vypočteno 706,1; 25 %; {[Ptl2(L6)] + 4H2O + Na+}+), 717,3 (vypočteno 717,5; 45 %; {[PtI(L6)2] + 4H2O}+), 796,0 (vypočteno 796,2; 100 %; {[PtI2(L6)2] + Na+}+), 812,9 (vypočteno 812,4; 10 %; {[Ptl2(L6)2] + K+}+). IR (ATR, v, cm-1): 468w, 543w, 614w, 643w, 738w, 803w, 837m, 966w, 101 Iw, 1063w, 1127w, 1149w, 1221m, 1304w, 1519s, 3110m.
F
Komplex 6
- 10CZ 309542 B6
Komplex 7: Žlutá pevná látka. Výtěžek 88 %. Analyticky vypočteno pro CisHi4l2C12N4Pt: C, 26,82; H, 1,75; N, 6,95 %; změřené: C, 27,15; H, 1,84; N, 6,77 %. ’HNMR (400 MHz, DMF-A·, 298 K, ppm): δ 8,99 (s, 1H, C2-H), 8,03 (s, 1H, C5-H), 7,86-7,74 (m, 2H, C7-H, Cll-H), 7,69-7,57 (m, 2H, C8-H, 10-H), 7,42 (s, 1H, C4-H). 13CNMR (101 MHz, DMF-ď/, 298 K, ppm): δ 138,0 (C2), 135,2 (C6), 133,3 (C9), 130,8 (C4), 130,2 (C8, CIO), 123,1 (C7, Cil), 119,4 (C5). 195PtNMR (86 MHz, DMF-ďz, 298 K, ppm): δ -3146. ESI+ MS (MeOH, m/z): 678,2 (vypočteno 677,9; 100 %; [PtI(L7)2]+), 843,7 (vypočteno 834,8; 15 %; {[Ptl2(L7)2] + K+}+). IR (ATR, v, cm-1): 515w, 649w, 733w, 821m, 963w, lOllw, 1065w, 1094w, 1132w, 1184w, 1252w, 1307m, 1418w, 1516s, 3111m.
Cl
Komplex 7
Příklad 2
In vitro cytotoxicita komplexů vzorce 1 až 7 vůči mnohočetnému myelomu
Pro stanovení in vitro cytotoxicity komplexů vzorce 1 až 7 vůči lidským myelomovým buněčným liniím U266 (U266B1) a KMS12-PE, a nenádorové buněčné linie fibroblastů HS-5, byla použita mikrotitrační kolorimetrická analýza využívající 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5difenyltetrazolium bromid (MTT). Testem jsou detekovány životaschopné, metabolicky aktivní buňky, které, na rozdíl od mrtvých buněk, enzymaticky redukují MTT barvivo na jeho fialový formazán. Počtu metabolicky aktivních buněk pak odpovídá množství zredukovaného MTT, tedy intenzita a přeneseně pak spektrofotometricky stanovitelná absorbance vzniklého fialového zbarvení.
Myelomová buněčná linie U266 (U266B1) je suspenzní linie. Byla zakoupena od společnosti American Type Collection (ATCC ®TIB-196™). Byla vytvořena z periferní krve 53-letého muže s mnohočetným myelomem vylučujícím imunoglobulin IgE (zdroj dsmz.de). Myelomové buňky linie U266 (U266B1) exprimují Interleukin-6 (Ingersoll et al., Med. Chem. 7 (2011) 473). Z hlediska morfologie se jedná o jednotlivé nebo v seskupení se vyskytující kulaté až polygonální buňky v suspenzi.
Myelomová buněčná linie KMS12-PE je suspenzní linie. Byla získána z buněčné banky JCRB Japanese Cancer Research Resources Bank (National Institute of Biomedical Innovation, Osaka, Japonsko) pod označením JCRB0430. Byla vytvořena z pleurálního výpotku 64-leté ženy v refrakterním terminálním stádiu mnohočetného myelomu (neprodukujícím imunoglobulin) po
- 11 CZ 309542 B6 kombinované chemoterapii. Z hlediska morfologie se jedná o malé kulaté buňky, kterou rostou v buněčné suspenzi samostatně anebo v malých shlucích (zdroj dsmz.de).
Buněčná linie HS-5 (ATCC®CRL-11882™) zakoupena od společnosti American Type Collection byla odvozena z transformovaných fibroblastů, které byly získány z kostní dřeně zdravého 30letého muže. Jedná se o buňky adherentní (zdroj dsmz.de).
Buňky myelomové linie U266 (U266B1) byly kultivovány v médiu RPMI-1640 s přídavkem 15% fetálního bovinního séra, 1% antibiotik Penicilin-Streptomycin, 1% L-glutamin a 100 mM pyruvát sodný, a to podle instrukcí dodavatele (ATCC) - v inkubátoru při 37 °C, 100% vlhkosti a atmosféře 5% CO2. Buňky myelomové linie KMS12-PE a linie fibroblastů HS-5 byly kultivovány za stejných podmínek jako myelomová linie U266, ale pouze s 10 % fetálního bovinního séra.
Testované komplexy 1 až 7 byly rozpuštěny v N,N'-dimethylformamidu (DMF) pro přípravu 50,0 mM zásobního roztoku. Pro vlastní experiment byl zásobní roztok ředěn médiem do koncentrací 1 μΜ, 2 μΜ a 3 μΜ.
Suspenze buněk myelomových linií U266 (U266B1) a KMS12-PE byly pipetovány do devadesáti šesti jamkové mikrotitrační destičky a při 35 až 40 % buněčné konfluenci byly k buňkám přidány 1 μΜ, 2 μΜ a 3 μΜ koncentrace komplexů 1 až 7. Ovlivněné myelomové buněčné suspenze byly následně inkubovány po dobu 24 h (37 °C, 100% vlhkost, 5% CO2). Současně byl testován vliv komplexů 1 až 7 na buněčnou suspenzi fibroblastů. Jako negativní kontrola bylo použito médium RPMI s 10% FBS a jako další kontrola byl použit 0,015% DMF v médiu (procentické zastoupení činidla, v němž byly testované komplexy rozpuštěny). Po expozici byl do směsí přidán roztok ΜΤΤ a následovala inkubace po dobu 4 h při 37 °C. Aplikací 10 % SDS došlo k zastavení reakce a po další 24 h inkubaci ovlivněných buněčných suspenzí při 37 °C byla provedena spektrofotometrická analýza přístrojem Labysystems Multiskan RC ELISA při vlnové délce 570 nm.
Nakonec byla vypočítána viabilita buněk pro DMF a pro tři koncentrace testovaných komplexů 1 až 7. Byly provedeny tři nezávislé experimenty (každý z nich v tripletu) vždy z nově pasážovaných buněk.
Tabulka 1: Viabilita pozorovaná na testovaných buněčných liniích U266B1, KMS12-PE a HS-5 pro komplexy 1 až 7
Komplex U266B1 KMS12-PE
1 μΜ 2 μΜ 3 μΜ 1 μΜ 2 μΜ 3 μΜ
1 95,0±1,6 83,0±8,1 73,5±3,5 56,5±3,5 23,6±4,5 9,3±6,0
2 93,5±4,5 83,5±4,5 57,0±13,0 36,0±5,0 9,0±2,0 3,5±1,5
3 85,5±1,5 35,5±6,5 6,0±2,0 33,0±4,0 3,5±0,5 2,2±1,8
4 83,6±8,3 44,5±11,5 8,6±4,4 45,5±4,5 8,6±4,6 2,3±1,2
5 72,5±7,5 20,0±7,0 4,0±1,0 29,0±2,0 4,0±2,0 1,5±0,5
6 64,5±0,5 9,0±2,0 3,0±1,0 11,5±0,5 2,0±1,0 1,1±0,9
7 11,5±3,5 3,5±1,5 2,5±1,5 2,1±1,9 0,3±0,2 0,6±0,5
Komplex HS-5
- 12 CZ 309542 B6
1 μM 2 μM 3 μM
1
2
3
4
5
6 82,5±4,4 63,0±10,4 51,0±3,2
7
Příklad 3
Detekce apoptózy a buněčného cyklu u myelomových buněčných linií
Byly zkoumány účinky komplexu 6 na průběh buněčného cyklu myelomových buněk lišících se expresí interleukinu-6 (IL-6) po 24 h působení. Analýza buněčného cyklu byla provedena průtokovou cytometrií buněk barvených propidium jodidem (PI). Myelomové buňky linie U266 (U266B1) exprimující IL-6 a linie KMS12-PE bez exprese IL-6 byly po 24 h ovlivnění 1 μM, 2 μM a 3 μM koncentracemi komplexu 6 fixovány 96% ledově chladným etanolem, promyty ledově chladným PBS s 2% podílem fetálního bovinního séra a následně inkubovány po dobu 30 min při pokojové teplotě roztokem PBS obsahujícím RNAse A (0,2 mg/ml). Po přidání PI byla provedena analýza buněčného cyklu průtokovou cytometrií (BD FACSVerse, BD Biosciences, San Jose, CA, USA).
Byly zkoumány účinky komplexu 6 na indukci apoptózy u myelomových buněk lišících se expresí IL-6. Detekce apoptózy byla provedena barvením na Annexin V/7-AAD a stanovením aktivit kaspáz 3 a 7. Zatímco Annexin V poskytuje velmi citlivou metodu pro detekci buněčné apoptózy, 7-aminoactinomycin D (7-AAD) se používá k detekci nekrotických nebo pozdně apoptických buněk. Barvení Annexin V/7-AAD bylo použito k semi-kvantifikaci životaschopných, apoptických a nekrotických buněk po 24 h působení 1 μM, 2 μM a 3 μM koncentracemi komplexu 6 na buněčné suspenze myelomové linie U266 (U266B1) a linie KMS12-PE. Ovlivněné buňky byly po 24 h sklizeny, stočeny na centrifuze k vytvoření buněčného peletu, který byl uchováván na ledu. Postupně byl přidán vazebný pufr (140 mM NaCl, 4 mM KCl, 0,75 mM MgCE a 10 mM HEPES), Annexin V, 7-AAD a CaCl2. Vzorky byly ponechány po dobu 15 min v ledové tříšti a bez přístupu světla.
Pro stanovení apoptózy aktivitou kaspáz 3 a 7 byly buňky myelomových linií U266 (U266B1) a KMS12-PE ovlivněné 1 μM, 2 μM a 3 μM koncentracemi komplexu 6 sklízeny po 24 h. Buněčné pelety byly rozpuštěny ve vazebném pufru s 2% podílem bovinního fetálního séra. Následně bylo přidáno detekční činidlo CellEventTM Caspase-3/7 Green Detection Reagent (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Vzorky byly inkubovány při pokojové teplotě a bez přítomnosti světla po dobu 40 min a po dobu 5 min s fluorescenčním barvivem DNA - DAPI (4',6-diamidin2-fenylindol). U obou použitých metod bylo kritériem zastoupení alespoň 5 000 buněk/vzorek.
Vlastní detekce apoptózy u obou metod byla provedena průtokovou cytometrií (BD FACSVerse, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) a získaná data byla analyzována pomocí BD FACSuite software (BD Biosciences).
Příklad 4
Detekce apoptózy a fází buněčného cyklu u ko-kultivací myelomových buněk a fibroblastů
- 13 CZ 309542 B6
Byly zkoumány účinky komplexu 6 na indukci apoptózy u dvou typů buněk (myelomové buňky a buňky fibroblastů) ko-kultivovaných v témže médiu. Ko-kultivované byly kombinace linií U266 (U266B1) s HS-5, a KMS12-PE s HS-5.
Suspenze buněk myelomových linií a linie fibroblastů, byly pipetovány do šesti jamkového panelu způsobem, že do jamky byly nejdříve pipetovány buňky linie fibroblastů v počtu 25 tis. buněk/jamka a následně k nim byly přidány buňky myelomových linií U266 (U266B1) nebo KMS12-PE, v počtu 500 tis. buněk/jamka. U takto ko-kultivovaných buněk byly zkoumány účinky 10 komplexu 6 na indukci apoptózy. Detekce apoptózy byla provedena barvením na Annexin V/7AAD a stanovením aktivit kaspáz 3 a 7.

Claims (7)

1. Czs-dijodo komplex platiny v oxidačním stupni +11 obecného vzorce C,
5 kde:
- substituent R1 je nezávisle vybrán ze skupiny atom vodíku nebo C1-C4 alkyl;
- substituent R2 je nezávisle vybrán ze skupiny Cl-C 4 alkyl, fenyl nebo fenyl-substituovaný C1-C2 alkyl, kde fenyl může být nesubstituovaný nebo substituovaný halogenem nebo C1-C4 alkoxy skupinou;
10 - přičemž je-li substituent R2 methyl, je substituent R1 jiný než atom vodíku, popřípadě ve formě farmaceuticky přijatelného solvátu.
2. Czs-dijodo komplex platiny v oxidačním stupni +11 obecného vzorce C,
R2
Pt
R2 kde:
15 - substituent R1 je nezávisle vybrán ze skupiny atom vodíku nebo C1-C4 alkyl;
- substituent R2 je nezávisle vybrán ze skupiny C1-C4 alkyl, fenyl nebo fenyl-substituovaný Cl- 15CZ 309542 B6
C2 alkyl, kde fenyl může být nesubstituovaný nebo substituovaný halogenem nebo C1-C4 alkoxyskupinou;
popřípadě ve formě farmaceuticky přijatelného solvátu;
pro použití v medicíně jako léčivo.
3. Cis-dijodo komplex platiny pro použití podle nároku 2, kde použitím v medicíně je použití v léčbě mnohočetného myelomu.
4. Cis-dijodo komplex platiny podle nároku 1 nebo cis-dijodo komplex platiny pro použití podle kteréhokoliv z nároků 2 až 3, kde farmaceuticky přijatelný solvát je solvát s molekulou rozpouštědla vybranou ze skupiny voda, primární alkohol, sekundární alkohol, aceton, n- hexan, diethylether, a jejich směsi; a počet molekul rozpouštědla na molekulu cis-dijodo komplexu platiny je v rozmezí 1 až 4.
5. Způsob přípravy komplexu obecného vzorce C podle nároku 1, vyznačující se tím, že vychází z tetrachloroplatnatanu, jehož reakcí s jodidem alkalického kovu se připraví in situ tetrajodoplatnatan, který se následně podrobí reakci s ekvimolárním množstvím příslušného derivátu 1H- imidazolu.
6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že
- reakce přípravy komplexu obecného vzorce C se provádí při laboratorní teplotě po dobu 12 až 36 h, s výhodou 24 h, a/nebo
- reakce přípravy komplexu obecného vzorce C se provádí v prostředí rozpouštědla vybraného ze skupiny: primární alkohol, voda, a jejich směsi.
7. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství alespoň jednoho cis-dijodo komplexu platiny obecného vzorce C, a alespoň jednu pomocnou látku.
CZ2021-444A 2021-09-21 2021-09-21 Komplexy platiny a jejich použití pro léčbu mnohočetného myelomu CZ309542B6 (cs)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2021-444A CZ309542B6 (cs) 2021-09-21 2021-09-21 Komplexy platiny a jejich použití pro léčbu mnohočetného myelomu
PCT/CZ2022/050095 WO2023046221A1 (en) 2021-09-21 2022-09-20 Platinum complexes and use thereof for treatment of multiple myeloma

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2021-444A CZ309542B6 (cs) 2021-09-21 2021-09-21 Komplexy platiny a jejich použití pro léčbu mnohočetného myelomu

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2021444A3 CZ2021444A3 (cs) 2023-03-29
CZ309542B6 true CZ309542B6 (cs) 2023-03-29

Family

ID=83692685

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2021-444A CZ309542B6 (cs) 2021-09-21 2021-09-21 Komplexy platiny a jejich použití pro léčbu mnohočetného myelomu

Country Status (2)

Country Link
CZ (1) CZ309542B6 (cs)
WO (1) WO2023046221A1 (cs)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012085475A1 (fr) * 2010-12-23 2012-06-28 Centre National De La Recherche Scientifique Nouveaux complexes carbéniques de platine et leur utilisation comme médicaments
CZ305374B6 (cs) * 2014-04-22 2015-08-19 Univerzita PalackĂ©ho Dijodo-komplexy platiny a jejich použití pro přípravu léčiv k léčbě nádorových onemocnění
CZ306966B6 (cs) * 2016-03-02 2017-10-18 Univerzita PalackĂ©ho v Olomouci Dijodo-komplexy platiny s ω-substituovanými deriváty 6-alkyloxy-9-deazapurinu a použití těchto komplexů pro přípravu léčiv v protinádorové terapii

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012085475A1 (fr) * 2010-12-23 2012-06-28 Centre National De La Recherche Scientifique Nouveaux complexes carbéniques de platine et leur utilisation comme médicaments
CZ305374B6 (cs) * 2014-04-22 2015-08-19 Univerzita PalackĂ©ho Dijodo-komplexy platiny a jejich použití pro přípravu léčiv k léčbě nádorových onemocnění
CZ306966B6 (cs) * 2016-03-02 2017-10-18 Univerzita PalackĂ©ho v Olomouci Dijodo-komplexy platiny s ω-substituovanými deriváty 6-alkyloxy-9-deazapurinu a použití těchto komplexů pro přípravu léčiv v protinádorové terapii

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GRAVES, Bradford J., et al. Synthesis and structural characterization of cis-dichlorobis(N-methylimidazole)platinum(II) and cis-dibromobis(Nmethylimidazole)platinum(II). Inorganic Chemistry, 1978, Vol. 17, No. 11, p. 3007-3011, ISSN 0020-1669, celý dokument. *
RAVERA, Mauro, et al. Synthesis, characterization, structure, molecular modeling studies and biological activity of sterically crowded Pt(II) complexes containing bis(imidazole) ligands. Journal of Inorganic Biochemistry, 2011, Vol. 105, p. 400-409, ISSN 0162-0134, celý dokument; *

Also Published As

Publication number Publication date
CZ2021444A3 (cs) 2023-03-29
WO2023046221A1 (en) 2023-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Colina-Vegas et al. Half sandwich Ru (II)-acylthiourea complexes: DNA/HSA-binding, anti-migration and cell death in a human breast tumor cell line
KR101834366B1 (ko) 육산화사비소의 결정다형을 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 이의 제조방법
Paloque et al. Synthesis, characterization, and antileishmanial activities of gold (I) complexes involving quinoline functionalized N-heterocyclic carbenes
Guo et al. DNA-unresponsive platinum (II) complex induces ERS-mediated mitophagy in cancer cells
Kaluđerović et al. Ruthenium (II) p-cymene complex bearing 2, 2′-dipyridylamine targets caspase 3 deficient MCF-7 breast cancer cells without disruption of antitumor immune response
Gibadullina et al. New 2, 6-diaminopyridines containing a sterically hindered benzylphosphonate moiety in the aromatic core as potential antioxidant and anti-cancer drugs
CN111548360B (zh) 一种二硫代氨基碳酸混价铜配合物及其制备和应用
CN101074229A (zh) 7－氮杂靛玉红和7－氮杂异靛蓝衍生物制备及其药学用途
Xie et al. Anti-metastasis and anti-proliferation effect of mitochondria-accumulating ruthenium (II) complexes via redox homeostasis disturbance and energy depletion
Schmidlehner et al. Cytotoxicity and preliminary mode of action studies of novel 2-aryl-4-thiopyrone-based organometallics
CN116143842A (zh) 氧化异阿朴菲生物碱与n-杂环卡宾的环金属铱配合物及其合成方法和应用
Adeyemo et al. Coordination-driven self-assembly of ruthenium (II) architectures: synthesis, characterization and cytotoxicity studies
Nguyen et al. Synergetic anticancer activity of gold porphyrin appended to phenyl tin malonate organometallic complexes
Pantelić et al. Synthesis, characterization and in vitro biological evaluation of novel organotin (IV) compounds with derivatives of 2-(5-arylidene-2, 4-dioxothiazolidin-3-yl) propanoic acid
CN111116667B (zh) 基于8-羟基喹啉衍生物和1-苯基吡唑铱二聚体构筑的铱配合物及其合成方法和应用
Zeng et al. Synthesis, characterization and anticancer activity studies of ruthenium (II) polypyridyl complexes on A549 cells
KR20150041786A (ko) 암치료 및 면역억제를 위한 조합요법
Bannwart et al. A New Class of Gold (I) NHC Complexes with Proapoptotic and Resensitizing Properties towards Multidrug Resistant Leukemia Cells Overexpressing BCL-2
Schmidlehner et al. Organometallic complexes of (thio) allomaltol-based Mannich-products: Synthesis, stability and preliminary biological investigations
CZ309542B6 (cs) Komplexy platiny a jejich použití pro léčbu mnohočetného myelomu
JP5553275B2 (ja) 金属錯体およびこれを有効成分として含有する抗がん剤
Utku et al. Synthesis and cytotoxic activity of platinum (II) and platinum (IV) complexes with 2-hydroxymethylbenzimidazole or 5 (6)-chloro-2-hydroxymethylbenzimidazole ligands against MCF-7 and HeLa cell lines
CN103864720B (zh) 苯丙烯酸类法尼基硫代水杨酸衍生物及制备方法和用途
WO2016109849A1 (en) Cymanquine compounds and derivatives thereof and uses thereof
Weader Synthesis, Characterization, and Biological Activity of Imidazolium Salts

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20240921