CN118010870A - 同时测定不同食品基质中多种硝基苯酚类化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明所述同时测定不同食品基质中多种硝基苯酚类化合物的方法，将2,4‑二硝基苯酚、2,5‑二硝基苯酚、2,6‑二硝基苯酚、3,4‑二硝基苯酚和3,5‑二硝基苯酚用乙腈‑乙酸溶液配制一系列2,4‑二硝基苯酚、2,5‑二硝基苯酚、2,6‑二硝基苯酚、3,4‑二硝基苯酚、3,5‑二硝基苯酚浓度不同的混合液作为标样；将被测食品基质经提取处理和净化处理得到试样；然后采用高效液相色谱‑串联质谱法对试样和标样进行检测，得到试样中2,4‑二硝基苯酚、2,5‑二硝基苯酚、2,6‑二硝基苯酚、3,4‑二硝基苯酚、3,5‑二硝基苯酚的浓度，再通过试样中2,4‑二硝基苯酚、2,5‑二硝基苯酚、2,6‑二硝基苯酚、3,4‑二硝基苯酚、3,5‑二硝基苯酚的浓度计算出被测食品基质中各硝基苯酚类化合物的含量。
Description
技术领域
本发明属于硝基苯酚类化合物检测技术领域，涉及不同食品基质中2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚等多种化合物的同时测定方法。
背景技术
硝基苯酚类化合物主要包括2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚。其中，2,4-二硝基苯酚(2,4-Dinitrophenol，2,4-DNP)是一种典型的线粒体氧化磷酸化解偶联剂，具有提高新陈代谢的功能，在20世纪30年代曾经做“节食辅助剂”广泛用于减肥药，但长期服用会产生一系列副作用，急性中毒时会导致生恶心、呕吐、出汗、头晕、体温上升等现象，慢性中毒时会导致白内障、皮肤损伤、骨髓中枢神经系统和心血管系统的不同程度受损等问题。由于2,4-二硝基苯酚是具有多种工业用途的化学产品，因此目前还是能够在政府监管下合法生产和售卖，但禁止人类服用。
关于硝基苯酚类化合物的检测，目前的研究多集中于土壤及水资源方面的污染治理，检测方法也局限于硝基苯酚类化合物总量的检测，缺乏对各种具体硝基苯酚类化合物(例如2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚)的定性定量检测方法。在减肥食品领域，比如茶叶、巧克力、咖啡、压片糖果和固体饮料等，目前我国尚没有硝基苯酚类化合物的检测方法，更没有相应的限量标准，因此建立针对减肥食品基质中硝基苯酚类化合物的检测尤为必要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供同时测定不同食品基质中多种硝基苯酚类化合物的方法，以实现对食品、尤其是减肥食品中所含2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚的定量检测，并具有良好的准确度和精密度，同时降低分析成本。
本发明所述同时测定不同食品基质中多种硝基苯酚类化合物的方法，将2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚用乙腈-乙酸溶液配制一系列2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚浓度不同的混合液作为系列标样，所述乙腈-乙酸溶液中，乙腈与乙酸的体积比为99：1；将被测食品基质经提取处理和净化处理得到试样溶液；然后采用液相色谱-质谱联用仪对系列标样和试样溶液进行检测，得到试样中2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚的浓度，再通过试样中2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚的浓度计算出被测食品基质中2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚的含量。
上述方法中，被测食品基质的提取处理操作如下：
(1)被测食品基质为茶叶及其制品
当茶叶及其制品为固体物时，将其样品粉碎后加入去离子水静置至完全溶胀，当茶叶制品为液体物时，将其样品直接加入去离子水，然后加入乙腈-乙酸溶液和陶瓷均质子通过振荡混合均匀，再加入无水硫酸镁和无水乙酸钠并通过振荡混合均匀，随后通过超声使样品提取完全，超声后经离心分离所得上清液即为提取液；粉碎后的茶叶及其制品或液体茶叶制品的样品与去离子水的质量比为1：5～6；乙腈-乙酸溶液中，乙腈与乙酸的体积比为99：1，乙腈-乙酸溶液的加入量应同时满足使样品中五种硝基苯酚类化合物提取完全和达到检出限的要求；粉碎后的茶叶及其制品或液体茶叶制品的样品与无水硫酸镁的质量比为1：3～4，粉碎后的茶叶及其制品或液体茶叶制品的样品与无水乙酸钠的质量比为1：0.7～1；
(2)被测食品基质为茶叶及其制品以外的其它食品
当其它食品为常温捣碎遇热不易融化的固体物时，将其样品粉碎后加入乙腈-乙酸溶液和陶瓷均质子，当其它食品为常温捣碎遇热易融化的固体物时，将其样品冷却后再粉碎后加入乙腈-乙酸溶液和陶瓷均质子，当其它食品为液体物时，将其样品直接加入乙腈-乙酸溶液和陶瓷均质子，然后通过振荡混合均匀，再通过超声使样品提取完全，超声后经离心分离所得上清液即为提取液；乙腈-乙酸溶液中，乙腈与乙酸的体积比为99：1，乙腈-乙酸溶液的加入量应同时满足使样品中五种硝基苯酚类化合物提取完全和达到检出限的要求。
上述方法中，被测食品基质的净化处理操作如下：
(1)被测食品基质为茶叶及其制品
将茶叶及其制品的提取液加入装有除水剂和净化剂的容器中混合均匀，然后离心分离得上清液，再将上清液过有机滤膜，所得滤液即为试样；所述除水剂为无水硫酸镁，所述净化剂为C18(十八烷基硅烷键和硅胶)和PSA(乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶)，无水硫酸镁、C18、PSA的质量比为3：1：1；所述茶叶及其制品的提取液质量与除水剂和净化剂的总质量之比为4：0.8～1.2；
(2)被测食品基质为茶叶及其制品以外的其它食品
将增强型脂质去除净化剂(EMR-Lipid)用去离子水活化，所述净化剂(EMR-Lipid)与去离子水的质量比为1：5～8；将其它食品的提取液和活化所得净化液按所述提取液与所述净化液的体积比为1.3～2：1计量，并将它们混合均匀，再离心分离得第一上清液；然后将所得第一上清液加入装有氯化钠和无水硫酸钠的容器中混合均匀，再离心分离得第二上清液，将第二上清液过有机滤膜，所得滤液即为试样；所述氯化钠与其它食品样品的质量比为1～2：1，所述无水硫酸钠与其它食品样品的质量比为1～2：1，所述第一上清液与氯化钠和无水硫酸钠的总质量之比为1：0.2～0.3。
上述方法中，采用液相色谱-质谱联用仪对试样和标样进行检测的操作如下：
(1)定性检测
按照高效液相色谱-串联质谱条件测定试样和系列标样，记录试样和标样中各硝基苯酚类化合物的色谱保留时间，以相对于最强离子丰度的百分比作为定性离子对的相对离子丰度，记录浓度相当的试样与标样中相应硝基苯酚类化合物的相对离子丰度；当试样中检出与某标样中2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚的色谱峰保留时间变化范围在±2.5％之内的色谱峰，并且相对离子丰度允许偏差不超过规定的范围时，则确定试样中含有相应硝基苯酚类化合物，反之，试样中不含有相应硝基苯酚类化合物；
(2)定量检测
①准曲线的制作
按照高效液相色谱-串联质谱条件，将系列标样进行测定，得到各标样中2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚的定量离子色谱峰面积，以标样中硝基苯酚类化合物质量浓度为横坐标，以定量离子色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚的标准曲线；
②试样的检测
按照高效液相色谱-串联质谱的条件，将试样进行测定，得到试样中2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚的定量色谱峰面积，再根据所绘制的2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚标准曲线，得到试样中2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚的浓度。
试样中被测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内，如果试样中被测物的浓度超出标准曲线范围时，应对试样作相应稀释后再进行测定。
上述方法中，通过试样中2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚的浓度计算被测食品基质中上述各硝基苯酚类化合物含量采用下述公式：
式中，
X，被测食品基质中硝基苯酚类化合物的含量，
C，检测所得试样中硝基苯酚类化合物的浓度，
V，被测食品基质提取处理时所加入乙腈-乙酸溶液的体积，
m，被测食品基质样品的取样量。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明所述方法填补了在食品领域、尤其是减肥食品领域国内外尚无2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚等具体硝基苯酚类化合物检测方法及标准的空白，同时优化了被测食品基质提取处理和净化处理及分离条件，优化了定性定量方法，为打击减肥食品中非法添加硝基苯酚类化合物的行为提供了技术支撑。
2、本发明所述方法具有良好的准确度及精密度，实施例表明，所测定的茶叶和巧克力的空白样品在不同水平的加标回收率及精密度分别为83.3％～94.8％、0.75％～6.21％〔(n＝6)，见表5和表10〕，因而本发明所述方法满足检测的要求。
3、采用本发明所述方法，使用一套仪器、一种试剂体系、通过一次操作就能同时获得5种硝基苯酚类化合物的含量，既可减少测试工作量，又可节约分析试剂，从而降低分析成本。
附图说明
图1是实施例1、实施例2中所测定的系列标样中其中一个标样的总离子流图(2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚浓度分别为0.25ng/mL、5ng/mL、2ng/mL、0.5ng/mL、0.05ng/mL)。
图2是实施例1中对5种硝基苯酚类化合物标准品在空白茶叶中加标所制备试样进行测定的总离子流图(2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚浓度分别为0.25ng/mL、5ng/mL、2ng/mL、0.5ng/mL、0.05ng/mL)。
图3是实施例2中对5种硝基苯酚类化合物标准品在空白巧克力中加标所制备试样进行测定的总离子流图(2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚浓度分别为0.25ng/mL、5ng/mL、2ng/mL、0.5ng/mL、0.05ng/mL)。
图4是实施例1、实施例2中将系列标样进行测定所绘制的2.4-二硝基苯酚标准曲线图。
图5是实施例1、实施例2中将系列标样进行测定所绘制的2.5-二硝基苯酚标准曲线图。
图6是实施例1、实施例2中将系列标样进行测定所绘制的2.6-二硝基苯酚标准曲线图。
图7是实施例1、实施例2中将系列标样进行测定所绘制的3.4-二硝基苯酚标准曲线图。
图8是实施例1、实施例2中将系列标样进行测定所绘制的3.5-二硝基苯酚标准曲线图。
图9是实施例1中绿茶检测所得2,4-二硝基苯酚含量分布图。
图10是实施例1中茉莉花茶检测所得2,4-二硝基苯酚含量分布图。
图11是实施例1中红茶检测所得2,4-二硝基苯酚含量分布图。
图12是实施例1中普洱茶检测所得2,4-二硝基苯酚含量分布图。
图13是实施例1中白茶检测所得2,4-二硝基苯酚含量分布图。
图14是实施例1中A、B两省份的绿茶检测所得2,4-二硝基苯酚含量分布图。
具体实施方式
下面通过实施例并结合附图对本发明所述同时测定不同食品基质中多种硝基苯酚类化合物的方法作进一步说明。显然，所描述实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所保护的范围。
下述实施例中，2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚标准品均通过市场购买；其他化学试剂为色谱纯，均通过市场购买。
实施例1
本实施例用高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)同时测定茶叶中的2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚。
一、空白茶叶的测定
所述空白茶叶，是不含2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚的茶叶，用于本发明所述方法的验证。本实施例中，空白茶叶是从市场购买的绿茶。
步骤如下：
1、标样的配制
(1)中间溶液的配制
分别量取浓度均为100μg/mL的2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚标准品100μL，置于五个10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混匀，即得浓度为1.0μg/mL的五种硝基苯酚类中间溶液，分别置于棕色储液瓶中于-20℃保存备用；
(2)混合标准溶液的配制
分别量取2,4-二硝基苯酚中间溶液0.25mL、2,5-二硝基苯酚中间溶液5mL、2,6-二硝基苯酚中间溶液2mL、3,4-二硝基苯酚中间溶液0.5mL、3,5-二硝基苯酚中间溶液0.05mL，将它们置于同一个10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混匀，即得混合标准溶液，将其置于棕色储液瓶中，于-20℃保存备用；混合标准溶液中，2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚的浓度分别为0.025μg/mL、0.5μg/mL、0.2μg/mL、0.05μg/mL、0.005μg/mL；
(3)系列标样的配制
分别量取混合标准溶液1μL、2μL、5μL、10μL、20μL、50μL置于六个容量瓶中，用乙腈-乙酸溶液(乙腈：乙酸＝99：1，体积比)稀释至1.00mL，摇匀，即得到六个五种硝基苯酚类化合物组成的系列标样溶液；
2、试样的制备
(1)被测绿茶的提取处理
称取绿茶样品2g粉碎后置于50mL离心管中，加10mL去离子水，混和均匀后静置30min使其完全溶胀；然后加入15mL乙腈-乙酸溶液(乙腈：乙酸＝99：1，体积比)及1颗陶瓷均质子，剧烈振荡1min混合均匀，再加入6g无水硫酸镁、1.5g无水乙酸钠，剧烈振荡1min混合均匀，随后超声10min，再以8000r/min离心5min，所得上清液即为绿茶提取液；
(2)绿茶提取液的净化处理
吸取2.0mL绿茶提取液至内含无水硫酸镁(除水剂)及C18和PSA(净化剂)的离心管中，涡旋混匀2min，再以8000r/min离心5min，所得上清液过0.22μm有机滤膜，经有机滤膜过滤所得滤液即为试样；所述离心管中含300mg无水硫酸镁、100mg C18、100mg PSA。
3、仪器条件
(1)液相条件
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH Shield RP18(100mm x 3.0mm，1.7μm)；流动相：A为浓度10mmoL/L甲酸铵水溶液(含体积分数为0.1％的甲酸)，B为乙腈(含体积分数为0.1％甲酸)，梯度洗脱程序：0～10.0min，25％ B～70％ B；10.0～10.01min，70％ B～25％B；10.01～13.0min，25％ B。柱温：30℃；流速：0.25mL/min；进样量：5μL。
(2)质谱条件
离子化模式：电喷雾电离，负离子模式(ESI-)；质谱扫描方式：多反应离子对监测(MRM)；气帘气压力(CUR)：55kPa，碰撞气压力(CAD)：55kPa，喷雾电压(IS)：-4500V，离子源温度(TEM)：500℃，雾化气压力(GS1)：207kPa，辅助加热气压力2(GS2)：207kPa，优化后的质谱参数见表1。
表1化合物的主要质谱条件参数
注:*表示定量离子(quantitative ion)，对于不同质谱仪器，参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳
4、定性测定
按照高效液相色谱-串联质谱条件测定试样和系列标样，记录试样和标样中硝基苯酚类化合物的色谱保留时间，以相对于最强离子丰度的百分比作为定性离子对的相对丰度，记录浓度相当的试样与标样中相应成分的相对离子丰度；当试样中检出与某标样中2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚的色谱峰保留时间变化范围在±2.5％之内的色谱峰，并且相对离子丰度允许偏差不超过表2规定的范围时，则确定试样中含有相应硝基苯酚类化合物。反之，试样中不含有相应硝基苯酚类化合物。
表2定性时供试样中离子相对丰度的允许偏差范围
| 相对离子丰度(％) | 最大允许偏差(％) |
| ＞50 | ±20 |
| 20～50 | ±25 |
| 10～20 | ±30 |
| ≤10 | ±50 |
由于被测绿茶为空白茶叶，因此试样中不含有相应硝基苯酚类化合物。
5、定量测定
(1)标准曲线的制作
按照高效液相色谱-串联质谱条件，将六个五种硝基苯酚类化合物标样组成的系列标样进行测定，得到各标样中2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚的定量离子色谱峰面积，以标样中硝基苯酚类化合物的质量浓度为横坐标，以定量离子色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚的标准曲线，所绘制的标准曲线见图4至图8。根据图4至图8所示标准曲线得到的线性方程、相关系数见表3。
表3 5种化合物在乙腈-乙酸溶液中的线性方程、线性范围
(2)试样溶液的测定
按照高效液相色谱-串联质谱条件，将试样进行测定，得到的试样中五种硝基苯酚类化合物色谱峰面积为0，此茶叶中五种硝基苯酚类化合物的测定浓度均为0。
6、硝基苯酚类化合物含量的计算
用下述公式计算2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚的含量：
X，绿茶中硝基苯酚类化合物的含量，单位为μg/kg；
C，检测所得试样中硝基苯酚类化合物的浓度，单位为ng/mL；
V，绿茶样品提取处理时所加入乙腈-乙酸溶液的体积，单位为mL；
m，绿茶样品取样量，单位为g。
空白茶叶检测中，绿茶样品提取处理时所加入乙腈-乙酸溶液的体积为15mL，绿茶样品取样量为2g，但由于检测所得试样中五种硝基苯酚类化合物的浓度为零，经计算被检测绿茶中2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚的含量均为0。
7、方法验证
(1)基质效应
由于质谱响应较易受到样品基质的干扰，实验过程中采用相对响应值法对绿茶中的基质效应(ME)进行了考察，通过计算基质匹配标准曲线与纯溶剂标准曲线的斜率比来评价基质效应；此处的纯溶剂标准曲线表示用乙腈-乙酸溶液(乙腈：乙酸＝99：1，体积比)配制由五种硝基苯酚类化合物浓度不同的混合液组成的系列标样(与本实施例中“空白茶叶的测定”部分配制的系列标样数量和浓度相同)，按照高效液相色谱-串联质谱条件检测所得的标准曲线(与图4至图8相同)，基质匹配标准曲线表示用空白茶叶(绿茶)按照上述的绿茶提取处理和净化处理方法得到的净化滤液配制由五种硝基苯酚类化合物浓度不同的混合液组成的系列标样(系列标样的数量及标样中五种硝基苯酚类化合物浓度与测定纯溶剂标准曲线中的相同)，按照高效液相色谱-串联质谱条件检测所得的标准曲线。一般来说，当ME值在80％～120％之间时，表明基质效应在可接受范围内，在实际检测中可以忽略基质效应；反之则应考虑基质效应对实际检测的影响。绿茶中五种硝基苯酚类化合物化合物的ME计算见表4。结果显示该类化合物均不存在较强的基质效应，可忽略基质效应，在实际检测中可采用乙腈-乙酸溶液(乙腈：乙酸＝99：1，体积比)配制标样进行定量检测。
表4五种硝基苯酚类化合物在空白茶叶中的基质效应
(2)线性范围和相关系数
根据五种硝基苯酚类化合物在高效液相色谱-串联质谱仪上的响应，用乙腈-乙酸溶液(乙腈：乙酸＝99：1，体积比)配制2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚系列标样，在已优化的色谱条件下，以峰面积(Y)对相应的质量浓度(X)作图，绘制标准曲线，并计算各被测硝基苯酚类化合物线性回归方程及其相关系数。附图4～附图8及表3表明，2,4-二硝基苯酚浓度在0.025～1.25ng/mL范围内、2,5-二硝基苯酚浓度在0.5～25ng/mL范围内、2,6-二硝基苯酚浓度在0.2～10ng/mL范围内、3,4-二硝基苯酚浓度在0.05～2.5ng/mL范围内、3,5-二硝基苯酚浓度在0.005～0.25ng/mL范围内，线性关系良好，相关系数r均＞0.999。
(3)回收率和精密度
按照空白茶叶的测定步骤1-步骤6，对不含被测硝基苯酚类化合物的空白茶叶样品用五种硝基苯酚类化合物标准品进行加标回收试验，不同加标水平分别制样6份，考察本发明所述方法的准确度和精密度，结果见表5。结果表明，五种硝基苯酚类化合物各添加水平的平均回收率均在65.0％～115.0％之间，精密度均＜10％，方法的准确度和精密度均基本满足定量分析的要求。另外取在空白茶叶样品中添加定量限水平的样品在0d、2d、4d、7d分别测定，以回收率表示，由表6可见，2,4-二硝基苯酚和2,6-二硝基苯酚的标准溶液在放置1天后，开始有明显降解，实验过程中应临用新配。
表5五种硝基苯酚类化合物的回收率和精密度结果
表6五种硝基苯酚类化合物日间精密度结果
(4)检出限和定量限
采用空白茶叶加标并逐级稀释的方式进行检出限(LOD)确定，按照空白茶叶提取处理和净化处理的方法得到加标试样，采用高效液相色谱-串联质谱条件进行检测。根据各硝基苯酚类化合物的特征色谱峰的信噪比S/N＝3和S/N＝10时对应的加标水平确定检出限(LOD)和定量限(LOQ)，最终确定2,4-二硝基苯酚的检出限为0.075μg/kg、定量限为0.1875μg/kg，2,5-二硝基苯酚的检出限为1.50μg/kg、定量限为3.75μg/kg，2,6-二硝基苯酚的检出限为0.375μg/kg、定量限为1.50μg/kg，3,4-二硝基苯酚的检出限为0.15μg/kg、定量限为0.375μg/kg，3,5-二硝基苯酚的检出限为0.015μg/kg、定量限为0.0375μg/kg。
二、实际茶叶测定
实际茶叶测定采用与空白茶叶测定相同的方法，对从市场购买和网购的423批茶叶进行测定，其中绿茶290批，茉莉花茶85批，红茶33批，普洱茶9批，白茶6批。测定时，每批茶叶至少取一个样品，取样量为2g，测定结果均只检出2,4-二硝基苯酚，其余四种硝基苯酚类化合物未检出。实际茶叶中2,4-二硝基苯酚具体检出情况见表7及图9至图13。检测结果表明，不同种类的茶叶中2,4-二硝基苯酚含量有较大差异，绿茶中2,4-二硝基苯酚含量相对较高，6批白茶均检出2,4-二硝基苯酚，茉莉花茶、红茶和普洱茶中2,4-二硝基苯酚含量范围较为接近，其原因可能与不同茶叶的生长习性、对2,4-二硝基苯酚的富集程度和土壤、水源环境有关。
表7茶叶中2,4-二硝基苯酚的含量
三、不同省份绿茶中2.4-二硝基苯酚的比较
采用与空白茶叶样品测定相同的方法，对从A省份市场购买和网购的230批绿茶和从B省份市场购买和网购的60批绿茶分别进行测定，测定时，每批茶叶至少取一个样品，取样量为2g。检测结果见图14，从图14可以看出，A省份和B省份的绿茶均只检出2.4-二硝基苯酚，其余四种硝基苯酚类化合物未检出，A省份绿茶中2.4-二硝基苯酚含量范围为0～18.81μg/kg，B省份绿茶中2.4-二硝基苯酚含量范围为0～2.49μg/kg。检测结果表明，两个省份茶叶中2.4-二硝基苯酚含量差异较大，B省份的绿茶中2.4-二硝基苯酚含量远低于A省份，其原因可能与当地茶叶种植的土壤及水源环境有关。
实施例2
本实施例用高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)同时测定巧克力中2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚。
一、空白巧克力的测定
所述空白巧克力，是不含2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚的巧克力，用于本发明所述方法的验证。本实施例中，空白巧克力从市场购买。
操作如下：
1、标样的配制
与实施例1中标样的配制相同。
2、试样的制备
(1)被测巧克力的提取处理
将被测巧克力于-20℃冷冻12h后，经组织捣碎机捣碎混匀，称取捣碎混匀的巧克力样品1g置于50mL离心管中，再加入10mL乙腈-乙酸溶液(乙腈：乙酸＝99：1，体积比)及1颗陶瓷均质子，剧烈振荡1min混合均匀，然后超声10min，再以8000r/min离心5min，所得上清液即为巧克力提取液；
(2)巧克力提取液的净化处理
将600mg增强型脂质去除净化剂(EMR-Lipid)用3mL去离子水活化，吸取巧克力提取液5mL加入上述活化后的净化液中，混匀2min，再于4℃下以8000r/min离心5min得第一上清液；将第一上清液加入装有1g氯化钠和1g无水硫酸钠的离心管中，涡旋混匀2min，再于4℃下以8000r/min离心5min，得第二上清液；将第二上清液过0.22μm有机滤膜，经有机滤膜过滤所得滤液为试样；
3、仪器条件
与实施例1相同。
4、定性测定
按照高效液相色谱-串联质谱条件测定试样和系列标样，记录试样和标样中硝基苯酚类化合物的色谱保留时间，以相对于最强离子丰度的百分比作为定性离子对的相对丰度，记录浓度相当的试样与标样中相应成分的相对离子丰度；当试样中检出与某标样中2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚的色谱峰保留时间变化范围在±2.5％之内的色谱峰，并且相对离子丰度允许偏差不超过表8规定的范围时，则确定试样中具有相应硝基苯酚类化合物。反之，试样中不具有相应硝基苯酚类化合物。
表8定性时供试样中离子相对丰度的允许偏差范围
| 相对离子丰度(％) | 最大允许偏差(％) |
| ＞50 | ±20 |
| 20～50 | ±25 |
| 10～20 | ±30 |
| ≤10 | ±50 |
由于被测巧克力为空白巧克力，因此试样中不具有相应硝基苯酚类化合物。
5、定量测定
(1)标准曲线的制作
与实施例1相同。
(2)试样溶液的测定
按照高效液相色谱-串联质谱条件，将试样进行测定，得到的试样中五种硝基苯酚类化合物的色谱峰面积为0，此巧克力中五种硝基苯酚类化合物的测定浓度均为0。
6、硝基苯酚类化合物含量的计算
用下述公式计算2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚的含量：
X，巧克力中硝基苯酚类化合物的含量，单位为μg/kg；
C，检测所得试样中硝基苯酚类化合物的浓度，单位为ng/mL；
V，巧克力样品提取处理时所加入乙腈-乙酸溶液的体积，单位为mL；
m，巧克力样品取样量，单位为g。
空白巧克力检测中，巧克力样品提取处理时所加入乙腈-乙酸溶液的体积为10mL,巧克力样品取样量为1g，但由于检测所得试样中五种硝基苯酚类化合物的浓度为零，经计算被检测巧克力中2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚的含量均为0。
7、方法验证
(1)基质效应
由于质谱响应较易受到样品基质的干扰，实验过程中采用相对响应值法对巧克力中的基质效应(ME)进行了考察，通过计算基质匹配标准曲线与纯溶剂标准曲线的斜率比来评价基质效应；此处的纯溶剂标准曲线表示用乙腈-乙酸溶液(乙腈：乙酸＝99：1，体积比)配制由五种硝基苯酚类化合物浓度不同的混合液组成的系列标样(与本实施例中“空白巧克力的测定”部分配制的系列标样数量和浓度相同)，按照高效液相色谱-串联质谱条件检测所得的标准曲线(与图4至图8相同)，基质匹配标准曲线表示用空白巧克按照上述的巧克力提取处理和净化处理方法得到的净化滤液配制由五种硝基苯酚类化合物浓度不同的混合液组成的系列标样(系列标样的数量及标样中五种硝基苯酚类化合物浓度与测定纯溶剂标准曲线中的相同)，按照高效液相色谱-串联质谱条件检测所得的标准曲线。一般来说，当ME值在80％～120％之间时，表明基质效应在可接受范围内，在实际检测中可以忽略基质效应；反之则应考虑基质效应对实际检测的影响。巧克力中五种化合物的ME计算见表9。结果显示该类化合物均不存在较强的基质效应，可忽略基质效应，在实际检测中可采用乙腈-乙酸溶液(乙腈：乙酸＝99：1，体积比)配制标样进行定量检测。
表9五种化合物在空白巧克力的基质效应
(2)线性范围和相关系数
与实施例1相同。
(3)回收率和精密度
按照空白巧克力的测定步骤1-步骤6，对不含被测硝基苯酚类化合物的空白巧克力样品用五种硝基苯酚类化合物标准品进行加标回收试验，不同加标水平分别制样6份，考察本发明所述方法的准确度和精密度，结果见表10。结果表明，5种硝基苯酚类化合物各添加水平的平均回收率在65.0％～115.0％之间，精密度均＜10％，方法的准确度和精密度均基本满足定量分析的要求。
表10五种硝基苯酚类化合物的回收率和精密度结果
(4)检出限和定量限
采用空白巧克力加标并逐级稀释的方式进行检出限(LOD)确定，按照空白巧克力提取处理和净化处理得到加标试样，采用高效液相色谱-串联质谱条件进行检测。根据各硝基苯酚类化合物的特征色谱峰的信噪比S/N＝3和S/N＝10时对应的加标水平确定检出限(LOD)和定量限(LOQ)，最终确定2,4-二硝基苯酚的检出限为0.10μg/kg、定量限为0.25μg/kg，2,5-二硝基苯酚的检出限为1.5μg/kg、定量限为5.00μg/kg，2,6-二硝基苯酚的检出限为0.50μg/kg、定量限为2.00μg/kg，3,4-二硝基苯酚的检出限为0.15μg/kg、定量限为0.50μg/kg，3,5-二硝基苯酚的检出限为0.015μg/kg、定量限为0.05μg/kg。
二、实际巧克力测定
实际巧克力测定采用与空白巧克力测定相同的方法。对从市场购买和网购的20批巧克力进行测定，测定时，每批巧克力至少取一个样品，取样量为1g。检测结果显示，20批巧克力中均未检出2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚。
Claims (5)
1.一种同时测定不同食品基质中多种硝基苯酚类化合物的方法，其特征在于将2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚和3,5-二硝基苯酚用乙腈-乙酸溶液配制一系列2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚浓度不同的混合液作为标样，所述乙腈-乙酸溶液中，乙腈与乙酸的体积比为99：1；将被测食品基质经提取处理和净化处理得到试样；然后采用高效液相色谱-串联质谱法对试样和系列标样进行检测，得到试样中2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚的浓度，再通过试样中2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚的浓度计算出被测食品基质中2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚的含量。
2.根据权利要求1所述同时测定不同食品基质中多种硝基苯酚类化合物的方法，其特征在于被测食品基质的提取处理操作如下：
(1)被测食品基质为茶叶及其制品
当茶叶及其制品为固体物时，将其样品粉碎后加入去离子水静置至完全溶胀，当茶叶制品为液体物时，将其样品直接加入去离子水，然后加入乙腈-乙酸溶液和陶瓷均质子通过振荡混合均匀，再加入无水硫酸镁和乙酸钠并通过振荡混合均匀，随后通过超声使样品提取完全，超声后经离心分离所得上清液即为提取液；粉碎后的茶叶及其制品或液体茶叶制品的样品与去离子水的质量比为1：5～6；乙腈-乙酸溶液中，乙腈与乙酸的体积比为99：1，乙腈-乙酸溶液的加入量应同时满足使样品中五种硝基苯酚类化合物提取完全和达到检出限的要求；粉碎后的茶叶及其制品或液体茶叶制品的样品与无水硫酸镁的质量比为1：3～4，粉碎后的茶叶及其制品或液体茶叶制品的样品与无水乙酸钠的质量比为1：0.7～1；
(2)被测食品基质为茶叶及其制品以外的其它食品
当其它食品为常温捣碎遇热不易融化的固体物时，将其样品粉碎后加入乙腈-乙酸溶液和陶瓷均质子，当其它食品为常温捣碎遇热易融化的固体物时，将其样品冷却后再粉碎后加入乙腈-乙酸溶液和陶瓷均质子，当其它食品为液体物时，将其样品直接加入乙腈-乙酸溶液和陶瓷均质子，然后通过振荡混合均匀，再通过超声使样品提取完全，超声后经离心分离所得上清液即为提取液；乙腈-乙酸溶液中，乙腈与乙酸的体积比为99：1，乙腈-乙酸溶液的加入量应同时满足使样品中五种硝基苯酚类化合物提取完全和达到检出限的要求。
3.根据权利要求2所述同时测定不同食品基质中多种硝基苯酚类化合物的方法，其特征在于被测食品基质的净化处理操作如下：
(1)被测食品基质为茶叶及其制品
将茶叶及其制品的提取液加入装有除水剂和净化剂的容器中混合均匀，然后离心分离得上清液，再将上清液过有机滤膜，所得滤液即为试样；所述除水剂为无水硫酸镁，所述净化剂为C18和PSA，无水硫酸镁、C18、PSA的质量比为3：1：1；所述茶叶及其制品的提取液质量与除水剂和净化剂的总质量之比为4：0.8～1.2；
(2)被测食品基质为茶叶及其制品以外的其它食品
将增强型脂质去除净化剂用去离子水活化，所述净化剂与去离子水的质量比为1：5～8；将其它食品的提取液和活化所得净化液按所述提取液与所述净化液的体积比为1.3～2：1计量，并将它们混合均匀，再离心分离得第一上清液；然后将所得第一上清液加入装有氯化钠和无水硫酸钠的容器中混合均匀，再离心分离得第二上清液，将第二上清液过有机滤膜，所得滤液即为试样；所述氯化钠与其它食品样品的质量比为1～2：1，所述无水硫酸钠与其它食品样品的质量比为1～2：1，所述第一上清液与氯化钠和无水硫酸钠的总质量之比为1：0.2～0.3。
4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述同时测定不同食品基质中多种硝基苯酚类化合物的方法，其特征在于采用高效液相色谱-串联质谱法对试样和标样进行检测的操作如下：
(1)定性检测
按照高效液相色谱-串联质谱条件测定试样和系列标样，记录试样和标样中各硝基苯酚类化合物的色谱保留时间，以相对于最强离子丰度的百分比作为定性离子对的相对离子丰度，记录浓度相当的试样与标样中相应硝基苯酚类化合物的相对离子丰度；当试样中检出与某标样中2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚的色谱峰保留时间变化范围在±2.5％之内的色谱峰，并且相对离子丰度允许偏差不超过规定的范围时，则确定试样中含有相应硝基苯酚类化合物，反之，试样中不含有相应硝基苯酚类化合物；
(2)定量检测
①标准曲线的制作
按照高效液相色谱-串联质谱条件，将系列标样进行测定，得到各标样中2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚的定量离子色谱峰面积，以标样中硝基苯酚类化合物质量浓度为横坐标，以定量离子色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚的标准曲线；
②试样的检测
按照高效液相色谱-串联质谱条件，将试样进行测定，得到试样中2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚的定量色谱峰面积，再根据所绘制的2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚标准曲线，得到试样中2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚的浓度。
5.根据权利要求4所述同时测定不同食品基质中多种硝基苯酚类化合物的方法，其特征在于通过试样中2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、3,4-二硝基苯酚、3,5-二硝基苯酚的浓度计算被测食品基质中上述各硝基苯酚类化合物含量采用下述公式：
式中，
X，被测食品基质中硝基苯酚类化合物的含量，
C，检测所得试样中硝基苯酚类化合物的浓度，
V，被测食品基质提取处理时所加入乙腈-乙酸溶液的体积，
m，被测食品基质样品的取样量。
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