CN104146112A - 从六堡茶中提取茶褐素提取物的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种六堡茶中的茶褐素的提取方法，具体按照以下步骤实施：原料预辐照处理；酶法处理；超声波处理；加热浸提；氯仿萃取；乙酸乙酯萃取；正丁醇萃取；蒸干，得到茶褐素提取物。本发明还提供一种由上述方法提取的茶褐素在保肝方面的应用。采用60Co-γ射线辐照可促进茶多酚类物质的氧化聚合形成更多的茶褐素，并用纤维素酶辅助提取技术可显著提高溶剂法茶褐素提取率。能够得到含量为25％左右的茶褐素提取物，高于其他方法的提取率(16％)，并在保肝实验中发现其对药物急性肝损伤有一定的保护作用，可作为保肝功能食品开发，有一定的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种从六堡茶中提取茶褐素提取物的方法，本发明还涉及一种由上述方法提取得到的茶褐素在保肝方面的应用。
背景技术
六堡茶是六大茶类黑茶中之一，原产于广西梧州市苍梧县六堡乡，历史悠久，品质佳。被称之为历史名茶。其生产历史可以追朔到一千五百年前，在清朝的嘉庆年间，由其自身的特殊的槟榔香味被列为中国的二十四大名茶之一。清朝末期的程远道曾写过一首诗用来赞美六堡茶：“六堡名茶满山岗，止疴去腻有专长。请君泡碗今宵喝，明日犹留齿颊香。”采用中叶种或大叶种茶树的新芽、嫩叶和嫩茎，利用六堡茶的传统工艺，初制(杀青、初揉、渥堆、复揉、干燥)和精制(筛、风、拣、拼配、初蒸渥堆、复蒸压笠、陈化)，制成含有黑茶品质特征的具有“六堡香味”(槟榔香味)的广西六堡茶，且越陈越口感佳。六堡茶因其具有红、浓、醇、陈四个特点而闻名中外，是中国特有的出口茶之一，远销东南亚各国及港澳地区、日本、美国等。中国当代的著名文化学者肖健，2012年曾为广西六堡茶作出定位，他评价广西梧州出产的六堡茶和云南普洱茶同为千年的中国名茶。
茶褐素一般认为是采用溶剂浸提法得到的茶汤经过氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取后剩余的呈褐色的物质。大部分学者认为茶褐素是在茶叶加工过程中由茶黄素和茶红素深度氧化而得的非透析性的褐色高聚物，其结构较为复杂，所含化学成分及结构式目前还未得到深入研究。秦谊等人以普洱茶为原料研究茶褐素的提取工艺，先将茶叶粉碎后乙醇浸泡，然后用热的蒸馏水提取，并用有机溶剂二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，剩余的水相经无水乙醇沉淀后即为茶褐素，通过红外光谱分析，含有O-H、N-H、C-H、C＝O、C-N、C-O-C等伸缩振动吸收。易恋等人、倪德江等人也以普洱茶为原料，周向军等人以乌龙茶为原料，均采用乙醇浸泡后热的蒸馏水提取，然后用不同极性的有机溶剂萃取，剩余的水相经过无水乙醇沉淀蒸干得到茶褐素，通过单因素和正交实验优化了茶褐素的提取工艺，获得了较高的提取率，并且测定了茶褐素的抗氧化活性。张水花等人以普洱茶为原料，在传统提取工艺的基础上，采用微波辅助提取的方法，利用单因素和正交试验优化了茶褐素的提取工艺，理化分析确定茶褐素是含有蛋白质和多糖类物质的弱酸性物质。杨新河等人对普洱茶提取所得茶褐素用葡聚糖凝胶层析柱(sephadex LH-20)柱分级分离，以丙酮-水溶液作为洗脱剂，收集得到6个级分，通过初步理化与光谱性质分析表明茶褐素的化学成分复杂，有待更深入的研究。目前主要的提取技术有以下几种：溶剂提取法、微波辅助提取法、超声辅助提取法和超临界流体萃取法。其中溶剂法提取杂质多，得率较低，费时，提取液过滤、浓缩等操作困难，溶剂消耗量大；微波辅助提取法是一种较为高效的提取分离技术，但现在大多处于实验室研究或中试阶段，真正能用于工业生产的较少；超声辅助提取法虽然有效能量利用极低，但操作过程中产生大量的热，同样不利于茶褐素等生理活性物质的提取；超临界流体萃取法，其设备投资和维护费用高，对茶褐素等极性较大的物质提取率较差。
发明内容
本发明的目的是提供一种六堡茶中的茶褐素的提取方法，解决了现有技术中存在的提取率低的问题。
本发明的另一个目的是提供一种由上述六堡茶中的茶褐素的提取方法提取得到的茶褐素在保肝方面的应用。
本发明所采用的第一技术方案是，一种六堡茶中的茶褐素的提取方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1、原料预辐照处理：
将六堡茶茶叶用粉碎机粉碎，筛选，经60Co-γ射线辐照，得到六堡茶茶叶粉末；
步骤2、酶法处理：
称取一定量的六堡茶茶叶粉末，加入蒸馏水，并加入纤维素酶，进行酶解，得到酶解处理液；
步骤3、超声波处理：
将酶解处理液在常温下超声处理30min，得到超声波处理液；
步骤4、加热浸提：
将超声处理液加热，并进行回流浸提，溶液趁热抽滤，再按步骤2的蒸馏水量加入蒸馏水浸提3次，合并滤液；
步骤5、氯仿萃取：
将步骤4滤液用等体积氯仿萃取，弃去氯仿层，剩下水层液再用等体积氯仿萃取，重复2次，弃去氯仿层，留下水层；
步骤6、乙酸乙酯萃取：
将步骤5水层用等体积乙酸乙酯萃取，弃去乙酸乙酯层，剩下水层液再用等体积乙酸乙酯萃取，重复3次，弃去乙酸乙酯层，留下水层；
步骤7、正丁醇萃取：
将步骤6水层用两倍体积正丁醇萃取，弃去正丁醇层，剩下水层再用两倍体积正丁醇萃取，重复4次，弃去正丁醇层，留下水层；
步骤8、将步骤7萃取后的水层蒸干，得到茶褐素提取物。
本发明的特点还在于，
步骤1中筛选的筛目为40-70目；60Co-γ射线辐照的剂量为2～24kGy。
步骤2中六堡茶茶叶粉末与蒸馏水的质量体积比(g/ml)为：1:8-1:10；纤维素酶与六堡茶茶叶粉末的质量比为：1:2000-3:1000；蒸馏水的pH值为2-10；所述酶解条件是：温度为20-60℃；酶解时间为20-100min。
步骤4中将超声处理液加热到温度80℃-100℃；回流浸提的时间为20min-60min。
本发明所采用的第二技术方案是，一种由上述六堡茶中的茶褐素的提取方法提取得到的茶褐素在保肝方面的应用。
本发明的有益效果是：本发明在有机试剂提取前，采用60Co-γ射线辐照可促进茶多酚类物质的氧化聚合形成更多的茶褐素，并用纤维素酶辅助提取技术可显著提高溶剂法茶褐素提取率。能够得到含量为25％左右的茶褐素提取物，高于其他方法的提取率(16％)，并在保肝实验中发现其对药物急性肝损伤有一定的保护作用，可作为保肝功能食品开发，有一定的应用前景。
附图说明
图1是本发明酶用量对茶褐素提取率的影响关系图；
图2是本发明酶解温度对茶褐素提取率的影响的关系图；
图3是本发明pH值与茶褐素提取率的关系图；
图4是本发明酶解时间与茶褐素提取率的关系图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明提供一种六堡茶中茶褐素的提取方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1、原料预辐照处理：
将六堡茶茶叶用粉碎机粉碎，并过40-70目筛，经剂量为2～24kGy的60Co-γ射线辐照，得到六堡茶茶叶粉末；
步骤2、酶法处理：
称取一定量的六堡茶茶叶粉末，加入蒸馏水，六堡茶茶叶粉末与蒸馏水的质量体积比(g/ml)为：1:8-1:12；蒸馏水的PH为2-10，并加入纤维素酶，纤维素酶与六堡茶茶叶粉末的质量比为：1:2000-3:1000；在20-60℃条件下水解20-100min，得到酶解处理液；
步骤3、超声波处理：
将酶解处理液在常温下超声处理30min，得到超声波处理液；
步骤4、加热浸提：
将超声处理液加热到温度80℃-100℃，回流浸提20min-60min，溶液趁热抽滤，再按步骤2的蒸馏水量加入蒸馏水浸提3次，合并滤液；
步骤5、氯仿萃取：
将步骤4滤液用等体积氯仿萃取，弃去氯仿层，剩下水层液再用等体积氯仿萃取，重复2次，弃去氯仿层，留下水层；
步骤6、乙酸乙酯萃取：
将步骤5水层用等体积乙酸乙酯萃取，弃去乙酸乙酯层，剩下水层液再用等体积乙酸乙酯萃取，重复3次，弃去乙酸乙酯层，留下水层；
步骤7、正丁醇萃取：
将步骤6水层用两倍体积正丁醇萃取，弃去正丁醇层，剩下水层再用两倍体积正丁醇萃取，重复4次，弃去正丁醇层，留下水层；
步骤8、将步骤7萃取后的水层蒸干，得到茶褐素提取物。
实施例1
一种六堡茶中茶褐素的提取方法，具体按照以下步骤实施：将六堡茶茶叶用粉碎机粉碎，并过60目筛，经剂量为24kGy的60Co-γ射线辐照，得到六堡茶茶叶粉末；称取10g六堡茶茶叶粉末，并加入100ml的蒸馏水，蒸馏水的PH为4，加入20mg的纤维素酶，在30℃条件下水解20min，得到酶解处理液；将酶解处理液在常温下超声处理30min，得到超声波处理液；将超声处理液加热到温度100℃，回流浸提40min，溶液趁热抽滤，再按与上述等体积的蒸馏水量加入蒸馏水浸提3次，合并滤液；将上述滤液用等体积氯仿萃取，弃去氯仿层，剩下水层液再用等体积氯仿萃取，重复2次，弃去氯仿层，留下水层；将上述水层用等体积乙酸乙酯萃取，弃去乙酸乙酯层，剩下水层液再用等体积乙酸乙酯萃取，重复3次，弃去乙酸乙酯层，留下水层；将上述水层用两倍体积正丁醇萃取，弃去正丁醇层，剩下水层再用两倍体积正丁醇萃取，重复4次，弃去正丁醇层，留下水层；将上述水层蒸干，得到茶褐素提取物。此实施例的茶褐素的提取率为23.773％。
实施例2
一种六堡茶中茶褐素的提取方法，具体按照以下步骤实施：将六堡茶茶叶用粉碎机粉碎，并过40目筛，经剂量为2kGy的60Co-γ射线辐照，得到六堡茶茶叶粉末；称取10g六堡茶茶叶粉末，并加入80ml的蒸馏水，蒸馏水的PH为2，加入5mg的纤维素酶，在30℃条件下水解20min，得到酶解处理液；将酶解处理液在常温下超声处理30min，得到超声波处理液；将超声处理液加热到温度80℃，回流浸提20min，溶液趁热抽滤，再按与上述等体积的蒸馏水量加入蒸馏水浸提3次，合并滤液；将上述滤液用等体积氯仿萃取，弃去氯仿层，剩下水层液再用等体积氯仿萃取，重复2次，弃去氯仿层，留下水层；将上述水层用等体积乙酸乙酯萃取，弃去乙酸乙酯层，剩下水层液再用等体积乙酸乙酯萃取，重复3次，弃去乙酸乙酯层，留下水层；将上述水层用两倍体积正丁醇萃取，弃去正丁醇层，剩下水层再用两倍体积正丁醇萃取，重复4次，弃去正丁醇层，留下水层；将上述水层蒸干，得到茶褐素提取物。此实施例的茶褐素的提取率为22.364％。
实施例3
一种六堡茶中茶褐素的提取方法，具体按照以下步骤实施：将六堡茶茶叶用粉碎机粉碎，并过70目筛，经剂量为20kGy的60Co-γ射线辐照，得到六堡茶茶叶粉末；称取10g六堡茶茶叶粉末，并加入120ml的蒸馏水，蒸馏水的PH为10，加入30mg的纤维素酶，在60℃条件下水解100min，得到酶解处理液；将酶解处理液在常温下超声处理30min，得到超声波处理液；将超声处理液加热到温度90℃，回流浸提60min，溶液趁热抽滤，再按与上述等体积的蒸馏水量加入蒸馏水浸提3次，合并滤液；将上述滤液用等体积氯仿萃取，弃去氯仿层，剩下水层液再用等体积氯仿萃取，重复2次，弃去氯仿层，留下水层；将上述水层用等体积乙酸乙酯萃取，弃去乙酸乙酯层，剩下水层液再用等体积乙酸乙酯萃取，重复3次，弃去乙酸乙酯层，留下水层；将上述水层用两倍体积正丁醇萃取，弃去正丁醇层，剩下水层再用两倍体积正丁醇萃取，重复4次，弃去正丁醇层，留下水层；将上述水层蒸干，得到茶褐素提取物。此实施例的茶褐素的提取率为23.659％。
实施例4
一种六堡茶中茶褐素的提取方法，具体按照以下步骤实施：将六堡茶茶叶用粉碎机粉碎，并过60目筛，经剂量为12kGy的60Co-γ射线辐照，得到六堡茶茶叶粉末；称取10g六堡茶茶叶粉末，并加入100ml的蒸馏水，蒸馏水的PH为4，加入20mg的纤维素酶，在40℃条件下水解40min，得到酶解处理液；将酶解处理液在常温下超声处理30min，得到超声波处理液；将超声处理液加热到温度100℃，回流浸提40min，溶液趁热抽滤，再按与上述等体积的蒸馏水量加入蒸馏水浸提3次，合并滤液；将上述滤液用等体积氯仿萃取，弃去氯仿层，剩下水层液再用等体积氯仿萃取，重复2次，弃去氯仿层，留下水层；将上述水层用等体积乙酸乙酯萃取，弃去乙酸乙酯层，剩下水层液再用等体积乙酸乙酯萃取，重复3次，弃去乙酸乙酯层，留下水层；将上述水层用两倍体积正丁醇萃取，弃去正丁醇层，剩下水层再用两倍体积正丁醇萃取，重复4次，弃去正丁醇层，留下水层；将上述水层蒸干，得到茶褐素提取物。此实施例的茶褐素的提取率为24.503％。
实施例5
一种六堡茶中茶褐素的提取方法，具体按照以下步骤实施：将六堡茶茶叶用粉碎机粉碎，并过60目筛，经剂量为15kGy的60Co-γ射线辐照，得到六堡茶茶叶粉末；称取10g六堡茶茶叶粉末，并加入120ml的蒸馏水，蒸馏水的PH为8，加入25mg的纤维素酶，在50℃条件下水解80min，得到酶解处理液；将酶解处理液在常温下超声处理30min，得到超声波处理液；将超声处理液加热到温度85℃，回流浸提45min，溶液趁热抽滤，再按与上述等体积的蒸馏水量加入蒸馏水浸提3次，合并滤液；将上述滤液用等体积氯仿萃取，弃去氯仿层，剩下水层液再用等体积氯仿萃取，重复2次，弃去氯仿层，留下水层；将上述水层用等体积乙酸乙酯萃取，弃去乙酸乙酯层，剩下水层液再用等体积乙酸乙酯萃取，重复3次，弃去乙酸乙酯层，留下水层；将上述水层用两倍体积正丁醇萃取，弃去正丁醇层，剩下水层再用两倍体积正丁醇萃取，重复4次，弃去正丁醇层，留下水层；将上述水层蒸干，得到茶褐素提取物。此实施例的茶褐素的提取率为22.593％。
实施例6
一种六堡茶中茶褐素的提取方法，具体按照以下步骤实施：将六堡茶茶叶用粉碎机粉碎，并过60目筛，经剂量为4kGy的60Co-γ射线辐照，得到六堡茶茶叶粉末；称取10g六堡茶茶叶粉末，并加入90ml的蒸馏水，蒸馏水的PH为6，加入10mg的纤维素酶，在20-60℃条件下水解40min，得到酶解处理液；将酶解处理液在常温下超声处理30min，得到超声波处理液；将超声处理液加热到温度95℃，回流浸提50min，溶液趁热抽滤，再按与上述等体积的蒸馏水量加入蒸馏水浸提3次，合并滤液；将上述滤液用等体积氯仿萃取，弃去氯仿层，剩下水层液再用等体积氯仿萃取，重复2次，弃去氯仿层，留下水层；将上述水层用等体积乙酸乙酯萃取，弃去乙酸乙酯层，剩下水层液再用等体积乙酸乙酯萃取，重复3次，弃去乙酸乙酯层，留下水层；将上述水层用两倍体积正丁醇萃取，弃去正丁醇层，剩下水层再用两倍体积正丁醇萃取，重复4次，弃去正丁醇层，留下水层；将上述水层蒸干，得到茶褐素提取物。此实施例的茶褐素的提取率为23.213％。
以下结合酶法处理条件分析本实验的有益效果。
(1)酶用量的影响
表1 酶用量对茶褐素提取率的影响
此处理条件，除了酶用量不同，其余条件同实施例4，通过图1和表1可知，茶褐素的提取率随着加入的纤维素酶的量的增加呈现先上升后下降的趋势，并且在纤维素酶用量为20mg的时候提取率有最大值。因为纤维素酶对底物酶解时存在一个最适的浓度，即低于20mg时，说明纤维素酶的用量不足，高于20mg时，说明纤维素酶的用量已经超过底物所对应的的酶解用量，造成成本的增高，因此茶叶原料为10g、酶解温度30℃、酶解时间40min的条件下，纤维素酶用量20mg为最佳值。
(2)酶解温度的影响
表2 酶解温度对茶褐素提取率的影响
此处理条件，除了酶解温度不同，其余条件同实施例4，在酶解温度的试验中，根据图2可知，在选取的温度范围内，茶褐素粗品的提取率呈现先上升后下降，并且提取率最大时的酶解温度为40℃。由此可说明纤维素酶对底物进行酶解时存在最适的温度，使得酶的活性最高。低于此温度，活性未完全展现，高于此温度，酶的稳定性受到影响，降低了其活性。因此选取酶解温度为40℃作为最佳值。
(3)pH值的影响
表3 pH值对茶褐素提取率的影响
此处理条件，除了酶解pH值不同，其余条件同实施例4，如图3，在PH值的影响实验中，根据实验数据作图可知，在2、4、6、8、10的PH值条件下，茶褐素的提取率仍然出现先上升后下降的趋势，并且在PH值为4的时候得到提取率的最大值。由此表明过酸或者过碱的化学条件下，都会降低纤维素酶的活性，因此选取PH＝4为此因素的最优值。
(4)酶解时间的影响
表4 酶解时间对茶褐素提取率的影响
此处理条件，除了酶解时间不同，其余条件同实施例4，如图4所示，在酶解时间中，茶褐素的提取率在选取的时间范围内，随着时间的增长同样呈现先增长后下降的趋势。最高的酶解时间为40min。在20-40min的时间段内，茶褐素粗品的提取率显著增高，说明延长时间使得纤维素酶对底物进行充分的酶解，超过40min时，酶解基本完成，延长时间反而降低了茶褐素粗品的提取率，因此我们选取40min作为纤维素酶酶解的最佳时间。
由此可见，采用60Co-γ射线辐照和纤维素酶酶解，能够不同程度的提高茶褐素的提取率，并且经过此条件下提取的茶褐素具有一定的保肝作用。
由茶褐素溶液保肝活性CCl4和PAPA模型实验可知，茶褐素提取物对药物急性肝损伤有一定的保护作用，茶褐素溶液对血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)，肝组织中蛋白、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等含量都有正作用。
联苯双酯是经典的保肝药物，已经广泛的应用。而茶褐素的保肝活性实验未见有报道，本发明已经证明茶褐素有一定的保肝活性，如果将茶褐素作为一种食品或保健品，其保肝活性足以满足需要，而且对身体没有危害。
Claims (5)
1.一种六堡茶中的茶褐素的提取方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：
步骤1、原料预辐照处理：
将六堡茶茶叶用粉碎机粉碎，筛选，经60Co-γ射线辐照，得到六堡茶茶叶粉末；
步骤2、酶法处理：
称取一定量的六堡茶茶叶粉末，加入蒸馏水，并加入纤维素酶，进行酶解，得到酶解处理液；
步骤3、超声波处理：
将酶解处理液在常温下超声处理30min，得到超声波处理液；
步骤4、加热浸提：
将超声处理液加热，并进行回流浸提，溶液趁热抽滤，再按步骤2的蒸馏水量加入蒸馏水浸提3次，合并滤液；
步骤5、氯仿萃取：
将步骤4滤液用等体积氯仿萃取，弃去氯仿层，剩下水层液再用等体积氯仿萃取，重复2次，弃去氯仿层，留下水层；
步骤6、乙酸乙酯萃取：
将步骤5水层用等体积乙酸乙酯萃取，弃去乙酸乙酯层，剩下水层液再用等体积乙酸乙酯萃取，重复3次，弃去乙酸乙酯层，留下水层；
步骤7、正丁醇萃取：
将步骤6水层用两倍体积正丁醇萃取，弃去正丁醇层，剩下水层再用两倍体积正丁醇萃取，重复4次，弃去正丁醇层，留下水层；
步骤8、将步骤7萃取后的水层蒸干，得到茶褐素提取物。
2.根据权利要求1所述的六堡茶中的茶褐素的提取方法，其特征在于，所述步骤1中筛选的筛目为40-70目；60Co-γ射线辐照的剂量为2～24kGy。
3.根据权利要求1所述的六堡茶中的茶褐素的提取方法，其特征在于，所述步骤2中六堡茶茶叶粉末与蒸馏水的质量体积比(g/ml)为：1:8-1:12；纤维素酶与六堡茶茶叶粉末的质量比为：1:2000-3:1000；蒸馏水的pH值为2-10；所述酶解条件是：温度为20-60℃；酶解时间为20-100min。
4.根据权利要求1所述的六堡茶中的茶褐素的提取方法，其特征在于，所述步骤4中将超声处理液加热到温度80℃-100℃；回流浸提的时间为20min-60min。
5.一种由上述权利要求所述的六堡茶中的茶褐素的提取方法提取得到的茶褐素在保肝方面的应用。
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