CN114397260A - 六堡茶中茶褐素含量的测定方法 - Google Patents
六堡茶中茶褐素含量的测定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了六堡茶中茶褐素含量的测定方法，属于茶叶成分测定的技术领域，利用该测定方法能够准确测定六堡茶中茶褐素的含量，该方法的重复性、回收率、线性关系、灵敏度均较好，对于测定六堡茶中茶褐素具有较高专属性；包括如下制备步骤：(1)取多个1级六堡茶混合后制备茶褐素对照品，并进行茶褐素的纯度标定，利用标定的茶褐素标准品制备标准六堡茶样品茶褐素浓度‑吸光率曲线；(2)取待测定六堡茶样品浸泡提取，加入乙醇混合静置，离心后得待测品沉淀物；(3)将待测品沉淀物溶解稀释，放入紫外分光光度计中测定得待测品吸光度；(4)利用标准六堡茶样品茶褐素浓度‑吸光率曲线求出待测品吸光度对应茶褐素浓度，再求出茶褐素含量。
Description
技术领域
本发明涉及茶叶成分测定的技术领域，更具体地说，尤其涉及六堡茶中茶褐素含量的测定方法。
背景技术
六堡茶是指采用中国广西梧州六堡镇当地的大叶种茶树的鲜叶作为原料，经杀青、揉捻、渥堆、复揉、干燥五道工序制成，具有独特槟榔香气的黑茶品种，属于后发酵茶。六堡茶呈黑褐色，汤色红浓明亮，口感醇和爽滑，香气纯陈，具有越陈越香的特性，贮存年份对六堡茶香气、滋味、口感有较大的影响，且贮存年份成为市场上对六堡茶的产品价格的重要影响因素。
不同贮存年份对六堡茶的品质，以及茶叶中茶多酚、氨基酸、茶黄素、茶红素、茶褐素等内含成分都会产生影响。不同陈化时间的六堡茶中茶褐素含量范围在9.49％～16.29％之间变化。随着陈化时间的增加，六堡中茶褐素含量逐渐增加，且增加明显。
由此可见，茶褐素含量是六堡茶品质评价的重要标准之一，国标中只有NY/T3675-2020红茶中茶红素和茶褐素含量的测定分光光度法进行红茶中茶褐素的测定，而红茶的基质与六堡茶差异较大，若利用国标NY/T 3675-2020的测定方法来测定六堡茶中茶褐素含量，标准中的罗勃兹经验系数不适用于六堡茶中茶褐素的测定，得到的结果与实际情况相差太大，不能准确获知六堡茶中茶褐素含量，进而影响了茶叶品质的评定。因此，亟待发明一种能够利有效测定六堡茶中茶褐素含量的方法，以便更准确的评定六堡茶品质。
发明内容
本发明的目的在于提供六堡茶中茶褐素含量的测定方法，利用该测定方法能够准确测定六堡茶中茶褐素的含量，该方法的重复性、回收率、线性关系、灵敏度均较好，对于测定六堡茶中茶褐素具有较高专属性。
本发明的技术方案如下：
六堡茶中茶褐素含量的测定方法，包括如下制备步骤：
(1)取多个不同批次等级是1级六堡茶混合后制备茶褐素对照品，并进行茶褐素的纯度标定，利用标定的茶褐素标准品制备标准六堡茶样品茶褐素浓度-吸光率曲线；
(2)取待测定六堡茶样品浸泡提取过滤，加入无水乙醇混合静置，离心后得待测品沉淀物；
(3)将步骤(2)所得待测品沉淀物用水溶解稀释，将其放入紫外分光光度计中测定得待测品吸光度；
(4)利用标准六堡茶样品茶褐素浓度-吸光率曲线求出步骤(3)所得待测品吸光度对应茶褐素浓度，再根据稀释溶液体积求出茶褐素含量。
进一步的，所述的步骤(2)中，将待测定六堡茶样品放入沸水中浸泡，每100mL的沸水中加入待测定六堡茶样品的重量为2g，浸泡后在沸水浴中密封提取40min。
进一步的，所述的步骤(2)中，加入的无水乙醇试剂占容易总量的90％，加入后放置在4℃冰箱中静置3小时。
进一步的，所述的步骤(2)中，将经过静置的溶液在4℃下离心15min，离心速度为9000r/min。
进一步的，所述的步骤(3)中，将溶解稀释后的溶液放入紫外分光光度计中测定时，测定的波长为280±2nm，比色明厚度为1cm。
进一步的，所述的步骤(3)中，若测定的待测品吸光度不在0.1～0.7范围时，将溶解稀释后的溶液进一步稀释后再放入紫外分光光度计中测定得待测品吸光度，直至测定的待测品吸光度在0.1～0.7范围中。
进一步的，所述的步骤(1)中，包括以下步骤：
(1.1)取多个不同批次的1级六堡茶各1等份混合得标准六堡茶样品；
(1.2)将步骤(1.1)所得标准六堡茶样品放入沸水中浸泡后水浴提取，过滤、浓缩后得标准品浓缩液；
(1.3)往步骤(1.2)所得标准品浓缩液中加入无水乙醇混合静置，离心后得标准品沉淀物；
(1.4)将步骤(1.3)所得标准品沉淀物加入乙酸乙酯试剂混合静置，离心后烘干得茶褐素粗品；
(1.5)将步骤(1.4)所得茶褐素粗品溶解过滤，冷冻干燥得茶褐素精品；
(1.6)利用步骤(1.5)所得茶褐素精品制备茶褐素浓度-吸光率曲线法计算出六堡茶样品中茶褐素的含量。
进一步的，所述的步骤(1.6)中，测定茶褐素精品不同浓度的吸光度前，还需要使用顶空-气相色谱质谱法对其中的乙醇、乙酸乙酯残留量进行测定，求出茶褐素精品中茶褐素的实际含量。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
本发明的六堡茶中茶褐素含量的测定方法，取多个不同批次等级是1级六堡茶混合后制备茶褐素对照品，并进行茶褐素的纯度标定，利用标定的茶褐素标准品制备标准六堡茶样品茶褐素浓度-吸光率曲线；取待测定六堡茶样品浸泡提取过滤，加入无水乙醇混合静置，离心后得待测品沉淀物；将待测品沉淀物用水溶解稀释，将其放入紫外分光光度计中测定得待测品吸光度；利用标准六堡茶样品茶褐素浓度-吸光率曲线求出待测品吸光度对应茶褐素浓度，再根据稀释溶液体积求出茶褐素含量。利用本发明的测定方法能够准确测定六堡茶中茶褐素的含量，该方法的重复性、回收率、线性关系、灵敏度均较好，对于测定六堡茶中茶褐素具有较高专属性。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是标准六堡茶样品茶褐素浓度-吸光率曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
本发明的六堡茶中茶褐素含量的测定方法，包括如下制备步骤：
(1)取多个不同批次等级是1级六堡茶混合后制备茶褐素对照品，并进行茶褐素的纯度标定，利用标定的茶褐素标准品制备标准六堡茶样品茶褐素浓度-吸光率曲线。
包括以下步骤：
(1.1)取多个不同批次的1级六堡茶各1等份混合得标准六堡茶样品。其中，所选取的六堡茶为多批次的经过了评茶师评定、等级为1级的六堡茶，每批次的样品六堡茶分别经电子分析天平秤重各取150g混合均匀。
(1.2)将步骤(1.1)所得标准六堡茶样品放入沸水中浸泡后水浴提取，过滤、浓缩后得标准品浓缩液。
其中，加入的标准六堡茶样品与沸水的比例为1：10，并在沸水浴中密封提取40min，提取次数为2次。完成提取后使用纱布趁热过滤茶汤(过滤接收容器放置于冰浴中)，收集到的茶汤使用平衡浓缩液浓缩。
(1.3)往步骤(1.2)所得标准品浓缩液中加入无水乙醇混合静置，离心后得标准品沉淀物。其中，加入无水乙醇的量占溶液总量的90％，混合均匀后放置到4℃冰箱静置3小时，将经过静置的溶液在4℃下离心15min，离心速度为9000r/min。
(1.4)将步骤(1.3)所得标准品沉淀物加入乙酸乙酯试剂混合静置，离心后烘干得茶褐素粗品。其中，加入乙酸乙酯的量占溶液总量的90％，混合均匀后放置到4℃冰箱静置3小时，将经过静置的溶液在4℃下离心15min，离心速度为9000r/min。完成离心后获得的沉淀物在65℃±2℃烘箱下烘1.5小时，得到茶褐素粗品。
(1.5)将步骤(1.4)所得茶褐素粗品溶解过滤，冷冻干燥得茶褐素精品。
其中，每100mL的超纯水中加入茶褐素粗品的重量为5g，溶解后通过滤膜(＞50000Da的滤膜)过滤，再使用冷冻干燥得到茶褐素精品。
(1.6)利用步骤(1.5)所得茶褐素精品制备茶褐素浓度-吸光率曲线法计算出六堡茶样品中茶褐素的含量。
其中，测定茶褐素精品不同浓度的吸光度前，还需要使用顶空-气相色谱质谱法对其中的乙醇、乙酸乙酯残留量进行测定，求出茶褐素精品中茶褐素的实际含量。茶褐素精品中茶褐素的实际含量为：1-(乙醇％+乙酸乙酯％)，得到的茶褐素精品需避光密封保存在2～8℃冰箱中。
茶褐素精品中乙醇、乙酸乙酯残留溶剂检测方法为：
标准品茶褐素测定溶液制备：精密称取茶褐素精品0.50g到5mL容量瓶，用水溶解并定容至刻度，吸取3.00mL到20mL顶空瓶内进行测定。其中，
色谱条件：色谱柱：DB-WAX毛细管色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)
进样口温度：250℃，分流比：20:1；
色谱柱温度：初始温度40℃，保持时间5min，以20℃/min升至200℃，保持时间3min，以60℃/min升至240℃，保持时间1min；柱流量(He)：1.2mL/min；
离子源温度：230℃，电子能量：70eV
监测模式：选择离子检测(SIM)，乙醇监测离子：30、31、45、46，乙酸乙酯监测离子：43、45、61、70、88。
顶空进样器：加热箱温度90℃，定量环温度100℃，传输线温度120℃，样品瓶平衡15min，进样持续时间0.5min。
(2)取待测定六堡茶样品浸泡提取过滤，加入无水乙醇混合静置，离心后得待测品沉淀物。
其中，将待测定六堡茶样品放入沸水中浸泡，每100mL的沸水中加入待测定六堡茶样品的重量为2g，浸泡后在沸水浴中密封提取40min。加入的无水乙醇试剂占容易总量的90％，加入后放置在4℃冰箱中静置3小时。将经过静置的溶液在4℃下离心15min，离心速度为9000r/min。
(3)将步骤(2)所得待测品沉淀物用水溶解稀释，将其放入紫外分光光度计中测定得待测品吸光度。
其中，将待测品沉淀物用水溶解，并转移至100mL容量瓶中，定容至刻度，精密吸取上述稀释液0.50mL到50mL容量瓶，用水定容至刻度，摇匀，得到稀释的待测溶液放入紫外分光光度计中测定，测定的波长为280±2nm，比色明厚度为1cm，以超纯水作为空白调零。
若测定的待测品吸光度不在0.1～0.7范围时，将溶解稀释后的溶液进一步稀释后再放入紫外分光光度计中测定得待测品吸光度，直至测定的待测品吸光度在0.1～0.7范围中。
(4)利用标准六堡茶样品茶褐素浓度-吸光率曲线求出步骤(3)所得待测品吸光度对应茶褐素浓度，并代入稀释溶液体积求出茶褐素含量。
本发明的测定方法使用经评级过的六堡茶进行茶褐素的对照品制备，使用乙醇、乙酸乙酯对茶褐素进一步纯化，通过使用顶空-气相色谱质谱法对纯化过程中的残留溶剂进行测定，顶空-气相色谱质谱法对于残留溶剂的检测比气相色谱法能达到高灵敏度，对于痕量残留检出能力高于气相，且质谱抗干扰能力强于气相，使用质荷比进行定性可以排除在气相法中由于色谱峰的干扰而导致检测目标物检测不到的因素。顶空-气相色谱质谱法使用顶空进样器进样，在设定加热箱温度只在残留物的沸点以上，可保证其余高于该沸点的物质不被挥发，不进到检测系统，进而减少污染。气相色谱测定法会在同一时间将除了目标物以外的其余物质也同时进行气化，进到系统内，引起系统污染，如色谱峰不能进一步分离，从而导致测定结果错误。
通过检测残留溶剂的量而标定茶褐素的纯度，标定纯度后的茶褐素作为测定六堡茶中茶褐素的对照品，以获得标准六堡茶样品茶褐素浓度-吸光率曲线。得到标准六堡茶样品吸光率-茶褐素含量曲线表后该曲线表用于检测六堡茶中茶褐素，在基质上对照品的来源为六堡茶，使用同样基质来源的对照品进行检测能进一步排除由于基质不同而影响测定结果的因素。因此本发明的测定方法重复性、回收率、线性关系、灵敏度都较好，对于测定六堡茶中茶褐素具有较高专属性。
实验例
1、获得标准六堡茶样品茶褐素浓度-吸光率曲线
(1)取30个不同批次的经过了评茶师评定、等级为1级六堡茶，每批次的六堡茶经电子分析天平秤重各取150g，将这30批次的六堡茶混合得标准六堡茶样品。
(2)将标准六堡茶样品按与沸水1：10的比例放入沸水中浸泡，并在沸水浴中密封提取40min，提取次数为2次。完成提取后使用纱布趁热过滤茶汤(过滤接收容器放置于冰浴中)，收集到的茶汤使用平衡浓缩液浓缩后得标准品浓缩液。
(3)往标准品浓缩液中加入无水乙醇混合静置，加入无水乙醇的量占溶液总量的90％，混合均匀后放置到4℃冰箱静置3小时，将经过静置的溶液在4℃下离心15min，离心速度为9000r/min，离心后得标准品沉淀物。
(4)将标准品沉淀物加入乙酸乙酯试剂混合静置，加入乙酸乙酯的量占溶液总量的90％，混合均匀后放置到4℃冰箱静置3小时，将经过静置的溶液在4℃下离心15min，离心速度为9000r/min。完成离心后获得的沉淀物在65℃±2℃烘箱下烘1.5小时，得到茶褐素粗品。
(5)将茶褐素粗品溶解过滤，每100mL的超纯水中加入茶褐素粗品的重量为5g，溶解后通过滤膜(＞50000Da的滤膜)过滤，再使用冷冻干燥得到茶褐素精品。
(6)使用顶空-气相色谱质谱法对茶褐素精品中的乙醇、乙酸乙酯残留量进行测定，求出茶褐素精品中茶褐素的实际含量，茶褐素精品中茶褐素的实际含量为：1-(乙醇％+乙酸乙酯％)。
茶褐素精品中乙醇、乙酸乙酯残留溶剂检测方法为：
标准品茶褐素测定溶液制备：精密称取茶褐素精品0.50g到5mL容量瓶，用水溶解并定容至刻度，吸取3.00mL到20mL顶空瓶内进行测定。其中，
色谱条件：色谱柱：DB-WAX毛细管色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)
进样口温度：250℃，分流比：20:1；
色谱柱温度：初始温度40℃，保持时间5min，以20℃/min升至200℃，保持时间3min，以60℃/min升至240℃，保持时间1min；柱流量(He)：1.2mL/min；
离子源温度：230℃，电子能量：70eV
监测模式：选择离子检测(SIM)，乙醇监测离子：30、31、45、46，乙酸乙酯监测离子：43、45、61、70、88。
顶空进样器：加热箱温度90℃，定量环温度100℃，传输线温度120℃，样品瓶平衡15min，进样持续时间0.5min。
测定茶褐素精品不同浓度的吸光度，获得标准六堡茶样品茶褐素浓度-吸光率曲线，如图1所示。
2、测定六堡茶中茶褐素含量
取10组不同批次的六堡茶茶叶，分别定为六堡茶1～10，将六堡茶1～10分别按本发明的测定方法、称重法、NY/T 3675-2020中的紫外法、间接紫外法分别测定各组六堡茶中的茶褐素含量。
本发明的测定方法：
(1)将六堡茶1～10分别作为待测定六堡茶样品1～10，每组待测定六堡茶样品分别进行如下操作：将每组待测定六堡茶样品放入沸水中浸泡，每100mL的沸水中加入待测定六堡茶样品的重量为2g，浸泡后在沸水浴中密封提取40min。加入的无水乙醇试剂占容易总量的90％，加入后放置在4℃冰箱中静置3小时。将经过静置的溶液在4℃下离心15min，离心速度为9000r/min，离心后得10组待测品沉淀物。
(2)将得到的10组待测品沉淀物分别进行如下操作：将待测品沉淀物用水溶解，并转移至100mL容量瓶中，定容至刻度，精密吸取上述稀释液0.50mL到50mL容量瓶，用水定容至刻度，摇匀，得到稀释的待测溶液放入紫外分光光度计中测定，测定的波长为280±2nm，比色明厚度为1cm，以超纯水作为空白调零，测定得10组待测品吸光度。
在测定待测品吸光度时，若吸光度不在0.1～0.7范围时，将溶解稀释后的溶液进一步稀释后再放入紫外分光光度计中测定得待测品吸光度，直至测定的待测品吸光度在0.1～0.7范围中。
(3)利用标准六堡茶样品茶褐素浓度-吸光率曲线求出10组待测品吸光度分别对应的茶褐素浓度，并计算10组待测品茶褐素含量，如表1所示。
表110组六堡茶的吸光度、茶褐素浓度及茶褐素含量情况
| 名称 | 测得吸光度 | 浓度/(ug/mL) | 取样量/g | 茶褐素百分数 |
| 六堡茶1 | 0.2698 | 48.7626 | 5.0121 | 9.7％ |
| 六堡茶2 | 0.2787 | 50.5533 | 5.0211 | 10.1％ |
| 六堡茶3 | 0.2946 | 53.7525 | 5.0312 | 10.7％ |
| 六堡茶4 | 0.3014 | 55.1207 | 5.0144 | 11.0％ |
| 六堡茶5 | 0.2945 | 53.7324 | 5.0333 | 10.7％ |
| 六堡茶6 | 0.2844 | 51.7002 | 5.0345 | 10.3％ |
| 六堡茶7 | 0.3544 | 65.7847 | 5.0122 | 13.1％ |
| 六堡茶8 | 0.3824 | 71.4185 | 5.0344 | 14.2％ |
| 六堡茶9 | 0.3788 | 70.6942 | 5.0612 | 14.0％ |
| 六堡茶10 | 0.3648 | 67.8773 | 5.0944 | 13.3％ |
利用称重法、NY/T 3675-2020中的紫外法、间接紫外法分别测定各组六堡茶中的茶褐素含量分别如表2所示。
表2不同方法测定10组六堡茶茶褐素的含量情况
根据表1和表2可得，使用称量法测得10组待测定六堡茶样品的茶褐素含量为9.7％～13.9％，使用NY/T 3675-2020中的紫外法测得10组待测定六堡茶样品的茶褐素含量为20.1％～25.5％，使用间接紫外法测得10组待测定六堡茶样品的茶褐素含量为29.2～40.1％，本发明的测定方法测得10组待测定六堡茶样品的茶褐素含量为9.7％～14.2％。称量法与本发明的测定方法测得茶褐素含量接近，间接紫外法测定结果与称量法测定结果差异较大，NY/T 3675-2020与称量法测定结果差异较大。原因是NY/T 3675-2020标准中罗勃兹经验系数不适用于六堡茶中茶褐素的测定，六堡茶与红茶基质差异大。间接紫外法中没有茶褐素对照品作为基准，误差较大。
本发明的测定方法通过制备的茶褐素对照品对六堡茶样品中的茶褐素测定，10组待测定六堡茶样品每组均取6份样品，每一份样品均利用本发明的测定方法进行测定茶褐素含量，并计算这些样本测定的重复性，再对待测定六堡茶样品进行加标试验和定量限试验，测定结果分别如表3至5所示。
表3 10组待测定六堡茶样品测定茶褐素含量情况
表4待测定六堡茶样品茶褐素加标试验情况
表5待测定六堡茶样品茶褐素定量限试验情况
根据表3至5可得，10组待测定六堡茶样品中取出的6份样品的茶褐素含量为9.7％～14.2％，得到测定每组待测定六堡茶样品中的6份样品测定的重复性RSD为2.3％～4.2％，使用茶褐素对照品对待测定六堡茶样品进行加标试验在加标量范围在0.5％～15％时回收率为92.6％～106.2％，使用空白溶液加入茶褐素对照品进行定量限试验测定得到茶褐素的定量限为0.5％，线性相关系数为0.997。由此可见，本发明的测定方法重复性、回收率、线性关系、灵敏度都较好，对于测定六堡茶中茶褐素具有较高专属性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种六堡茶中茶褐素含量的测定方法，其特征在于，包括如下制备步骤：
(1)取多个不同批次等级是1级六堡茶混合后制备茶褐素对照品，并进行茶褐素的纯度标定，利用标定的茶褐素标准品制备标准六堡茶样品茶褐素浓度-吸光率曲线；
(2)取待测定六堡茶样品浸泡提取过滤，加入无水乙醇混合静置，离心后得待测品沉淀物；
(3)将步骤(2)所得待测品沉淀物用水溶解稀释，将其放入紫外分光光度计中测定得待测品吸光度；
(4)利用标准六堡茶样品茶褐素浓度-吸光率曲线求出步骤(3)所得待测品吸光度对应茶褐素浓度，再根据稀释溶液体积求出茶褐素含量。
2.根据权利要求1所述的六堡茶中茶褐素含量的测定方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，将待测定六堡茶样品放入沸水中浸泡，每100mL的沸水中加入待测定六堡茶样品的重量为2g，浸泡后在沸水浴中密封提取40min。
3.根据权利要求2所述的六堡茶中茶褐素含量的测定方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，加入的无水乙醇试剂占容易总量的90％，加入后放置在4℃冰箱中静置3小时。
4.根据权利要求3所述的六堡茶中茶褐素含量的测定方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，将经过静置的溶液在4℃下离心15min，离心速度为9000r/min。
5.根据权利要求1所述的六堡茶中茶褐素含量的测定方法，其特征在于，所述的步骤(3)中，将溶解稀释后的溶液放入紫外分光光度计中测定时，测定的波长为280±2nm，比色明厚度为1cm。
6.根据权利要求5所述的六堡茶中茶褐素含量的测定方法，其特征在于，所述的步骤(3)中，若测定的待测品吸光度不在0.1～0.7范围时，将溶解稀释后的溶液进一步稀释后再放入紫外分光光度计中测定得待测品吸光度，直至测定的待测品吸光度在0.1～0.7范围中。
7.根据权利要求1所述的六堡茶中茶褐素含量的测定方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，包括以下步骤：
(1.1)取多个不同批次的1级六堡茶各1等份混合得标准六堡茶样品；
(1.2)将步骤(1.1)所得标准六堡茶样品放入沸水中浸泡后水浴提取，过滤、浓缩后得标准品浓缩液；
(1.3)往步骤(1.2)所得标准品浓缩液中加入无水乙醇混合静置，离心后得标准品沉淀物；
(1.4)将步骤(1.3)所得标准品沉淀物加入乙酸乙酯试剂混合静置，离心后烘干得茶褐素粗品；
(1.5)将步骤(1.4)所得茶褐素粗品溶解过滤，冷冻干燥得茶褐素精品；
(1.6)利用步骤(1.5)所得茶褐素精品制备茶褐素浓度-吸光率曲线法计算出六堡茶样品中茶褐素的含量。
8.根据权利要求7所述的六堡茶中茶褐素含量的测定方法，其特征在于，所述的步骤(1.6)中，测定茶褐素精品不同浓度的吸光度前，还需要使用顶空-气相色谱质谱法对其中的乙醇、乙酸乙酯残留量进行测定，求出茶褐素精品中茶褐素的实际含量。
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