CN116840384A - 一种茶叶中儿茶素和茶黄素的液相色谱质谱联用的检测方法 - Google Patents

一种茶叶中儿茶素和茶黄素的液相色谱质谱联用的检测方法 Download PDF

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CN116840384A CN202310923922.9A CN202310923922A CN116840384A CN 116840384 A CN116840384 A CN 116840384A CN 202310923922 A CN202310923922 A CN 202310923922A CN 116840384 A CN116840384 A CN 116840384A
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Abstract

本发明提供了一种茶叶中儿茶素和茶黄素的液相色谱质谱联用的检测方法，属于质量检测技术领域。该方法主要包括了三个步骤：S1、系列标准工作液的配置；S2、待测样品溶液的配置；S3、HPLC‑MS/MS检测：将步骤S1的系列标准工作液注入液相色谱质谱联用仪中，以8种儿茶素和4种茶黄素的多反应监测模式离子峰面积与其对应的浓度进行回归分析，得到标准工作曲线，在相同条件下，将S2的待测样品溶液注入液相色谱质谱联用仪中，将检测结果代入标准工作曲线，即可求得样品中8种儿茶素和4种茶黄素的含量。本发明的方法能准确的检测较低含量的8种儿茶素类物质和4种茶黄素类物质的含量。

Description

一种茶叶中儿茶素和茶黄素的液相色谱质谱联用的检测方法
技术领域
本发明属于质量检测技术领域，具体涉及一种茶叶中儿茶素和茶黄素的液相色谱质谱联用的检测方法。
背景技术
儿茶素和茶黄素分别是绿茶和红茶中主要的具有抗氧化作用的生物活性成分。茶多酚主要通过儿茶素表达其生物活性，茶叶被看做是“饮料之王”就是因为它含有丰富的儿茶素，且儿茶素是茶叶苦味和涩味的主要来源。茶黄素是红茶多酚的主要组成成分之一，其含量占红茶干物质的1％～5％，茶黄素对红茶的色、香、味等品质特征有较大的影响，是形成红茶“汤色亮”、“冷后浑”、“金圈”现象的原因，红茶的滋味也与茶黄素的收敛性有关。
现阶段国内外对儿茶素的研究多集中于对其生理活性的研究以及不同产地、种类茶叶间儿茶素含量的差异，对茶黄素的研究主要集中在其保健功能的开发以及作用机制的探究。对于儿茶素和茶黄素的定量分析方法有大量的研究报道，但是同时对儿茶素和茶黄素进行分离和定量分析的研究很少，在这些分析方法中，HPLC法是食品分析中应用最广泛的技术。色质联用法是在色谱的基础上连接了质谱，质谱在分析过程中可以提供丰富的结构信息，将其与色谱结合，能够有效的对物质进行分离、定性、定量，很好地解决了色谱定性能力差的问题。在质谱领域中，三重四极杆是最灵敏和定量重现性最好的仪器。使用HPLC-MS/MS可以在单个分析中实现准确定量。因此，建立一种HPLC-MS/MS方法用于同时检测茶叶中的儿茶素类和茶黄素类物质含量十分有必要。已经有研究学者采用HPLC-MS/MS方法对茶叶中的儿茶素类和茶黄素类物质含量进行同时检测分析，但其所建立方法的回收率和稳定性均较差，且应用该方法测定的3种茶叶样品(红茶、乌龙茶和绿茶)含量结果远远低于茶叶中儿茶素和茶黄素的正常含量范围，方法本身的科学性有待于进一步研究与核实。
发明内容
鉴于此，本发明提供了一种茶叶中儿茶素和茶黄素的液相色谱质谱联用的检测方法，使用本申请的方法可以准确的检测较低含量的8种儿茶素类物质和4种茶黄素类物质的含量。
本发明提供的技术方案如下：
本发明提供了一种茶叶中儿茶素和茶黄素的液相色谱质谱联用的检测方法，所述方法包括：
S1、系列标准工作液的配置：精确称取8种儿茶素标准品溶解后逐级稀释得到儿茶素系列标准工作液，精确称取4种茶黄素的标准品溶解后逐级稀释得到茶黄素系列标准工作液；
S2、待测样品溶液的配置：取待测茶叶样品经提取、离心后，将上清液过水相滤膜，过滤后的提取液经稀释后即为待测样品溶液；
S3、HPLC-MS/MS检测：将步骤S1的儿茶素系列标准工作液和茶黄素系列标准工作液分别注入液相色谱质谱联用仪中，以8种儿茶素和4种茶黄素的多反应监测模式离子峰面积与其对应的浓度进行回归分析，得到标准工作曲线，在相同条件下，将S2的待测样品溶液注入液相色谱质谱联用仪中，得到8种儿茶素和4种茶黄素的多反应监测模式离子峰面积，代入标准工作曲线，即可求得样品中8种儿茶素和4种茶黄素的含量；
所述8种儿茶素为儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯；
所述4种茶黄素为茶黄素、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3'-没食子酸酯，茶黄素-3,3'-双没食子酸。
在本发明的一个具体实施方式中，步骤S1中溶解过程的溶剂和步骤S2中提取过程的提取液均为70％甲醇水溶液，步骤S1和步骤S2中，稀释过程用含2％抗坏血酸的70％甲醇水溶液。
在本发明的一个具体实施方式中，步骤S1中儿茶素系列标准工作液中，8种儿茶素的浓度为10μg/L、25μg/L、50μg/L、100μg/L、250μg/L、500μg/L、1000μg/L、2500μg/L、5000μg/L、10000μg/L；步骤S1中茶黄素系列标准工作液中，4种茶黄素的浓度为25μg/L、50μg/L、125μg/L、250μg/L、500μg/L、1250μg/L、2500μg/L、5000μg/L。
在本发明的一个具体实施方式中，步骤S2中，提取的具体步骤为：取待测茶叶样品加入70％甲醇水溶液，先涡旋混匀，然后于70℃下水浴20min，再取出涡旋混匀；离心是以7500r/min离心3min；水相滤膜的型号是0.22μm水相滤膜。
在本发明的一个具体实施方式中，待测茶叶样品与70％甲醇水溶液的质量体积比为1:100。
在本发明的一个具体实施方式中，步骤S2中，稀释的倍数分别为100倍、1000倍、5000倍，稀释100倍的待测样品溶液用于检测表没食子儿茶素、儿茶素、没食子儿茶素没食子酸酯、儿茶素没食子酸酯、茶黄素、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3'-没食子酸酯、茶黄素-3,3'-双没食子酸的含量，稀释1000倍的待测样品溶液用于检测没食子儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯的含量，稀释5000倍的待测样品溶液用于检测表没食子儿茶素没食子酸酯的含量。
在本发明的一个具体实施方式中，步骤S3中所述色谱的工作条件为：
色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18，2.1mm×100mm，1.8μm；
色谱柱温度：35℃；
流速：0.2mL/min；
进样量：2μL；
流动相：流动相A为0.1％甲酸水溶液、流动相B为乙腈；
流动相梯度洗脱程序表如下：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 90 10
10 87 13
25 70 30
30 2 98
35 2 98
35.1 90 10
45 90 10
。
在本发明的一个具体实施方式中，所述质谱的工作条件为：
离子源：电喷雾离子源；
扫描模式：正、负离子扫描模式；
检测方式：多反应监测模式；
干燥气：氮气；
雾化气：氮气；
雾化气压力：30psi；
离子喷雾电压：负离子模式：4000V，正离子模式：2500V；
干燥气温度：350℃；
干燥气流速：9L/min；
质谱采集参数见下表：
在本发明的一个具体实施方式中，所述方法的8种儿茶素在浓度为10～10000μg/L范围内线性关系良好，4种茶黄素在浓度为25～5000μg/L范围内线性关系良好，平均加标回收率的范围为95.01％～105.92％，RSD均小于6％，检出限为1.0～250mg/kg，定量限为3.0～830mg/kg。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1.本方法在检测茶叶中8种儿茶素类物质和4种茶黄素类物质时，将8种儿茶素类物质和4种茶黄素类物质分为三组分别进行检测，即将待测样品稀释100倍用来检测EGC、C、GCG、CG、TF、TF-3-G、TF-3'-G、TFBG的含量，将待测样品稀释1000倍用来检测GC、EC、ECG的含量，将待测样品稀释5000倍用来检测EGCG的含量，在对待测样品进行相应的稀释的同时，也克服了样品的基质效应，不需要针对样品的基质效应再专门进行优化。此外，在质谱检测过程中对8种儿茶素类物质采取负离子扫描模式，对4种茶黄素类物质采取正离子扫描模式。采用本发明的方法能准确的检测较低含量的8种儿茶素类物质和4种茶黄素类物质的含量。
2.该方法中的儿茶素类物质在浓度为(10～10000)μg/L范围内线性关系良好、茶黄素类物质在浓度为(25～5000)μg/L范围内线性关系良好，平均加标回收率的范围为95.01％～105.92％，检出限为(1.0～250)mg/kg，定量限为(3.0～830)mg/kg，稳定性、精密度均满足相关标准要求。
3.与常用的国标方法相比，可同时检测的目标物质数量更多、检出限与定量限更低，检测结果更加准确，可为茶叶分级、茶叶质量控制、茶叶生物活性成分提取等研究提供技术支持。
附图说明
图1为实施例1中样品前处理过程中，料液比对响应值的影响的图；
图2为实施例1中样品前处理过程中，提取溶剂对响应值的影响的图；
图3为实施例1中样品前处理过程中，提取时间对响应值的影响的图；
图4为实施例1中样品前处理过程中，提取温度对响应值的影响的图；
图5为实施例1中样品前处理过程中，稀释溶剂种类对响应值的影响的图；
图6为实施例2中，不同类型色谱柱分离儿茶素类、茶黄素类物质标准溶液的TIC图；
图7为实施例2中，不同流动相体系下儿茶素类、茶黄素类物质分离情况的TIC图；
图8为实施例2中，不同色谱柱温度分离儿茶素类、茶黄素类物质标准溶液的TIC图；
图9为实施例2中，不同洗脱程序分离儿茶素类、茶黄素类物质标准溶液的TIC图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
8种儿茶素和4种茶黄素的名称及对应的英文简称如下：
8种儿茶素：儿茶素：C；表儿茶素：EC；没食子儿茶素：GC；表没食子儿茶素：EGC；儿茶素没食子酸酯：CG；表儿茶素没食子酸酯：ECG；没食子儿茶素没食子酸酯：GCG；表没食子儿茶素没食子酸酯：EGCG。
4种茶黄素：茶黄素：TF；茶黄素-3-没食子酸酯：TF-3-G；茶黄素-3'-没食子酸酯：TF-3'-G；和茶黄素-3,3'-双没食子酸：TFBG。
以下实施例中对8种儿茶素和4种茶黄素的描述均以英文简称的形式表示。
通用的材料与方法
(1)仪器与设备
表1仪器与设备
名称 型号/规格 厂家
液相色谱-串联质谱联用仪 Agilent1260-G6420A 美国Agilent公司
电子分析天平 BP211D 德国Sartorius公司
涡旋混合器 XW-80A 上海驰唐实业有限公司
超纯水仪 Milli-Q 美国Millipore公司
水恒温震荡水槽 XMTD-8222 上海精宏实验设备有限公司
离心机 5810R 德国Eppendorf公司
研磨器 MDJ-D02H1 小熊电器股份有限公司
超声波清洗器 KQ-500VDE 昆山市超声仪器有限公司
水相针式滤器 0.22μm，13mm 上海安谱实验科技股份有限公司
(2)材料与试剂
8种儿茶素和4种茶黄素标准品：C、EC、GC、EGC、CG、ECG、GCG、EGCG、TF、TF-3-G、TF-3’-G和TFBG标准品(纯度均≥98％)购自成都德思特生物技术有限公司。
试剂：色谱纯甲醇、色谱纯乙腈购自美国Sigma-Aldrich公司，色谱纯甲酸、分析纯L(+)-抗坏血酸购自成都市科隆化学品有限公司。
样品：实验所用茶叶样品均购买于四川及外省各茶企业。
实验用水为纯水。
(3)标准工作液的配制
精确称取EC、ECG、CG、EGCG、EGC、GCG、GC、C、TF、TF-3-G、TF-3’-G和TFBG标准品各10.00mg，分别用70％甲醇溶解后定容至10mL，混匀，即得浓度为1000mg/L的不同的单一标准品储备溶液，于-20℃下避光保存备用，有效期为1个月。
分别准确吸取适量各儿茶素类物质单一标准储备溶液，用抗坏血酸浓度为2％的70％甲醇水溶液稀释，配制成浓度均为100mg/L的儿茶素混合标准工作溶液，然后用抗坏血酸浓度为2％的70％甲醇水溶液逐级稀释配制成10、25、50、100、250、500、1000、2500、5000、10000μg/L的儿茶素系列标准工作溶液；分别准确吸取适量各茶黄素类物质单一标准品储备溶液，用抗坏血酸浓度为2％的70％甲醇水溶液稀释，配制成浓度均为50mg/L的茶黄素混合标准工作溶液，然后用抗坏血酸浓度为2％的70％甲醇水溶液逐级稀释配制成25、50、125、250、500、1250、2500、5000μg/L的茶黄素系列标准工作溶液，现配现用。
(4)样品前处理
称取茶叶试样0.1000g于15mL离心管中，加入10mL 70％甲醇水溶液，涡旋混匀，于70℃下水浴20min，取出涡旋混匀，然后以7500r/min，离心3min，将上清液倒入10mL容量瓶，定容至10mL，过0.22μm水相滤膜。提取液用含2％抗坏血酸的70％甲醇溶液稀释100倍、1000倍、5000倍，即为待测样品。
稀释100倍的待测样品用来检测EGC、C、GCG、CG、TF、TF-3-G、TF-3'-G、TFBG，稀释1000倍的待测样品用来检测GC、EC、ECG，稀释5000倍的待测样品用来检测EGCG。
(5)仪器方法
液相色谱条件为：
色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18，2.1mm×100mm，1.8μm；
色谱柱温度：35℃；
流速：0.2mL/min；
进样量：2μL；
流动相：流动相A为0.1％甲酸水溶液、流动相B为乙腈；
流动相的梯度洗脱程序见下表：
表2梯度洗脱程序
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 90 10
10 87 13
25 70 30
30 2 98
35 2 98
35.1 90 10
45 90 10
质谱条件为：
离子源：电喷雾离子源(ESI)；
扫描模式：正、负离子扫描模式；
检测方式：多反应监测模式(MRM)；
干燥气：氮气；
雾化气：氮气；
雾化气压力：30psi；
离子喷雾电压：4000V(负离子模式)，2500V(正离子模式)；
干燥气温度：350℃；
干燥气流速：9L/min；
质谱采集参数见表3所示。
表3质谱采集参数
注：“*”表示定量离子对。
测定：
将上述配制好的儿茶素系列标准工作液和茶黄素系列标准工作液分别注入液相色谱-串联质谱仪中，以化合物的MRM离子峰面积y与其对应化合物的浓度x绘制标准工作曲线，得到线性方程、相关系数R。具体数值如表4所示。由表可知，本方法中的儿茶素参数在(10～10000)μg/L浓度范围内线性关系良好、该方法中的茶黄素参数在(25～5000)μg/L浓度范围内线性关系良好，相关系数R均＞0.99。
在相同的工作条件下，将稀释倍数分别为100倍、1000倍、5000倍的待测样本注入HPLC-MS/MS，得到相应检测物质的MRM离子峰面积，然后代入相应的标准工作曲线，即可求得待测样品的相应检测物质的含量。
表4标准工作曲线的线性方程、相关系数、线性范围、稀释倍数
实施例1样品前处理条件的优化
1.料液比的选择
为考察料液比对提取率的影响，分别以茶叶与70％甲醇水溶液的比例为1:60、1:70、1:80、1:90、1:100(g/mL)对茶叶进行提取，每组平行测定3次。各料液比条件下响应值情况见图1。由图1可知，料液比从1:60升到1:90时提取效率一直在提升，响应值逐渐增大，在料液比为1:100时较1:90提取率提高程度不明显，综合考虑提取效率以及减少实验误差，料液比选择为1:100。
2.提取溶剂种类的选择
为考察提取溶剂种类对提取率的影响，分别以25％乙醇溶液、70％乙醇溶液、70％甲醇溶液、纯水作为提取溶剂对茶叶进行提取，每组平行测定3次。各提取溶剂种类条件下响应值情况见图2。由图2可知，70％甲醇作为提取溶剂时提取效率最高，因此提取溶剂选择为70％甲醇溶液。
3.提取时间的选择
为考察提取时间对提取率的影响，分别以5min、10min、15min、20min、25min、30min作为提取时间对茶叶进行提取，每组平行测定3次。各提取时间条件下响应值情况见图3。由图3可知，大部分待测物在提取时间为20min和30min时各提取效率较高；在12种待测物中，TF和TFBG的含量相对较低，应优先考虑TF和TFBG提取率高的提取时间，在提取时间为20min时，TF和TFBG提取率相对高；且在20min条件下，ECG和TF-3-G的含量明显高于其他提取时间，因此提取时间选择为20min。
4.提取温度的选择
为考察提取温度对提取率的影响，分别以60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃作为提取温度对茶叶进行提取，每组平行测定3次。各提取温度条件下响应值情况见图4。由图4可知，提取温度为70℃时大部分各待测物的提取效率最高，其次是85℃；在12种待测物中，TFBG的含量相对较低，应优先考虑TFBG提取率高的提取温度，在提取温度为70℃时，TFBG提取率相对高；且出于环保角度考虑，70℃温度低对环境更友好，因此提取温度选择为70℃。
5.稀释溶剂种类的选择
为考察稀释溶剂种类对提取率的影响，分别以含2％抗坏血酸的70％甲醇溶液、含2％抗坏血酸的70％乙醇溶液、含2％抗坏血酸的25％乙醇溶液、含2％抗坏血酸的纯水、含2％抗坏血酸的0.1％甲酸水-乙腈(V:V＝90:10)作为稀释溶剂对提取液进行稀释，每组平行测定3次。各稀释溶剂种类下响应值情况见图5，其中溶剂1为含2％抗坏血酸的25％乙醇溶液；溶剂2为含2％抗坏血酸的70％乙醇溶液；溶剂3为含2％抗坏血酸的70％甲醇溶液；溶剂4为含2％抗坏血酸的纯水；溶剂5为含2％抗坏血酸的0.1％甲酸水-乙腈(V:V＝90:10)。由图5可知，稀释溶剂为含2％抗坏血酸的70％甲醇溶液和含2％抗坏血酸的70％乙醇溶液时各待测物的提取效率较高；在12种待测物中，ECG、TF-3’-G、TFBG的含量相对较低，应优先考虑ECG、TF-3’-G和TFBG提取率高的稀释溶剂，在稀释溶剂为含2％抗坏血酸的70％甲醇溶液时ECG、TF-3’-G和TFBG提取率相对高，因此稀释溶剂选择为含2％抗坏血酸的70％甲醇溶液。
实施例2液相色谱条件的优化
1.色谱柱的选择
针对实验室现有色谱柱以及儿茶素类、茶黄素类物质结构特征，分别考察了5种规格色谱柱对儿茶素类、茶黄素类物质的分离效果，色谱柱的型号及规格如表5所示。不同类型色谱柱分离儿茶素类、茶黄素类物质标准溶液的总离子流图(TIC图)如图6所示，图中，1：GC；2：EGC；3：C；4：EC；5：EGCG；6：GCG；7：ECG；8：CG；9：TF；10：TF-3-G；11：TF-3’-G；12：TFBG。由图可知：Agilent SB-C18 RRHD色谱柱分离效果较好但拖尾严重；Agilent Eclipse PlusC18色谱柱的分离效果优于Agilent Poroshell 120EC-C18、Agilent Eclipse XDB-C18、Agilent Extend C18三种型号的色谱柱，综合考虑后选择Agilent Eclipse Plus C18(2.1mm×100mm，1.8μm)作为本方法检测色谱柱。
表5用于分离儿茶素类、茶黄素类物质的色谱柱的型号、规格及其对应的TIC图
2.流动相种类的优化
选定色谱柱后，用混合标准工作溶液考察了8种不同流动相体系对儿茶素类、茶黄素类物质响应及分离的影响，如表6所示。不同流动相种类分离儿茶素类、茶黄素类物质标准溶液的总离子流图(TIC图)见图7所示，图中，1、2、3、4、5、6、7、8分别代表8种流动相体系；A、B分别为负、正离子模式下的TIC图。由图7可知，乙腈体系下儿茶素类、茶黄素类物质出峰时间较甲醇体系快；纯水体系下儿茶素类、茶黄素类物质出峰拖尾严重；在流动相中加入甲酸铵对儿茶素类、茶黄素类物质保留时间、分离度无明显影响，但严重抑制各物质的响应，且峰拖尾。总体而言，0.1％甲酸水-乙腈体系下各待测物的分离情况、峰形、响应优于其他流动相体系，因此选择0.1％甲酸水-乙腈体系作为本方法检测流动相种类。
表6流动相种类体系
序号 水相 有机相
1 0.1％甲酸水 乙腈
2 0.1甲酸水 甲醇
3 水 乙腈
4 水 甲醇
5 0.1％甲酸水+5mmol甲酸铵 乙腈
6 0.1％甲酸水+5mmol甲酸铵 甲醇
7 水+5mmol甲酸铵 乙腈
8 水+5mmol甲酸铵 甲醇
注：因所使用的仪器在同时采集正负离子模式时，正离子模式下离子响应低，因此对8种流动相体系分别进行正、负离子模式扫描。
3.色谱柱温度考察
色谱柱温度对待测物的分离度和响应都存在不同程度的影响，分别考察了色谱柱在7种温度下对儿茶素类、茶黄素类物质分离以及响应的影响。不同色谱柱温度分离儿茶素类、茶黄素类物质标准溶液的总离子流图(TIC图)见图8所示，图中，A、B、C、D、E、F、G分别代表20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃。由图8可知，随着色谱柱温度的增加，待测物出峰时间变快，分离效果变差，特别是40℃和50℃条件下，EC和EGCG两个物质不能完全分开；色谱柱对待测物响应的影响不是特别大。为了尽量提高分析效率，降低色谱柱柱压，综合考虑后选择色谱柱温度为35℃。
4.流动相梯度考察
为保证儿茶素类、茶黄素类物质具有良好的分离和响应，考察了不同初始流动相比例(见表7)对儿茶素类、茶黄素类物质保留时间、分离效果以及响应的影响，不同流动相梯度分离儿茶素类、茶黄素类物质标准溶液的总离子流图(TIC图)见图9所示，图中，A、B、C、D、E、F分别为ESI-模式条件下的TIC图；G、H、I、J、K、L分别为ESI+模式条件下的TIC图。由表7和图9可知，改变有机相初始比例以及有机相比例增加速率能明显改变各待测物的出峰时间和分离情况；在等度洗脱条件下，物质出峰慢、峰宽较宽；初始有机相比例高会导致所有物质出峰快，峰分离情况差；综合考虑后选择编号5为流动相梯度洗脱程序。
表7梯度洗脱程序
实施例3质谱条件的优化
用70％甲醇溶液配制12种待测物质的单一标准工作溶液(浓度约为500μg/L)，分别在ESI正离子和负离子模式下对其进行一级质谱扫描，得到待测物的母离子。发现儿茶素类物质在负离子模式下、茶黄素类物质在正离子模式下响应好。然后优化得到每种儿茶素类、茶黄素类物质的一级质谱最佳破碎电压，再对每种儿茶素类、茶黄素类物质的分子离子峰进行二级质谱分析，得到碎片离子信息，最后优化得到每种儿茶素类、茶黄素类物质的二级质谱最佳碰撞电压。优化后的儿茶素类、茶黄素类物质的MRM信息如表3。
同时考察了干燥气温度、干燥气流速、雾化气压力、离子喷雾电压等条件对儿茶素类、茶黄素类物质响应的影响，结果见表8～12。由表可知，在所有待测物中，TF-3’-G和TFBG的响应值相对偏低，而其他待测物的响应值处于足够大的水平，因此优先选择TF-3’-G和TFBG响应值较高的离子源参数。综合比较各参数的响应值后最终质谱离子源条件确定为干燥气温度350℃、干燥气流速9L/min、雾化气压力30psi、负离子模式下离子喷雾电压4000V，正离子模式下离子喷雾电压为2500V。
表8不同干燥气温度对儿茶素类、茶黄素类物质响应值的影响
表9不同干燥气流速对儿茶素类、茶黄素类物质响应值的影响
表10不同雾化气压力对儿茶素类、茶黄素类物质响应值的影响
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表11负离子模式下不同离子喷雾电压对儿茶素类物质响应值的影响
表12正离子模式下不同离子喷雾电压对茶黄素类物质响应值的影响
实施例4HPLC-MS/MS检测方法性能评价
1.方法的线性和灵敏度
“通用的材料与方法”中所得的标准工作曲线可知，儿茶素参数在(10～10000)μg/L浓度范围内线性关系良好、茶黄素参数在(25～5000)μg/L浓度范围内线性关系良好，相关系数R均＞0.99。为了考察本方法的灵敏度，采用信噪比法计算本方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)，以信噪比S/N≥3左右的浓度确定为本方法检出限浓度，以信噪比S/N≥10左右的浓度为本方法定量限浓度，具体结果见表13，由表可知，本方法测定儿茶素类、茶黄素类物质具有良好的灵敏度，能够很好满足茶叶中8种儿茶素类、4种茶黄素类物质测定的需要。
表13标准工作曲线的线性方程、相关系数、线性范围、稀释倍数、定量限、检出限
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2.方法的准确度和精密度
准确称取绿茶、红茶样品各12份，其中3份完全按“通用的材料与方法”的样品前处理方法制备待测样品，另9份分别加入适量混合标准工作液使最终测试液浓度构成低浓度、中浓度、高浓度三个不同浓度水平加标样品，再按照“通用的材料与方法”的样品前处理方法制备待测样品，按照本文方法进行测定，考查本方法的加标回收率和精密度情况，具体结果见表14～表16。由表可知，本文方法测定茶叶中的儿茶素类、茶黄素类物质的平均回收率在95.01％～105.92％之间、相对标准偏差RSD均小于5％，且日内精密度(n＝6)和日间精密度(n＝12)的RSD均小于6％，均满足GB/T 32465-2015《化学分析方法验证确认和内部质量控制要求》和GB/T 27417-2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》等相关标准对方法回收率和精密度的要求，说明本方法能够满足茶叶中的儿茶素类、茶黄素类物质含量的准确测定需要。
由于本实验采用的HPLC-MS/MS方法具有较低的检出限，在进行方法学验证时需要对样品进行稀释，由加标回收结果可知，本实验在对样品进行稀释的同时也克服了样品的基质效应，没有必要针对样品的基质效应再专门进行优化。
表14绿茶样品加标回收率试验结果(n＝3)
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表15红茶样品加标回收率试验结果(n＝3)
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表16方法精密度测试结果
3.溶液稳定性验证
分别吸取2μL茶叶样品溶液和低、中、高浓度加标溶液，按照本方法优化后的最佳仪器设备条件，在0h、2h、4h、8h、12h、16h、20h、24h时注入液相色谱-串联质谱仪进行分析；在各单一标准储备溶液于-20℃避光环境下放置第7、15、30、45、60d时，分别吸取2μL浓度均为10000μg/L的混合标准工作溶液(用单一标准储备溶液现配)注入液相色谱-串联质谱联用仪，按照本方法优化后的最佳仪器设备条件进行分析，考察标准储备溶液稳定性，具体结果见表17～表19。由表可知，样品待测溶液在24小时内响应结果未明显变化，单一标准储备溶液在60天内响应结果未明显变化，说明本方法制备的待测液在24h内稳定性良好，于-20℃避光环境下的单一标准储备溶液在60d内稳定性均良好。
表17绿茶溶液稳定性测试结果
表18红茶溶液稳定性测试结果
表19单一标准工作溶液稳定性测试结果
化合物名称 单一标准工作溶液RSD(％)
EGCG 5.50％
GC 5.09％
EC 6.39％
ECG 3.95％
EGC 6.74％
C 5.48％
GCG 4.45％
CG 4.54％
TF 6.80％
TF-3-G 3.75％
TF-3′-G 5.81％
TFBG 4.66％
实施例5
本实施例采用“通用的材料与方法”所述方法测定4个茶叶中8种儿茶素和4种茶黄素的含量。
4种茶叶样品分别为：样品1(毛峰绿茶)，样品2(黄金芽红茶)，样品3(炒青绿茶)，样品4(西湖龙井茶绿茶)，4个茶叶样品全部按照“通用的材料与方法”所述的样品前处理步骤进行处理，得到4个茶叶样品的待测样品溶液。
在“通用的材料与方法”所述的HPLC-MS/MS工作条件下，将4个茶叶样品的待测样品溶液分别注入HPLC-MS/MS，得到8种儿茶素和4种茶黄素的MRM离子峰面积，然后代入标准工作曲线，即可求得样品中8种儿茶素和4种茶黄素的含量。含量测定结果见表20所示。
表20本实施例待测样品的检测结果
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种茶叶中儿茶素和茶黄素的液相色谱质谱联用的检测方法，其特征在于，所述方法包括：
S1、系列标准工作液的配置：精确称取8种儿茶素标准品溶解后逐级稀释得到儿茶素系列标准工作液，精确称取4种茶黄素的标准品溶解后逐级稀释得到茶黄素系列标准工作液；
S2、待测样品溶液的配置：取待测茶叶样品经提取、离心后，将上清液过水相滤膜，过滤后的提取液经稀释后即为待测样品溶液；
S3、HPLC-MS/MS检测：将步骤S1的儿茶素系列标准工作液和茶黄素系列标准工作液分别注入液相色谱质谱联用仪中，以8种儿茶素和4种茶黄素的多反应监测模式离子峰面积与其对应的浓度进行回归分析，得到标准工作曲线，在相同条件下，将S2的待测样品溶液注入液相色谱质谱联用仪中，得到8种儿茶素和4种茶黄素的多反应监测模式离子峰面积，代入标准工作曲线，即可求得样品中8种儿茶素和4种茶黄素的含量；
所述8种儿茶素为儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯；
所述4种茶黄素为茶黄素、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3'-没食子酸酯、茶黄素-3,3'-双没食子酸。
2.根据权利要求1所述的一种茶叶中儿茶素和茶黄素的液相色谱质谱联用的检测方法，其特征在于，步骤S1中溶解过程的溶剂和步骤S2中提取过程的提取液均为70％甲醇水溶液，步骤S1和步骤S2中，稀释过程用含2％抗坏血酸的70％甲醇水溶液。
3.根据权利要求1所述的一种茶叶中儿茶素和茶黄素的液相色谱质谱联用的检测方法，其特征在于，步骤S1中儿茶素系列标准工作液中，8种儿茶素的浓度为10μg/L、25μg/L、50μg/L、100μg/L、250μg/L、500μg/L、1000μg/L、2500μg/L、5000μg/L、10000μg/L；步骤S1中茶黄素系列标准工作液中，4种茶黄素的浓度为25μg/L、50μg/L、125μg/L、250μg/L、500μg/L、1250μg/L、2500μg/L、5000μg/L。
4.根据权利要求1所述的一种茶叶中儿茶素和茶黄素的液相色谱质谱联用的检测方法，其特征在于，步骤S2中，提取的具体步骤为：取待测茶叶样品加入70％甲醇水溶液，先涡旋混匀，然后于70℃下水浴20min，再取出涡旋混匀；离心是以7500r/min离心3min；水相滤膜的型号是0.22μm水相滤膜。
5.根据权利要求4所述的一种茶叶中儿茶素和茶黄素的液相色谱质谱联用的检测方法，其特征在于，待测茶叶样品与70％甲醇水溶液的质量体积比为1:100。
6.根据权利要求1所述的一种茶叶中儿茶素和茶黄素的液相色谱质谱联用的检测方法，其特征在于，步骤S2中，稀释的倍数分别为100倍、1000倍、5000倍，稀释100倍的待测样品溶液用于检测表没食子儿茶素、儿茶素、没食子儿茶素没食子酸酯、儿茶素没食子酸酯、茶黄素、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3'-没食子酸酯、茶黄素-3,3'-双没食子酸的含量，稀释1000倍的待测样品溶液用于检测没食子儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯的含量，稀释5000倍的待测样品溶液用于检测表没食子儿茶素没食子酸酯的含量。
7.根据权利要求1所述的一种茶叶中儿茶素和茶黄素的液相色谱质谱联用的检测方法，其特征在于，步骤S3中所述色谱的工作条件为：
色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18，2.1mm×100mm，1.8μm；
色谱柱温度：35℃；
流速：0.2mL/min；
进样量：2μL；
流动相：流动相A为0.1％甲酸水溶液、流动相B为乙腈；
流动相梯度洗脱程序表如下：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 90 10 10 87 13 25 70 30 30 2 98 35 2 98 35.1 90 10 45 90 10
。
8.根据权利要求1所述的一种茶叶中儿茶素和茶黄素的液相色谱质谱联用的检测方法，其特征在于，所述质谱的工作条件为：
离子源：电喷雾离子源；
扫描模式：正、负离子扫描模式；
检测方式：多反应监测模式；
干燥气：氮气；
雾化气：氮气；
雾化气压力：30psi；
离子喷雾电压：负离子模式：4000V，正离子模式：2500V；
干燥气温度：350℃；
干燥气流速：9L/min；
质谱采集参数见下表：
9.根据权利要求1所述的一种茶叶中儿茶素和茶黄素的液相色谱质谱联用的检测方法，其特征在于，所述方法的8种儿茶素在浓度为10～10000μg/L范围内线性关系良好，4种茶黄素在浓度为25～5000μg/L范围内线性关系良好，平均加标回收率的范围为95.01％～105.92％，RSD均小于6％，检出限为1.0～250mg/kg，定量限为3.0～830mg/kg。
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