CN114146167A - 用于减弱基因表达调节抗病毒转移载体免疫应答的方法和组合物 - Google Patents

用于减弱基因表达调节抗病毒转移载体免疫应答的方法和组合物 Download PDF

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岸本·隆·慧
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Selecta Biosciences Inc
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Abstract

本申请涉及用于减弱基因表达调节抗病毒转移载体免疫应答的方法和组合物。本文中提供了用于施用病毒转移载体和靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂的方法及相关组合物。

Description

用于减弱基因表达调节抗病毒转移载体免疫应答的方法和组 合物
本申请是申请日为2015年9月7日、申请号为“201580047807.3”、发明名称为“用于减弱基因表达调节抗病毒转移载体免疫应答的方法和组合物”的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/US2015/048770的中国国家阶段申请。
相关申请
本申请根据35 U.S.C.§119要求以下申请的权益：于2014年9月7日提交的美国临时申请62/047,034；于2014年9月16日提交的62/051,255；于2015年1月9日提交的62/101,841；于2014年9月7日提交的62/047,044，于2014年9月16日提交的62/051,258；于2015年1月9日提交的62/101,861；于2014年9月7日提交的62/047,054；于2014年9月16日提交的62/051,263；于2015年1月9日提交的62/101,872；于2014年9月7日提交的62/047,051，于2014年9月16日提交的62/051,267；以及于2015年1月9日提交的62/101,882；其中每个申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及用于施用病毒转移载体(viral transfer vector)和靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂(antigen-presenting cell targeted immunosuppressant)的方法和组合物。
背景技术
抗病毒转移载体是用于多种应用的有希望的治疗剂。许多可能的患者具有针对病毒转移载体所基于的病毒的一定水平的预先存在的免疫力。病毒载体(例如腺相关载体)可以是高度免疫原性的，并引发体液和细胞介导的免疫。与将病毒转移载体用于治疗相关的问题进一步变得复杂。本发明人令人惊讶地和出人意料地发现，上述问题和限制可以通过实施本文中公开的本发明来克服。
发明内容
本文中提供了用于施用基因表达调节病毒转移载体和靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂的方法和组合物。病毒转移载体包含编码可在本文中提供的任一种方法或组合物中对本文中提供的任一种目的具有治疗益处的蛋白质、肽或核酸的基因表达调节转基因。
在一个方面是包括通过向对象伴随施用靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和病毒转移载体来在所述对象中建立减弱的抗病毒转移载体应答的方法。在一个实施方案中，所述对象不具有针对病毒转移载体的预先存在的免疫力。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述减弱的抗病毒转移载体应答是针对所述病毒转移载体的T细胞应答，并且所述方法还包括在伴随施用靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和病毒转移载体之前，向对象施用所述病毒转移载体而不施用所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述伴随施用所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和病毒转移载体是重复地伴随施用所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和病毒转移载体。
在另一个方面是包括以下的方法：通过向对象伴随施用靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和病毒转移载体来在所述对象中建立减弱的抗病毒转移载体应答，以及向所述对象施用一个或更多个重复剂量的所述病毒转移载体。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述减弱的抗病毒转移载体应答是针对所述病毒转移载体的T细胞应答，并且所述方法还包括在伴随施用靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和病毒转移载体以及所述一个或更多个重复剂量的所述病毒转移载体之前，向对象施用所述病毒转移载体而不施用所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括单独地或与病毒转移载体组合地提供或获得靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂。
在另一个方面是包括以下的方法：通过首先向对象施用病毒转移载体而不施用靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂来减弱抗病毒转移载体应答，其中所述抗病毒转移载体应答是T细胞应答，以及随后向所述对象伴随施用所述病毒转移载体和靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括在向所述对象伴随施用所述病毒转移载体和所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂之后，向所述对象施用一个或更多个重复剂量的所述病毒转移载体。
在另一个方面是包括以下的方法：在向对象施用所述病毒转移载体之前，确定所述对象中针对所述病毒转移载体的预先存在的免疫力水平，向所述对象伴随施用靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和病毒转移载体，以及向所述对象施用所述病毒转移载体的剂量。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，所述确定包括在向所述对象施用所述病毒转移载体之前测量所述对象中抗病毒转移载体抗体的水平。在所提供的任一种方法的另一个实施方案中，所述确定包括在向所述对象施用所述病毒转移载体之前测量所述对象中针对所述病毒转移载体的T细胞应答水平。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括一个或更多个重复剂量的所述病毒转移载体。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，所述预先存在的免疫力水平针对的是所述病毒转移载体的病毒抗原。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，所述预先存在的免疫力水平针对的是所述病毒转移载体的蛋白质转基因表达产物的抗原。
在另一个方面是包括以下的方法：通过向对象重复地伴随施用靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和病毒转移载体来提高所述对象中病毒转移载体的转基因表达。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括确定提高对象中所述转基因表达的重复地伴随施用所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和病毒转移载体的频率和剂量。
在另一个方面是包括以下的方法：向对象重复地伴随施用靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和病毒转移载体，以及选择所述病毒转移载体的一个或更多个剂量以使其小于当所述对象预期由于重复施用所述病毒转移载体而发生抗病毒转移载体免疫应答时会为所述对象选择的病毒转移载体剂量。
在另一个方面是包括以下的方法：通过向实体(entity)传达(communicate)伴随施用所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和病毒转移载体导致对象中减弱的抗病毒转移载体应答，来诱导所述实体购买或获得单独或与病毒转移载体组合的靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂。
在另一个方面是包括以下的方法：通过向实体传达通过向对象伴随施用所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和病毒转移载体进行有效的重复病毒转移载体给药是可能的，来诱导所述实体购买或获得单独或与病毒转移载体组合的靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述传达还包括用于实施本文中所述的任一种方法的说明(instructions)或描述病毒转移载体与靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂伴随施用之益处的信息。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括将靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂或病毒转移载体或二者分发给实体。
在另一个方面是包括以下的方法：确定伴随施用靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和病毒转移载体以在对象中产生减弱的抗病毒转移载体应答的频率和剂量。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括根据所确定的频率和剂量指导向对象伴随施用所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和病毒转移载体。
在另一个方面是包括以下的方法：确定与一个或更多个重复剂量的病毒转移载体组合地伴随施用靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和病毒转移载体以在对象中产生减弱的抗病毒转移载体应答的频率和剂量。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括根据所确定的频率和剂量指导向对象伴随施用靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和病毒转移载体，以及施用一个或更多个重复剂量的病毒转移载体。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括在向对象伴随施用所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和病毒转移载体以及施用所述一个或更多个重复剂量的病毒转移载体之前，指导向所述对象施用所述病毒转移载体的剂量。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述对象是先前没有施用病毒转移载体的对象。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述对象是先前已经施用了不超过一次病毒转移载体的对象。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，重复剂量中的病毒转移载体的量至少等于先前剂量中病毒转移载体的量。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，重复剂量中的病毒转移载体的量小于先前剂量中病毒转移载体的量。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂还与一个或更多个重复剂量的病毒转移载体伴随施用于对象。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂不还与病毒转移载体的一个或更多个重复剂量中的至少一个伴随施用于对象。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，所述对象不具有针对病毒转移载体的预先存在的免疫力。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，所述伴随施用是同时施用。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括确定对象中针对病毒转移载体的预先存在的免疫力水平。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述病毒转移载体是逆转录病毒转移载体、腺病毒转移载体、慢病毒转移载体或腺相关病毒转移载体。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述病毒转移载体是腺病毒转移载体，并且所述腺病毒转移载体是亚组A、亚组B、亚组C、亚组D、亚组E或亚组F腺病毒转移载体。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述病毒转移载体是慢病毒转移载体，并且所述慢病毒转移载体是HIV、SIV、FIV、EIAV或绵羊慢病毒载体。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述病毒转移载体是腺相关病毒转移载体，并且所述腺相关病毒转移载体是AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11腺相关病毒转移载体。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述病毒转移载体是嵌合病毒转移载体。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述嵌合病毒转移载体是AAV-腺病毒转移载体。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述基因表达调节转基因编码DNA结合蛋白或治疗性RNA。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述DNA结合蛋白是人工转录因子。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，治疗性RNA是mRNA翻译抑制剂、RNA干扰(RNA interference，RNAi)剂、催化活性RNA分子(核酶)、转移RNA(tRNA)或结合蛋白质或其他分子配体的RNA(适配体)。在本文中提供的任一方法的一个实施方案中，RNAi剂是双链RNA、单链RNA、微RNA、短干扰RNA、短发夹RNA或三链体形成寡核苷酸。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂包含红细胞结合治疗剂。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，红细胞结合治疗剂包含ERY1、ERY19、ERY59、ERY64、ERY123、ERY141和ERY162。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，红细胞结合治疗剂还包含病毒转移载体抗原。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述病毒转移载体抗原是病毒抗原。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂包含带负电荷的颗粒。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述带负荷的电颗粒是聚苯乙烯、PLGA或金刚石颗粒。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，颗粒的ζ电位为负。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，颗粒的ζ电位低于-50mV。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，颗粒的ζ电位低于-100mV。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂包含凋亡小体模拟物和一种或更多种病毒转移载体抗原。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述凋亡小体模拟物是包含一种或更多种病毒转移载体抗原的颗粒。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述一种或更多种病毒转移载体抗原包含一种或更多种病毒抗原。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述颗粒还可包含凋亡信号分子。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述颗粒包含聚乙醇酸聚合物(PGA)、聚乳酸聚合物(PLA)、聚癸二酸聚合物(PSA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚乳酸-癸二酸共聚物(PLSA)、聚乙醇酸-癸二酸共聚物(PGSA)、聚丙交酯-乙交酯共聚物(PLG)或聚乙二醇(PEG)。在本文中提供的任一方法的一个实施方案中，所述颗粒的平均直径为0.1至5μm、0.1至4μm、0.1至3μm、0.1至2μm、0.1至1μm或0.1至500nm。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂包含含有免疫抑制剂的合成纳米载体。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述合成纳米载体还包含病毒转移载体抗原。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，病毒转移载体抗原是病毒抗原。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，免疫抑制剂和/或抗原(如果存在的话)包封在合成纳米载体中。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述合成纳米载体包含脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、金属纳米颗粒、基于表面活性剂的乳液、树枝状聚合物、巴基球(buckyball)、纳米线、病毒样颗粒或者肽或蛋白质颗粒。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述合成纳米载体包含聚合物纳米颗粒。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述聚合物纳米颗粒包含聚合物，其作非甲氧基封端的普朗尼克聚合物。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述聚合物纳米颗粒包含聚酯、与聚醚连接的聚酯、聚氨基酸、聚碳酸酯、聚缩醛、聚缩酮、多糖、聚乙基
Figure BDA0003336102440000071
唑啉或聚乙烯亚胺。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述聚酯包含聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚乳酸-乙醇酸共聚物或聚己内酯。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述聚合物纳米颗粒包含聚酯和与聚醚连接的聚酯。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述聚醚包含聚乙二醇或聚丙二醇。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，使用合成纳米载体群体的动态光散射获得的粒度分布的均值是大于110nm的直径。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述直径大于150nm。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述直径大于200nm。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述直径大于250nm。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述直径小于5μm。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述直径小于4μm。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述直径小于3μm。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述直径小于2μm。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述直径小于1μm。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述直径小于500nm。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述直径小于450nm。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述直径小于400nm。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述直径小于350nm。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述直径小于300nm。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，包含在合成纳米载体中的免疫抑制剂的载荷在所述合成纳米载体中平均为0.1％至50％(重量/重量)。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，载荷为0.1％至25％。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，载荷为1％至25％。在本文中提供的任一方法的一个实施方案中，载荷为2％至25％。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，免疫抑制剂是NF-kB途径的抑制剂。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，免疫抑制剂是雷帕霉素。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，合成纳米载体群体的纵横比(aspect ratio)大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7或1∶10。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括按照减弱抗病毒转移载体应答(例如抗体、T细胞或B细胞应答)、提高转基因表达或建立抗病毒转移载体应答的方案执行所述方法。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括确定减弱抗病毒转移载体应答(例如抗体、T细胞或B细胞应答)、提高转基因表达或者建立抗病毒转移载体应答的方案。
在所提供的任一种方法的另一个实施方案中，所述方法还包括在向对象施用之前、期间或之后评估针对病毒转移载体的抗体免疫应答。
在另一方面，提供了任一实施例中所述的方法或组合物。
在另一方面，将所述组合物中的任一种用于所提供的任一种方法。
在另一方面，将任一种所述方法用于治疗本文中所述的任一种疾病或病症。在另一方面，将任一种所述方法用于减弱抗病毒转移载体应答、建立减弱的抗病毒转移载体应答、提高转基因表达或者用于重复施用病毒转移载体。
附图说明
图1显示在致敏(prime)或加强时，在注射了具有或不具有包含雷帕霉素之合成纳米载体的AAV的小鼠的肝中的GFP表达。已经分析了悬液中的所有细胞的GFP表达，除了由第一“净”门排除的高侧向散射碎片(总量的2-3％，其为胶原酶处理的副产物)。所有剩余的细胞被针对相对GFP强度(FL-1通道)设门(gate)。显示的数字代表总的亲本群体的GFP阳性细胞的百分比。
图2显示了作为具有或不具有包含雷帕霉素之合成纳米载体的加强功能的经AAV注射小鼠肝中的GFP表达。所呈现的数据与图1中相同，但是根据所采用的AAV加强是否与包含雷帕霉素之合成纳米载体共施用来进行分组(来自组5和6的未加强的样品也显示为单独的“超组”)。
图3示出了以具有或不具有包含雷帕霉素之合成纳米载体的AAV注射的动物的肝中的GFP高细胞份额。对GFP阳性细胞(如图1中所示)设门，然后再对具有比亲本群体中平均值高10倍的平均GFP荧光强度的群体设门。所呈现的数字是来自亲本GFP阳性群体的百分比，如图1中所示。
图4显示来自实验的结果，其中在接受了与或不与包含雷帕霉素之合成纳米载体共施用的单次AAV-GFP接种后在第14天处对小鼠进行放血，并测定其血清的AAV抗体。显示所有小鼠的1∶40血清稀释度的最高OD。背景正常小鼠血清的OD为0.227。
图5显示了来自实验的结果，其中在接受了与或不与包含雷帕霉素之合成纳米载体共施用的单次AAV-GFP接种后(i.v.)，在第14、21和33天对小鼠进行放血，并测定其血清的AAV抗体。显示所有小鼠的1∶40血清稀释度的最高OD。显示了背景正常小鼠血清活性。使用双因素方差分析(two-way ANOVA)计算统计学显著性。
图6显示了来自实验的结果，其中在第0和21天与或不与包含雷帕霉素之合成纳米载体共施用地注射AAV-GFP(i.v.)，然后在第14和33天放血，并测定其血清的AAV抗体。显示所有小鼠的1∶40血清稀释度的最高OD。显示了背景正常小鼠血清活性。使用双因素方差分析计算统计学显著性。
图7提供了与图6相同的数据，其中显示了各小鼠的读数。仅在加强免疫接种(第21天)时以包含雷帕霉素之合成纳米载体处理的组中的两只小鼠在第33天没有显示可检出的抗体，尽管在第14天是阳性的(实线箭头)。在致敏时用含有雷帕霉素的合成纳米载体处理的两组中均有5只小鼠之一在第33天具有可检出的抗体水平(虚线箭头)，而来自以包含雷帕霉素之合成纳米载体处理的组中的小鼠在致敏和加强时均具有较低的抗体水平(空心菱形)。
图8显示来自实验的结果，其中在接受与或不与包含雷帕霉素之合成纳米载体共施用的单次AAV-GFP接种后在第14天对小鼠进行放血，并且测定其血清中的AAV抗体。显示所有小鼠的1∶40血清稀释度的最高OD。背景正常小鼠血清的OD为0.227。N＝15只小鼠/组。
图9显示了实验的结果，其中在接受与或不与包含雷帕霉素之合成纳米载体共施用的单次AAV-GFP接种后(i.v.)，在第14、21和33天对小鼠进行放血，并测定其血清中的AAV抗体。显示所有小鼠的1∶40血清稀释度的最高OD。显示了背景正常小鼠血清水平。使用双因素方差分析计算统计学显著性。在第14天时N＝15只小鼠/组，并且在第21和33天时为5只小鼠/组。
图10示出了来自实验的结果，其中在第0和21天与或不与包含雷帕霉素之合成纳米载体共施用地以AAV8-GFP进行一次或两次注射(i.v.)，如所示，然后在第14和33天放血。通过ELISA测定血清中的抗AAV8抗体。显示所有小鼠的1∶40血清稀释的OD。正常小鼠血清的背景水平由虚线指示。使用双因素方差分析计算统计学显著性。
图11显示在致敏或加强时，在以具有或不具有包含雷帕霉素之合成纳米载体注射的AAV的小鼠的肝中的GFP表达。已经分析了悬液中的所有细胞的GFP表达，除了由第一“净”门排除的高侧向散射碎片(总量的2-3％，其为胶原酶处理的副产物)。所有剩余的细胞被针对相对GFP强度(FL-1通道)设门。显示的数字代表总的亲本群体的GFP阳性细胞的百分比。
图12显示在致敏和/或加强时，在以具有或不具有包含雷帕霉素之合成纳米载体注射的AAV的小鼠的肝中的RFP表达。已经分析了悬液中的所有细胞的RFP表达，除了高侧向散射碎片以外。显示的数字代表肝细胞的总亲本群体的RFP阳性细胞的百分比。
图13显示了以单独的AAV-GFP或与包含雷帕霉素之合成纳米载体组合免疫接种的小鼠中的细胞毒活性。在第0和21天用具有或不具有包含雷帕霉素之合成纳米载体的AAV8-GFP(i.v.)注射动物。在最后一次注射后第7天(第28天)施用以来自AAV衣壳蛋白的显性细胞毒性肽和GFP转基因的组合脉冲的靶细胞，并在18小时后测量它们的生存力，并与无肽脉冲对照细胞的活力进行比较。
图14显示用单独的AAV-GFP或与包含雷帕霉素之合成纳米载体组合免疫接种的小鼠中的AAV特异性IFN-γ产生。在第0和17天以具有或不具有NCS的AAV-GFP(i.v.)注射动物。在第25天分离脾细胞，并在体外与来自AAV衣壳蛋白的显性MHC I类结合肽孵育7天，然后通过ELISpot用相同的肽进行测定。每个样品一式两份，并减除背景地显示。
图15显示用单独的AAV-GFP或与包含雷帕霉素之合成纳米载体组合免疫接种的小鼠中的GFP特异性IFN-γ产生。在第0和17天用具有或不具有包含雷帕霉素之合成纳米载体的AAV8-GFP(i.v.)注射动物。分离脾细胞并在体外与来自GFP的MHC I类结合肽一起孵育7天，然后通过ELISpot用相同的肽进行测定。每个样品一式两份，并减除背景地显示。
图16显示了实验的设计。
图17显示来自实验的结果，其中在第0天与或不与带有100μg雷帕霉素的合成纳米载体共施用地以rAAV2/8-萤光素酶注射小鼠(i.v.)，并且随后在第14天以i.v.注射AAV-hFIX攻击小鼠。在指定的多个时间点收集血清，并测定抗AAV8抗体(左)和人因子IX蛋白的水平(右)。
图18显示了实验的实验设计。
图19显示来自实验的结果，其中对雄性C57BL/6小鼠在第0天与带有100μg雷帕霉素的合成纳米载体伴随注射(i.v.)rAAV2/8-萤光素酶，然后在第21天与带有100μg雷帕霉素的合成纳米载体伴随注射rAAV2/8-hFIX。类似地处理对照动物，但用空纳米载体代替包含雷帕霉素之合成纳米载体。如所指示在不同时间点收集血清，并通过ELISA测定AAV抗体(左)和人FIX蛋白的水平(右)。通过PCR确定肝中的AAV2/8-FIX载体拷贝数(中间)。
图20显示了实验的实验设计。
图21提供的结果表明：在第0天相伴随地i.v.施用带有雷帕霉素的合成纳米载体和rAAV2/8载体(AAV2/8-Luc)对于在第21天施用的AAV5载体(AAV5-hFIX)的抗体应答没有显著影响。相反，结果还显示在第0天以包含雷帕霉素之合成纳米载体和rAAV2/8-Luc伴随地处理的小鼠在第21天显示出对在完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant，CFA)中的重组hFIX蛋白之免疫接种的稳健应答。
具体实施方式
在详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于特别示例的材料或工艺参数，因为这些当然可以改变。还应当理解，本文中使用的术语仅是为了描述本发明的具体实施方案的目的，并且不旨在限制使用替代性术语来描述本发明。
本文中引用的所有出版物、专利和专利申请(无论上文中或下文中)，出于所有目的通过引用整体并入本文。这种通过引用的并入不旨在承认本文中引用的任何所并入的出版物、专利和专利申请构成现有技术。
除非内容另有明确规定，本说明书和所附权利要求中使用的没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。例如，提及“聚合物”包括两种或更多种这样的分子的混合物或不同分子量的单一聚合物种类的混合物；提及“合成纳米载体”包括两种或更多种这样的合成纳米载体的混合物或多种这样的合成纳米载体；提及“DNA分子”包括两种或更多种这样的DNA分子的混合物或多种这样的DNA分子；提及“免疫抑制剂”包括两种或更多种此类免疫抑制剂分子的混合物或多种此类免疫抑制剂分子等。
本文中使用的术语“包括/包含”或其变化形式应理解为指明包括任何所列举的整体(例如特征、要素、特性、性质、方法/工艺步骤或限制)或整体(例如特征、要素、特性、性质、方法/工艺步骤或限制)的组，但不排除任何其他整体或整体的组。因此，本文中使用的术语“包括/包含”是包括性的，并且不排除另外的未列举的整体或方法/工艺步骤。
在本文中提供的任何组合物和方法的一些实施方案中，“包括/包含”可以用“基本上由......组成”或“由......组成”代替。短语“基本上由......组成”在本文中用于要求指定的整体或步骤以及不会实质上影响所要求保护的发明的特征或功能的那些。本文中使用的术语“由......组成”用于指示仅存在所列举的整体(例如特征、要素、特性、性质、方法/工艺步骤或限制)或整体(例如特征、要素、特性、性质、方法/工艺步骤或限制)的组。
A.引言
抗病毒转移载体是用于多种应用的有希望的治疗剂，所述应用例如基因表达调节。因此，病毒转移载体可以包含编码蛋白质或核酸的转基因。这样的实例包括微RNA(microRNA，miRNA)、小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，以及结合信使RNA中的突变位点的反义寡核苷酸(例如小核RNA(small nuclear RNA，snRNA))。遗憾的是，对这些治疗剂的希望在本领域中还没有实现，这在很大程度上是由于针对病毒转移载体的细胞和体液免疫应答。这些免疫应答包括抗体、B细胞和T细胞应答，并且可以特异性针对病毒转移载体的病毒抗原(例如病毒衣壳或外壳蛋白或者其肽)。
目前，许多可能的患者具有针对病毒转移载体所基于的病毒的一定水平的预先存在的免疫力。事实上，针对病毒抗原的抗体(例如抗腺相关病毒的抗体)在人群中是高度普遍的。此外，即使预先存在的免疫力水平低，例如由于病毒转移载体的低免疫原性，这样低的水平仍然可以阻止成功转导(例如Jeune，等，Human Gene Therapy Methods，24：59-67(2013))。因此，甚至低水平的预先存在的免疫力也可能阻碍特定病毒转移载体的使用，并且可能需要临床医生基于不同血清型的病毒选择病毒转移载体，这可能不是有效的；或如果另一种病毒转移载体治疗不可用，甚至选择不同类型的治疗。
另外，病毒载体(例如腺相关载体)可以是高度免疫原性的，并引发体液和细胞介导的免疫，这可损害效力，特别是在再施用的情况下。事实上，针对病毒转移载体的细胞和体液免疫应答可在单次施用病毒转移载体后产生。在施用病毒转移载体后，中和抗体滴度可以提高并保持高水平达几年，并且可以降低病毒转移载体再施用的有效性，因为重复施用病毒转移载体通常导致增强的不希望的免疫应答。此外，可能出现病毒转移载体特异性CD8+T细胞，其例如在重新暴露于病毒抗原(例如衣壳蛋白)时消除表达期望转基因产物的经转导细胞。事实上，已经显示AAV衣壳抗原触发了以AAV病毒转移载体转导的肝细胞的免疫介导的破坏(例如Manno等，Nature Medicine，Vol.12，No.3，2006)。对于许多治疗应用，预期将需要多轮施用病毒转移载体以获得长期益处，并且在没有本文中提供的方法和组合物的情况下，预期这样做的能力受到严重限制，特别是如果需要再施用的情况下。
与将病毒转移载体用于治疗相关的问题进一步变得复杂，因为病毒转移载体抗原可以在单次施用后持续一段时间，例如至少几周(例如Nathawani等，N Engl J Med 365；25，2011；Nathwani，等，N Engl J Med 371；21，2014)。例如，已经发现在接受腺相关病毒血清型8(adeno-associated virus serotype 8，AAV8)病毒转移载体的单次输注的患者中产生的持久的衣壳特异性体液免疫(例如Nathwani，等，N Engl J Med 371；21，2014)。抗原的持久性进一步阻碍了成功使用病毒转移载体的能力。避免对病毒转移载体的免疫应答是重要的，以便成功地用病毒转移载体进行治疗。然而，在本发明之前，没有办法这样做并实现长期免疫应答减弱而不需要长期施用免疫抑制剂。
本发明人令人惊讶地和出人意料地发现，上述问题和限制可以通过实施本文中公开的本发明来克服。提供了为前述障碍给出解决方案以有效将病毒转移载体用于治疗的方法和组合物。特别地，已出人意料地发现，可以用本文中提供的方法和相关组合物减弱抗病毒转移载体的免疫应答。所述方法和组合物可以提高用病毒转移载体治疗的效力，并提供长期免疫减弱，即使在需要重复施用病毒转移载体的情况下。
现在将在下文中更详细地描述本发明。
B.定义
“施用”是指以药理学可用的方式向对象给予或分配材料。该术语旨在包括“导致被施用”。“导致被施用”意指直接或间接地导致、敦促、鼓励、辅助、诱导或指导另一方施用该材料。本文中提供的任一种方法可以包括或另外包括伴随施用靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和病毒转移载体的步骤。在一些实施方案中，重复地进行伴随施用。在另一些实施方案中，伴随施用是同时施用。
在本文中提供的用于向对象施用的组合物或剂型的上下文中，“有效量”是指在对象中产生一种或更多种期望结果的组合物或剂型的量，所述结果例如，降低或消除针对病毒转移载体的免疫应答或产生减弱的抗病毒转移载体应答。有效量可以用于体外或体内目的。对于体内目的，所述量可以是临床医生认为对于可能由于施用病毒转移载体而经历不期望免疫应答的对象具有临床益处的量。在本文中提供的任一种方法中，所施用的组合物可以是以本文中提供的任一种有效量来施用。
有效量可涉及降低不期望免疫应答的水平，尽管在一些实施方案中，其涉及完全防止不期望的免疫应答。有效量还可以涉及延迟不期望的免疫应答的发生。有效量也可以是导致期望治疗终点或期望治疗结果的量。有效量优选导致对象中对抗原(如病毒转移载体抗原)的致耐受性免疫应答。有效量也可以优选导致转基因表达提高(转基因由病毒转移载体递送)。这可以通过测量对象中的多种目的组织或系统中的转基因蛋白质浓度来确定。可以局部或全身测量这种表达的提高。可以通过常规方法监测上述任何方法的实现。
在所提供的任一种组合物和方法中的一些实施方案中，有效量是使其中期望免疫应答(例如降低或消除针对病毒转移载体的免疫应答或产生减弱的抗病毒转移载体应答)在对象中持续至少1周、至少2周或至少1个月的量。在所提供的任一种组合物和方法中的另一些实施方案中，有效量是产生可测量的期望免疫应答的量，例如降低或消除针对病毒转移载体的免疫应答或产生减弱的抗病毒转移载体应答。在一些实施方案中，有效量是产生可测量的期望免疫应答(例如，针对特定病毒转移载体抗原)至少1周、至少2周或至少1个月的量。
有效量将当然地取决于所治疗的特定对象；病症、疾病或障碍的严重性；个体患者参数包括年龄、身体状况、身材和体重；治疗的持续时间；共存治疗的性质(如果有的话)；具体的施用途径和在健康从业者的知识和专长内的类似因素。这些因素是本领域普通技术人员公知的，并且可以仅通过常规实验来解决。
“抗病毒转移载体免疫应答”或“针对病毒转移载体的免疫应答”等是指针对病毒转移载体的任何不期望的免疫应答。在一些实施方案中，不期望的免疫应答是针对病毒转移载体或其抗原的抗原特异性免疫应答。在一些实施方案中，免疫应答对病毒转移载体的病毒抗原是特异性的。在另一些实施方案中，免疫应答对于由病毒转移载体的转基因编码的蛋白质或肽是特异性的。在一些实施方案中，免疫应答特异性针对病毒转移载体的病毒抗原，而不是由病毒转移载体的转基因编码的蛋白质或肽。免疫应答可以是抗病毒转移载体抗体应答、抗病毒转移载体T细胞免疫应答，例如CD4+T细胞或CD8+T细胞免疫应答或抗病毒转移载体B细胞免疫应答。
当在对象中，或与所述对象或另一对象中的预期或测量的应答相比，抗病毒转移载体免疫应答以某种方式降低或消除时，则被称为“减弱的抗病毒转移载体应答”。在一些实施方案中，对象中的减弱的抗病毒转移载体应答包括：相比于抗病毒转移载体免疫应答B而言降低的抗病毒转移载体免疫应答A(例如T细胞、B细胞或抗体应答)，其中所述抗病毒转移载体免疫应答A为使用从经过本文中提供的伴随施用之后的对象中所获得的生物样品所测得，且所述抗病毒转移载体免疫应答B为在将病毒转移载体施用于另一个对象(例如测试对象)而未伴随施用靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂之后，使用从所述另一个对象中获得的生物样品所测得。在一些实施方案中，在向另一个对象施用病毒转移载体而未施用任何靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂之后，从所述另一对象中获得所述生物样品。在一些实施方案中，所述减弱的抗病毒转移载体应答是相比于抗病毒转移载体免疫应答B而言降低的抗病毒转移载体免疫应答A(例如T细胞、B细胞或抗体应答)，其中所述抗病毒转移载体免疫应答A为在如本文中所提供的伴随施用后，在对对象的生物样品进行随后的病毒转移载体体外攻击后从所述对象中获得的生物样品中的免疫应答；所述抗病毒转移载体免疫应答B是在将病毒转移载体施用于另一个对象(例如测试对象)而未伴随施用靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂之后，对从所述另一个对象中获得的生物样品进行病毒转移载体体外攻击后所检测的免疫应答。在一些实施方案中，所述减弱的抗病毒转移载体应答是相比于抗病毒转移载体免疫应答B而言降低的抗病毒转移载体免疫应答A(例如T细胞、B细胞或抗体应答)，其中所述抗病毒转移载体免疫应答A是在如本文中所提供的伴随施用之后，对所述对象施用病毒转移载体攻击后在所述对象中的免疫应答；所述抗病毒转移载体免疫应答B是在将病毒转移载体施用于另一个对象(例如测试对象)而未伴随施用靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂之后，对所述另一个对象施用随后的病毒转移载体攻击后在所述另一个对象中的免疫应答。在一些实施方案中，在不施用任何靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂的情况下施用病毒转移载体。
“抗原”是指B细胞抗原或T细胞抗原。“抗原类型”意指共享相同或基本上相同的抗原特征的分子。在一些实施方案中，抗原可以是蛋白质、多肽、肽、脂蛋白、糖脂、多核苷酸、多糖等。
“靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂”意指导致产生具有致耐受性作用的抗原呈递细胞(antigen-presenting cell，APC)的试剂。这种免疫抑制剂可以包括与导致递送至APC并导致致耐受性作用的载体相偶联的免疫抑制剂，以及凭借其形式或特征可导致APC致耐受性作用的试剂。靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂的实例包括但不限于包含本文中所述的免疫抑制剂的合成纳米载体；与靶向APC的抗体或其抗原结合片段(或靶向APC的其他配体)偶联的如本文中所述的免疫抑制剂、红细胞结合治疗剂，以及通过其特征导致APC致耐受性免疫应答的颗粒等。
当靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂是与免疫抑制剂偶联的合成纳米载体时，在一些实施方案中，免疫抑制剂是除了构成合成纳米载体的结构的材料之外的要素。例如，在一个实施方案中，其中合成纳米载体由一种或更多种聚合物构成，则免疫抑制剂是附加的并且在一些实施方案中与所述一种或更多种聚合物连接的化合物。作为另一个实例，在一个实施方案中，其中合成纳米载体由一种或更多种脂质构成，则免疫抑制剂也还是附加于其中的，并且在一些实施方案中，与一种或更多种脂质连接。在这样的一些实施方案中，其中靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂是与免疫抑制剂偶联的合成纳米载体，并且合成纳米载体的材料也导致致耐受作用，则免疫抑制剂是除了导致致耐受性作用的合成纳米载体的材料之外存在的要素。
“抗原特异性”是指由目的抗原的存在所导致的，或产生特异性识别或结合目的抗原的分子的免疫应答。一般而言，虽然这种应答针对目的抗原是可测量的，但对于其他抗原的应答则降低或可忽略不计。例如，当免疫应答产生抗原特异性抗体时，其产生选择性结合目的抗原但不与其他抗原结合的抗体。作为另一个实例，其中免疫应答涉及CD4+或CD8+T细胞的产生，则在MHC I类或II类抗原呈递的情况下，抗原特异性CD4+或CD8+T细胞可通过抗原呈递细胞(APC)，或在CD8+T细胞的情况下通过其中产生抗原的任何其他细胞(例如以病毒感染的细胞)，分别与目的抗原或其一部分结合。在免疫耐受的情况下，抗原特异性是指相对于其他不相关或未关联抗原(例如，在时间上或在空间上与靶抗原错位的抗原)，针对靶抗原的特异性免疫应答的选择性预防或抑制。
“评估免疫应答”是指对于体外或体内免疫应答的水平、存在或不存在、降低、提高等的任何测量或测定。这样的测量或测定可以对从对象获得的一个或更多个样品来进行。这样的评估可以用本文中提供的或本领域中已知的任一种方法进行。所述评估可以是评估抗体或T细胞的数目或百分比，例如特异性针对病毒转移载体的那些抗体或T细胞，例如在来自对象的样品中的抗体或T细胞。所述评估还可以是评估与免疫应答相关的任何效应，例如测量细胞因子、细胞表型等的存在或不存在。本文中提供的任一种方法可以包括或另外包括评估针对病毒转移载体或其抗原的免疫应答的步骤。评估可以直接或间接进行。所述术语旨在包括导致、敦促、鼓励、辅助、诱导或指导另一方评估免疫应答的行动。
“连接”或“连接的”或者“偶联”或“偶联的”(等)意指将一个实体(例如部分)与另一个实体经化学结合。在一些实施方案中，所述连接是共价的，意指连接发生在两个实体之间存在共价键的情况下。在一些非共价实施方案中，非共价连接由非共价相互作用介导，其包括但不限于电荷相互作用、亲和力相互作用、金属配位作用、物理吸附、主客体相互作用、疏水相互作用、TT堆叠相互作用、氢键相互作用、范德华相互作用、磁相互作用、静电相互作用、偶极-偶极相互作用和/或其组合。在一些实施方案中，封装是连接的形式。
除非另有说明，本文所用的“平均”是指算术均值。
“伴随地”是指以时间相关的方式向对象施用两种或更多种材料/试剂，优选在时间上充分相关，以提供免疫应答中的调节，并且甚至更优选地组合施用两种或更多种材料/试剂。在一些实施方案中，伴随施用可以包括在指定的时间段内，优选在1个月内，更优选在1周内，还更优选在1天内，甚至更优选在1小时内施用两种或更多种材料/试剂。在一些实施方案中，材料/试剂可以重复地伴随施用，即伴随施用多于一次，如实施例中所提供的。
“确定”意指客观地确定某事物，例如事实、关系或数量。在一些实施方案中，可以确定对象是否对病毒转移载体具有预先存在的免疫力。该术语旨在包括“导致被确定”。“导致被确定”意指导致、敦促、鼓励、帮助、诱导或指导另一方执行如本文中所提供的确定步骤。在一些实施方案中，确定步骤可以是确定对象是否对病毒转移载体具有预先存在的免疫力。本文中提供的任一种方法可以包括或另外包括如本文中所述的确定步骤，包括确定对象是否对病毒转移载体具有预先存在的免疫力的步骤。
“指导”意指影响，例如采取某种行动来以某种方式影响另一方的行为，例如以这样的方式引起或控制另一方的行为，以使得他们执行如本文中所提供的一个或更多个步骤。在一些实施方案中，另一方是正在进行指导的一方的代理。在另一些实施方案中，另一方不是正在进行指导的一方的代理，但由另一方所执行的步骤可归因于指导或是指导的结果。因此，指导包括指示或提供指令以执行一个或更多个步骤，以便收获以所述一个或更多个步骤的执行为条件的益处。
“剂型”意指在适于施用于对象的介质、载体、载剂或装置中的药理学和/或免疫学活性材料。本文中提供的任一种组合物或剂量可以是剂型的形式。
“剂量”是指在给定时间内向对象施用的药理学和/或免疫学活性物质的具体量。“在先剂量”是指材料的较早剂量。一般而言，本发明的方法和组合物中靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和/或病毒转移载体的剂量是指靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和/或病毒转移载体的量。或者，在其中靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂是包含免疫抑制剂的合成纳米载体的情况下，可以基于提供期望量之靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂的合成纳米载体的数目来施用剂量。当在重复剂量的情况下使用剂量时，剂量是指每个重复剂量的量，其可以相同或不同。
“封装”意指将至少一部分物质包封在合成纳米载体内。在一些实施方案中，物质完全包封在合成纳米载体内。在另一些实施方案中，被封装的物质的大部分或全部不暴露于合成纳米载体外部的局部环境。在另一些实施方案中，不超过50％、40％、30％、20％、10％或5％(重量/重量)暴露于局部环境。封装不同于吸收，后者将大部分或全部物质置于合成纳米载体的表面上，并使物质暴露于合成纳米载体外部的局部环境。
“提高转基因表达”是指提高对象中病毒转移载体的转基因表达产物的水平，所述转基因由病毒转移载体递送。在一些实施方案中，转基因表达产物的水平可以通过测量对象的多种目的组织或系统中的转基因蛋白质浓度来确定。或者，当转基因表达产物是核酸时，转基因表达的水平可以通过转基因核酸产物测量。可以例如通过测量从对象中获得的样品中的转基因表达产物的量并将其与先前样品进行比较来确定转基因表达提高。样品可以是组织样品。在一些实施方案中，可以使用流式细胞术测量转基因表达产物。
“建立”意指产生成果或结果或推断出某事物，例如事实或关系。基于使用该术语的情况，该术语的用途将是显而易见的。为了产生成果或结果，可以以多种方式完成建立，其包括但不限于采取措施来完成成果或结果。例如，在一些实施方案中，施用如本文中所提供的材料可产生成果或结果。为了确定某事物，例如事实或关系，建立可以通过进行实验、执行设计等来完成。例如，可以基于关于对象的实验结果来建立“施用病毒转移载体可能在对象中产生抗病毒转移载体免疫应答”，所述结果包括关于从对象获得的一个或更多个样品的结果。一般而言，在对象中产生抗病毒转移载体免疫应答的可能性是在不施用如本文中提供的靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂的情况下，在施用(或在一些实施方案中重复施用)病毒转移载体后产生这种应答的可能性。同样，还可以基于关于对象的实验结果来建立“对象对病毒转移载体具有预先存在的免疫力”，所述结果包括关于从对象中获得的一个或更多个样品的结果。在另一个实施方案中，这样的建立可以通过评估对象中的免疫应答来确定。关于建立施用剂量，靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂或病毒转移载体的剂量可以通过从测试剂量开始并使用已知的缩放技术(例如异速缩放或等比例缩放)来确定，以确定用于施用的剂量。这样也可以用于建立本文中提供的方案。“建立”包括“导致被建立”。“导致被建立”意指为实体进行导致、敦促、鼓励、辅助、诱导或指导或与实体协调行动，以执行本文中所提供的建立步骤。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，该方法可以包括或另外包括如本文中所述的任何一个建立步骤。
“频率”是指向对象施用靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂、病毒转移载体或二者组合(例如伴随施用)的时间间隔。
“基因表达调节转基因”是指编码基因表达调节剂的任何核酸。“基因表达调节剂”是指可以增强、抑制或调节一种或更多种内源基因之表达的分子。因此，基因表达调节剂包括DNA结合蛋白(例如，人工转录因子)以及介导RNA干扰的分子。基因表达调节剂包括RNAi分子(例如dsRNA或ssRNA)、miRNA和三链体形成寡核苷酸(triplex-formingoligonucleotide，TFO)。基因表达调节剂还可包括经修饰的RNA，包括任何前述RNA分子的经修饰形式。
“免疫抑制剂”意指引起致耐受性作用的化合物，优选通过其对APC产生作用。致耐受性作用一般是指APC或其他免疫细胞全身性地和/或局部地调节，其以持久的方式降低、抑制或防止对抗原的不期望免疫应答。在一个实施方案中，免疫抑制剂是引起APC在一种或更多种免疫效应细胞中促进调节性表型的免疫抑制剂。例如，调节性表型的特征可以是：抑制抗原特异性CD4+T细胞或B细胞的产生、诱导、刺激或募集；抑制抗原特异性抗体的产生，Treg细胞(例如，CD4+CD25highFoxP3+Treg细胞)的产生、诱导、刺激或募集等。这可以是CD4+T细胞或B细胞转化为调节表型的结果。这也可以是在其他免疫细胞(例如CD8+T细胞、巨噬细胞和iNKT细胞)中诱导FoxP3的结果。在一个实施方案中，免疫抑制剂是在APC处理抗原后影响APC应答的免疫抑制剂。在另一个实施方案中，免疫抑制剂不是干扰抗原处理的免疫抑制剂。在另一个实施方案中，免疫抑制剂不是凋亡信号分子。在另一个实施方案中，免疫抑制剂不是磷脂。
免疫抑制剂包括但不限于：他汀类；mTOR抑制剂，例如雷帕霉素或雷帕霉素类似物(即，rapalog)；TGF-β信号传导剂；TGF-β受体激动剂；组蛋白脱乙酰酶抑制剂，例如曲古抑菌素A；皮质类固醇；线粒体功能抑制剂，例如鱼藤酮；P38抑制剂；NF-κβ抑制剂，例如6Bio、地塞米松、TCPA-1、IKK VII；腺苷受体激动剂；前列腺素E2激动剂(PGE2)，例如米索前列醇；磷酸二酯酶抑制剂，例如磷酸二酯酶4抑制剂(PDE4)，例如咯利普兰；蛋白酶体抑制剂；激酶抑制剂；G蛋白偶联受体激动剂；G蛋白偶联受体拮抗剂；糖皮质激素；类视黄醇；细胞因子抑制剂；细胞因子受体抑制剂；细胞因子受体激活剂；过氧化物酶体增殖物激活受体拮抗剂；过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂；组蛋白脱乙酰酶抑制剂；钙调磷酸酶抑制剂；磷酸酶抑制剂；PI3KB抑制剂，例如TGX-221；自噬抑制剂，例如3-甲基腺嘌呤；芳烃受体抑制剂；蛋白酶体抑制剂I(PSI)；和氧化的ATP，例如P2X受体阻断剂。免疫抑制剂还包括IDO、维生素D3、视黄酸、环孢素例如环孢素A、芳烃受体抑制剂、白藜芦醇、硫唑嘌呤(Aza)、6-巯基嘌呤(6-MP)、6-硫鸟嘌呤(6-TG)、FK506、萨菲菌素A、沙美特罗、霉酚酸酯(MMF)、阿司匹林和其他COX抑制剂、尼氟酸、雌三醇和雷公藤内酯。其他示例性免疫抑制剂包括但不限于：小分子药物、天然产物、抗体(例如抗CD20、CD3、CD4的抗体)、基于生物制剂的药物、基于碳水化合物的药物、RNAi、反义核酸、适配体、甲氨蝶呤、NSAID；芬戈莫德；那他珠单抗；阿仑单抗；抗CD3；他克莫司(FK506)，阿巴西普，贝拉西普等。“Rapalog”是指在结构上与雷帕霉素(西罗莫司)(的类似物)相关的分子。Rapalog的实例包括但不限于坦罗莫司(CCI-779)、依维莫司(RAD001)、地磷莫司(AP-23573)和佐他莫司(ABT-578)。Rapalog的另一些实例可见于例如WO公开WO 1998/002441和美国专利8,455,510，其Rapalog通过引用整体并入本文。
免疫抑制剂可以是直接提供对APC的致耐受性作用的化合物，或者其可以是间接提供致耐受性作用的化合物(即在施用后以某种方式处理后)。因此，免疫抑制剂包括本文中提供的任何化合物的前药形式。其他免疫抑制剂是本领域技术人员已知的，并且本发明不限于这一方面。在一些实施方案中，免疫抑制剂可以包含本文中提供的任一种药剂。
“诱导购买”是指建议实体购买靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂、病毒转移载体或二者以实现如本文中所述的有益效果或执行本文中提供的任一种方法的任何行为。这种行为包括：包装靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂、病毒转移载体或二者，其描述伴随施用靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和病毒转移载体以减弱抗病毒转移载体反应、提高转基因表达或允许重复施用病毒转移载体的益处。或者，所述包装可以描述或建议本文中提供的任一种方法的性能。诱导实体购买的行为还包括营销靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂、病毒转移载体或靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和病毒转移载体产物，其中带有描述或建议使用此类产品来实施本文中所述的任何有益效果或本文中提供的任一种方法的信息。或者，市场营销包括描述或建议使用此类产品以减弱抗病毒转移载体反应、提高转基因表达或重复施用病毒转移载体的材料。作为另一示例，诱导行为还可以包括传达描述或建议任何前述内容的信息的行为。传达是可以以书面、口头等任何形式进行的行为。如果是书面形式，则可以经由包括电子或纸基介质的任何介质进行传达。此外，诱导行为还包括分发靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂、病毒转移载体或二者的行为。分发的行为包括将靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂、病毒转移载体或二者连带信息、包装、营销材料等都提供给实体的任何行为，所述信息、包装、营销材料等描述、指导或传达本文中所述的任何益处或本文中提供的任一种方法的步骤或其减弱抗病毒转移载体应答、提高转基因表达或允许重复施用病毒转移载体的能力。分发行为包括销售、提供销售和运输用于销售(例如，运输到药房、医院等)。
当偶联至合成纳米载体时，“载荷”是基于整个合成纳米载体中材料的配方总干重(重量/重量)与合成纳米载体偶联的免疫抑制剂的量。通常来说，这样的载荷作为合成纳米载体群体的平均来计算。在一个实施方案中，合成纳米载体的平均载荷为0.1％至99％。在另一个实施方案中，载荷为0.1％至50％。在另一个实施方案中，载荷为0.1％至20％。在另一个实施方案中，载荷为0.1％至10％。在又一个实施方案中，载荷为1％至10％。在又一个实施方案中，载荷为7％至20％。在另一个实施方案中，载荷在合成纳米载体群体中平均为至少0.1％、至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％、至少0.5％、至少0.6％、至少0.7％、至少0.8％、至少0.9％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在另一个实施方案中，载荷在合成纳米载体群体中平均为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在上述实施方案的一些实施方案中，载荷在合成纳米载体群体中平均为不超过25％。在一些实施方案中，可以如在实施例中描述的或本领域已知的那样计算载荷。在一些实施方案中，当免疫抑制剂的形式本身是颗粒或颗粒样(例如纳米晶体免疫抑制剂)时，免疫抑制剂的载荷是在颗粒等中的免疫抑制剂的量(重量/重量)。在这样的一些实施方案中，载荷可以接近97％、98％、99％或更高。
“合成纳米载体的最大尺寸”意指沿着合成纳米载体的任何轴测量的纳米载体的最大尺寸。“合成纳米载体的最小尺寸”意指沿着合成纳米载体的任何轴测量的合成纳米载体的最小尺寸。例如，对于球形合成纳米载体，合成纳米载体的最大和最小尺寸将基本上相同，并且将是其直径的尺寸。类似地，对于立方形合成纳米载体，合成纳米载体的最小尺寸将是其高度，宽度或长度中的最小值，而合成纳米载体的最大尺寸将是其高度，宽度或长度中的最大值。在一个实施方案中，基于样品中合成纳米载体的总数，在样品中至少75％、优选至少80％、更优选至少90％的合成纳米载体的最小尺寸为等于或大于100nm。在一个实施方案中，基于样品中合成纳米载体的总数，样品中至少75％、优选至少80％、更优选至少90％的最大尺寸等于或小于5μm。优选地，基于样品中合成纳米载体的总数，样品中至少75％、优选至少80％、更优选至少90％的合成纳米载体的最小尺寸为大于110nm、更优选大于120nm、更优选大于130nm、还更优选大于150nm。合成纳米载体的最大和最小尺寸的纵横比可以根据实施方案而变化。例如，合成纳米载体的最大尺寸与最小尺寸的纵横比可以在1∶1至1,000,000∶1、优选1∶1至100,000∶1、更优选1∶1至10,000∶1、更优选1∶1至1000∶1、还更优选1∶1至100∶1、并且还更优选1∶1至10∶1之间变化。优选地，基于样品中合成纳米载体的总数，样品中至少75％、优选至少80％、更优选至少90％的合成纳米载体的最大尺寸为等于或小于3μm、更优选等于或小于2μm、更优选等于或小于1μm、更优选等于或小于800nm、更优选等于或小于600nm、还更优选等于或小于500nm。在一些优选的实施方案中，基于样品中合成纳米载体的总数，样品中至少75％、优选至少80％、更优选至少90％的合成纳米载体的最小尺寸等于或大于100nm、更优选等于或大于120nm、更优选等于或大于130nm、更优选等于或大于140nm、并且还更优选等于或大于150nm。在一些实施方案中，通过将合成纳米载体悬浮在液体(通常为水性)介质中并使用动态光散射(dynamic light scattering，DLS)(例如使用Brookhaven ZetaPALS仪器)，可以获得对合成纳米载体尺寸(例如有效直径)的测量。例如，可将合成纳米载体的悬浮液从水性缓冲液稀释到纯化水中，以达到约0.01至0.1mg/mL的最终合成纳米载体悬浮液浓度。稀释的悬浮液可以直接在合适的比色杯内部制备，或转移到合适的比色杯中以用于DLS分析。然后可以将比色杯放置在DLS中，使其平衡到受控温度，然后扫描足够的时间以基于介质的黏度和样品的折射率的适当输入来获得稳定的和可重复的分布。然后报告有效直径或分布的均值。确定高纵横比或非球形的合成纳米载体的有效尺寸可能需要放大技术(例如电子显微术)以获得更准确的测量。合成纳米载体的“尺寸”或“大小”或“直径”意指例如使用动态光散射获得的粒度分布的均值。
“可测量水平”是指高于阴性对照水平或将被认为高于背景或信号噪声的任何水平。可测量水平是将被认为指示所测量的分子存在的水平。
“非甲氧基封端的聚合物”意指具有至少一个以不同于甲氧基的部分结束的末端的聚合物。在一些实施方案中，聚合物具有至少两个以不同于甲氧基的部分结束的末端。在另一些实施方案中，聚合物不具有以甲氧基结尾的末端。“非甲氧基封端的普朗尼克聚合物”意指除了在两个末端具有甲氧基的线性普朗尼克聚合物之外的聚合物。本文中提供的聚合物纳米颗粒可以包含非甲氧基封端的聚合物或非甲氧基封端的普朗尼克聚合物。
“获得”是指以任何方式获取材料的行为。所述材料可以通过生产、购买、接收等获取。该术语旨在包括“导致获得”。“导致获得”意指导致、敦促、鼓励、辅助、诱导或指导实体或与实体协调以获得本文中提供的材料。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，该方法可以包括或另外包括如本文所述地来获得的任一步骤。
“可药用赋形剂”或“可药用载体”意指与药理活性物质一起使用以配制组合物的药理非活性物质。可药用赋形剂包括本领域已知的多种材料，包括但不限于糖类(例如葡萄糖、乳糖等)、防腐剂(例如抗微生物剂)、重构助剂、着色剂、盐水(例如磷酸缓冲盐水)和缓冲剂。
“针对病毒转移载体的预先存在的免疫力”是指对象中抗体、T细胞和/或B细胞的存在，所述细胞已经预先通过先前暴露于病毒转移载体的抗原或交叉反应性抗原(包括但不限于其他病毒)而被致敏。在一些实施方案中，这种预先存在的免疫力达到这样的水平，其预期导致干扰病毒转移载体效力的抗病毒转移载体免疫应答。在一些实施方案中，这种预先存在的免疫达到这样的水平，其在随后暴露于病毒转移载体后预期导致抗病毒转移载体免疫应答。预先存在的免疫力可以通过确定针对来自对象的样品(例如血液样品)中存在的病毒转移载体的抗体(例如中和抗体)的水平来评估。本文中至少在实施例中描述了用于评估抗体(例如中和抗体)水平的测定，并且其也是本领域普通技术人员已知的。这样的测定是ELISA测定。预先存在的免疫力还可以通过确定免疫细胞(例如B或T细胞)的抗原回忆应答来评估，所述免疫细胞以由APC呈递的病毒转移载体抗原或由MHC I类或MHC II类的分子呈递的病毒抗原表位体内或体外刺激。抗原特异性回忆应答的测定包括但不限于ELISpot、胞内细胞因子染色、细胞增殖和细胞因子产生测定。一般而言，这些和其他测定是本领域普通技术人员已知的。在一些实施方案中，不显示针对病毒转移载体的预先存在的免疫力的对象是具有一定水平的抗病毒转移载体抗体(例如中和抗体)或被认为是阴性的记忆B或T细胞的对象。在另一些实施方案中，不显示针对病毒转移载体的预先存在的免疫力的对象是具有高于平均阴性对照不超过3个标准偏差的抗病毒转移载体应答水平的对象。
“生产”是指导致材料被制造的任何行为。生产的行为包括制备材料或以某种方式处理材料。在一些实施方案中，生产的行为包括使得该材料可供另一人使用的任何行为。该术语旨在包括“导致生产”。“导致产生”意指导致、敦促、鼓励、辅助、诱导或指导实体或与实体协调行动以制造本文中提供的材料。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，所述方法可以包括或另外包括如本文中所述的任一生产步骤。
“方案”意指向对象施用的模式，并且包括一种或更多种物质向对象的任何给药方案。方案由要素(或变量)构成；因此方案包括一个或更多个要素。方案的这些要素可包括给药量(剂量)、给药频率、施用途径、给药持续时间、给药速率、给药间隔、任何前述的组合等。在一些实施方案中，可以使用方案向一个或更多个测试对象施用本发明的一种或更多种组合物。然后可以评估这些测试对象的免疫应答，以确定该方案是否有效产生期望的或期望水平的免疫应答或治疗作用。可以评估任何治疗和/或免疫作用。方案的一个或更多个要素可已先前在测试对象(例如非人对象)中证明，然后转化为对人方案。例如，使用已建立的技术(例如异速缩放或其他缩放方法)在非人对象中证明的给药量可以缩放转化为对人方案的要素。可以使用本文中提供的或本领域已知的任何方法确定方案是否具有期望的作用。例如，样品可以从根据特定方案已施用本文中提供的组合物的对象中获得，以确定特定免疫细胞、细胞因子、抗体等是否降低、产生、活化等。示例性方案是先前证明会导致针对病毒转移载体抗原的致耐受性免疫应答或实现本文中所述的任一种有益结果的方案。用于检测免疫细胞的存在和/或数量的可用方法包括但不限于流式细胞术方法(例如，FACS)、ELISpot、增殖应答、细胞因子产生和免疫组织化学方法。用于免疫细胞标志物的特异性染色的抗体和其他结合剂是可商购的。此类试剂盒通常包括用于抗原的染色试剂，其允许对来自异质细胞群体的期望细胞群体的基于FACS的检测、分离和/或定量。在一些实施方案中，如果预期所选择的要素在对象中实现期望的结果，则使用所述方案包含的一种或更多种或者所有或基本上所有要素来向对象施用本文中提供的组合物。这种期望可以基于在测试对象中确定的方案，并且如果需要可以缩放。本文中提供的任一种方法可包括或另外包括根据这样的方案单独或与一个或更多个剂量的病毒转移载体组合施用靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂的剂量的步骤，所述方案已经显示减弱抗病毒转移载体免疫应答或允许重复施用病毒转移载体。本文中提供的任一种方法可以包括或另外包括确定实现本文中所述的任一种有益结果的此类方案。
“提供”意指个体执行的提供用于实践本发明之材料的行为或一组行为。提供可以包括生产、分发、销售、给予、使之可用、开处方或施用材料的行为。行为或一组行为可以直接地或间接地执行。因此，该术语旨在包括“导致提供”。“导致提供”意指导致、敦促、鼓励、辅助、诱导或指导实体或与实体协调行动以提供用于实施本发明的材料。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，所述方法可以包括或另外包括如本文中所述提供的任一步骤。
“重复剂量”或“重复给药”等意指在较早剂量或给药之后向对象施用相同材料的至少一个额外剂量或给药。例如，病毒转移载体的重复剂量是在相同材料的在先剂量后的至少一个额外剂量的病毒转移载体。虽然材料可以相同，但是重复剂量中的材料的量可以不同于较早的剂量。例如，在本文中提供的任一种方法或组合物的一个实施方案中，重复剂量中的病毒转移载体的量可以小于较早剂量中的病毒转移载体的量。或者，在本文中提供的任一种方法或组合物的实施方案中，重复剂量的量可以至少等于较早剂量中的病毒转移载体的量。重复剂量可以在先前剂量后数周、数月或数年施用。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，重复剂量在刚好在所述重复剂量之前进行的剂量后至少1周施用。如果重复剂量对于对象产生有益作用，则认为重复剂量是有效的。优选地，有效的重复剂量导致与减弱的抗病毒转移载体应答相结合的有益作用。
“选择病毒转移载体的剂量以小于......”是指选择病毒转移载体的剂量，其小于当所述对象由于重复施用所述病毒转移载体而发生针对所述病毒转移载体的抗病毒转移载体免疫应答时会被选择的向对象施用的病毒转移载体量。该术语旨在包括“导致选择”。“导致选择”意指导致、敦促、鼓励、辅助、诱导或指导实体或与实体协调行动来选择上述较小剂量。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，所述方法可以包括或另外包括如本文所述进行选择的任一步骤。
“同时”意指同时或基本上同时施用，其中临床医生将认为施用之间的任何时间对于期望治疗结果的影响实际上为零或可忽略。在一些实施方案中，意指以5、4、3、2、1或更少的分钟数进行施用。
“对象”意指动物，包括温血哺乳动物，例如人和灵长类动物；鸟类；家养或农场动物，例如猫、狗、绵羊、山羊、牛、马和猪；实验动物，例如小鼠、大鼠和豚鼠；鱼类；爬行动物；动物园动物和野生动物等。本文中使用的对象可以是本文中提供的任一种方法或组合物中需要的一种。
“合成纳米载体”意指在为见于自然界中的离散物体，并且具有尺寸小于或等于5微米的至少一个维度。一般包括白蛋白纳米颗粒作为合成纳米载体，然而在某些实施方案中，合成纳米载体不包含白蛋白纳米颗粒。在一些实施方案中，合成纳米载体不包含壳聚糖。在另一些实施方案中，合成纳米载体不是基于脂质的纳米颗粒。在另外的实施方案中，合成纳米载体不包含磷脂。
合成纳米载体可以是但不限于一种或多种基于脂质的纳米颗粒(本文中也称为脂质纳米颗粒，即构成其结构的大多数材料是脂质的纳米颗粒)、聚合物纳米颗粒、金属纳米颗粒、基于表面活性剂的乳液、树枝状聚合物、巴基球、纳米线、病毒样颗粒(即主要由病毒结构蛋白构成但不具有感染性或具有低感染性的颗粒)、基于肽或蛋白质的颗粒(本文中也称为蛋白质颗粒，即构成其结构的大多数材料是肽或蛋白质的颗粒)(例如白蛋白纳米颗粒)和/或使用纳米材料(例如脂质-聚合物纳米颗粒)的组合而开发的纳米颗粒。合成纳米载体可以是多种不同的形状，包括但不限于球形、立方形、角锥形、椭圆体形、圆柱形、环形等。根据本发明的合成纳米载体包含一个或更多个表面。可适用于本发明实践的示例性合成纳米载体包括：(1)Gref等人的美国专利5,543,158中公开的可生物降解的纳米颗粒，(2)Saltzman等人的公开的美国专利申请20060002852的聚合物纳米颗粒，(3)DeSimone等人的公开的美国专利申请20090028910的光刻构建的纳米粒子，(4)von Andrian等人的WO2009/051837的公开内容，(5)Penades等人的公开的美国专利申请2008/0145441中公开的纳米颗粒，(6)de los Rios等人的公开的美国专利申请20090226525中公开的蛋白质纳米颗粒，(7)Sebbel等人的公开的美国专利申请20060222652中公开的病毒样颗粒，(8)Bachmann等人的公开的美国专利申请20060251677中公开的核酸连接的病毒样颗粒，(9)WO2010047839A1或WO2009106999A2中公开的病毒样颗粒，(10)P.Paolicelli等人，“Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate andDeliver Virus-like Particles”Nanomedicine.5(6)：843-853(2010)中公开的纳米沉淀纳米颗粒，(11)美国公开2002/0086049中公开的凋亡细胞、凋亡小体或者合成或半合成模拟物，或(12)Look等人，Nanogel-based delivery of mycophenolic acid amelioratessystemic lupus erythematosus in mice”J.Clinical Investigation 123(4)：1741-1749(2013)中的那些。
根据本发明的具有等于或小于约100nm、优选等于或小于100nm的最小尺寸的合成纳米载体不包含具有激活补体之羟基的表面，或者包含基本上由不激活补体之羟基的部分组成的表面。在一个优选的实施方案中，根据本发明的具有等于或小于约100nm、优选等于或小于100nm的最小尺寸的合成纳米载体不包含基本上激活补体的表面，或者包含实质上由基本上不激活补体的部分组成的表面。在一个更优选的实施方案中，根据本发明的具有等于或小于约100nm、优选等于或小于100nm的最小尺寸的合成纳米载体不包含激活补体的表面，或者包含实质上由不激活补体的部分组成的表面。在一些实施方案中，合成纳米载体排除了病毒样颗粒。在一些实施方案中，合成纳米载体可以具有大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7或大于1∶10的纵横比。
“治疗性蛋白质”意指可以用于治疗目的的任何蛋白质。治疗性蛋白质可以是用于蛋白质替代或蛋白质补充的蛋白质。治疗性蛋白质包括但不限于酶、酶辅因子、激素、凝血因子、细胞因子、生长因子等。其他治疗性蛋白质的实例在本文其他地方提供。
“病毒转移载体的转基因”是指使用病毒转移载体转运到细胞中的核酸材料，并且一旦在细胞中，其表达以分别产生蛋白质或核酸分子，例如用于如本文中所述的治疗应用。转基因可以是基因表达调节转基因。“被表达”或“表达”等是指在转基因转导入细胞并由转导细胞加工后，合成功能性(即，对于期望目的具有生理活性)基因产物。这样的基因产物在本文中也称为“转基因表达产物”。因此，表达的产物是所得蛋白质或核酸，例如由转基因编码的反义寡核苷酸或治疗性RNA。
“病毒转移载体”意指已经适于递送本文中提供的转基因的病毒载体。“病毒载体”是指递送转基因的病毒转移载体的所有病毒组分。因此，“病毒抗原”是指病毒转移载体的病毒组分的抗原，例如衣壳或外壳蛋白，但不是转基因或其编码的产物。“病毒转移载体抗原”是指病毒转移载体的任何抗原，包括其病毒组分以及蛋白质转基因表达产物。将病毒载体改造以将一种或更多种期望核酸转导到细胞中。转基因可以是基因表达调节转基因。在一些实施方案中，转基因是编码本文中提供的蛋白质的转基因，例如治疗性蛋白质、DNA结合蛋白质等。在另一些实施方案中，转基因是编码反义核酸、snRNA、RNAi分子(例如，dsRNA或ssRNA)、miRNA或三链体形成寡核苷酸(TFO)等的转基因。病毒载体可以基于但不限于逆转录病毒(例如，鼠逆转录病毒、禽逆转录病毒、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)和劳斯肉瘤病毒(RSV))、慢病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒、甲病毒等。其他实例在本文中其他地方提供或在本领域中是已知的。病毒载体可基于病毒的天然变体、毒株或血清型，例如本文中提供的那些中的任一种。病毒载体也可基于通过分子进化选择的病毒。病毒载体也可以是工程化载体、重组载体、突变体载体或杂交载体。在一些实施方案中，病毒载体是“嵌合病毒载体”。在这样的一些实施方案中，这意味着病毒载体由来自于多于一种病毒或病毒载体的病毒组分构成。
C.本发明方法中使用的组合物
如上所述，针对病毒转移载体的细胞和体液免疫应答可以不利地影响病毒转移载体治疗剂的效力，并且还可以干扰其再施用，使得许多患者不可能长期治疗。如本领域所证明的，由于先前暴露于病毒转移所基于的病毒，用病毒转移载体的治疗预期对于一些患者是不会成功的。另外，即使患者不具有针对病毒转移载体的预先存在的免疫力，单次施用病毒转移载体也可能导致细胞和体液免疫应答，例如中和抗体效价和/或记忆性T细胞的活化，这将不允许成功的再施用。使这些问题进一步复杂化的是病毒转移载体抗原的长期持久性。
重要的是，已经发现本文中提供的方法和组合物通过减弱针对病毒转移载体的免疫应答来克服上述障碍。还发现本文中提供的方法和组合物允许再施用病毒转移载体并提供针对病毒转移载体的长期耐受性，而不需要长期免疫抑制。因此，本文中提供的方法和组合物可用于用病毒转移载体治疗对象。病毒转移载体可用于递送转基因用于多种目的，包括用于基因表达调节，本文中提供的方法和组合物也是可如此应用的。
对象
本文中提供的对象可以是患有本文中提供的任一种疾病或病症的对象，并且转基因是编码可用于控制本文中提供的任一种蛋白质的表达的基因表达调节剂的转基因。所述蛋白质可以是胞外、胞内或膜结合蛋白质。在一些实施方案中，对象患有这样的疾病或病症，其中对象的内源性形式的蛋白质有缺陷或以有限量产生或根本不产生，并且基因表达调节剂可以控制这种蛋白质的表达。因此，在一些实施方案中，基因表达调节剂可以控制本文中提供的任一种蛋白质或其内源形式(例如本文中提供的治疗性蛋白质的内源形式)的表达。
治疗性蛋白质的实例包括但不限于可输注或可注射的治疗性蛋白质、酶、酶辅助因子、激素、血液或凝血因子、细胞因子和干扰素、生长因子、脂肪因子等。
可输注或可注射的治疗性蛋白质的实例包括例如托珠单抗
Figure BDA0003336102440000301
α-1抗胰蛋白酶(Kamada/AAT)、
Figure BDA0003336102440000302
(Affymax和Takeda，合成肽)、白蛋白干扰素α-2b(Novartis/ZalbinTM)、
Figure BDA0003336102440000303
(Pharming Group，C1抑制剂替代疗法)、特沙拉林(Theratechnologies/Egrifta，合成生长激素释放因子)、ocrelizumab(Genentech，Roche和Biogen)、belimumab
Figure BDA0003336102440000304
pegloticase(SavientPharmaceuticals/KrystexxaTM)、taligluceraseα(Protalix/Uplyso)、阿加糖酶α
Figure BDA0003336102440000305
和维拉苷酶α(Shire)。
酶的实例包括溶菌酶、氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、天冬酰胺酶、尿酸酶、糖苷酶、蛋白酶、核酸酶、胶原酶、透明质酸酶、肝素酶、类肝素酶、激酶、磷酸酶、溶素和连接酶。酶的其他实例包括用于酶替代疗法的那些，包括但不限于伊米苷酶(例如，CEREZYMETM)、α-半乳糖苷酶A(α-galA)(例如，阿加糖酶β，FABRYZYMETM)、酸性α-葡糖苷酶(GAA)(例如，葡糖苷酶α，LUMIZYMETM，MYOZYMETM)和芳基硫酸酯酶B(例如，laronidase，ALDURAZYMETM，艾杜硫酶，ELAPRASETM，芳基硫酸酯酶B，NAGLAZYMETM)。
激素的实例包括褪黑激素(N-乙酰基-5-甲氧基色胺)、5-羟色胺、甲状腺素(或四碘甲腺原氨酸)(一种甲状腺激素)、三碘甲腺原氨酸(一种甲状腺激素)、肾上腺素(Epinephrine或adrenaline)、去甲肾上腺素(Norepinephrine或noradrenaline)、多巴胺(或催乳素抑制激素)、抗缪勒氏管激素(antimullerian hormone)(或缪勒氏管抑制因子或激素)、脂连蛋白、促肾上腺皮质激素(或促皮质素)、血管紧张素原和血管紧张素、抗利尿激素(或升压素、精氨酸升压素)、心房钠尿肽(或心房肽)、降钙素、胆囊收缩素、促肾上腺皮质激素释放激素、红细胞生成素、促卵泡激素、胃泌素、食欲刺激素、胰高血糖素、胰高血糖素样肽(GLP-1)、GIP、促性腺激素释放激素、生长激素释放激素、人绒毛膜促性腺激素、人胎盘催乳素、生长激素、抑制素、胰岛素、胰岛素样生长因子(或生长调节素)、瘦素、促黄体激素、黑素细胞刺激激素、促食欲肽、催产素、甲状旁腺激素、催乳素、松弛素、促胰液素、生长抑素、血小板生成素、促甲状腺激素(或促甲状腺素)、促甲状腺素释放激素、皮质醇、醛固酮、睾酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、二氢睾酮、雌二醇、雌酮、雌三醇、孕酮、骨化三醇(1，25-二羟基维生素D3)、骨化二醇(25-羟基维生素D3)、前列腺素、白三烯、前列环素、血栓素、催乳素释放激素、促脂肪素、脑利钠肽、神经肽Y、组胺、内皮素、胰多肽、肾素和脑啡肽。
血液或凝血因子的实例包括因子I(纤维蛋白原)、因子II(凝血酶原)、组织因子、因子V(前加速素、不稳定因子)、因子VII(稳定因子、前转化素)、因子VIII(抗血友病球蛋白)、因子IX(克雷司马斯因子或血浆凝血激酶组分)、因子X(Stuart-Prower因子)、因子Xa、因子XI、因子XII(Hageman因子)、因子XIII(纤维蛋白稳定因子)、von Willebrand因子、vonHeldebrant因子、前激肽释放因子(Fletcher因子)、高分子量激肽原(HMWK)(Fitzgerald因子)、纤连蛋白、纤维蛋白、凝血酶、抗凝血酶(例如抗凝血酶III)、肝素辅助因子II、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、蛋白Z相关蛋白酶抑制剂(protein Z-related protease inhibitot，ZPI)、纤溶酶原、α2-纤溶酶抑制剂、组织纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator，tPA)、尿激酶、纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI1)、纤溶酶原激活物抑制剂-2(plasminogen activator inhibitor-2，PAI2)、癌症促凝剂和阿法依伯汀(Epogen，Procrit)。
细胞因子的实例包括淋巴因子、白介素和趋化因子、1型细胞因子(例如IFN-γ、TGF-β)和2型细胞因子(例如IL-4、IL-10和IL-13)。
生长因子的实例包括肾上腺髓质素(Adrenomedullin，AM)、促血管生成素(Angiopoietin，Ang)、自分泌运动因子、骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein，BMP)、脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)、红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)、成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor，FGF)、胶质细胞系衍生的神经营养因子(Glial cellline-derived neurotrophic factor，GDNF)、粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte macrophagecolony-stimulating factor，GM-CSF)、生长分化因子-9(Growth differentiationfactor-9，GDF9)、肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor，HGF)、肝癌衍生生长因子(Hepatoma-derived growth factor，HDGF)、胰岛素样生长因子(Insulin-like growthfactor，IGF)、迁移刺激因子、肌生成抑制蛋白(GDF-8)、神经生长因子(Nerve growthfactor，NGF)及其他神经营养因子、血小板衍生生长因子(Platelet-derived growthfactor，PDGF)、血小板生成素(Thrombopoietin，TPO)、转化生长因子α(Transforminggrowth factor alpha，TGF-α)、转化生长因子β(Transforming growth factor beta，TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(Tumour necrosis factor-alpha，TNF-α)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、Wnt信号途径、胎盘生长因子(placentalgrowth factor，PlGF)、[(胎牛促生长素)](Foetal Bovine Somatotrophin，FBS)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6和IL-7。
脂肪因子的实例包括瘦素和脂连蛋白。
蛋白质的其他实例包括但不限于：受体、信号蛋白、细胞骨架蛋白、支架蛋白、转录因子、结构蛋白、膜蛋白、胞质蛋白、结合蛋白、核蛋白、分泌蛋白、高尔基体蛋白、内质网蛋白、线粒体蛋白和囊泡蛋白等。
疾病或病症的实例包括但不限于溶酶体贮积病/症，例如Santavuori-Haltia病(婴儿型神经胶质性脂样脂褐质沉积症1型)、Jansky-Bielschowsky病(晚幼儿神经性元蜡样脂褐质沉积症，2型)、Batten病(幼年神经元性腊样脂褐质沉积症，3型)、Kufs病(神经元性脂样脂褐质沉积症，4型)、Von Gierke病(糖原贮积病，Ia型)、糖原贮积病(Ib型)、Pompe病(糖原贮积病，II型)、Forbes或Cori病(糖原贮积病，III型)、黏脂脂沉积症II(I-细胞疾病)，黏脂糖病III(假-胡勒多发性营养不良)、黏液脂肪变性IV(唾液脂肪变性)、胱氨酸血症(成人非肾病类型)、胱氨酸血症(婴儿型肾病类型)、胱氨酸血症(青少年肾病)、Salla病/婴儿唾液酸储存病症和鞘脂激活蛋白缺乏症；脂质和鞘脂降解障碍，例如GM1神经节苷脂贮积症(婴儿、晚婴儿/幼年和成人/慢性)，Tay-Sachs病、Sandhoff病、GM2神经节苷脂贮积症(Ab变体)、法布里病、戈谢病(I，II和III型)、异染性脑白质营养不良、克拉伯病(早期和晚期发病)、Neimann-Pick病(A，B，C1和C2型)、法伯病和沃尔曼病(胆固醇贮积病)；黏多糖降解障碍，例如Hurler综合征(MPSI)、Scheie综合征(MPS IS)、Hurler-Scheie综合征(MPSIH/S)、Hunter综合征(MPS II)、Sanfillippo A综合征(MPS IIIA)、Sanfillippo B综合征(MPS IIIB)、Sanfillippo C综合征(MPS IIIC)、Sanfillippo D综合征(MPS IIID)、Morquio A综合征(MPS IVA)、Morquio B综合征(MPS IVB)、马-拉综合征(MPS VI)和Sly综合征(MPS VII)；糖蛋白降解障碍，例如α甘露糖苷沉积症、β甘露糖苷沉积症、岩藻糖沉积症、阿司帕林葡萄糖尿症、黏脂质病I(唾液酸沉积症)、半乳糖唾液酸沉积症、辛德勒病，以及辛德勒病II型/Kanzaki病；以及白质营养不良疾病/病症，例如无β脂蛋白血症、新生儿肾上腺脑白质营养不良、卡纳万病、脑源性黄斑病、Pelizaeus Merzbacher病、丹吉尔病、Refsum病(婴儿)和Refum病(经典)。
本文中提供的对象的此类疾病/病症的另外的实例包括但不限于：酸性麦芽糖酶缺乏症(例如Pompe病、2型糖原病、溶酶体贮积病)；肉碱缺乏；肉碱棕榈酰转移酶缺乏；脱支酶缺陷(例如，Cori或Forbes病、3型糖原症)；乳酸脱氢酶缺乏症(例如11型糖原病)；肌苷酸脱氨酶缺乏；磷酸果糖激酶缺陷(例如，Tarui病、7型糖原病)；磷酸甘油酸激酶缺乏(例如，9型糖原病)；磷酸甘油酸变位酶缺陷(例如，10型糖原病)；磷酸化酶缺乏(例如，McArdle病、肌磷酸酶缺乏、5型糖原病)；戈谢病(例如，染色体1，酶葡糖脑苷脂酶受影响)；软骨发育不全(例如，染色体4，成纤维细胞生长因子受体3受影响)；亨廷顿病(例如，染色体4，亨廷顿蛋白)；血色素沉着病(例如，染色体6，HFE蛋白)；囊性纤维化(例如，染色体7，CFTR)；弗里德赖希共济失调(染色体9，frataxin)；Best疾病(染色体11，VMD2)；镰状细胞病(染色体11，血红蛋白)；苯丙酮尿症(染色体12，苯丙氨酸羟化酶)；Marfan综合征(染色体15，原纤维蛋白)；强直性肌张力障碍(19号染色体，强直性肌营养不良蛋白激酶)；肾上腺脑白质营养不良(x染色体，过氧化物酶体中的木脂酰-CoA连接酶)；杜克氏肌营养不良(x染色体，肌养蛋白)；Rett综合征(x染色体，甲基CpG结合蛋白2)；莱伯氏遗传性视神经病(线粒体，呼吸蛋白)；线粒体脑病、乳酸中毒和中风(MELAS)(线粒体，转移RNA)；和尿素循环的酶缺陷。
这样的疾病或病症的另外的实例包括但不限于：镰状细胞性贫血、肌管性肌病、血友病B、脂蛋白脂肪酶缺乏、鸟氨酸转氨酶缺乏、克-格氏综合征、黏膜脂质沉积症IV、Niemann-Pick A、Sanfilippo A、Sanfilippo B、Sanfilippo C、Sanfilippo D、b地中海贫血和Duchenne肌营养不良。疾病或病症的另外的实例包括脂质和鞘脂降解缺陷、黏多糖降解、糖蛋白降解、白细胞营养不良等的结果。
因此，治疗性蛋白质还包括肌磷酸化酶、葡糖脑苷脂酶、成纤维细胞生长因子受体3、亨廷顿蛋白、HFE蛋白、CFTR、弗氏蛋白酶、VMD2、血红蛋白、苯丙氨酸羟化酶、原纤维蛋白、强直性肌营养不良蛋白激酶、木脂酰-CoA连接酶、肌养蛋白、甲基CpG结合蛋白2、β血红蛋白、肌管蛋白、组织蛋白酶A、因子IX、脂蛋白脂肪酶、β半乳糖苷酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、酸性α葡糖苷酶、UDP-葡糖醛酸基转移酶1-1、GlcNAc-1-磷酸转移酶、GlcNAc-1-磷酸转移酶、Mucolipin-1、微粒体甘油三酯转移蛋白、鞘磷脂酶、酸性神经酰胺酶、溶酶体酸性脂肪酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、类肝素N-硫酸酯酶、α-N-乙酰氨基葡糖苷酶、乙酰CoA-α-葡糖胺乙酰转移酶、N-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺-6硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶A、囊性纤维化传导跨膜调节蛋白和呼吸蛋白。
作为另一些实例，基因表达调节剂可以控制与如下疾病或病症相关的蛋白质的表达：脂质和鞘脂降解障碍(例如β-半乳糖苷酶A、β-己糖胺酶A和B、GM2激活蛋白、8-半乳糖苷酶A、葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、半乳糖神经酰胺酶、鞘磷脂酶、鞘磷脂酶、NPC1、HE1蛋白(胆固醇运输缺陷)、酸性神经酰胺酶、溶酶体酸脂肪酶)；黏多糖降解障碍(例如L-艾杜糖苷酸酶、L-艾杜糖醛酸酶、L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、类肝素N-硫酸酯酶、N-乙酰葡糖胺酶、乙酰CoA-葡糖胺酶、乙酰转移酶、乙酰葡糖胺-6-硫酸酯酶、半乳糖胺-6-硫酸酯酶、芳基硫酸酯酶B、葡糖醛酸糖苷酶)；糖蛋白降解障碍(例如，甘露糖苷酶、甘露糖苷酶、1-岩藻糖苷酶、天冬氨酰葡糖胺酶、神经氨酸酶、溶酶体保护性蛋白、溶酶体8-N-乙酰半乳糖胺酶、溶酶体8-N-乙酰半乳糖胺酶)；溶酶体贮积病症(例如，棕榈酰蛋白硫酯酶(至少4个亚型)、溶酶体膜蛋白(未知)、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸转位酶、酸性麦芽糖酶、脱葡萄糖酶淀粉-1，6-葡萄糖苷酶、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、神经节苷脂唾液酸酶(神经氨酸酶)、溶酶体半胱氨酸转运蛋白、溶酶体半胱氨酸转运蛋白、溶酶体半胱氨酸转运蛋白、唾液酸转运蛋白鞘脂激活蛋白、A、B、C、D)和白细胞营养不良(例如，微粒体甘油三酯转移蛋白/载脂蛋白B、过氧化物酶体膜转移蛋白、Peroxin、天冬酰转移酶、固醇-27-羟化酶、蛋白脂质蛋白、ABC1转运蛋白、过氧化物酶体膜蛋白3或过氧化物酶体生物合成因子1、植烷酸氧化酶)。
本文中提供的病毒转移载体的转基因是基因表达调节转基因。这样的转基因编码可以增强、抑制或调节一种或更多种内源基因之表达的基因表达调节剂。内源基因可以编码本文中提供的任一种蛋白质，只要该蛋白质是对象的内源性蛋白质即可。因此，对象可以是患有本文中提供的任一种疾病或病症的对象，其中将存在由基因表达调节所提供的益处。
基因表达调节剂包括DNA结合蛋白(例如，人工转录因子，例如美国公开No.20140296129中的那些，其人工转录因子通过引用并入本文；以及美国公开No.20030125286的转录沉默子蛋白NRF，其转录沉默子蛋白NRF通过引用并入本文)以及治疗性RNA。治疗性RNA包括但不限于mRNA翻译的抑制剂(反义)、RNA干扰(RNAi)剂、催化活性RNA分子(核酶)、转移RNA(tRNA)和结合蛋白质和其他分子配体的RNA(适配体)。基因表达调节剂是前述的任何试剂，并且包括反义核酸、RNAi分子(例如，双链RNA(dsRNA)、单链RNA(ssRNA)、微RNA(miRNA)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA))和三链体形成寡核苷酸(TFO)。基因表达调节剂还可以包括任何前述RNA分子的修饰形式，并因此包括经修饰的mRNA，例如合成的经化学修饰的RNA。
基因表达调节剂可以是反义核酸。反义核酸可以提供基因表达的靶向抑制(例如，突变蛋白质、显性活性基因产物、与毒性相关的蛋白质或由感染原(例如病毒)引入到细胞中的基因产物的表达)。因此，调节基因表达的病毒转移载体可用于治疗与显性失活或获得功能的致病机制相关的疾病或病症，癌症或感染。本文中提供的任一种方法的对象可以是患有病毒感染、炎性病症、心血管疾病、癌症、遗传性病症或自身免疫病的对象。反义核酸还可以干扰mRNA剪接机制并扰乱正常细胞mRNA加工。因此，基因表达调控转基因可以编码与剪接体蛋白相互作用的元件。反义核酸(及相关构建体)的实例可见于例如美国公开No.20050020529和20050271733，其反义核酸和其构建体通过引用并入本文。
基因表达调节剂还可以是核酶(即，可以切割其他RNA的RNA分子，例如单链RNA)。这样的分子可以被工程化以识别RNA分子中的特定核苷酸序列并将其切割(Cech，J.Amer.Med.Assn.，260：3030，1988)。例如，可以改造核酶，使得只有具有与含有核酶的构建体互补之序列的mRNA失活。核酶的类型和如何制备相关构建体是本领域中已知的(Hasselhoff，等，Nature，334：585，1988；和U.S.Publication No.20050020529，其关于这种核酶和方法的教导通过引用并入本文)。
基因表达调节剂可以是干扰RNA(RNAi)。RNA干扰是指由干扰RNA介导的序列特异性转录后基因沉默的过程。一般而言，dsRNA的存在可以触发RNAi应答。已经在多种系统中研究了RNAi。Fire等，1998，Nature，391，806，RNAi in C.elegans；Bahramian and Zarbl，1999，Molecular and Cellular Biology，19，274-283以及Wianny and Goetz，1999，Nature Cell Biol.，2，70，RNAi mediated by dsRNA in mammalian systems；Hammond等，2000，Nature，404，293，RNAi in Drosophila cells；Elbashir等，2001，Nature，411，494，RNAi induced by introduction of duplexes of synthetic 21-nucleotide RNAs incultured mammalian cells。这样的工作与其他工作一起为有助于构建RNAi分子的长度、结构、化学组成和序列以便介导RNAi活性提供指导。多种出版物提供了可用作基因表达调节剂的RNAi分子的实例。这样的出版物包括，美国专利No.8,993,530、8,877,917、8,293,719、7,947,659、7,919,473、7,790,878、7,737,265、7,592,322；以及美国公开No.20150197746、20140350071、20140315835、20130156845和20100267805，涉及RNAi分子类型及其生产的教导通过引用并入本文。
适配体可结合多种蛋白质靶标并破坏那些蛋白质与其他蛋白质的相互作用。因此，基因表达调节剂可以是适配体，并且基因表达调节转基因可以编码这种适配体。可通过特异性结合调节蛋白的DNA结合位点来选择适配体阻止基因转录的能力。PCT公开No.WO98/29430和WO 00/20040提供了用于调节基因表达的适配体的实例；并且美国公开No.20060128649也提供了这样的适配体的实例，其中每一个的适配体通过引用并入本文。
作为另一个实例，调节基因表达的可以是三链体寡聚体。这样的分子可以阻碍转录。一般而言，这被称为三链体策略，因为寡聚物围绕双螺旋DNA，形成三链螺旋。这样的分子可以被设计为识别所选择基因上的独特位点(Maher等，Antisense Res.and Dev.，1(3)：227，1991；Helene，C.，Anticancer Drug Design，6(6)：569，1991)。
转基因的序列还可以包括表达控制序列。表达控制DNA序列包括启动子、增强子和操纵子，并且一般基于这样的表达系统来选择，所述表达系统中将利用所述表达构建体。在一些实施方案中，选择启动子和增强子序列来用于提高基因表达的能力，而可以选择操纵子序列用于调节基因表达的能力。转基因还可以包括促进并优选促进宿主细胞中的同源重组的序列。转基因还可以包括在宿主细胞中复制所必需的序列。
示例性的表达控制序列包括启动子序列，例如巨细胞病毒启动子；劳斯肉瘤病毒启动子；和猴病毒40启动子；以及在本文中别处公开或本领域已知的任何其他类型的启动子。通常来说，启动子有效地连接编码期望表达产物的序列的上游(即5’)。转基因还可以包括可操作地连接编码序列下游(即3’)的合适的多聚腺苷酸化序列(例如，SV40或人生长激素基因多聚腺苷酸化序列)。
病毒载体
病毒已经进化出了专门的机制以将它们的基因组转运到它们所感染的细胞内；基于这样的病毒的病毒载体可以针对特定应用定制以转导细胞。可如本文中提供的使用的病毒载体的实例是本领域中已知的或在本文中描述的。合适的病毒载体包括例如逆转录病毒载体、慢病毒载体、基于单纯疱疹病毒(HSV)的载体、基于腺病毒的载体、基于腺相关病毒(AAV)的载体和AAV-腺病毒嵌合载体。
本文中提供的病毒转移载体可以基于逆转录病毒。逆转录病毒是能够感染多种宿主细胞的单链正义RNA病毒。感染后，逆转录病毒基因组整合到其宿主细胞的基因组中，使用其自身的逆转录酶从其RNA基因组产生DNA。然后病毒DNA与宿主细胞DNA一起复制，其翻译和转录病毒和宿主基因。可以操作逆转录病毒载体以使病毒不能复制。因此，认为逆转录病毒载体特别可用于体内稳定的基因转移。逆转录病毒载体的实例可见于例如美国公开No.20120009161、20090118212和20090017543，病毒载体及其制备方法通过引用整体并入本文。
慢病毒载体是可用于生产本文中提供的病毒转移载体的逆转录病毒载体的实例。慢病毒具有感染非分裂细胞的能力，这是构成基因递送载体的更高效方法的性质(见例如Durand等，Viruses.2011 Feb；3(2)：132-159)。慢病毒的实例包括HIV(人)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马感染性贫血病毒(EIAV)和绵羊髓鞘脱落病毒(visnavirus)(绵羊慢病毒)。与其他逆转录病毒不同，已知基于HIV的载体将其乘客基因并入非分裂细胞中。慢病毒载体的实例可见于例如美国公开No.20150224209、20120203870、20140335607、20140248306、20090148936和20080254008，其中病毒载体及其制备方法通过引用整体并入本文。
基于单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)的病毒载体也适用于本文中提供的用途。许多复制缺陷型HSV载体含有用于去除一个或更多个立即早期基因的缺失以阻止复制。疱疹病毒载体的优点是其进入潜伏期的能力，其可以导致长期DNA表达，并且其大的病毒DNA基因组可以容纳高达25kb的外源DNA。对于基于HSV的载体的描述参见例如美国专利No.5,837,532、5,846,782、5,849,572和5,804,413，以及国际专利申请WO 9I/02788、WO 96/04394、WO 98/15637和WO 99/06583，其对病毒载体及其制备方法的描述通过引用整体并入。
腺病毒(Adenovirus，Ad)是可以在体内将DNA转移到多种不同靶细胞类型中的非包膜病毒。通过缺失病毒复制所需的选择基因，可以使病毒复制缺陷。消耗性非复制必需E3区域也经常被缺失，以允许用于更大DNA插入物的额外空间。病毒转移载体可基于腺病毒。可以以高滴度产生腺病毒转移载体，并且可以高效地将DNA转移到复制和非复制细胞中。与慢病毒不同，腺病毒DNA不整合到基因组中，因此不在细胞分裂期间复制，而是使用宿主的复制机制在宿主细胞的核中复制。
病毒转移载体可以基于的腺病毒可以来自任何来源、任何亚组、任何亚型、亚型混合物或任何血清型。例如，腺病毒可以是亚型A(例如，血清型12、18和31)、亚组B(例如，血清型3、7、11、14、16、21、34、35和50)、亚组C(例如血清型1、2、5和6)、亚组D(例如，血清型8、9、10、13、15、17、19、20、22-30、32、33、36-39和42-48)、亚组E(例如血清型4)、亚组F(例如血清型40和41)、未分类的血清组(例如血清型49和51)或任何其他腺病毒血清型。腺病毒血清型1至51可从美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，Va.)获得。非C组腺病毒以及甚至非人腺病毒可用于制备复制缺陷型腺病毒载体。非C组腺病毒载体、产生非C组腺病毒载体的方法和使用非C组腺病毒载体的方法公开于例如，美国专利No.5,801,030、5,837,511和5,849,561，以及国际专利申请WO 97/12986和WO 98/53087。任何腺病毒、甚至嵌合腺病毒可以用作腺病毒载体的病毒基因组的来源。例如，人腺病毒可以用作复制缺陷型腺病毒载体的病毒基因组的来源。腺病毒载体的另一些实例可见于美国公开No.20150093831、20140248305、20120283318、201000008889、20090175897和20090088398，其中病毒载体及其制备方法的描述通过引用整体并入。
本文中提供的病毒转移载体也可以基于腺相关病毒(AAV)。AAV载体对于例如本文中所述的那些治疗应用令人特别感兴趣。AAV是尚未知其引起人疾病的DNA病毒。通常来说，AAV需要与辅助病毒(例如，腺病毒或疱疹病毒)共感染，或辅助基因的表达，以高效复制。AAV具有在特定位点稳定感染宿主细胞基因组的能力，使得它们比逆转录病毒更可预测；然而，通常来说，载体的克隆容量为4.9kb。已经在基因治疗应用中所使用的AAV载体通常具有大约96％的亲本基因组缺失，使得仅剩下包含用于DNA复制和包装的识别信号的末端重复序列(ITR)。对于基于AAV的载体的描述参见例如美国专利No.8,679,837、8,637,255、8,409,842、7,803,622和7,790,449，以及美国公开No.20150065562、20140155469、20140037585、20130096182、20120100606和20070036757，其病毒载体和方法或其制备通过引用整体并入本文。AAV载体可以是重组AAV载体。AAV载体还可以是自身互补(self-complementary，sc)AAV载体，其描述于例如美国专利公开2007/01110724和2004/0029106，以及美国专利No.7,465,583和7,186,699中，其中载体和其生产方法通过引用并入本文。
其中有病毒转移载体的腺相关病毒可以是任何血清型或血清型混合物。AAV血清型包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10和AAV11。例如，当病毒转移载体基于血清型的混合物时，病毒转移载体可以含有取自一种AAV血清型的衣壳信号序列(例如选自AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11中的任一种)和来自不同血清型(例如选自AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11中的任一种)的包装序列。因此，在本文中提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，AAV载体是AAV 2/8载体。在本文中提供的任一种方法或组合物的另一些实施方案中，AAV载体是AAV 2/5载体。
本文中提供的病毒转移载体也可以基于甲病毒。甲病毒包括辛德毕斯(和VEEV)病毒、奥拉病毒、Babanki病毒、巴马森林病毒、贝巴鲁病毒、卡巴斯欧病毒病毒、基孔肯雅病毒、东部马脑炎病毒、沼泽地病毒、摩根堡病毒、盖塔病毒、高地J病毒、孜拉加奇病毒、马亚罗病毒病毒、Me Tri病毒、米德尔堡病毒、莫斯达斯佩德拉斯病毒、穆坎布病毒、恩杜穆病毒、欧尼恩病毒、那皮舒纳病毒、里奥内格罗病毒、罗斯河病毒、鲑鱼胰腺病病毒、塞姆利基森林病毒、南方象海豹病毒、图那特病毒、特罗卡拉病毒、乌纳病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、西方马脑炎病毒和瓦塔罗阿病毒。通常来说，这种病毒的基因组编码可以在宿主细胞的细胞质中翻译的非结构蛋白(例如，复制子)和结构蛋白(例如衣壳和包膜)。罗斯河病毒、辛德比斯病毒、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus，SFV)和委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus，VEEV)都已被用于开发用于转基因递送的病毒转移载体。假型病毒可以通过组合甲病毒包膜糖蛋白和逆转录病毒衣壳来形成。甲病毒载体的实例可见于美国公开No.20150050243、20090305344和20060177819；载体及其制备方法通过引用整体并入本文。
靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂
靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂可包括通过其形式或特性可导致APC致耐受性作用的试剂。靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂还包括包含与免疫抑制剂缀合之载体的试剂。
靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂包括带负电的颗粒，例如具有一定尺寸和ζ电位的聚苯乙烯、PLGA或金刚石颗粒，例如美国公开No.20150010631中描述的那些，这样的颗粒及其制备方法的描述通过引用并入本文。这种颗粒可以具有任何颗粒形状或构象。然而，在一些实施方案中，优选使用在体内不太可能聚集的颗粒。在一个实施方案中，这些颗粒具有球形形状。一般而言，这种颗粒的尺寸不一定是均匀的，尽管这种颗粒通常必须具有足以引发抗原呈递细胞或其他MPS细胞中的吞噬作用的尺寸。优选地，这些颗粒在尺寸上是微米尺度或纳米尺度的，以增强溶解度，避免由体内聚集引起的可能的并发症并促进胞饮作用。
这些颗粒可以具有约0.1μm至约10μm、约0.2μm至约2μm、约0.3μm至约5μm或约0.5μm至约3μm的平均直径。在一些实施方案中，这些颗粒可以具有约0.1μm、约0.2μm、约0.3μm、约0.4μm、约0.5μm、约1.0μm、约1.5μm、约2.0μm、约2.5μm、约3.0μm、约3.5μm、约4.0μm、约4.5μm或约5.0μm的平均直径。这些颗粒不需要具有均一的直径，并且药物制剂可以包含具有混合颗粒尺寸的多种颗粒。
在一些实施方案中，这些颗粒是非金属的。在这些实施方案中，这些颗粒可以由聚合物形成。在一个优选的实施方案中，这些颗粒是可生物降解的。合适的颗粒的实例包括聚苯乙烯颗粒、PLGA颗粒、PLURONICS稳定化聚丙烯硫化物颗粒和金刚石颗粒。另外，这些颗粒可以由宽范围的其他材料形成。例如，这些颗粒可以由玻璃、二氧化硅、羟基羧酸的聚酯、二羧酸的聚酐、或羟基羧酸与二羧酸的共聚物构成。更一般地，这些颗粒可以由美国公开No.20150010631中描述的其他材料构成。
颗粒通常具有特定的ζ电位。在某些实施方案中，ζ电位为负。ζ电位可以小于约-100mV或小于约-50mV。在某些实施方案中，颗粒具有-100mV至0mV、-75mV至0mV、-60mV至0mV、-50mV至0mV、-40mV至0mV、-30mV至0mV、-20mV至+0mV、-10mV至-0mV、-100mV至-50mV、-75mV至-50mV或-50mV和-40mV的ζ电位。
在另一个实施方案中，这些颗粒还包含本文中提供的一种或更多种抗原。在这些实施方案的一些中，所述一种或更多种抗原被包封在颗粒中。
靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂的另一个实例是纳米晶体形式的免疫抑制剂，其中免疫抑制剂本身的形式是颗粒或颗粒样。在这些实施方案中，这种形式模拟了病毒或其他外来病原体。许多药物已被纳米化并且用于生产这种药物形式的适当方法是本领域普通技术人员已知的。药物纳米晶体(例如纳米晶体雷帕霉素)是本领域普通技术人员已知的(Katteboinaa等2009，International Journal of PharmTech Resesarch；Vol.1，No.3；pp682-694)。本文中使用的“药物纳米晶体”是指不包括载体或基质材料的药物(例如，免疫抑制剂)的形式。在一些实施方案中，药物纳米晶体包含90％、95％、98％或99％或更多的药物。用于生产药物纳米晶体的方法包括但不限于研磨、高压均质化、沉淀、喷雾干燥、超临界溶液的迅速膨胀(rapid expansion of supercritical solution，RESS)、
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技术(Baxter Healthcare)和Nanocrystal技术TM(Elan Corporation)。在一些实施方案中，表面活性剂或稳定剂可用于药物纳米晶体的空间或静电稳定性。在一些实施方案中，免疫抑制剂的纳米晶体或纳米晶体形式可以用于提高免疫抑制剂(特别是不溶或不稳定的免疫抑制剂)的溶解度、稳定性和/或生物利用度。
靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂也可以是凋亡小体模拟物，并且使得相关抗原被耐受。这样的模拟物描述于美国公开No.20120076831中，所述模拟物及其制备方法通过引用并入本文。凋亡小体模拟物可以是颗粒、珠、分支化聚合物、树枝状聚合物或脂质体。优选地，模拟物是颗粒状，并且一般是球面形、椭圆形、棒形、球形或多面体形状。然而，或者模拟物可以是不规则或分支形状。在一些优选的实施方案中，模拟物由可生物降解的材料构成。还优选的是，模拟物具有净中性或负电荷，以便降低与一般带有净负电荷的细胞表面的非特异性结合。优选地，模拟物表面由使得非特异性或不需要的生物相互作用最小化的材料构成。当为颗粒时，所述模拟物表面可用阻止或降低非特异性相互作用的材料包被。通过用亲水层例如聚(乙二醇)(poly(ethylene glycol)，PEG)及其共聚物如PLURONICS(包括聚(乙二醇)-bl-聚(丙二醇)-bl-聚(乙二醇)的共聚物)涂覆颗粒所获得的空间稳定化可降低与间质的蛋白质的非特异性相互作用。
当作为颗粒时，模拟物可以是由玻璃、二氧化硅、羟基羧酸的聚酯、二羧酸的聚酐或羟基羧酸与二羧酸的共聚物构成的颗粒。这些模拟物可以是量子点，或由量子点构成，例如量子点聚苯乙烯颗粒。这些模拟物可以包括聚乙醇酸聚合物(PGA)、聚乳酸聚合物(PLA)、聚癸二酸聚合物(PSA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚乳酸-癸二酸共聚物(PLSA)、聚乙醇酸-癸二酸共聚物(PGSA)等。模拟物也可以是聚苯乙烯珠。
这些模拟物可以包含一种或更多种抗原。模拟物可以能够直接或间接地与一种或更多种期望获得其耐受性的抗原缀合。在一些情况下，模拟物将具有多个结合位点，以便暴露抗原的多个拷贝，并提高致耐受性应答的可能性。模拟物可以在其表面上具有一种抗原或在表面上具有多种不同的抗原。然而，或者模拟物可具有可吸附缀合部分的表面而不形成化学键。
在一些实施方案中，模拟物还可以包含凋亡信号分子，例如使用聚苯乙烯珠，尽管这不是必需的。凋亡信号分子包括但不限于美国公开No.20050113297中描述的凋亡信号分子，所述凋亡信号分子通过引用并入本文。适用于这些颗粒的分子包括靶向吞噬细胞的分子，所述吞噬细胞包括巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞。这样的分子可以是血小板反应素或膜联蛋白I。
靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂也可以是红细胞结合治疗剂，例如美国公开No.20120039989中描述的那些，所述治疗剂及其制备方法通过引用并入本文。如其所述，发现了与红细胞(也称为红血球)特异性结合的肽。这些肽甚至在存在于血液中的其他因子的存在下与红细胞特异性结合，并且可用于产生免疫耐受。因此，红细胞结合治疗剂包含一种或更多种期望对其耐受的抗原和红细胞亲和配体。所述一种或更多种抗原可以是本文中所述的病毒转移载体抗原，例如一种或更多种病毒抗原(例如一种或更多种病毒衣壳蛋白的病毒抗原)。此外，所述一种或更多种抗原还可以是或包括所提供的被表达转基因的一种或更多种抗原。所述抗原可以形成期望对其耐受的混合物。
特异性结合红细胞的肽的实例包括ERY1、ERY19、ERY59、ERY64、ERY123、ERY141和ERY162。除了结合红细胞的肽之外，蛋白质(例如抗体，例如单链抗体及其抗原结合片段)也可以用作亲和配体。亲和配体还可以包括用于红细胞表面组分的核苷酸适配体配体。因此，可以制备适配体并用于代替其他红细胞亲和配体。DNA和RNA适配体可用于提供非共价红细胞结合。适配体可以分类为DNA适配体、RNA适配体或肽适配体。另外，亲和配体可以是两种或更多种亲和配体的融合物，例如红细胞结合肽。此外，红细胞结合治疗剂的组分可以与载体(例如聚合物囊泡(polymersome)、脂质体或胶束或一些类型的纳米颗粒)相缔合。在一些实施方案中，组分被包封在这样的载体中。在一些实施方案中，载体包含本文中所述的亲和配体和一种或更多种抗原。在这样的一个实施方案中，亲和配体和一种或更多种抗原不一定需要彼此缀合。
靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂还包括本文中提供的与靶向APC的载体相偶联的任一种免疫抑制剂。在一些实施方案中，所述载体可以是对APC标志物具有特异性的抗体或其抗原结合片段(或一些其他配体)。这样的标志物包括但不限于CD1a(R4，T6，HTA-1)；CD1b(R1)；CD1c(M241，R7)；CD1d(R3)；CD1e(R2)；CD11b(αM整合素链，CR3，Mo1，C3niR，Mac-1)；CD11c(αX整合素，p150，95，AXb2)；CDw117(乳糖神经酰胺(Lactosylceramide，LacCer)；CD19(B4)；CD33(gp67)；CD 35(CR1，C3b/C4b受体)；CD 36(GpIIIb，GPIV，PASIV)；CD39(ATP脱氢酶，NTP脱氢酶-1)；CD40(Bp50)；CD45(LCA，T200，B220，Ly5)；CD45RA；CD45RB；CD45RC；CD45RO(UCHL-1)；CD49d(VLA-4α，α4整合素)；CD49e(VLA-5α，α5整合素)；CD58(LFA-3)；CD64(FcγRI)；CD72(Ly-19.2，Ly-32.2，Lyb-2)；CD73(Ecto-5’核苷酸酶(nucloticlase))；CD74(Ii，恒定链)；CD80(B7，B7-1，BB1)；CD81(TAPA-1)；CD83(HB15)；CD85a(ILT5，LIR3，HL9)；CD85d(ILT4，LIR2，MIR10)；CD85j(ILT2，LIR1，MIR7)；CD85k(ILT3，LIR5，HM18)；CD86(B7-2/B70)；CD88(C5aB)；CD97(BL-KDD/F12)；CD101(IGSF2，P126，V7)；CD116(GM-CSFRα)；CD120a(TMFRI，p55)；CD120b(TNFRII，p75，TNFRp80)；CD123(IL-3Rα)；CD139；CD148(HPTP-η，p260，DEP-1)；CD150(SLAM，IPO-3)；CD156b(TACE，ADAM17，cSVP)；CD157(Mo5，BST-1)；CD167a(DDR1，trkE，cak)；CD168(RHAMM，IHABP，HMMR)；CD169(唾液酸黏附素，Siglec-1)；CD170(Siglec-5)；CD171(L1CAM，NILE)；CD172(SIRP-1α，MyD-1)；CD172b(SIRPβ)；CD180(RP105，Bgp95，Ly64)；CD184(CXCR4，NPY3R)；CD193(CCR3)；CD196(CCR6)；CD197(CCR7(wsCDw197))；CDw197(CCR7，EBI1，BLR2)；CD200(OX2)；CD205(DEC-205)；CD206(MMR)；CD207(Langerin)；CD208(DC-LAMP)；CD209(DC-SIGN)；CDw218a(IL18Rα)；CDw218b(IL8Rβ)；CD227(MUC1，PUM，PEM，EMA)；CD230(朊病毒蛋白(PrP))；CD252(OX40L，TNF(配体)超家族，成员4)；CD258(LIGHT，TNF(配体)超家族，成员14)；CD265(TRANCE-R，TNF-R超家族，成员11a)；CD271(NGFR，p75，TNFR超家族，成员16)；CD273(B7DC，PDL2)；CD274(B7H1，PDL1)；CD275(B7H2，ICOSL)；CD276(B7H3)；CD277(BT3.1，B7家族：嗜乳脂蛋白3)；CD283(TLR3，TOLL样受体3)；CD289(TLR9，TOLL样受体9)；CD295(LEPR)；CD298(ATP1B3，Na K ATP酶β3亚基)；CD300a(CMRF-35H)；CD300c(CMRF-35A)；CD301(MGL1，CLECSF14)；CD302(DCL1)；CD303(BDCA2)；CD304(BDCA4)；CD312(EMR2)；CD317(BST2)；CD319(CRACC，SLAMF7)；CD320(8D6)；和CD68(gp110，巨噬唾液酸蛋白)；II类MHC；BDCA-1；和Siglec-H。用于制备抗体-药物缀合物的方法可见于美国公开No.20150231241，所述方法通过引用并入本文。其他方法是本领域技术人员已知的。
靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂还可以是包含本文中所述的任一种免疫抑制剂的合成纳米载体。这样的合成纳米载体包括美国公开No.20100151000的那些，其合成纳米载体及其制备方法通过引用并入本文。如其所述，发现可以通过施用包含NF-κB抑制剂和抗原的颗粒(例如脂质体或聚合物颗粒)在体内产生致耐受性应答。因此，包含NF-κB途径抑制剂和一种或更多种病毒转移载体抗原的颗粒可用作本文中提供的靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂。在一些实施方案中，所述颗粒是脂质体。在另一些实施方案中，颗粒包含载体颗粒，例如金属颗粒(例如钨、金、铂或铱颗粒)。在另一些实施方案中，颗粒包含聚合物基质或载体，其示例性实例包括生物相容性聚合物颗粒(例如，用聚丙交酯-乙交酯共聚物制备的颗粒)。在另一些实施方案中，颗粒包含陶瓷或无机基质或载体。
NF-κB途径的抑制剂可以降低NF-κB途径的成员的水平或功能活性，并且可以选自BTK、LYN、BCR Igα、BCR Igβ、Syk、Blnk、PLCγ2、PKCβ、DAG、CARMA1、BCL10、MALT1、PI3K、PIPS、AKT、p38MAPK、ERK、COT、IKKα、IKKβ、IKKγ、NIK、RelA/p65、P105/p50、c-Rel、RelB、p52、NIK、Leu13、CD81、CD19、CD21及其在补体和凝集级联中的配体、TRAF6、泛素连接酶、Tab2、TAK1、NEMO、NOD2、RIP2、Lck、fyn、Zap70、LAT、GRB2、SOS、CD3ζ、Slp-76、GADS、ITK、PLCγ1、PKC0、ICOS、CD28、SHP2、SAP、SLAM和2B4。在一些实施方案中，NF-κB途径抑制剂降低RelA/p65、P105/p50、c-Rel、RelB或p52中的任一种或更多种的水平或功能活性。
根据本发明可以使用多种其他合成纳米载体，并且在一些实施方案中，将其与免疫抑制剂偶联以提供其他靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂。在一些实施方案中，合成纳米载体是球体或球状体。在一些实施方案中，合成纳米载体是平的或板状的。在一些实施方案中，合成纳米载体是立方体或立方体状的。在一些实施方案中，合成纳米载体是椭圆形或椭球状的。在一些实施方案中，合成纳米载体是圆柱体、锥体或棱锥体。
在一些实施方案中，期望使用在尺寸或形状方面相对均一的合成纳米载体群体，使得每个合成纳米载体具有相似的性质。例如，基于合成纳米载体的总数，所提供的组合物或方法中的任一种的至少80％、至少90％或至少95％的合成纳米载体可具有这样的最小尺寸或最大尺寸，其落在合成纳米载体的平均直径或平均尺寸的5％、10％或20％内。
合成纳米载体可以是实心或中空的，并且可以包含一个或更多个层。在一些实施方案中，每层相对于其他层具有独特的组成和独特的性质。仅举一个例子，合成纳米载体可以具有核/壳结构，其中核是一层(例如聚合物核)，并且壳是第二层(例如脂质双层或单层)。合成纳米载体可以包含多个不同的层。
在一些实施方案中，合成纳米载体可任选地包含一种或更多种脂质。在一些实施方案中，合成纳米载体可以包含脂质体。在一些实施方案中，合成纳米载体可以包含脂质双层。在一些实施方案中，合成纳米载体可以包含脂质单层。在一些实施方案中，合成纳米载体可以包含胶束。在一些实施方案中，合成纳米载体可以包含由脂质层(例如脂质双层、脂质单层等)包围的包含聚合物基质的核心。在一些实施方案中，合成纳米载体可以包含由脂质层(例如，脂质双层，脂质单层等)包围的非聚合物的核心(例如，金属颗粒、量子点、陶瓷颗粒、骨颗粒、病毒颗粒、蛋白质、核酸、碳水化合物等)。
在另一些实施方案中，合成纳米载体可以包含金属颗粒、量子点、陶瓷颗粒等。在一些实施方案中，非聚合物的合成纳米载体是非聚合物组分的聚集体，例如金属原子(例如金原子)的聚集体。
在一些实施方案中，合成纳米载体可任选地包含一种或更多种两亲性实体。在一些实施方案中，两亲性实体可以促进具有提高的稳定性、改善的均一性或提高的黏度的合成纳米载体的生产。在一些实施方案中，两亲性实体可以与脂质膜(例如，脂质双层、脂质单层等)的内表面缔合。本领域已知的许多两亲性实体适合用于制备根据本发明的合成纳米载体。这样的两亲性实体包括但不限于，磷酸甘油酯；磷脂酰胆碱；二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)；二油基磷脂酰乙醇胺(DOPE)；二油基丙基三乙基铵(DOTMA)；二油酰磷脂酰胆碱；胆固醇；胆固醇酯；二酰基甘油；琥珀酸二酰基甘油酯；二磷脂酰甘油(DPPG)；己烷癸醇；脂肪醇如聚乙二醇(PEG)；聚氧乙烯-9-月桂醚；表面活性脂肪酸，例如棕榈酸或油酸；脂肪酸；脂肪酸单甘油酯；脂肪酸甘油二酯；脂肪酸酰胺；脱水山梨糖醇三油酸酯(
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85)甘胆酸盐；脱水山梨糖醇单月桂酸酯(
Figure BDA0003336102440000462
20)；聚山梨醇酯20(
Figure BDA0003336102440000463
20)；聚山梨醇酯60(
Figure BDA0003336102440000464
60)；聚山梨醇酯65(
Figure BDA0003336102440000466
65)；聚山梨醇酯80(
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80)；聚山梨醇酯85(
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85)；聚氧乙烯单硬脂酸酯；表面活性素；泊洛沙姆；脱水山梨糖醇脂肪酸酯，例如脱水山梨醇三油酸酯；卵磷脂；溶血卵磷脂；磷脂酰丝氨酸；磷脂酰肌醇；鞘磷脂；磷脂酰乙醇胺(脑磷脂)；心磷脂；磷脂酸；脑苷脂；磷酸二鲸蜡酯；二棕榈酰磷脂酰甘油；硬脂胺；十二烷基胺；十六烷基胺；乙酰棕榈酸酯；甘油蓖麻油酸酯；硬脂酸十六烷基酯；肉豆蔻酸异丙酯；泰洛沙泊；聚(乙二醇)5000-磷脂酰乙醇胺；聚(乙二醇)400单硬脂酸酯；磷脂；具有高表面活性剂性质的合成和/或天然洗涤剂；脱氧胆酸盐；环糊精；离液盐；离子配对剂；及其组合。两亲性实体组分可以是不同的两亲性实体的混合物。本领域技术人员将认识到，这是具有表面活性剂活性的物质的示例性而非全面的列举。任何两亲性实体可用于生产根据本发明所使用的合成纳米载体。
在一些实施方案中，合成纳米载体可任选地包含一种或更多种碳水化合物。碳水化合物可以是天然的或合成的。碳水化合物可以是衍生化的天然碳水化合物。在某些实施方案中，碳水化合物包括单糖或二糖，其包括但不限于葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺和神经氨酸。在某些实施方案中，碳水化合物是多糖，其包括但不限于短梗霉聚糖(pullulan)、纤维素、微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟基纤维素(HC)、甲基纤维素(MC)、葡聚糖、环葡聚糖、糖原、羟乙基淀粉、角叉菜胶、糖、直链淀粉、壳聚糖、N，O-羧甲基壳聚糖、藻胶和藻酸、淀粉、壳多糖、菊粉、魔芋、葡甘露聚糖、石耳葡聚糖、肝素、透明质酸、凝胶多糖和黄原胶。在一些实施方案中，合成纳米载体不包含(或特别排除)碳水化合物，例如多糖。在某些实施方案中，碳水化合物可包括碳水化合物衍生物，例如糖醇，其包括但不限于甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇和乳糖醇。
在一些实施方案中，合成纳米载体可以包含一种或更多种聚合物。在一些实施方案中，合成纳米载体包含一种或更多种作为非甲氧基封端之普朗尼克聚合物的聚合物。在一些实施方案中，构成合成纳米载体的聚合物中的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％(重量/重量)是非甲氧基封端的普朗尼克聚合物。在一些实施方案中，构成合成纳米载体的所有聚合物是非甲氧基封端的普朗尼克聚合物。在一些实施方案中，合成纳米载体包含一种或更多种作为非甲氧基封端聚合物的聚合物。在一些实施方案中，构成合成纳米载体的聚合物中的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％(重量/重量)是非甲氧基封端的聚合物。在一些实施方案中，构成合成纳米载体的所有聚合物是非甲氧基封端的聚合物。在一些实施方案中，合成纳米载体包括不含普朗尼克聚合物的一种或更多种聚合物。在一些实施方案中，构成合成纳米载体的聚合物中的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％(重量/重量)不包含普朗尼克聚合物。在一些实施方案中，构成合成纳米载体的所有聚合物不包含普朗尼克聚合物。在一些实施方案中，这样的聚合物可以被包衣层(例如脂质体、脂质单层、胶束等)包围。在一些实施方案中，合成纳米载体的要素可以与聚合物连接。
可以通过多种方法中的任一种将免疫抑制剂与合成纳米载体偶联。一般而言，连接可以是免疫抑制剂与合成纳米载体之间结合的结果。这种结合可导致免疫抑制剂与合成纳米载体的表面连接和/或被包含(包封)在合成纳米载体内。然而，在一些实施方案中，由于合成纳米载体的结构，免疫抑制剂被合成纳米载体包封，而不是与合成纳米载体结合。在一些优选的实施方案中，合成纳米载体包含本文中提供的聚合物，并且免疫抑制剂与聚合物连接。
当由于免疫抑制剂和合成纳米载体之间的结合而发生连接时，可以通过偶联部分进行连接。偶联部分可以是免疫抑制剂通过其与合成纳米载体相结合的任何部分。这样的部分包括共价键，例如酰胺键或酯键，以及将免疫抑制剂与合成纳米载体(共价或非共价地)结合的单独分子。这样的分子包括接头或聚合物或其单元。例如，偶联部分可以包含与免疫抑制剂静电结合的带电聚合物。作为另一个实例，偶联部分可以包含与其共价结合的聚合物或其单元。
在一些优选的实施方案中，合成纳米载体包含本文中提供的聚合物。这些合成纳米载体可以是完全聚合的，或者它们可以是聚合物与其他材料的混合物。
在一些实施方案中，合成纳米载体的聚合物缔合以形成聚合物基质。在这些实施方案的一些中，组分(例如免疫抑制剂)可以与聚合物基质中的一种或更多种聚合物共价缔合。在一些实施方案中，共价缔合由接头介导。在一些实施方案中，组分可以与聚合物基质中的一种或更多种聚合物非共价缔合。例如，在一些实施方案中，组分可以包封在聚合物基质内、被聚合物基质包围和/或分散在聚合物基质中。作为替代或补充，组分可通过疏水相互作用、电荷相互作用、范德华力等与聚合物基质中的一种或更多种聚合物缔合。许多种聚合物和用于从其形成聚合物基质的方法是常规已知的。
聚合物可以是天然或非天然(合成)聚合物。聚合物可以是包含两种或更多种单体的均聚物或共聚物。就序列而言，共聚物可以是无规、嵌段或包含无规和嵌段序列的组合。通常来说，根据本发明的聚合物是有机聚合物。
在一些实施方案中，聚合物包括聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺或聚醚或其单元。在另一些实施方案中，聚合物包含聚(乙二醇)(PEG)、聚丙二醇、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚乳酸-乙醇酸共聚物或聚己内酯或其单元。在一些实施方案中，优选聚合物是可生物降解的。因此，在这些实施方案中，优选的是，如果聚合物包含聚醚，例如聚(乙二醇)或聚丙二醇或其单元，则聚合物包含聚醚和生物可降解聚合物的嵌段共聚物，以使得聚合物是可生物降解的。在另一些实施方案中，聚合物不仅仅包含聚醚或其单元，例如聚(乙二醇)或聚丙二醇或其单元。
适用于本发明的聚合物的其他实例包括但不限于：聚乙烯、聚碳酸酯(例如聚(1，3-二氧杂环己烷-2-酮))、聚酐(例如聚(癸二酸酐))、聚丙基富马酸酯、聚酰胺(例如聚己内酰胺)、聚缩醛、聚醚、聚酯(例如，聚丙交酯、聚乙交酯、聚丙交酯-乙交酯共聚物、聚己内酯、聚羟基酸(例如、聚(β羟基链烷酸酯)))、聚原酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯和聚胺、聚赖氨酸、聚赖氨酸-PEG共聚物和聚(乙烯亚胺)、聚(乙烯亚胺)-PEG共聚物。
在一些实施方案中，根据本发明的聚合物包括已由美国食品和药物管理局(FDA)根据21 C.F.R.§177.2600批准用于人的聚合物，其包括但不限于聚酯(例如，聚乳酸、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚己内酯、聚戊内酯、聚(1，3-二氧杂环己烷-2酮))；聚酐(例如，聚(癸二酸酐))；聚醚(例如，聚乙二醇)；聚氨酯；聚甲基丙烯酸酯；聚丙烯酸酯；和聚氰基丙烯酸酯。
在一些实施方案中，聚合物可以是亲水的。例如，聚合物可以包含阴离子基团(例如磷酸根基团、硫酸根基团、羧酸根基团)；阳离子基团(例如季铵基)；或极性基团(例如，羟基、巯基、胺基)。在一些实施方案中，包含亲水性聚合物基质的合成纳米载体在合成纳米载体内产生亲水性环境。在一些实施方案中，聚合物可以是疏水性的。在一些实施方案中，包含疏水性聚合物基质的合成纳米载体在合成纳米载体内产生疏水环境。聚合物的亲水性或疏水性的选择可对并入合成纳米载体内的材料的性质具有影响。
在一些实施方案中，聚合物可以用一个或更多个部分和/或官能团修饰。根据本发明可以使用多种部分或官能团。在一些实施方案中，聚合物可以用聚乙二醇(PEG)、碳水化合物和/或衍生自多糖的无环聚缩醛修饰(Papisov，2001，ACS Symposium Series，786：301)。某些实施方案可以使用Gref等人的美国专利No.5543158或Von Andrian等人的WO公开WO2009/051837的一般教导来进行。
在一些实施方案中，聚合物可以用脂质或脂肪酸基团修饰。在一些实施方案中，脂肪酸基团可以是丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸或木蜡酸中的一种或更多种。在一些实施方案中，脂肪酸基团可以是棕榈油酸、油酸、反型异油酸、亚油酸、α-亚油酸、γ-亚油酸、花生四烯酸、鳕肝油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸或芥酸中的一种或更多种。
在一些实施方案中，聚合物可以是聚酯，其包括含有乳酸和乙醇酸单元的共聚物，例如聚乳酸-乙醇酸共聚物和聚丙交酯-乙交酯共聚物，在本文中统称为“PLGA”；以及包含乙醇酸单元的均聚物，在本文中称为“PGA”，以及乳酸单元如聚-L-乳酸、聚-D-乳酸、聚-D，L-乳酸、聚-L-丙交酯、聚-D-丙交酯和聚-D，L-丙交酯，在本文中统称为“PLA”。在一些实施方案中，示例性聚酯包括例如聚羟基酸；PEG共聚物和丙交酯与乙交酯的共聚物(例如，PLA-PEG共聚物、PGA-PEG共聚物、PLGA-PEG共聚物及其衍生物)。在一些实施方案中，聚酯包括例如聚(己内酯)、聚(己内酯)-PEG共聚物、聚L-丙交酯-L-赖氨酸共聚物、聚(丝氨酸酯)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)、聚[α-(4-氨基丁基)-L-乙醇酸]及其衍生物。
在一些实施方案中，聚合物可以是PLGA。PLGA是乳酸与乙醇酸的生物相容性且生物可降解的共聚物，并且多种形式的PLGA的特征在于乳酸∶乙醇酸的比例。乳酸可以是L-乳酸、D-乳酸或D，L-乳酸。PLGA的降解速率可以通过改变乳酸∶乙醇酸比率来调节。在一些实施方案中，根据本发明使用的PLGA的特征在于乳酸∶乙醇酸的比率为约85∶15、约75∶25、约60∶40、约50∶50、约40∶60、约25∶75或约15∶85。
在一些实施方案中，聚合物可以是一种或更多种丙烯酸类聚合物。在某些实施方案中，丙烯酸类聚合物包括例如丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙酯、甲基丙烯酸氰基乙酯、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、甲基丙烯酸烷基酰胺共聚物、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸酐)、甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯共聚物、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚物、聚氰基丙烯酸酯，以及包含一种或更多种前述聚合物的组合。丙烯酸聚合物可以包括具有低含量的季铵基团的丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的完全聚合的共聚物。
在一些实施方案中，聚合物可以是阳离子聚合物。通常来说，阳离子聚合物能够缩合和/或保护核酸的带负电荷的链。含胺聚合物如聚(赖氨酸)(Zauner等，1998，Adv.DrugDel.Rev.，30：97；和Kabanov等，1995，Bioconjugate Chem.，6：7)、聚(乙烯亚胺)(PEI；Boussif等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1995，92：7297)和聚(酰氨基胺)树枝状聚合物(Kukowska-Latallo等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，93：4897；Tang等，1996，Bioconjugate Chem.，7：703；和Haensler等，1993，Bioconjugate Chem.，4：372)在生理pH下带正电荷，与核酸形成离子对。在一些实施方案中，合成纳米载体可以不包含(或可以排除)阳离子聚合物。
在一些实施方案中，聚合物可以是带有阳离子侧链的可降解聚酯(Putnam等，1999，Macromolecules，32：3658；Barrera等，1993，J.Am.Chem.Soc.，115：11010；Kwon等，1989，Macromolecules，22：3250；Lim等，1999，J.Am.Chem.Soc.，121：5633；和Zhou等，1990，Macromolecules，23：3399)。这些聚酯的实例包括聚(L-丙交酯-L-赖氨酸)共聚物(Barrera等，1993，J.Am.Chem.Soc.，115：11010)、聚(丝氨酸酯)(Zhou等，1990，Macromolecules，23：3399)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)(Putnam等，1999，Macromolecules，32：3658；和Lim等，1999，J.Am.Chem.Soc.，121：5633)和聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)(Putnam等，1999，Macromolecules，32：3658；和Lim等，1999，J.Am.Chem.Soc.，121：5633)。
这些和其他聚合物的性质及其制备方法是本领域中公知的(见例如美国专利6,123,727；5,804,178；5,770,417；5,736,372；5,716,404；6,095,148；5,837,752；5,902,599；5,696,175；5,514,378；5,512,600；5,399,665；5,019,379；5,010,167；4,806,621；4,638,045；和4,946,929；Wang等，2001，J.Am.Chem.Soc.，123：9480；Lim等，2001，J.Am.Chem.Soc.，123：2460；Langer，2000，Acc.Chem.Res.，33：94；Langer，1999，J.Control.Release，62：7；以及Uhrich等，1999，Chem.Rev.，99：3181)。更一般地，用于合成某些合适的聚合物的多种方法在下列文献中描述于：Concise Encyclopedia of PolymerScience and Polymeric Amines and Ammonium Salts，Goethals编，Pergamon Press，1980；Principles of Polymerization，Odian，John Wiley&Sons著，第四版，2004；Contemporary Polymer Chemistry，Allcock等著，Prentice-Hall，1981；Deming等，1997，Nature，390：386；以及美国专利6,506,577，6,632,922，6,686,446和6,818,732。
在一些实施方案中，聚合物可以是直链或支链聚合物。在一些实施方案中，聚合物可以是树枝状聚合物。在一些实施方案中，聚合物可以基本上彼此交联。在一些实施方案中，聚合物可以基本上不含交联。在一些实施方案中，可以根据本发明使用聚合物而不经历交联步骤。还应理解，合成纳米载体可包含嵌段共聚物、接枝共聚物、共混物、混合物和/或任何前述物质和其他聚合物的加合物。本领域技术人员将认识到，本文中列出的聚合物代表可以根据本发明使用的聚合物的示例性而非全面的列表。
在一些实施方案中，合成纳米载体不包含聚合物组分。在一些实施方案中，合成纳米载体可包含金属颗粒、量子点、陶瓷颗粒等。在一些实施方案中，非聚合的合成纳米载体是非聚合物组分的聚集体，例如金属原子(例如金原子)的聚集体。
在一些实施方案中，本文中提供的任何免疫抑制剂可以与合成纳米载体、抗体或其抗原结合片段(或靶向APC的其他配体)、红细胞结合肽等偶联。免疫抑制剂包括但不限于：他汀类；mTOR抑制剂，例如雷帕霉素或雷帕霉素类似物；TGF-β信号传导剂；TGF-β受体激动剂；组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂；皮质类固醇；线粒体功能抑制剂，例如鱼藤酮；P38抑制剂；NF-κB抑制剂；腺苷受体激动剂；前列腺素E2激动剂；磷酸二酯酶抑制剂，例如磷酸二酯酶4抑制剂；蛋白酶体抑制剂；激酶抑制剂；G蛋白偶联受体激动剂；G蛋白偶联受体拮抗剂；糖皮质激素；类视黄醇；细胞因子抑制剂；细胞因子受体抑制剂；细胞因子受体激活剂；过氧化物酶体增殖物激活受体拮抗剂；过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂；组蛋白去乙酰化酶抑制剂；钙调磷酸酶抑制剂；磷酸酶抑制剂和氧化的ATP。免疫抑制剂还包括IDO、维生素D3、环孢素A、芳烃受体抑制剂、白藜芦醇、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、阿司匹林、尼氟酸、雌三醇、雷公藤甲素(tripolide)、白介素(例如IL-1，IL-10)、环孢素A、靶向细胞因子或细胞因子受体的siRNA等。
他汀类的实例包括阿托伐他汀
Figure BDA0003336102440000521
西立伐他汀、氟伐他汀
Figure BDA0003336102440000522
洛伐他汀
Figure BDA0003336102440000523
Figure BDA0003336102440000524
美伐他汀
Figure BDA0003336102440000525
匹伐他汀
Figure BDA0003336102440000526
瑞舒伐他汀
Figure BDA0003336102440000527
Figure BDA0003336102440000528
瑞舒伐他汀
Figure BDA0003336102440000529
和辛伐他汀
Figure BDA00033361024400005210
Figure BDA00033361024400005211
mTOR抑制剂的实例包括雷帕霉素及其类似物(例如CCL-779，RAD001，AP23573，C20-甲代烯丙基雷帕霉素(C20-Marap)，C16-(S)-丁基磺酰氨基雷帕霉素(C16-BSrap)，C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素(C16-iRap)(Bayle等Chemistry&Biology 2006，13：99-107))、AZD8055、BEZ235(NVP-BEZ235)、大黄根酸(大黄酚)、地磷莫司(MK-8669)、依维莫司(RAD0001)、KU-0063794、PI-103、PP242、替西罗莫司和WYE-354(可得自Selleck，休斯敦，TX，美国)。
TGF-β信号传导剂的实例包括TGF-β配体(例如激活素A、GDF1、GDF11、骨形态发生蛋白、nodal、TGF-β)及其受体(例如ACVR1B、ACVR1C、ACVR2A、ACVR2B、BMPR2、BMPR1A、BMPR1B、TGFβRI、TGFβRII)、R-SMADS/co-SMADS(例如，SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD5、SMAD8)和配体抑制剂(例如卵泡抑素、头蛋白(noggin)、脊索素、DAN、lefty、LTBP1、THBS1、饰胶蛋白聚糖(Decorin))。
线粒体功能抑制剂的实例包括苍术苷(二钾盐)、豆氨酸(三铵盐)、羰基氰化物m-氯苯腙、羧基苍术苷(例如来自胶苍术(Atractylis gummifera))、CGP-37157、(-)-鱼藤素(例如来自绢毛萌豆(Mundulea sericea))、F16、己糖激酶II VDAC结合结构域肽、寡霉素、鱼藤酮、Ru360、SFK1和缬氨霉素(例如来自灰色链霉菌(Streptomyces fulvissimus))(EMD4Biosciences，美国)。
P38抑制剂的实例包括SB-203580(4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亚磺酰基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)、SB-239063(反式-1-(4-羟基环己基)-4-(氟苯基)-5-(2-甲氧基-嘧啶_4-基)咪唑)、SB-220025(5-(2-氨基-4-嘧啶基)-4-(4-氟苯基)-1-(4-哌啶基)咪唑)和ARRY-797。
NF(例如NK-βIII)抑制剂的实例包括IFRD1、2-(1，8-萘啶-2-基)-苯酚、5-氨基水杨酸、BAY 11-7082、BAY 11-7085、CAPE(咖啡酸苯乙酯)、马来酸二乙酯、IKK-2抑制剂IV、IMD0354、乳胞素、MG-132[Z-Leu-Leu-Leu-CHO]、NFκB激活抑制剂III、NF-κB激活抑制剂II、JSH-23、小白菊内酯(parthenolide)、苯基胂氧化物(PAO)、PPM-18、吡咯烷二硫代氨基甲酸铵盐、QNZ、RO 106-9920、楝酰胺(rocaglamide)、楝酰胺AL、楝酰胺C、楝酰胺I、楝酰胺J、洛克米兰醇(rocaglaol)、(R)-MG-132、水杨酸钠、雷公藤内酯(PG490)和蟛蜞菊内酯(vedelolactone)。
腺苷受体激动剂的实例包括CGS-21680和ATL-146e。
前列腺素E2激动剂的实例包括前列腺素2和前列腺素4。
磷酸二酯酶抑制剂(非选择性和选择性抑制剂)的实例包括咖啡因、氨茶碱、IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)、副黄嘌呤、己酮可可碱、可可碱、茶碱、甲基化黄嘌呤、长春西汀、EHNA(赤式-9-(2-羟基-3-壬基)腺嘌呤)、阿那格雷、依诺昔酮(PERFANTM)、米力农、左西孟旦、松叶菊碱、异丁司特、吡拉米特、木犀草素、屈他维林、罗氟司特(DAXASTM，DALIRESPTM)、西地那非
Figure BDA0003336102440000531
他达那非
Figure BDA0003336102440000532
伐地那非
Figure BDA0003336102440000533
乌地那非、阿伐那非、淫羊藿苷、4-甲基哌嗪和吡唑并嘧啶-7-1。
蛋白酶体抑制剂的实例包括硼替佐米、双硫仑、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯和盐孢菌酰胺A。
激酶抑制剂的实例包括贝伐单抗、BIBW 2992、西妥昔单抗
Figure BDA0003336102440000534
伊马替尼
Figure BDA0003336102440000535
曲妥珠单抗
Figure BDA0003336102440000536
吉非替尼
Figure BDA0003336102440000537
雷珠单抗
Figure BDA0003336102440000538
哌加他尼、索拉非尼、达沙替尼、舒尼替尼、埃罗替尼、尼罗替尼、拉帕替尼、帕尼单抗、凡德他尼、E7080、帕唑帕尼和木利替尼。
糖皮质激素的实例包括氢化可的松(皮质醇)、醋酸可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、地塞米松、倍他米松、曲安西龙、倍氯米松、醋酸氟氢可的松、醋酸去氧皮质酮(DOCA)和醛固酮。
类维生素A的实例包括视黄醇、视黄醛、维A酸(视黄酸，
Figure BDA0003336102440000541
)、异维A酸
Figure BDA0003336102440000542
Figure BDA0003336102440000543
阿利维A酸
Figure BDA0003336102440000544
阿维A酯(TEGISONTM)及其代谢物阿曲汀
Figure BDA0003336102440000545
他扎罗汀
Figure BDA0003336102440000546
Figure BDA0003336102440000547
贝沙罗汀
Figure BDA0003336102440000548
和阿达帕林
Figure BDA0003336102440000549
细胞因子抑制剂的实例包括IL1ra、IL1受体拮抗剂、IGFBP、TNF-BF、尿调节素、α-2-巨球蛋白、环孢素A、戊脒和己酮可可碱
Figure BDA00033361024400005410
过氧化物酶体增殖物激活受体拮抗剂的实例包括GW9662、PPARγ拮抗剂III、G335和T0070907(EMD4Biosciences，美国)。
过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂的实例包括吡格列酮、环格列酮、氯贝特、GW1929、GW7647、L-165，041、LY 171883、PPARγ激活剂、Fmoc-Leu、曲格列酮和WY-14643(EMD4Biosciences，美国)。
组蛋白脱乙酰酶抑制剂的实例包括异羟肟酸(或异羟肟酸盐)例如曲古柳菌素A、环状四肽(例如trapoxin B)和缩酚酸肽，苯甲酰胺，亲电酮，脂肪酸化合物如丁酸苯酯和丙戊酸，异羟肟酸如伏立诺他(SAHA)、贝利司他(PXD101)、LAQ824和潘比司他(LBH589)，苯甲酰胺如恩孕酮(MS-275)、CI994和莫西司他(MGCD0103)，烟酰胺，NAD的衍生物，二氢香豆素，萘并吡喃酮和2-羟基萘醛。
钙调磷酸酶抑制剂的实例包括环孢素、吡美莫司、voclosporin和他克莫司。
磷酸酶抑制剂的实例包括BN82002盐酸盐、CP-91149、花萼海绵诱癌素A、斑蝥酸、斑蝥素、氯氰菊酯、乙基-3，4-脱质抑素、福司曲星钠盐、MAZ51、甲基-3，4-脱质抑素、NSC95397、去甲斑蝥素、来自东海原甲藻(prorocentrum concavum)的冈田酸铵盐、冈田酸、冈田酸钾盐、冈田酸钠盐、苯基胂氧化物、多种磷酸酶抑制剂混合物、蛋白磷酸酶1C、蛋白磷酸酶2A抑制蛋白、蛋白磷酸酶2A1、蛋白磷酸酶2A2和原钒酸钠。
根据本发明的组合物可以包含可药用赋形剂，例如防腐剂、缓冲剂、盐水或磷酸缓冲盐水。可以使用常规药物制造和配混技术制备组合物以得到可用的剂型。在一个实施方案中，将组合物与防腐剂一起悬浮在注射用无菌盐水溶液中。
D.使用和制造组合物的方法
病毒转移载体可以用本领域普通技术人员已知的方法或本文另有描述的方法制备。例如，可以使用例如在美国专利No.4,797,368和Laughlin等，Gene，23，65-73(1983)中所述的方法构建和/或纯化病毒转移载体。
例如，可以在互补细胞系中以适当的水平产生复制缺陷型腺病毒载体，所述互补细胞系提供不存在于复制缺陷型腺病毒载体中但是病毒繁殖所需的基因功能，从而产生高滴度的病毒转移载体储备。互补细胞系可补充由早期区、晚期区、病毒包装区、病毒相关RNA区或其组合所编码的至少一种复制必需的基因功能缺陷，包括所有腺病毒功能(例如，以使腺病毒扩增子能够增殖)。互补细胞系的构建涉及标准分子生物学和细胞培养技术，例如由Sambrook等，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor出版社，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)，和Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing Associates and John Wiley&Sons，New York，N.Y.(1994)所述。
用于产生腺病毒载体的互补细胞系包括但不限于293细胞(描述于例如Graham等，J.Gen.Virol.，36，59-72(1977))、PER.C6细胞(描述于例如国际专利申请WO 97/00326，以及美国专利No.5,994,128和6,033,908)和293-ORF6细胞(描述于例如国际专利申请WO 95/34671和Brough等，J.Virol.，71，9206-9213(1997))。在一些情况下，互补细胞不会补充所有需要的腺病毒基因功能。可使用辅助病毒以提供不由细胞或腺病毒基因组编码的反式基因功能，以使得能够复制腺病毒载体。腺病毒载体可以使用由例如以下所描述的材料和方法构建、扩增和/或纯化：美国专利No.5,965,358、5,994,128、6,033,908、6,168,941、6,329,200、6,383,795、6,440,728、6,447,995和6,475,757，美国专利申请公开号2002/0034735 A1，以及国际专利申请WO 98/53087、WO 98/56937、WO 99/15686、WO 99/54441、WO00/12765、WO 01/77304和WO 02/29388，以及本文确定的其他参考文献。非C组腺病毒载体(包括腺病毒血清型35载体)可以使用例如美国专利No.5,837,511和5,849,561以及国际专利申请WO 97/12986和WO 98/53087中所述的方法产生。
可以使用重组方法产生AAV载体。通常来说，该方法包括培养含有编码以下的核酸序列的宿主细胞：AAV衣壳蛋白或其片段；功能性rep基因；由AAV反向末端重复序列(inverted terminal repeat，ITR)构成的重组AAV载体和转基因；和足够的辅助功能，以允许将重组AAV载体包装到AAV衣壳蛋白中。在一些实施方案中，病毒转移载体可以包含选自以下的AAV血清型的反向末端重复序列(ITR)：AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11及其变体。
要在宿主细胞中培养以在AAV衣壳中包装rAAV载体的组分可以反式地提供给宿主细胞。或者，可以由稳定的宿主细胞提供任一种或更多种所需组分(例如，重组AAV载体、rep序列、cap序列和/或辅助功能)，所述稳定宿主细胞已经被使用本领域技术人员已知的方法所改造以含有一种或更多种所需组分。最合适地，这种稳定的宿主细胞可以在诱导型启动子的控制下含有所需的组分。然而，期望组分也可以在组成型启动子的控制下。可以使用任何合适的遗传元件来将产生本发明的rAAV所需的重组AAV载体、rep序列、cap序列和辅助功能递送到包装宿主细胞。所选择的遗传元件可以通过任何合适的方法递送，包括本文中所述的那些。用于构建本发明的任何实施方案的方法对于核酸操作技术人员是已知的，并且包括遗传工程、重组工程和合成技术。见例如，Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor出版社，Cold Spring Harbor，N.Y.。类似地，产生rAAV病毒粒子的方法是公知的，并且合适方法的选择不是对本发明的限制。见例如，K.Fisher等，J.Virol.，70：520-532(1993)和U.S.Pat.No.5,478,745。
在一些实施方案中，可以使用三重转染方法(例如，如美国专利No.6,001,650中详细描述的，其涉及三重转染方法的内容通过引用并入本文)来产生重组AAV载体。通常来说，通过以待包装入AAV颗粒的重组AAV载体(包含转基因)、AAV辅助功能载体和附属功能载体转染宿主细胞来产生重组AAV。一般来说，AAV辅助功能载体编码AAV辅助功能序列(rep和cap)，其反式地作用于多产的AAV复制和衣壳化。优选地，AAV辅助功能载体支持高效的AAV载体产生，而不产生任何可检出的野生型AAV病毒粒子(即，含有功能rep和cap基因的AAV病毒粒子)。附属功能载体可以编码用于非AAV衍生的病毒和/或细胞功能的核苷酸序列，AAV依赖于所述功能以复制。附属功能包括AAV复制所需的那些功能，包括但不限于参与AAV基因转录激活、阶段特异性AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、cap表达产物的合成和AAV衣壳组装的那些部分。基于病毒的附属功能可以来自任何已知的辅助病毒，例如腺病毒、疱疹病毒(除了单纯疱疹病毒1型)和痘苗病毒。
可以使用本领域已知的多种方法中的任一种来产生慢病毒载体。慢病毒载体和/或其生产方法的实例可见于例如：美国公开No.20150224209、20150203870、20140335607、20140248306、20090148936和20080254008，这样的慢病毒载体和生产方法通过引用并入本文。例如，当慢病毒载体为整合无能力时，慢病毒基因组还包含复制起点(ori)，其序列取决于其中必须表达慢病毒基因组的细胞的性质。所述复制起点可以来自真核来源，优选来自哺乳动物来源，最优选来自人来源。由于慢病毒基因组不整合到细胞宿主基因组中(因为缺陷的整合酶)，慢病毒基因组可在经历频繁细胞分裂的细胞中丢失；这在免疫细胞(例如B或T细胞)中尤其如此。复制起点的存在在一些情况下可以是有益的。可以在通过所述质粒或通过其他方法转染合适的细胞(例如293T细胞)后产生载体颗粒。在用于表达慢病毒颗粒的细胞中，可将所有或一些质粒用于稳定表达其编码多核苷酸，或用于瞬时或半稳定地表达其编码多核苷酸。
用于产生本文中提供的其他病毒载体的方法是本领域已知的，并且可与上述示例性方法类似。此外，病毒载体可商购获得。
在一些实施方案中，当制备某些靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂时，用于将组分与例如红细胞结合肽、抗体或其抗原结合片段(或靶向APC的其他配体)或合成纳米载体连接的方法可能是可用的。
在某些实施方案中，连接可以是共价接头。在一些实施方案中，根据本发明的免疫抑制剂可以通过由叠氮基与含有炔基的免疫抑制剂的1，3-偶极环加成反应，或通过炔烃与含有叠氮基的免疫抑制剂的1，3-偶极环加成反应所形成的1，2，3-三唑接头共价连接到外表面。这样的环加成反应优选在Cu(I)催化剂以及合适的Cu(I)-配体和还原剂的存在下进行以将Cu(II)化合物还原为催化活性Cu(I)化合物。这种Cu(I)催化的叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)也可以称为点击反应。
另外，共价偶联可包含这样的共价接头，其包含酰胺接头、二硫接头、硫醚接头、腙连接头、酰肼接头、亚胺或肟接头、脲或硫脲接头、脒接头、胺接头、以及磺酰胺接头。
通过一种组分(例如免疫抑制剂)上的胺与第二组分(例如纳米载体)上的羧酸基团之间的酰胺键形成酰胺接头。接头中的酰胺键可以使用任何常规的酰胺键形成反应以适当保护的氨基酸和活化羧酸(例如N-羟基琥珀酰亚胺活化的酯)来制备。
通过在例如R1-S-S-R2形式的两个硫原子之间形成二硫(S-S)键来制备二硫接头。二硫键可以通过含有巯基/硫醇基(-SH)的组分与另一活化的硫醇基，或含有硫醇/硫醇基的组分与含有活化硫醇基的组分的硫醇交换而形成。
三唑接头(特别是其中R1和R2可以是任何化学实体的
Figure BDA0003336102440000581
形式的1，2，3-三唑)
通过连接到第一组分的叠氮化物与连接到第二组分(例如免疫抑制剂)的末端炔的1，3-偶极环加成反应制备。1，3-偶极环加成反应在具有或不具有催化剂下(优选具有Cu(I)-催化剂下)进行，其通过1，2，3-三唑官能团连接两种组分。该化学由Sharpless等，Angew.Chem.Int.Ed.41(14)，2596，(2002)和Meldal等，Chem.Rev.，2008，108(8)，2952-3015详细描述，并且通常被称为“点击”反应或CuAAC。
硫醚接头为通过形成例如R1-S-R2形式的硫-碳(硫醚)键来制备。硫醚可以通过在一种组分上用烷基化基团(例如卤化物)烷基化硫醇/巯基(-SH)基团或在第二组分上用环氧化物烷基化来制备。硫醚接头也可以通过将一个组分上的硫醇/巯基基团迈克尔加成(Michael addition)到含有作为迈克尔受体的马来酰亚胺基团或乙烯基砜基团的第二组分上的缺电子烯基团上而形成。在另一种方式中，硫醚接头可以通过一个组分上的硫醇/巯基基团与第二组分上的烯基的自由基硫醇-烯反应来制备。
腙接头通过一个组分上的酰肼基团与第二组分上的醛/酮基团的反应制备。
酰肼接头通过一个组分上的肼基团与第二组分上的羧酸基团的反应形成。这种反应通常使用类似于形成酰胺键的化学进行，其中羧酸用活化试剂活化。
亚胺或肟接头通过一个组分上的胺或N-烷氧基胺(或氨氧基)基团与第二组分上的醛基或酮基反应形成。
脲或硫脲接头通过一个组分上的胺基与第二组分上的异氰酸酯或硫代异氰酸酯基团反应制备。
脒接头通过一个组分上的胺基与第二组分上的酰亚胺酯基反应制备。
胺接头通过一个组分上的胺基与第二组分上的烷基化基团(例如卤化物、环氧化物或磺酸酯基)的烷基化反应制备。或者，胺接头也可以通过用合适的还原剂(例如氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠)将一种组分上的胺基与第二组分上的醛基或酮基的还原胺化来制备。
磺酰胺接头通过一个组分上的胺基与第二组分上的磺酰卤(例如磺酰氯)基团反应制备。
砜接头通过亲核试剂迈克尔加成到乙烯基砜制备。乙烯基砜或亲核试剂可以在纳米载体的表面上或与组分连接。
组分也可以通过非共价缀合方法缀合。例如，带负电荷的免疫抑制剂可以通过静电吸附与带正电荷的组分缀合。含有金属配体的组分也可以通过金属-配体络合物与金属络合物缀合。
在一些实施方案中，在组装合成纳米载体之前，组分可以与聚合物(例如聚乳酸嵌段-聚乙二醇)连接，或者合成纳米载体可以在其表面上形成具有反应性或可活化基团。在后一种情况下，组分可以用与由合成纳米载体的表面呈现的连接化学物相容的基团制备。在另一些实施方案中，可以使用合适的接头将肽组分与VLP或脂质体连接。接头是能够将两个分子偶联在一起的化合物或试剂。在一个实施方案中，接头可以是如Hermanson 2008中所述的同型双功能或异型双功能试剂。例如，在EDC存在下，可以用同双功能接头己二酸二酰肼(ADH)处理表面上含有羧基的VLP或脂质体合成纳米载体，以与ADH接头形成相应的合成纳米载体。然后将所得ADH连接的合成纳米载体通过纳米载体上的ADH接头的另一端与含有酸基团的肽组分缀合，以产生相应的VLP或脂质体肽缀合物。
在一些实施方案中，制备了在聚合物链末端含有叠氮基或炔基的聚合物。然后将该聚合物用于以这样的方式制备合成纳米载体，即多个炔或叠氮基团位于该纳米载体的表面上。或者，合成纳米载体可以通过另一种途径制备，并且随后用炔或叠氮基团官能化。该组分在炔烃(如果聚合物含有叠氮化物)或叠氮化物(如果聚合物含有炔烃)存在下制备。然后使该组分在有或者没有催化剂的情况下通过1，3-偶极环加成反应与纳米载体进行反应，所述催化剂通过1，4-二取代的1，2，3-三唑接头将组分与颗粒共价连接。
如果组分是小分子，则在组装合成纳米载体之前将组分与聚合物连接可以是有利的。在一些实施方案中，制备具有用于通过其将组分与合成纳米载体上的表面基团连接的合成纳米载体也是有利的，而不是将组分与聚合物连接，然后在合成纳米载体的构建中使用该聚合物缀合物。
有关可用的缀合方法的详细描述，见Hermanson G T“BioconjugateTechniques”，第二版，Academic出版社出版，Inc.，2008。除了共价连接之外，组分可以通过吸附连接到预先形成的合成纳米载体上，或者可以在形成合成纳米载体期间通过包封连接。
合成纳米载体可以使用本领域已知的多种方法制备。例如，合成纳米载体可以通过例如以下方法形成：纳米沉淀、使用流控通道的流动聚焦、喷雾干燥、单和双乳液溶剂蒸发、溶剂萃取、相分离、研磨、微乳液处理、微加工、纳米加工、牺牲层、简单和复合凝聚，以及本领域普通技术人员公知的其他方法。作为替代或补充，已经描述了用于单分散半导体、导电、磁性、有机和其他纳米材料的水性和有机溶剂合成(Pellegrino等，2005，Small，1：48；Murray等，2000，Ann.Rev.Mat.Sci.，30：545；和Trindade等，2001，Chem.Mat.，13：3843)。文献中已经描述了另外的方法(见例如Doubrow，Ed.，“Microcapsules and Nanoparticlesin Medicine and Pharmacy，”CRC Press，Boca Raton，1992；Mathiowitz等，1987，J.Control.Release，5：13；Mathiowitz等，1987，Reactive Polymers，6：275；和Mathiowitz等，1988，J.Appl.Polymer Sci.，35：755；美国专利5578325和6007845；P.Paolicelli等，“Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate andDeliver Virus-like Particles”Nanomedicine.5(6)：843-853(2010))。
可以使用多种方法将材料封装成期望的合成纳米载体，所述方法包括但不限于：C.Astete等，“Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles”J.Biomater.Sci.Polymer Edn，Vol.17，No.3，pp.247-289(2006)；K.Avgoustakis“Pegylated Poly(Lactide)and Poly(Lactide-Co-Glycolide)Nanoparticles：Preparation，Properties and Possible Applications in Drug Delivery”CurrentDrug Delivery 1：321-333(2004)；C.Reis等，“Nanoencapsulation I.Methods forpreparation of drug-loaded polymeric nanoparticles”Nanomedicine 2：8-21(2006)；P.Paolicelli等，“Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that canEfficiently Associate and Deliver Virus-like Particles”Nanomedicine.5(6)：843-853(2010)。可以使用适合于将材料封装到合成纳米载体中的其他方法包括但不限于由2003年10月14日授予Unger的美国专利6,632,671中公开的方法。
在某些实施方案中，通过纳米沉淀法或喷雾干燥制备合成纳米载体。用于制备合成纳米载体的条件可以改变以产生具有期望尺寸或性质(例如疏水性、亲水性、外部形态、“黏性”、形状等)的颗粒。制备合成纳米载体的方法和使用的条件(例如，溶剂、温度、浓度、空气流速等)可取决于要与合成纳米载体连接的材料和/或聚合物基质的组成。
如果通过任何上述方法制备的合成纳米载体具有在期望范围之外的尺寸范围，则可以例如使用筛子来筛分合成纳米载体的尺寸。
合成纳米载体的要素可以例如通过一个或更多个共价键与整个合成纳米载体连接，或者可以通过一个或更多个接头连接。合成纳米载体官能化的其他方法可以修改自Saltzman等人的公开的美国专利申请2006/0002852、DeSimone等人的公开的美国专利申请2009/0028910或Murthy等人的公开的国际专利申请WO/2008/127532A1。
作为替代或补充，合成纳米载体可以直接或间接地通过非共价相互作用与组分连接。在一些非共价实施方案中，非共价连接由非共价相互作用介导，包括但不限于电荷相互作用、亲和力相互作用、金属配位、物理吸附、主-客相互作用、疏水相互作用、TT堆叠相互作用、氢键相互作用、范德华相互作用、磁相互作用、静电相互作用、偶极-偶极相互作用，和/或其组合。这种连接可以布置在合成纳米载体的外表面或内表面上。在一些实施方案中，封装和/或吸收是附着的形式。
本文中提供的组合物可包含无机或有机缓冲剂(例如，磷酸盐、碳酸盐、乙酸盐或柠檬酸盐的钠或钾盐)和pH调节剂(例如，盐酸、氢氧化钠或氢氧化钾、柠檬酸盐或乙酸盐、氨基酸及其盐)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、α-生育酚)、表面活性剂(例如，聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚氧乙烯9-10壬基苯酚、脱氧胆酸钠)、溶液和/或低温/冻干稳定剂(例如，蔗糖、乳糖、甘露糖醇、海藻糖)、渗透调节剂(例如，盐或糖)、抗菌剂(例如，苯甲酸、苯酚、庆大霉素)、消泡剂(例如，聚二甲基硅氧烷)、防腐剂(例如，硫柳汞、2-苯氧基乙醇、EDTA)、聚合物稳定剂和黏度调节剂(例如，聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆488、羧甲基纤维素)和潜溶剂(例如，甘油、聚乙二醇、乙醇)。
根据本发明的组合物可以包含可药用赋形剂。可以使用常规药物制造和混合技术制备组合物以得到可用的剂型。适用于实施本发明的技术可见于：Handbook ofIndustrial Mixing：Science and Practice，Edward L.Paul，Victor A.Atiemo-Obeng和Suzanne M.Kresta编，2004 John Wiley&Sons，Inc.；和Pharmaceutics：The Science ofDosage Form Design，第二版，M.E.Auten编，2001，Churchill Livingstone。在一个实施方案中，将组合物与防腐剂混悬于注射用无菌盐水溶液中。
应当理解，本发明的组合物可以以任何合适的方式制备，并且本发明决不限于可以使用本文中所述的方法制备的组合物。合适的制造方法的选择可需要注意相关特定部分的性质。
在一些实施方案中，组合物在无菌条件下制造或最终灭菌。这可以确保所得组合物是无菌的和非感染性的，因此与非无菌组合物相比提高了安全性。这提供了有价值的安全措施，尤其是当接受组合物的对象具有免疫缺陷、患有感染和/或易感染时。
根据本发明的给药可以通过多种途径，包括但不限于皮下、静脉内、肌内和腹膜内途径。本文中提及的组合物可以制造和制备以用于施用，在一些实施方案中用于使用常规方法的伴随施用。
本发明的组合物可以以有效量施用，例如本文中别处所描述的有效量。在一些实施方案中，靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和/或病毒转移载体以有效减弱抗病毒转移载体免疫应答或允许病毒转移载体向对象再施用的量存在于剂型中。在一些实施方案中，靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和/或病毒转移载体以有效提高对象中转基因表达的量存在于剂型中。在一些优选的实施方案中，靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和/或病毒转移载体以有效降低对病毒转移载体的免疫应答的量存在于剂型中，例如当伴随施用于对象时。剂型可以以多种频率施用。在一些实施方案中，进行靶向抗原呈递细胞免疫抑制剂与病毒转移载体的重复施用。
本发明的一些方面涉及确定本文中提供的施用方法的方案。方案可以通过至少改变病毒转移载体和靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂的频率、剂量，并随后评估期望或不期望的免疫应答来确定。用于实施本发明的优选方案降低针对病毒转移载体的免疫应答、减弱抗病毒转移载体应答和/或提高转基因表达。所述方案至少包括病毒转移载体和靶向抗原呈递细胞免疫抑制剂的施用频率和剂量。
实施例
实施例1：含聚合物-雷帕霉素缀合物的聚合物纳米载体(预示)
PLGA-雷帕霉素缀合物的制备：
将具有酸端基的PLGA聚合物(7525 DLG1A，酸值0.46mmol/g，LakeshoreBiomaterials；5g，2.3mmol，1.0当量)溶于30mL二氯甲烷(DCM)中。添加N，N-二环己基碳二亚胺(1.2当量，2.8mmol，0.57g)，然后添加雷帕霉素(1.0当量，2.3mmol，2.1g)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)(2.0当量，4.6mmol，0.56g)。将混合物在室温下搅拌2天。然后将混合物过滤以除去不溶的二环己基脲。将滤液浓缩至约10mL体积，并添加到100mL异丙醇(IPA)中以沉淀出PLGA-雷帕霉素缀合物。除去IPA层，然后用50mL IPA和50mL甲基叔丁基醚(MTBE)洗涤聚合物。然后将聚合物在真空下在35℃下干燥2天以得到作为白色固体的PLGA-雷帕霉素(约6.5g)。
含有PLGA-雷帕霉素的纳米载体如下制备：
用于纳米载体形成的溶液如下制备：
溶液1：在二氯甲烷中的PLGA-雷帕霉素100mg/mL。通过将PLGA-雷帕霉素溶解在纯二氯甲烷中制备溶液。溶液2：在二氯甲烷中的PLA-PEG 100mg/mL。通过将PLA-PEG溶解在纯二氯甲烷中制备溶液。溶液3：在100mM pH 8磷酸盐缓冲液中的聚乙烯醇50mg/mL。
首先制备初级油包水乳液。通过在小压力管中组合溶液1(0.75mL)和溶液2(0.25mL)并使用Branson数字超声波仪250在50％振幅下超声处理40秒来制备W1/O1。然后通过将溶液3(3.0mL)与初级W1/O1乳液组合，涡旋10秒，并使用Branson数字超声波仪250在30％振幅下超声处理60秒来制备次级乳液(W1/O1/W2)。将W1/O1/W2乳液添加到含有70mMpH 8磷酸盐缓冲溶液(30mL)的烧杯中，并在室温下搅拌2小时以使二氯甲烷蒸发，形成纳米载体。通过将纳米载体悬浮液转移到离心管中并在75,600×g和4℃下离心35分钟，除去上清液，并将沉淀重新悬浮在磷酸缓冲盐水中来洗涤一部分纳米载体。重复洗涤过程，将沉淀重悬于磷酸缓冲盐水中用于约10mg/mL的最终纳米载体分散体。
实施例2：含有雷帕霉素的金纳米载体(AuNC)的制备(预示)
HS-PEG-雷帕霉素的制备：
将PEG酸二硫化物(1.0当量)、雷帕霉素(2.0-2.5当量)、DCC(2.5当量)和DMAP(3.0当量)在无水DMF中的溶液在室温下搅拌过夜。通过过滤除去不溶性二环己基脲，将滤液添加异丙醇(IPA)中以沉淀出PEG-二硫化物-二-雷帕霉素酯，并用IPA洗涤并干燥。然后在DMF中用三(2-羧基乙基)膦盐酸盐处理聚合物，以将PEG二硫化物还原为巯基PEG雷帕霉素酯(HS-PEG-雷帕霉素)。通过从IPA沉淀回收所得聚合物并如前所述干燥并通过H NMR和GPC分析。
金NC(AuNC)的形成：
将500mL的1mM HAuCl4水溶液在配有冷凝器的1L圆底烧瓶中在剧烈搅拌下加热以回流10分钟。然后将50mL的40mM柠檬酸三钠的溶液迅速添加到搅拌的溶液中。将所得深酒红色溶液保持回流25-30分钟，停止加热，将溶液冷却至室温。然后将溶液通过0.8μm膜过滤器过滤，得到AuNC溶液。使用可见光谱和透射电子显微镜来表征AuNC。AuNC大约20um直径，由柠檬酸盐封端，峰吸收在520nm。
AuNC与HS-PEG-雷帕霉素的缀合物：
将150μl的HS-PEG-雷帕霉素(10μM，在10mM pH 9.0碳酸盐缓冲液中)的溶液添加到1mL的20nm直径的柠檬酸盐封端的金纳米载体(1.16nM)中，以产生2500∶1的巯基与金的摩尔比。将混合物在室温下在氩气下搅拌1小时，以允许巯基与金纳米载体上的柠檬酸完全交换。然后通过在12,000g下离心30分钟来纯化表面上具有PEG-雷帕霉素的AuNC。倾析出上清液，然后用1×PBS缓冲液沉淀洗涤含有AuNC-S-PEG-雷帕霉素的沉淀。然后将纯化的金-PEG-雷帕霉素纳米载体重悬于合适的缓冲液中用于进一步分析和生物测定。
实施例3：具有连接的布洛芬的介孔二氧化硅纳米颗粒(预示)
介孔SiO2纳米颗粒核心通过溶胶-凝胶方法产生。将十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)(0.5g)溶于去离子水(500mL)中，然后向CTAB溶液中添加2M NaOH水溶液(3.5mL)。将溶液搅拌30分钟，然后向溶液中添加四乙氧基硅烷(TEOS)(2.5mL)。将所得凝胶在80℃的温度下搅拌3小时。通过过滤捕获形成的白色沉淀，随后用去离子水洗涤并在室温下干燥。然后通过在HCl的乙醇溶液中悬浮过夜从颗粒中提取剩余的表面活性剂。用乙醇洗涤颗粒、离心，并在超声波处理下再分散。该洗涤过程重复另外两次。
然后使用(3-氨基丙基)-三乙氧基硅烷(APTMS)，用氨基将SiO2纳米颗粒官能化。为此，将颗粒悬浮在乙醇(30mL)中，并将APTMS(50μL)添加到悬浮液中。将悬浮液在室温下静置2小时，然后煮沸4小时，通过定期添加乙醇保持体积恒定。通过离心洗涤5个循环除去剩余的反应物，并再分散在纯乙醇中。
在单独的反应中，产生1-4nm直径的金晶种(gold seed)。在该反应中使用的所有水首先被去离子，然后从玻璃中蒸馏。将水(45.5mL)添加到100mL圆底烧瓶中。在搅拌下，添加0.2M NaOH水溶液(1.5mL)，然后添加1％四(羟甲基)氯化鏻(THPC)的水溶液(1.0mL)。在添加THPC溶液两分钟后，添加已经陈化至少15分钟的10mg/mL氯金酸水溶液(2mL)。将金晶种通过对水透析而纯化。
为了形成核-壳纳米载体，首先将上面形成的氨基官能化的SiO2纳米颗粒与金晶种在室温下混合2小时。通过离心收集金修饰的SiO2颗粒，并与氯金酸和碳酸氢钾的水溶液混合以形成金壳。然后通过离心洗涤颗粒并再分散在水中。通过将颗粒悬浮在布洛芬钠(1mg/L)的溶液中72小时来加载布洛芬。然后通过离心将游离的布洛芬从颗粒中洗涤并再分散在水中。
实施例4：含有环孢素A的脂质体(预示)
使用薄膜水合形成脂质体。将1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)(32μmol)、胆固醇(32μmol)和环孢素A(6.4μmol)溶于纯氯仿(3mL)中。将该脂质溶液添加到50mL圆底烧瓶中，并在60℃的温度下在旋转蒸发器上蒸发溶剂。然后用氮气冲洗烧瓶以除去剩余的溶剂。将磷酸缓冲盐水(2mL)和五个玻璃珠添加至烧瓶中，并且通过在60℃下摇动1小时使脂质膜水合以形成悬浮液。将悬浮液转移到小压力管中并在60℃下超声处理30秒脉冲的四个循环，每个脉冲之间有30秒的延迟。然后将悬浮液在室温下静置2小时，以允许完全水合。通过离心洗涤脂质体，然后再悬浮于新鲜的磷酸缓冲盐水中。
实施例5：包含雷帕霉素之合成纳米载体
材料
雷帕霉素购自TSZ CHEM(Wilson街185号，Framingham，MA 01702；产品目录#R1017)。具有76％丙交酯和24％乙交酯含量且特性黏度为0.69dL/g的PLGA购自SurModicsPharmaceuticals(Tom Martin大道756号，Birmingham，AL 35211，产品编号7525 DLG 7A)。具有约5,000Da的PEG嵌段和约40,000Da的PLA嵌段的PLA-PEG嵌段共聚物购自SurModicsPharmaceuticals(Tom Martin大道756号，Birmingham，AL 35211，产品编号100DL mPEG5000 5CE)。聚乙烯醇(85-89％水解)购自EMD Chemicals(产品号1.41350.1001)。
方法
溶液如下制备：
溶液1：在二氯甲烷中的75mg/mL的PLGA和25mg/mL的PLA-PEG。通过将PLGA和PLA-PEG溶解在纯二氯甲烷中制备溶液。
溶液2：在二氯甲烷中的100mg/mL的雷帕霉素。通过将雷帕霉素溶解在纯二氯甲烷中制备溶液。
溶液3：在100mM pH 8磷酸盐缓冲液中的50mg/mL的聚乙烯醇。
使用水包油乳液制备纳米载体。通过在小压力管中组合溶液1(1mL)、溶液2(0.1mL)和溶液3(3mL)并且使用Branson数字超声波仪250在30％振幅下超声处理60秒来制备O/W乳液。将O/W乳液添加到含有70mM pH 8磷酸盐缓冲溶液(30mL)的烧杯中，并在室温下搅拌2小时，使二氯甲烷蒸发，形成纳米载体。通过将纳米载体悬浮液转移到离心管中并在75,000×g和4℃下离心35分钟，除去上清液，并将沉淀重新悬浮在磷酸缓冲盐水中以洗涤一部分纳米载体。重复洗涤过程，将沉淀重悬于磷酸缓冲盐水中用于约10mg/mL的最终纳米载体分散体。
通过动态光散射测定纳米载体尺寸。通过HPLC分析测定纳米载体中雷帕霉素的量。通过重量分析法测定每mL悬浮液的总纳米载体干重。
Figure BDA0003336102440000661
Figure BDA0003336102440000671
实施例6：包含GSK1059615的合成纳米载体
材料
GSK1059615购自MedChem Express(Deer Park大道11号，Suite 102D MonmouthJunction，NJ 08852)，产品编号HY-12036。丙交酯∶乙交酯比为1∶1且特性黏度为0.24dL/g的PLGA购自Lakeshore Biomaterials(Tom Martin大道756号，Birmingham，AL 35211)，产品编号5050DLG2.5A。约5,000Da的具有甲基醚封端的PEG嵌段和0.26DL/g的总特性黏度的PLA-PEG-OMe嵌段共聚物购自Lakeshore Biomaterials(Tom Martin大道756号，Birmingham，AL 35211；产品编号100DL mPEG50005K-E)。Cellgro磷酸缓冲盐水1×pH 7.4(PBS 1×)购自Corning(9345 Discovery Blvd.Manassas，VA 20109)，产品编号21-040-CV。
方法
溶液如下制备：
溶液1：将PLGA(125mg)和PLA-PEG-OMe(125mg)溶解在10mL丙酮中。溶液2：将10mg的GSK1059615制备在1mL N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中。
通过在小玻璃压力管中组合溶液1(4mL)和溶液2(0.25mL)并在搅拌下将混合物滴加到含有20mL超纯水的250mL圆底烧瓶中来制备纳米载体。将烧瓶安装在旋转蒸发装置上，并在减压下除去丙酮。通过将纳米载体悬浮液转移到离心管中并在75,600rcf和4℃下离心50分钟，除去上清液，并将沉淀物重新悬浮在PBS 1×中来洗涤一部分纳米载体。重复洗涤过程，并将沉淀重悬于PBS 1×中，以获得基于聚合物标称浓度为10mg/mL的纳米载体悬浮液。然后使用来自Pall的1.2μm PES膜注射器过滤器(部件号4656)过滤经洗涤的纳米载体溶液。如上制备相同的纳米载体溶液，并在过滤步骤之后与第一次的合并。将均匀悬浮液在-20℃冷冻储存。
通过动态光散射测定纳米载体尺寸。通过在351nm的UV吸收测定纳米载体中GSK1059615的量。通过重量分析法测定每mL悬浮液的总纳米载体干重。
Figure BDA0003336102440000681
实施例7：具有病毒转移载体抗原的红细胞结合治疗(预示)
基于美国公开No.20120039989的教导制备红细胞结合治疗剂，并用作靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂。红细胞结合治疗剂可以包含ERY1、ERY19、ERY59、ERY64、ERY123、ERY141和ERY162中的任一种和任一种本文中所述的病毒转移载体抗原，例如病毒载体抗原，例如衣壳蛋白(或从其来源的肽抗原)或蛋白质(或从其来源的肽抗原)，例如由本文中所述的转基因编码的治疗性蛋白质(或从其来源的肽抗原)。
实施例8：含有NF-κB途径抑制剂的颗粒(预示)
根据美国公开No.20100151000的教导制备靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂。所述颗粒可以是脂质体或聚合物颗粒，并且包含本文中提供的免疫抑制剂中的任一种或美国公开No.20100151000中提供的任一种NF-kB途径抑制剂，所述抑制剂通过引用整体并入本文。此外，脂质体或聚合物颗粒还可以包含任一种本文中所述的病毒转移载体抗原，例如病毒载体抗原，例如衣壳蛋白(或从其来源的肽抗原)或蛋白质(或从其来源的肽抗原)，例如由本文中所述的转基因编码的治疗性蛋白质(或从其来源的肽抗原)。
实施例9：具有基因治疗转基因的腺病毒转移载体(预示)
根据美国专利公开2004/0005293中提供的方法产生腺病毒转移载体。这样的载体可以包含任一种本文中提供的转基因。例如，制备了表达来自人α1-抗胰蛋白酶启动子(AAT)的人B结构域缺失的FVIII cDNA的Ad-AAT-hFVIII载体。使用HPRT填充片段来优化载体大小并避免载体重排(Parks R J，Graham F L.A helper-dependent system foradenovirus vector production helps define a lower limit for efficient DNApackaging.J Virol.1997，71：3293-3298)。使用了Cre66包装细胞系。
实施例10：伴随施用具有与免疫抑制剂偶联的合成纳米载体的病毒转移载体(预 示)
将任何一个实施例(例如实施例9)的病毒转移载体与本文中提供的任一种靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂(例如实施例1-8或12)伴随施用(例如在同一天)于招募来进行临床试验的对象。评价针对病毒转移载体的一种或更多种免疫应答。针对病毒转移载体的一种或更多种免疫应答的水平可以通过与在不存在靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂下施用病毒转移载体(例如当单独施用病毒转移载体时)的对象或另一组对象中的一种或更多种免疫应答的水平进行比较来评价。在一些实施方案中，以类似的方式评价重复的伴随施用。
在这些试验期间建立的信息的应用中，当病毒转移载体不与靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂伴随施用时预期对象对病毒转移载体具有不期望的免疫应答时，病毒转移载体和靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂可以伴随施用于需要病毒转移载体的对象。在另一个实施方案中，可以准备使用在试验期间确定的信息的方案，以指导需要用病毒转移载体治疗的对象的病毒转移载体和合成纳米载体的伴随剂量，并且所述对象具有或预期具有针对病毒转移载体的不期望的免疫应答，而不具有靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂的益处。然后可将如此制备的方案用于治疗对象，特别是人对象。
实施例11：施用带有与免疫抑制剂偶联的合成纳米载体的具有基因治疗转基因的 病毒转移载体
如果纳米载体包封的免疫抑制剂(NC)在加强阶段共注射，则表达重组绿色荧光蛋白(AAV-GFP)的腺相关病毒的两次连续静脉内(i.v.)接种导致在体内肝细胞中更高的GFP表达。
实验方法
使用雄性C57BL/6小鼠(5只小鼠/组)。在不同的重复(参见下表1)，在21天间隔内向动物注射200μL AAV-GFP或AAV-GFP+包含雷帕霉素混合物的合成纳米载体(NC)一次或两次。在第一次注射后第33天(＝在注射两次的那些组的第二次注射后第12天)，处死动物，用胶原酶4(Worthington，Lakewood，NJ)处理其肝，过筛并用FACS分析全细胞悬浮液的GFP表达。简言之，首先用胶原酶(100U)灌注组织，在37℃孵育(30分钟)，除去胶原酶上清液，并用2％FBS终止。然后将组织样品切成约2毫米的方块，消化(胶原酶，400U)，重复搅拌，过滤(尼龙网)，离心(1500rpm)，并将沉淀物重新悬浮于冰冷的2％FBS中。
在第一次注射后第14天，将所有动物放血，并如下用ELISA分析其血清中的AAV抗体。将96孔板用在碳酸盐缓冲液中的50μL AAV以2×109vg/mL包被92小时，然后用300μL酪蛋白封闭2小时。将样品以1∶40稀释度添加到50μL酪蛋白中，并在室温下孵育2小时。使用兔抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA，315-035-008)作为二抗(0.5μg/mL，1小时)，然后添加TMB底物(10分钟)，然后添加终止溶液。然后在450nm的波长下读取平板，减去在570nm处的背景。将小鼠单克隆抗AAV8抗体(Fitzgerald，Acton，MA，10R-2136)用作阳性对照。
AAV-GFP的量：在第0天致敏时为1×1010个病毒基因组(VG)，在第21天加强时为5×1010VG。
所使用的纳米载体包封的免疫抑制剂(雷帕霉素或Rapa)的量：在致敏(第2、3和5组)或加强(第3和4组)时，为50μg纳米载体包封的Rapa。
表1.实验组
Figure BDA0003336102440000701
结果
与仅用AAV-GFP的致敏和加强相比，如果在仅用AAV-GFP致敏后在加强阶段使用NC，观察到AAV注射的小鼠的肝中GFP表达的统计学上较高水平(图1)。如果在致敏和加强两种情况下将AAV-GFP与NC共注射，也存在较高GFP表达的趋势，但是由于单个离群值，其未表现出相对于仅用AAV-GFP致敏-加强的明显统计学优势。仅在致敏注射时使用NC不会导致GFP表达的任何升高(图1，组1与组2和组5与组6)。总的来说，看来在加强时共施用AAV-GFP和NC驱使在动物中更高的GFP表达，所述动物根据目前的方案接受两次重组AAV注射。如果用AAV-GFP+NC加强的所有动物(图2)对仅用AAV-GFP(无论是否在致敏时用NC处理)加强的所有动物作图，则这是显着的，其中在存在NC下加强的9/10的动物表现出比没有NC加强的所有(10/10)动物更高的GFP表达(前者的平均表达提高＞50％)。类似地，如果仅考虑高度GFP阳性肝细胞，不管是否在致敏阶段利用NC，在加强期间利用NC导致统计上比利用AAV-GFP而没有NC加强的更高数值(图3)。还显而易见的是，没有NC的AAV-GFP加强导致甚至与单次致敏免疫接种相比降低的GFP表达。
单独地，在第14天对小鼠采血，并测试其血清中AAV抗体的存在。在这一点，所有小鼠已经在伴有或不伴有NC的共施用的情况下注射AAV-GFP一次(导致产生两组，每组15只小鼠)。如图4所示，接受不含NC的单一AAV-GFP注射的所有15/15只小鼠表现出对AAV的抗体反应性，导致最高OD高于正常血清对照(OD＝0.227)，而接受与NC共施用的AAV的小鼠中没有表现可检出水平的AAV抗体。如果仅使用单一AAV免疫接种，在NC与AAV共施用的小鼠中抗AAV抗体的水平在第21天保持低于基线，而在接受AAV而没有NC的小鼠中升高(图5)。在单次注射后33天，这些在未处理的小鼠中的水平仍然适度增长，而在NC处理的组中，5只小鼠中的4只没有可检出的AAV抗体(图5)。
如果在第21天用AAV-GFP加强小鼠，则未处理的小鼠中的抗体水平继续显著增长，而在仅在加强时接受NC的小鼠中钝化(图6和7)。有趣的是，在后一组中的两只小鼠在第14天呈阳性(在致敏时无处理)，其AAV抗体水平在第33天降至低于背景(图7)。同时，即使在第21天加强后，用NC处理的8/10小鼠在第33天也没有可检出的抗体(图6和7)。在AAV加强时应用NC可对阻断AAV抗体的产生具有较小的影响，尽管在这一点上，其与在加强时无NC处理的情况不具有统计学显著性(图6和7)。因此，在致敏时的NC处理看来对阻断AAV抗体的发展是重要的，其在稍后时间点的施用也是有益的。
结果示出了与用于降低针对病毒转移载体之抗体应答的病毒转移载体联合施用与免疫抑制剂偶联的合成纳米载体的益处。在与编码用于表达的蛋白质的病毒转移载体联合伴随施用与免疫抑制剂偶联的合成纳米载体的情况下，看到这样的益处。因此，上文中例示了用于降低抗病毒转移载体抗体应答的方案。
实施例12：包含雷帕霉素之合成纳米载体
材料
特性黏度为0.41dL/g的PLA购自Lakeshore Biomaterials(Tom Martin大道756号，Birmingham，AL 35211)，产品编号为100DL 4A。
约5,000Da的具有甲基醚封端的PEG嵌段和0.50DL/g的总特性黏度的PLA-PEG-OMe嵌段共聚物购自Lakeshore Biomaterials(Tom Martin大道756号，Birmingham，AL35211)，产品编号为100DL mPEG 5000 5CE。
雷帕霉素购自Concord Biotech Limited(Trasad路1482-1486号，Dholka382225，Ahmedabad印度)，产品编号为SIROLIMUS。
脱水山梨醇单棕榈酸酯购自Sigma-Aldrich(Spruce街3050号，St.Louis，MO63103)，产品编号为388920。
Figure BDA0003336102440000721
聚乙烯醇(PVA)4-88，USP(85-89％水解，黏度为3.4-4.6mPa·s)购自EMD Chemicals Inc.(South Democrat路480号，Gibbstown，NJ 08027)，产品编号为1.41350。
Dulbecco磷酸缓冲盐水1×(DPBS)购自Lonza(Muenchensteinerstrasse 38，CH-4002Basel，瑞士)，产品编号为17-512Q。
方法
溶液如下制备：
溶液1：通过在二氯甲烷中溶解37.5mg/mL的PLA、12.5mg/mL的PLA-PEG-Ome、8mg/mL的雷帕霉素和2.5的脱水山梨醇单棕榈酸酯来制备聚合物、雷帕霉素和脱水山梨醇单棕榈酸酯混合物。
溶液2：在100mM pH 8磷酸盐缓冲液中制备50mg/mL的聚乙烯醇。
通过在小玻璃压力管中组合溶液1(1.0mL)和溶液2(3mL)制备O/W乳液，涡旋混合10秒。然后将制剂通过在30％振幅下超声处理1分钟来匀化。然后将乳液添加到含有DPBS(30mL)的开口烧杯中。使用与上述相同的材料和方法制备第二O/W乳液，然后添加到含有第一乳液和DPBS的同一烧杯中。然后将组合的乳液在室温下搅拌2小时，以使二氯甲烷蒸发并形成纳米载体。通过将纳米载体悬浮液转移至离心管并在75,600×g和4℃下离心50分钟，除去上清液，并将沉淀物再悬浮于含有0.25％w/v PVA的DPBS中来洗涤一部分纳米载体。重复洗涤过程，然后将沉淀物重悬浮于含有0.25％w/v PVA的DPBS中，以获得基于聚合物标称浓度为10mg/mL的纳米载体悬浮液。然后使用0.22μm PES膜注射器过滤器(Millipore部件号SLGP033RB)过滤纳米载体悬浮液。然后将经过滤的纳米载体悬浮液储存在-20℃。
通过动态光散射测定纳米载体尺寸。通过HPLC分析测定纳米载体中雷帕霉素的量。通过重量分析法测定每mL悬浮液的总纳米载体干重。
Figure BDA0003336102440000731
实施例13：具有基因治疗转基因的病毒转移载体的单次施用诱导可被与免疫抑制 剂偶联的合成纳米载体的伴随施用所抑制的抗载体抗体应答
在CMV启动子下单次静脉内(i.v.)施用编码重组绿色荧光蛋白(AAV-GFP)(Virovek，Hayward，CA)的腺相关病毒导致抗AAV抗体应答，其通过用纳米载体包封的免疫抑制剂(根据实施例12产生)伴随处理而得到抑制。
实验方法
使用雄性C57BL/6小鼠(5-15只小鼠/组)。对动物i.v.注射200μL AAV8-GFP或AAV8-GFP+NC的混合物，所述NC为含有雷帕霉素的PLGA纳米载体(见下表2)。在处理后第14天，对所有动物采血，并通过ELISA分析其血清中的AAV8抗体。简言之，将96孔板用50μL在碳酸盐缓冲液中的2×109个载体基因组(vg)/mL的AAV8包被92小时，然后用300μL酪蛋白封闭2小时。将样品以1∶40稀释度添加50μL酪蛋白中，并在室温(RT)孵育2小时。将辣根过氧化物酶缀合的兔抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA，315-035-008)用作二抗(0.5μg/mL，1小时)，然后添加TMB底物(10分钟)，然后添加终止溶液。然后在450nm的波长下读取平板，减去在570nm处的背景。将小鼠单克隆抗AAV8抗体(Fitzgerald，Acton，MA，10R-2136)用作阳性对照。
AAV-GFP的量：在第0天(致敏)为1×1010个病毒基因组(vg)，在第21天(加强)为5×1010vg。
所使用的纳米载体包封的雷帕霉素(Rapa)的量：50μg纳米载体包封的雷帕霉素。
表2.实验组
组# 免疫接种，i.v.第0天 NC(i.v.第0天)
1 AAV-GFP(1×10<sup>10</sup>vg) 无
2 AAV-GFP(1×10<sup>10</sup>vg) 50μg的Rapa
在第14天对小鼠采血，并测试它们的血清中是否存在AAV8抗体。在这一点，所有小鼠已经注射AAV8-GFP一次，伴有或不伴有纳米载体的共施用(每种15只小鼠)。如图8所示，接受不含纳米载体的单一AAV-GFP注射的所有小鼠显示出针对AAV8的抗体反应性，导致高于正常血清对照的抗体水平(OD＝0.227)，而接受与NC共施用的AAV8的小鼠表现出很少或没有可检出水平的AAV8抗体。在NC处理组(n＝5)中，抗AAV8抗体水平在第21天保持在或低于基线，而在接受AAV8-GFP而没有NC的小鼠中升高(图9)。在单次注射AAV8-GFP后33天，未处理小鼠中的抗AAV8抗体水平继续适度提高，而在NC处理组中，5只小鼠中有4只小鼠没有可检出的AAV抗体(图9)。
结果示出了与用于降低针对病毒转移载体的抗体应答的病毒转移载体联合施用与免疫抑制剂偶联的合成纳米载体的益处。在包含编码用于表达的蛋白质的转基因的病毒转移载体联合伴随施用与免疫抑制剂偶联的合成纳米载体的情况下，看到这些益处。因此，本文中例示了用于降低抗病毒转移载体抗体应答的方案。
实施例14：具有基因治疗转基因的病毒转移载体和与合成纳米载体偶联的免疫抑 制剂的伴随施用抑制抗AAV抗体应答
实验方法
使用雄性C57BL/6小鼠(5只小鼠/组)。在第0天和/或第21天，如表3所示，向动物注射200μL的AAV8-GFP(Virovek，Hayward，CA)或AAV8-GFP+NC(如实施例12中制备)的混合物。在第0和33天收集血清，并如上所述通过ELISA分析抗AAV8抗体水平。
AAV-GFP的量：第0天致敏时为1×1010病毒基因组(vg)，第21天加强时为5×1010vg。
所使用的纳米载体包封的免疫抑制剂(雷帕霉素或Rapa)的量：在致敏(组2和4)或加强(组3和4)下，为50μg纳米载体包封的Rapa。
表3.实验组
Figure BDA0003336102440000751
Figure BDA0003336102440000761
结果
在第0天在不存在NC下注射AAV8-GFP的小鼠显示出强的抗AAV8抗体应答，所述应答在第21天第二次注射AAV8-GFP后显著提高(图10)。然而，如果在第21天将NC和AAV8-GFP伴随施用，则平均的抗体应答显着钝化。有趣的是，在这里后一组中在第14天具有抗体阳性的两只小鼠在第33天没有可检出水平的AAV8抗体(图10)。然而，在另2只小鼠中抗AAV8抗体滴度提高。相比之下，在第一次AAV8-GFP注射时(第0天)伴随施用的NC在第14天完全抑制抗AAV8抗体应答。在第21天单独第二次施用AAV8-GFP后，在第33天时，在5只小鼠中的4只中抗AAV8抗体也被抑制。在第0天和第21天伴随施用NC显示相似的趋势。因此，在第一次施用AAV时的NC处理对于阻断AAV抗体的发展是重要的。在AAV重复剂量时额外施用NC可以是潜在有益的。
结果示出了与用于降低针对病毒转移载体的抗体应答的病毒转移载体联合施用与免疫抑制剂偶联的合成纳米载体的益处。在与编码用于表达的蛋白质的病毒转移载体联合伴随施用与免疫抑制剂偶联的合成纳米载体的情况下，看到这些益处。因此，本文中例示了用于降低抗病毒转移载体抗体应答的方案。
实施例15：与免疫抑制剂偶联的合成纳米载体的治疗性施用增强病毒转移载体重 复剂量后转基因表达的维持
如果在重复施用编码用于表达的蛋白质的病毒转移载体时共注射纳米载体包封的免疫抑制剂(NC)(如实施例12中所产生的)，则两次连续静脉内(i.v.)接种编码重组绿色荧光蛋白(AAV8-GFP)(Virovek，Hayward，CA)的腺相关病毒导致体内肝细胞中较高的GFP表达。
实验方法
使用雄性C57BL/6小鼠(5只小鼠/组)。在第0天，在不存在NC下向动物注射200μLAAV8-GFP。一组动物没有接受另外的处理，而其他组在第21天接受AAV8-GFP的第二次剂量，其伴随或不伴随施用带有50μg雷帕霉素的NC(参见下表4)。在第一次注射后第33天(对于注射两次的那些组，则为第二次注射后12天)处死动物，将其肝用胶原酶4(Worthington，Lakewood，NJ)处理，过筛，并通过流式细胞术分析全细胞悬液的GFP表达。简言之，首先用胶原酶(100U)灌注组织，并在37℃孵育30分钟。除去胶原酶上清液，并用2％FBS终止。然后将组织样品切成约2毫米的方块，消化(胶原酶，400U)，重复搅拌，过滤(尼龙网)，离心(1500rpm)，将沉淀物重新悬浮于冰冷的2％FBS中。
AAV-GFP的量：在第0天为1×1010个病毒基因组(vg)，在第21天为5×1010vg(仅组2和3)。
所使用的纳米载体包封的免疫抑制剂(雷帕霉素或Rapa)的量：在第21天(组3)为50μg纳米载体包封的Rapa。
表4.实验组
Figure BDA0003336102440000771
结果
与在NC不存在下接受AAV8-GFP第二次注射的动物相比，如果在第21天在第二次注射AAV8-GFP时伴随施用NC，则观察到在AAV8-GFP处理的小鼠的肝中统计学上更高水平的GFP表达(图11)。在接受AAV8-GFP加NC的第二次注射的小鼠中观察到的GFP表达水平与在第0天仅接受AAV8-GFP单次剂量的小鼠中观察到的GFP表达水平相似。这些结果表明，可能由于抑制了可以消除表达GFP的经转导肝细胞的溶细胞性T细胞，在AAV8-GFP第二次剂量时共施用NC对于维持GFP的表达是重要的。
结果示出了与病毒转移载体联合施用与免疫抑制剂偶联的合成纳米载体对于维持载体转基因表达的益处。在与包含编码用于表达的蛋白质的转基因的病毒转移载体联合伴随施用与免疫抑制剂偶联的合成纳米载体的情况下，看到这些益处。
实施例16：与免疫抑制剂偶联的合成纳米载体的伴随施用增强转基因表达
实验方法
使用雄性C57BL/6小鼠(5只小鼠/组)。在第0天(组1-5)和/或第21天(组1-4、6)向动物注射200μL AAV-红色荧光蛋白(RFP)(Virovek，Hayward，CA)(见下表5)。在第0天(组2、4)和/或第21天(组3、4)伴随施用带有50μg雷帕霉素的NC。在第一次注射后第33天(对于注射两次的那些组，是在第二次注射后12天)处死动物，将其肝用胶原酶4(Worthington，Lakewood，NJ)处理，过筛，并通过流式细胞术分析全细胞悬液的RFP表达。简言之，首先用胶原酶(100U)灌注组织，并在37℃孵育30分钟。除去胶原酶上清液，用2％FBS终止。然后将组织样品切成约2毫米的方块，消化(胶原酶，400U)，重复搅拌，过滤(尼龙网)，离心(1500rpm)，并将沉淀物重新悬浮于冰冷的2％FBS中。
表5.实验组
Figure BDA0003336102440000781
Figure BDA0003336102440000791
结果
在不存在NC下施用一次或两次AAV8-RFP注射的动物在第33天显示相似的低水平的RFP表达(图12)。在第一次注射AAV8-RFP时伴随用NC处理的小鼠显示出具有统计学非显著性的RFP表达提高的趋势。相比之下，在第二次注射AAV8-RFP时(第21天)伴随以NC处理的小鼠显示RFP表达的统计学显著的提高。与在第0天和第21天在不存在NC下接受AAV8-RFP的对照动物相比，在第0天和第21天用NC处理的小鼠也显示RFP表达显着提高。
结果示出了与用于增强载体转基因表达的病毒转移载体联合施用与免疫抑制剂偶联的合成纳米载体的益处。在与包含编码用于表达的蛋白质的转基因的病毒转移载体联合伴随施用与免疫抑制剂偶联的合成纳米载体的情况下，看到这些益处。
实施例17：施用具有基因治疗转基因的病毒转移载体和与免疫抑制剂偶联的合成 纳米载体抑制CD8+T细胞活化
如果在两次AAV8-GFP注射中均以纳米载体封装的免疫抑制剂(NC)共注射，则表达重组绿色荧光蛋白(AAV-GFP)(Virovek，Hayward，CA)的腺相关病毒的两次连续静脉内(i.v.)接种导致体内对AAV衣壳蛋白和GFP较低的溶细胞性T细胞(cytolytic T cell，CTL)活性。
实验方法
使用雄性C57BL/6小鼠(3或6只小鼠/组)。在第0天和第17或21天(参见下表6)给动物注射200μL的AAV-GFP或AAV-GFP+NC混合物。在第一次注射后第28天(第二次注射后7天)测定在第0和21天注射的组(每组n＝3只小鼠)的抗原特异性CTL活性。简言之，用0.5μM或5μM CFSE标记来自同基因未免疫小鼠(syngeneic
Figure BDA0003336102440000802
mice)的脾细胞，分别产生CFSE低和CFSE高细胞群体。将CFSE高细胞与来自AAV衣壳的1μg/mL显性MHC I类结合肽(序列NSLANPGIA，第517-525位氨基酸)和来自GFP的显性MHC I类肽(HYLSTQSAL，aa 200-208)在37℃下孵育1小时，而CFSE低细胞单独在培养基中孵育。将对照CFSE低细胞和以肽脉冲的CFSE高靶细胞以1∶1的比例混合(总共2.0×107个细胞)并i.v.注射。在标记的细胞的注射后18小时，收获脾，处理并通过流式细胞术分析。基于未免疫小鼠中对照恢复比例(ratio ofrecovery，RR)计算比细胞毒性：(CFSE低细胞的百分比)/(CFSE高细胞的百分比)。比裂解百分比(％)＝100×[1-(来自未免疫小鼠的细胞RR/来自经免疫接种小鼠的细胞RR)或100×[1-(RR未免疫/RR经免疫接种)]。
对在第0和17天注射的组(每组n＝6只小鼠)在第一次注射后第25天(第二次注射后7天)测定抗原特异性IFN-γ产生。简言之，分离脾细胞，平板接种在具有预吸收的抗-IFN-γ抗体的孔中，并在体外用AAV衣壳或GFP肽(1μg/mL)再刺激7天。通过生物素化的抗-IFN-γ抗体和链霉亲和素-HRP使ELISpot显色，并对斑点进行计数。扣除非特异性背景。
AAV-GFP的量：第0天致敏时为1×1010个病毒基因组(vg)，第21天加强时为5×1010vg。
所使用的纳米载体包封的免疫抑制剂(雷帕霉素或Rapa)的量：在致敏和加强(组2)下，为50μg纳米载体包封的Rapa。
表6.实验组
Figure BDA0003336102440000801
结果
用NC伴随处理的动物显示较低水平的针对以AAV衣壳和GFP显性MHC I类肽的组合脉冲的靶细胞的体内CTL活性(图13)。类似地，与非NC处理组相比，用NC伴随处理的小鼠显示出抗原特异性IFN-γ产生细胞的显著降低(图14和15)。特别地，4/6小鼠在250,000个细胞/孔密度下表现出对AAV衣壳蛋白的回忆应答，而在NC处理组中没有(0/6)小鼠对这种肽应答(图14，p＜0.05)。此外，AAV8-GFP免疫组中的3/6小鼠显示对免疫显性GFP肽的应答，而NC处理组中没有小鼠(0/6)对这种肽应答(图15，p＝0.01)。
总的来说，似乎在致敏和加强时共施用AAV-GFP和NC导致抑制针对病毒衣壳和转基因蛋白的细胞毒性T细胞应答。
实施例18：施用具有基因治疗转基因的病毒转移载体和包含免疫抑制剂的合成纳 米载体
实验方法
使用雄性C57BL/6小鼠(5只小鼠/组)。在第0天，对动物i.v.注射1010vg的rAAV2/8-萤光素酶(rAAV2/8-Luc)(以类似于本文中提供的方法(例如在实施例21或22中)的方式产生)或rAAV2/8-Luc+含有100μg雷帕霉素的合成纳米载体(NC)(见下表7)。在第14天，所有动物接受静脉内注射1010vg的编码人因子IX(hFIX)的rAAV2/8(rAAV2/8-hFIX)(以类似于本文中提供的方法(例如实施例21或22中)的方式产生)。在多个时间点收集血清，并通过ELISA测定抗AAV抗体水平和hFIX蛋白水平。
图16示出了包含免疫抑制剂的合成纳米载体的施用方案和时间。在第0天(N＝5/组)，与rAAV2/8-Luc载体(1010vg)伴随i.v.施用含有100μg雷帕霉素的合成PLGA纳米载体(NC)或对照空纳米颗粒(空NP)。所有组在第14天接受注射(i.v.)编码人凝血因子IX(hFIX)的rAAV2/8载体。数据显示单次施用包含与AAV8-Luc伴随施用的免疫抑制剂的合成纳米载体可以预防或延迟抗AAV8抗体的产生(图17)。重要的是，带有rAAV2/8-萤光素酶的NC的伴随施用抑制了抗AAV8抗体形成足以使hFIX从在第14天施用的rAAV2/8-hFIX高效表达。相比之下，用空NP处理的动物产生抗AAV8抗体，其阻止hFIX从在第14天施用的rAAV2/8-hFIX载体高效表达。这些数据表明，在第一次施用AAV时伴随施用包含免疫抑制剂的合成纳米载体使得能够使相同血清型的AAV有效重复给药。
表7：处理组
Figure BDA0003336102440000821
实施例19：多次施用具有基因治疗转基因的病毒转移载体和包含免疫抑制剂的合 成纳米载体
实验设计示于图18中。使用雄性C57BL/6小鼠(5只小鼠/组)。在第0天，将含有雷帕霉素(100μg雷帕霉素)的合成纳米载体与rAAV2/8-Luc载体(以与本文中提供的方法(例如实施例21或22中)类似的方式产生)(1×1011vg)伴随i.v.施用(N＝5/组)(表8)。然后在第21天以伴随施用含雷帕霉素(100μg雷帕霉素)之合成纳米载体的rAAV2/8-hFIX(以与本文中提供的方法(例如实施例21或22中)类似的方式产生)攻击小鼠。对照组在第0和21天接受空NP，而不是NC。
表8：处理组
Figure BDA0003336102440000822
结果显示，将合成纳米载体注射与病毒转移载体的第一次(rAAV2/8-Luc)和第二次(rAAV2/8-hFIX)注射伴随施用抑制了抗AAV8抗体应答(图19，左图)并且降低了针对AAV8的中和抗体的滴度(表9)。对抗AAV8抗体的抑制使得能够获得更高水平的AAV2/8-hFIX载体拷贝数(图19，中间图)，这继而提供hFIX转基因的稳健表达(图19，右图)。注意，在用空纳米颗粒处理的对照组中，几只动物在第20天具有低水平的抗体。在第21天，这些动物中的两只具有中间水平的载体拷贝数和响应于rAAV2/8-hFIX施用的一些hFIX表达。然而，对照动物中的三只显示非常低的载体拷贝数并且没有可检出水平的FIX表达。
因此，证实了多次施用包含免疫抑制剂的合成纳米载体可以完全阻止抗原特异性抗AAV8抗体的诱导，允许在第二次注射AAV后高水平的转基因表达。
表9.中和抗AAV抗体滴度
AAV8中和抗体滴度
Figure BDA0003336102440000831
实施例20：抗原特异性
实验设计示于图20中。在第0天，将包含免疫抑制剂(100μg雷帕霉素)的合成纳米载体或对照空纳米颗粒与rAAV2/8-Luc载体(以与本文中提供的方法(例如实施例21或22中)相似的方式产生)伴随i.v.施用(1×1011vg/小鼠)。在第21天，使小鼠接受i.v.注射rAAV5-hFIX(以与本文中提供的方法(例如实施例21或22中)相似的方式产生)(1×1011vg/小鼠)或i.m.注射在完全弗氏佐剂(CFA)中乳化的人因子IX(hFIX)蛋白(表10)。
表10：处理组
Figure BDA0003336102440000841
结果表明，在第0天带有雷帕霉素的合成纳米载体和rAAV2/8载体(AAV2/8-Luc)的伴随i.v.施用对于在第21天施用的AAV5载体(AAV5-hFIX)的抗体应答没有显著影响(图21，左图)。用含有雷帕霉素的NC处理的动物与用空NP处理的小鼠相比，抗AAV5抗体应答具有短的延迟，这可能是因为在针对AAV8致敏并与AAV5交叉反应的空NP处理的小鼠中存在B细胞。然而，经NC处理的小鼠的抗AAV5抗体应答迅速地与经空NP处理组的抗AAV5抗体应答达到平行。
相比之下，在第21天接受AAV2/8-FIX的动物显示很少或没有抗AAV8抗体。这些数据表明NC处理在抑制抗AAV抗体应答上的作用对于与其共施用的AAV血清型(即AAV8)是特异性的，并且不使小鼠受到长期免疫抑制。类似地，在第0天用NC和rAAV2/8-Luc伴随处理的小鼠在第21天表现出对在完全弗氏佐剂(CFA)中的重组hFIX蛋白免疫接种的稳健应答(图21，右图)。该抗hFIX抗体应答可与在第0天用空NP而非NC处理的小鼠的应答相区分。因此，证明了伴随施用包含免疫抑制剂的合成纳米载体和AAV不导致慢性免疫抑制。
实施例21：具有基因治疗转基因的AAV5转移载体(预示)
ART-102如前所述制备(Matsushita T，等Gene Ther.1998；5：938-945)。质粒在NF-κB启动子和人生长激素聚腺苷酸化信号的控制下编码本文中提供的任一转基因。目的基因也可以在巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子的控制下。转基因盒侧翼为AAV-2反向末端重复序列，并且包装在来自AAV5的衣壳中，如Gao GP，等Proc Natl Acad Sci U SA.2002；99：11854-11859所述。载体通过组合层析和氯化铯密度梯度离心纯化，得到无空衣壳的级分。可以使用特异性引物和探针通过qPCR测定载体滴度。类似地，例如，可以产生编码萤火虫萤光素酶的rAAV5载体。
实施例22：具有基因治疗转基因的AAV2/8和AAV2/5转移载体(预示)
通过将来自AAV2-HCR-hAAT-FIX的MscIBsaI和BsaITsp45I片段与猿猴病毒40晚期polyA(SV40LpA)连接来构建scAAV主链质粒。所得质粒含有以完整5′末端分解位点(terminal resolution site，trs)和缺失的3′trs修饰的AAV2主链。对于构建LP1增强子/启动子，可以使用标准聚合酶反应(polymerase chain reaction，PCR)方法，其中扩增人载脂蛋白肝控制区(hepatic control region，HCR)的连续区段、包含5′非翻译区的人α1抗胰蛋白酶(human alpha1antitrypsin，hAAT)基因启动子和克隆的在位置4582(g至c)、4580(g至c)、4578(a至c)和4561(a至t)处修饰的经修饰的SV40小t抗原内含子(SV40内含子)到经修饰的AAV2主链中。从AAV-HCR-hAAT-hFIX中PCR扩增野生型hFIX cDNA或其他目的cDNA，其中没有3′非翻译区(untranslated region，UTR)区，并插入经修饰的SV40内含子的下游以制备scAAV-LP1-hFIX。使用在高表达的真核基因中最常见的密码子产生密码子优化的hFIX，合成为寡核苷酸，随后通过连接装配、PCR扩增和测序，然后克隆入AAVLP1主链以产生sc-AAV-LP1-hFIXco。ss和scAAV载体通过无腺病毒瞬时转染方法制备。
使用基于XX2和pAAV5-2的称为pLT-RCO3的嵌合AAV2 Rep-5Cap包装质粒产生AAV5假型载体颗粒。此外，使用包装质粒pAAV8-2制备AAV8假型载体。AAV2/5和2/8载体通过离子交换色谱法纯化。可以使用超螺旋质粒DNA作为标准，通过定量狭缝印记法(quantitativeslotblot)测定载体基因组(vg)滴度。这样的病毒载体可以包含本文中提供的任一种转基因。
实施例23：具有基因治疗转基因的AAV8转移载体(预示)
可以将小鼠基因组Alb区段(NCBI参考序列：NC_000071.6中的90474003-90476720)进行PCR扩增，并将其插入经修饰的pTRUF主链中的AAV2反向末端重复序列之间的BsrGI和SpeI限制性位点中。在接头编码序列(甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸)之后并且在NheI限制性位点之前的优化的P2A编码序列可以置入Bpu10I限制性位点。可将密码子优化的F9编码序列插入NheI位点以获得可用于构建rAAV8载体的pAB269。为了构建逆对照，可以使用合适的PCR引物扩增从BsiWI限制位点到NheI限制位点的内部区段。最终的rAAV生产质粒可以使用EndoFree质粒Megaprep试剂盒(Qiagen)产生。
rAAV8载体可以如Grimm，等，J.Virol.80，426-439(2006)中所述使用Ca3(PO4)2转染方案产生，然后由CsCl梯度纯化。可通过定量斑点印迹法滴定载体。
如Barzel，等，364，Nature，Vol.517，2015中所述，使用如上所述的载体证明了血友病B小鼠中出血因素的改善。特别地，所述载体实现了在肝细胞中整合到白蛋白等位基因中。由靶上整合(on-target integration)产生了F9，并且核糖体跳读是高效的。获得了稳定的F9血浆水平，并且经处理的F9缺陷小鼠具有正常的凝血时间。
实施例24：具有基因治疗转基因的AAV9转移载体(预示)
使用“第一代”E1/E3缺失的复制缺陷型腺病毒的腺病毒构建体可以如Kypson，等JThorac Cardiovasc Surg.1998和Akhter，等Proc Natl Acad Sci U S A.1997；94：12100-12105中所述产生。b2AR构建体(Adeno-b2AR)和转基因可以由适当的启动子驱动。可以从经感染的Epstein-Barr核抗原转染的293细胞纯化腺病毒的大规模制备物。
如Shah et al.，Circulation.2000；101：408-414中所述，经历左或右冠状动脉的经皮亚选择性导管插入术和输注腺病毒载体(例如如上所述产生的含有标志物转基因的那些)的兔子以腔室特异性方式表达转基因。此外，结论是经皮由腺病毒介导的治疗性转基因的冠状动脉内递送是可行的，并且可以增强急性全左心室功能。
实施例25：具有基因治疗转基因的慢病毒转移载体(预示)
可以制备以下：含有包装序列和插入在慢病毒LTR之间以允许靶细胞整合的转基因的慢病毒表达质粒；包装质粒，其编码pol、gag、rev和tat病毒基因并含有rev应答元件；以及编码病毒包膜基因之蛋白质的假型化质粒。可以通过前述方法转染HEK 293T细胞。在转染HEK 293T细胞后，慢病毒载体可以从含有重组慢病毒载体的细胞上清液中获得。
实施例26：具有基因治疗转基因的HIV慢病毒转移载体(预示)
根据美国公开No.20150056696的方法制备HIV慢病毒转移载体。从作为模板的人视网膜色素上皮细胞株ARPE-19(美国典型培养物保藏中心，American Type CultureCollection，ATCC)的cDNA中并使用合适的引物以PCR扩增hPEDF CDS片段。可以类似地获得本文中所述的任一种蛋白质的替选片段。通过凝胶回收获得hPEDF片段，并按照制造商的说明书通过TA克隆方法连接到pLenti6.3/V5-TOPO.RTM.载体(Invitrogen)中。可以通过测序验证所连接的hPEDF片段的序列。
实施例27：具有基因治疗转基因的SIV慢病毒转移载体(预示)
根据美国公开No.20150056696的方法制备SIV慢病毒转移载体。获得SIV基因转移载体、包装载体、rev表达载体和VSV-G表达载体，并将hPEDF片段导入基因转移载体中。可以类似地获得用于本文中所述的任一种蛋白质的替选片段，以用于引入基因转移载体中。
将来自人胎儿肾细胞的细胞系293T细胞以每个直径15cm的塑料培养皿接近1×107个细胞的细胞密度接种(第二天的细胞密度为70-80％)，并在20ml补充有10％胎牛血清的D-MEM培养基(Gibco BRL)中培养24小时。培养24小时后，将培养基替换为10ml OPTI-MEM培养基(Gibco BRL)。
对于一个培养皿，将10μg的基因转移载体、5μg的包装载体、2μg的rev表达载体和2μg的VSV-G表达载体溶解在1.5ml的OPTI-MEM培养基中，并添加40μl PLUS Reagent试剂(Invitro Co.)。将所得混合物搅拌并在室温下放置15分钟。通过用1.5ml OPTI-MEM培养基稀释60μl LIPOFECTAMINE试剂获得稀溶液；将所得混合物搅拌并在室温下放置15分钟。将所得的DNA复合物滴在上述培养皿中的细胞上。小心摇动培养皿以实现均匀混合，然后孵育。添加13ml含有20％胎牛血清的D-MEM培养基。回收上清液。
实施例28：具有基因治疗转基因的HSV转移载体(预示)
根据美国公开No.20090186003的方法制备HSV转移载体。HSV-1(F)毒株是用作原型HSV-1毒株的低传代临床分离物。构建了M002，其在鼠早期生长响应-1启动子(early-growth response-1 promoter，Egr-1)的转录控制下表达鼠白介素12(mIL-12)。或者，可以在合适的启动子控制下制备编码本文中所述的任一种蛋白质的类似构建体。获得在pBluescript-SK+(Stratagene)中的含有mIL-12的p40和p35亚基的质粒。通过用HindIII(5′端)和BamHI(3′端)消化除去p40亚基，并通过用NcoI(5′端)和EcoRI(3′端)消化除去p35亚基。使用聚合酶链反应(PCR)和合适的引物从载体pCITE-4a+(Novagen，Madison，Wis.)中扩增内部核糖体进入位点或IRES(internal ribosome entry site)序列。通过将鼠p40、鼠p35和IRES序列三方连接到pBS-SK+的HindIII和EcoRI位点中来构建质粒pBS-IL12，使得IRES序列分隔p40和p35编码序列。
可以如先前所述制备HSV穿梭质粒pRB4878(Andreansky等(1998)Gene Ther.5，121-130)。质粒4878-IL12如下构建：用XhoI和SpeI消化pBS-mIL-12以移出含有整个IL-12亚基编码区(包括IRES)的2.2kb片段，使用Klenow片段填充末端，并连接到位于pRB4878内的Egr-1启动子与乙型肝炎病毒polyA序列之间的平端KpnI位点中。通过如先前所述的同源重组构建M001(tk-)和M002(在天然基因座处修复tk)(Andreansky等(1998)Gene Ther.5，121-130)。通过在1％琼脂糖、1×TPE凝胶上电泳分离并转移至Zeta-Probe膜(Bio-Rad)上的经限制酶消化的病毒DNA的Southern印迹杂交，证实两种tk修复的病毒M002.29和M002.211。使用Gene Images AlkPhos Direct DNA标记系统(Amersham-PharmaciaBiotech，Piscataway，N.J.)将印迹与用碱性磷酸酶标记的合适的DNA探针杂交。通过酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)证明IL-12产生。
实施例29：具有CRISPR/Cas-9转基因的病毒转移载体(预示)
本文中描述的任一种病毒载体(例如在上述实施例中)，可用于产生具有基因编辑转基因的病毒转移载体。或者，例如，以下提供了用于产生具有编码Cas9(例如Cas9野生型(II型))的基因编辑转基因的病毒转移载体的方法。
可以在含有10％胎牛血清(Sigma，Steinheim，Germany)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素(Life Technologies)的DMEM培养基(Life Technologies，Darmstadt，德国)中培养HEK293T细胞。Huh7和Hep56D细胞培养基可另外含有1％非必需氨基酸(LifeTechnologies)。Jurkat细胞可以在含有10％胎牛血清(Sigma)、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和2mM L-谷氨酰胺(所有均为Life Technologies)的RPMI 1640培养基(GEHealthcare，Pasching，奥地利)中培养。所有细胞系可以在37℃和5％CO2下培养。对于大规模AAV载体生产，可将HEK293T细胞接种在10个15cm2培养皿中(每个培养皿4×106个细胞)。两天后，它们可以用(i)AAV载体质粒(编码gRNA和/或Cas9)、(ii)带有AAVrep和cap基因的AAV辅助质粒和(iii)为AAV产生提供辅助功能的腺病毒质粒进行三重转染。
AAV cap基因可以来自于合成分离物AAV-DJ(Grimm，等，J.Virol.2008，82，5887-5911)或来自新的变体AAVrh10A2。简言之，可以通过将七个氨基酸长的肽插入AAV血清型rh10的衣壳的暴露区域来产生AAVhh10A2。关于AAV生产质粒和方案的其他细节可以如
Figure BDA0003336102440000891
等，Nucleic Acids Res.2013，41，e199和Grimm，Methods 2002，28，146-157中报道的进行。为了产生小规模AAV储备，可以将每孔2×105个HEK293T细胞接种在6孔板中，并且第二天用上述质粒三重转染。三天后，将细胞刮到培养基中，通过以1500rpm离心10分钟收集，重悬于300μL 1×PBS(Life Technologies)中，并在液氮中和37℃下进行三次冻融循环。可以在13,200rpm下进行10分钟离心以除去细胞碎片，并且含有病毒转移载体颗粒的上清液可直接用于转导实验或在-20℃冷冻。
对于小规模转染和随后的T7测定，可以将2.8×104个HEK293T或1.2×104个Huh7细胞接种在96孔板中的每个孔中，并且第二天使用lipofectamine 2000(LifeTechnologies)按照制造商对于该形式的推荐进行转染(200ng DNA和0.5μLlipofectamine 2000，各自在25μL无血清培养基中)。200ng DNA可以由一体化的Cas9/gRNA载体构成，或者在分离的Cas9和gRNA构建体的情况下，每种100ng。为了获得用于Western印迹的裂解物，可以根据制造商对于该形式的建议，使用lipofectamine 2000在24孔板中转染HEK293T细胞(每种裂解物一个孔)。在转导实验中，细胞可以在96孔板中培养，并在接种后1天用10μL非纯化的AAV或纯化的载体转导。在三(转染)至五(转导)天的孵育后，根据制造商的方案，用补充有0.2μg/mL蛋白酶K(Roche，Mannheim，德国)的DirectPCR LysisReagent Cell(PeqLab，Erlangen，德国)裂解细胞。
如Senís，等Biotechnol.J.2014，9，1402-1412中所述，对如上述的那些质粒和载体可以实现CRISPR组分-Cas9和嵌合指导RNA(gRNA)的递送。此外，证明了可以分别使用肝特异性启动子或肝miRNA结合位点将Cas9表达导向或远离肝细胞。提供了这样的载体可用于体内基因改造的进一步证据。这在成年小鼠的示例性肝中完成。
实施例30：具有Cas9变体转基因的病毒转移载体(预示)
实施例30中的方法也可用于产生具有基因编辑转基因的病毒转移载体，例如编码Cas9变体的转基因，例如本文中所述的任一种Cas9变体。或者，可以使用本文中所述的任一种其他病毒载体代替来产生这种病毒转移载体。所提供的任一种Cas9变体可以由本文中提供的任一种基因编辑转基因编码。
为了制备Cas9变体，可以使用具有NLS和3×FLAG标签的人密码子优化的化脓链球菌Cas9核酸酶(Addgene质粒43861)作为野生型Cas9表达质粒。使用Cas9_Exp引物，以野生型Cas9表达质粒作为模板的PCR产物可以用Gibson装配克隆试剂盒(New EnglandBiolabs)装配以构建Cas9和FokI-dCas9变体。还可以克隆编码单个gRNA构建体(gRNA G1至G13)的表达质粒。
实施例31：具有锌指核酸酶转基因的病毒转移载体(预示)
本文中描述的任一种病毒载体(例如在上述实施例中)，可以用于产生具有编码锌指核酸酶的基因编辑转基因的病毒转移载体。或者，例如，以下提供了用于制备这种具有基因编辑转基因的病毒转移载体的方法。
TRBC和TRAC-ZFN可以如Urnov，等，Nature 435，646-651(2005)中所述进行设计和组装。所使用的识别螺旋可以如在Provasi，等，Nature Medicine，Vol.18，No.5，May 2012中所提供。编码TRBC-和TRAC-ZFN的慢病毒载体可以从来自于HIV的自失活转移构建体pCCLsin.cPPT.SFFV.eGFP.Wpre产生，其可以通过带有HIV整合酶中的D64V突变并由VSV包膜假型化的整合酶缺陷的第三代包装构建体包装。Ad5/F35腺病毒载体可以在E1-E3缺失的主链上产生。靶向TRBC或TRAC基因的ZFN可以使用2A肽序列连接，并克隆到pAdEasy-1/F35载体中，以处于在适当的启动子控制下，并且可以使用TREX 293T细胞产生用于每种构建体的Ad5/F35病毒。编码来自双向自失活转移载体pCCLsin.cPPT.ΔLNGFR.minCMV.hPGK.eGFP.Wpre和来自pCCLsin.cPPT.hPGK.eGFP.Wpre的WT1特异性TCR链和单个α21或β21 WT1特异性TCR链的慢病毒载体可以通过整合酶-感受态第三代构建体产生和包装，并由VSV包膜假型化。
使用如上述的载体，如Provasi，et al.，Nature Medicine，Vol.18，No.5，May2012中所述，已经显示ZFN促进内源性TCR β-和α-链基因的破坏。用ZFN处理的淋巴细胞缺乏CD3-TCR的表面表达，并且随着白介素-7(IL-7)和IL-15的添加而扩增。此外，在特异性针对Wilms肿瘤1(WT1)抗原的TCR的慢病毒转移后，TCR编辑的细胞以高水平表达新的TCR(也描述于Provasi，等，Nature Medicine，Vol.18，No.5，May 2012)。
实施例32：具有锌指核酸酶转基因的病毒转移载体(预示)
靶向hF9mut基因座的锌指核酸酶(ZFN)和F9靶向载体可以如Li，等，Nature.2011；475(7355)：217-221中所述制备。这样的载体已经显示成功地用于在血友病B(hemophiliaB，HB)的新生小鼠模型中的体内基因靶向中。编码靶向人F9基因的ZFN对的AAV载体和具有侧翼校正cDNA盒的同源臂的基因靶向载体的全身递送导致这样的小鼠的肝中对改造到小鼠基因组中的缺陷hF9基因的校正。此外，实现了足以使凝固时间正常化的稳定水平的人因子IX表达。
实施例33：具有大范围核酸酶转基因的病毒转移载体(预示)
本文描述的任一种病毒载体(例如在上述实施例中)可用于产生具有编码大范围核酸酶的基因编辑转基因的病毒转移载体。或者，例如，以下描述了用于产生具有基因编辑转基因的病毒转移载体的一般方法。大范围核酸酶可以是美国公开No.20110033935和20130224863中提供的任一种大范围核酸酶。
在一些实施方案中，将特定的病毒基因灭活以防止病毒的繁殖。优选地，在一些实施方案中，改变病毒以使得其仅能够在靶细胞内递送和维持，但不保留在靶细胞或组织内复制的能力。可以将编码大范围核酸酶的一个或更多个DNA序列引入改变的病毒基因组，以产生作为载体的病毒基因组。在一些实施方案中，病毒载体是逆转录病毒载体，例如但不限于MFG或pLJ载体。MFG载体是简化的莫洛尼鼠白血病病毒载体(Moloney murine leukemiavirus vector，MoMLV)，其中缺失编码pol和env蛋白的DNA序列以使其复制缺陷。Pll逆转录病毒载体也是MoMLV的一种形式(见例如Korman等(1987)，Proc.Nat′l Acad.Sci.，84：2150-2154)。在另一些实施方案中，重组腺病毒或腺相关病毒可用于产生病毒载体。
实施例34：具有外显子跳读转基因的病毒转移载体(预示)
本文中描述的任一种病毒载体(例如在上述实施例中)可以用于产生具有外显子跳读转基因的病毒转移载体。或者，例如，以下提供了用于产生具有特异性外显子跳读转基因的病毒转移载体的方法。
三质粒转染方案可以与pAAV(U7smOPT-SD23/BP22)和pAAV(U7smOPT-scr)质粒一起用于产生单链AAV1-U7ex235和AAV1-U7scr；并将scAAV-U7ex23质粒用于产生自身互补性scAAV9-U7ex239。pAAV(U7smOPT-scr)质粒可以含有不与任何鼠cDNA相匹配的非特异性序列GGTGTATTGCATGATATGT。
根据上述制备的病毒转移载体的使用，如Le Hir等，Molecular Therapy vol.21no.8，1551-1558Aug.2013中所述，表明这种载体可用于恢复肌养蛋白。然而，所述恢复在3个月至12个月之间显著降低，这与病毒基因组损失相关。因此，本文中提供的组合物和方法可以帮助维持这种治疗的效果。
实施例35：具有外显子跳读转基因的病毒转移载体(预示)
克隆U1#23可以利用寡核苷酸mU1anti5(5’-CGAAATTTCAGGTAAGCCGAGGTTATGAGATCTTGGGCCTCTGC-3’)和mU1anti3(5’-GAACTTTGCAGAGCCTCAAAATTAAATAGGGCAGGGGAGATACCATGATC-3’)，通过人U1 snRNA基因的反向PCR获得。含有反义链的插入物可以从具有寡核苷酸U1cas-up-NheI(5’-CTAGCTAGCGGTAAGGACCAGCTTCTTTG-3’)和U1cas-down-NheI(5’-CTAGCTAGCGGTTAGCGTACAGTCTAC-3’)的相应质粒中扩增。所得片段可以被NheI消化，并以pAAV2.1-CMV-EGFP质粒的正向方向克隆。
AAV-U1#23载体可以通过293细胞的三重转染产生，通过CsCl2超速离心纯化并通过使用基于实时PCR和斑点印迹测定进行滴定。可以通过在293细胞上连续稀释来评估绿色形成单位的数量。AAV载体可以通过AAV TIGEM载体核心产生。
六周龄的mdx小鼠可以通过尾静脉施用3-4×1012个AAV载体的基因组拷贝。在病毒施用后6和12周，可以处死动物，并且可以收获来自不同区域的肌肉。EGFP分析和解剖可以在荧光立体显微镜(Leica MZ16FA)下进行。
根据上述制备的病毒转移载体的使用，如Denti et al.，3758-3763，PNAS，March7，2006，vol.103，no.10中所述，通过尾静脉注射导致mdx小鼠中的持续外显子跳读。载体的全身递送导致有效的全身范围定殖，体内功能性质的显著恢复，以及降低肌酸激酶血清水平。结果表明肌肉萎缩降低。
实施例36：带有外显子跳读转基因的病毒转移载体(预示)
可以改造特异性针对某些外显子的不同U7snRNA构建体，例如来自U7smOPT-SD23/BP22(经修饰的鼠U7snRNA基因)。靶向某些外显子的反义序列可以被靶向肌养蛋白mRNA的外显子的反义序列代替，其作为反义寡核苷酸诱导外显子跳读。可以将序列插入U7snRNA构建体中。然后可将所得U7snRNA片段引入慢病毒载体构建体用于进一步慢病毒生产，或引入AAV载体构建体用于AAV生产。
慢病毒载体可以基于pRRLcPPT-hPGK-eGFP-WPRE构建体，其中去除了hPGK-GFP盒并用U7snRNA构建体代替。如前所述，可以通过将包装构建体pCMVΔR8.74(产生囊泡性口病病毒-G包膜的质粒(pMD.G))和载体本身转染到293T细胞中产生慢病毒载体。可以通过在12孔板中用系列稀释的载体制备物转导NIH3T3细胞来测定病毒滴度(感染性颗粒)。72小时后，可以使用基因组DNA纯化试剂盒(Qiagen，Crawley，英国)提取来自经转导细胞的基因组DNA。感染性颗粒滴度(感染性颗粒/ml)可以通过其他地方描述的定量实时PCR来测定。
对于随后的AAV载体产生，可以在pSMD2 AAV2载体的XbaI位点引入不同的U7snRNA片段。AAV2/1假型载体可以通过在293细胞中共转染pAAV2-U7snRNA、编码腺病毒辅助功能的pXX6和含有AAV2 rep和AAV1 cap基因的pAAV1pITRCO2来制备。载体颗粒可以在转染后48小时从获得的细胞裂解物的碘克沙醇(Iodixanol)梯度上纯化，并且滴度可以通过定量实时PCR测量。
如描述于Goyenvalle，等The American Society of Gene&Cell Therapy，Vol.20No.6，1212-1221 June 2012中的，病毒转移载体(例如用上述方法产生并且编码U7小核RNA的那些)可以在体外和体内诱导高效的外显子跳读。
实施例37：具有外显子跳读转基因的病毒转移载体(预示)
可以根据上述美国公开No.20090186003和实施例28的方法制备HSV转移载体，除了可以改变方法以使转基因代替为外显子跳读转基因。外显子跳读转基因可以是本文中所述或本领域已知的任一种这样的转基因。
实施例38：具有外显子跳读转基因的病毒转移载体(预示)
根据上述美国公开No.20150056696和实施例26的方法制备HIV慢病毒转移载体，除了可以改变方法以使转基因代替为外显子跳读转基因。外显子跳读转基因可以是本文所述或本领域已知的任一种这样的转基因。
实施例39：具有基因表达调节转基因的病毒转移载体(预示)
本文中描述的任一种病毒载体(例如在上述实施例中)可以用于产生具有基因表达调节转基因的病毒转移载体。或者，例如，以下提供了用于产生具有特异性基因表达调节转基因的病毒转移载体的方法。
根据Brown等，Nat Med.2006 May；12(5)：585-91中所述的方法产生病毒转移载体。简言之，使用RNA的逆转录构建质粒，定量PCR分析以定量mRNA的浓度和GAPDH表达以用于标准化。VSV假型第三代慢病毒载体(LV)通过瞬时四质粒共转染到293T细胞中产生并通过超速离心纯化。载体颗粒可以通过HIV-1 gag p24抗原免疫捕获来测量。
如描述于Brown等，Nat Med.2006 May；12(5)：585-91中的，示出这样的编码内源miRNA的靶序列的慢病毒载体导致产生可在不同组织中使基因表达隔离的miRNA。提供了miRNA调节的证据，并且示出这样的载体可以用于治疗应用。
实施例40：具有基因表达调节转基因的病毒转移载体(预示)
为了产生编码针对基因(例如，亨廷顿基因；AAV2/1-miRNA-Htt)的基于miRNA的发夹的AAV2/1血清型载体，将特定基因(例如人HTT)的cDNA克隆到含有AAV2反向末端重复序列(ITR)和1.6-kb巨细胞病毒增强子/鸡b-肌动蛋白(chicken b-actin，CBA)启动子的穿梭质粒中。还可以开发对照载体并且其含有空载体主链(例如AAV2/1-Null)或在相同启动子的控制下表达报道分子例如增强的绿色荧光蛋白(AAV2/1-eGFP)。病毒转移载体可以通过细胞系(例如人293细胞)的三重质粒共转染产生，然后可以如先前在Stanek等，Human GeneTherapy.2014；25：461-474中所述对重组病毒粒子进行柱纯化。然后可以使用定量PCR测定得到的AAV2/1-miRNA-Htt的滴度。
如Stanek等，Human Gene Therapy.2014；25：461-474中所述，使用这种病毒转移载体产生的数据证明AAV介导的RNAi可以有效地转导纹状体中的细胞，并且可以部分降低该区域中野生型和突变型Htt的水平。
实施例41：具有基因表达调节转基因的病毒转移载体(预示)
CD81基因可以通过逆转录扩增。cDNA可以用合适的引物进行PCR扩增。正向引物可以含有BamHI(Biolabs，Allschwill，瑞士)限制性位点，随后是5′CD81 cDNA特异性序列；反向引物可以包含3′CD81 cDNA特异性序列、6 His-标签、终止密码子和Xho I(Biolabs)限制性位点。可以将PCR产物消化并克隆到pTK431中的相似位点。pTK431是一种自我失活的HIV-1载体，其含有完整的tet-off诱导系统、中央多嘌呤链(central polypurine tract，cPPT)和土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件。质粒可以经CsCl2纯化。
靶标可以基于Hannon的设计标准(katahdin.cshl.org：9331/RNAi/html/rnai.html)根据CD81 mRNA序列设计。使用pSilencer 1.0-U6(Ambion)作为模板和含有限制性位点的U6启动子特异性正向引物，可以通过PCR将每个shRNA靶标添加至小鼠U6启动子。可以将PCR产物消化，克隆到pTK431中的类似位点中并测序以验证各构建体的完整性。
可以将载体质粒与包装构建体质粒pΔNRF和包膜质粒pMDG-VSVG一起共转染到HEK293T细胞中以产生病毒颗粒。可以通过p24抗原测量(KPL，Lausanne，瑞士)测定病毒滴度。
如Bahi，et al.J.Neurochem.(2005)92，1243-1255中所示，表达针对CD81的短发夹RNA(shRNA)的慢病毒(Lenti-CD81-shRNA)在体外感染HEK293T细胞后导致基因沉默。此外，体内递送Lenti-CD81-shRNA导致内源CD81的沉默。
实施例42：具有基因表达调节转基因的病毒转移载体(预示)
本文中描述的任一种病毒载体(例如在上述实施例中)可以用于产生具有编码RNAi剂的基因表达调节转基因的病毒转移载体。下文描述了可由本文中提供的基因表达调节转基因编码的RNAi剂的实例。
表达构建体可以包含驱动三种或更多种单独shRNA种类表达的启动子。小核RNA和转移RNA的合成可以由pol III特异性启动子控制下的RNA聚合酶III(pol III)指导。由于由这些调节元件指导的转录物的相对高丰度，pol III启动子(包括来自U6和H1基因的启动子)可用于驱动1-x RNAi的表达(见例如Domitrovich和Kunkel.Nucl.Acids Res.31(9)：2344-52(2003)；Boden，等Nucl.Acids Res.31(17)：5033-38(2003a)；和Kawasaki，等Nucleic Acids Res.31(2)：700-7(2003))。使用U6启动子的RNAi表达构建体可以包含靶向HCV基因组的三个不同区域的三种RNAi剂。可由基因表达调节转基因编码的RNAi剂的其他实例包括本文中所述的任一种RNAi剂。
实施例43：具有基因表达调节转基因的病毒转移载体(预示)
本文中描述的任一种病毒载体(例如在上述实施例中)可用于产生具有编码Serpina1 RNAi剂(例如美国专利公开号20140350071中描述的这种试剂之一)的基因表达调节转基因的病毒转移载体。具有这种转基因的病毒转移载体可以按照本文中提供的或本领域已知的类似方法产生。
例如，可以使用腺相关病毒(AAV)载体(Walsh等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204：289-300(1993)；U.S.Pat.No.5,436,146)。iRNA可以表达为来自具有例如U6或H1 RNA启动子或巨细胞病毒(CMV)启动子的重组AAV载体的两个分开的互补单链RNA分子。用于表达作为本发明特征的dsRNA的合适的AAV载体、用于构建重组AV载体的方法和用于将载体递送到靶细胞中的方法描述于Samulski R等(1987)，J.Virol.61：3096-3101；Fisher K J等(1996)，J.Virol，70：520-532；Samulski R等(1989)，J.Virol.63：3822-3826；美国专利No.5,252,479；美国专利No.5,139,941；国际专利申请WO 94/13788；以及国际专利申请WO93/24641中，这些信息的全部公开内容通过引用并入本文。
实施例44：在对象中建立减弱的抗病毒转移载体应答(预示)
任一种本文中提供的病毒转移载体(例如任何一个实施例)均为伴随施用，例如与本文中提供的靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂中的任一种同时i.v.、i.m.、s.c.或i.p.施用，例如在任何一个实施例中，也分别i.v.、i.m.、s.c.或i.p.施用。根据在对象中建立抗病毒转移载体减弱应答的方案，包括至少病毒转移载体和靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂的频率和剂量来进行施用。对象可以是任一种本文中所述的对象中，例如不具有对病毒转移载体的预先存在的免疫力的对象，或者期望重复施用病毒转移载体的对象。
在一些实施方案中，当减弱的抗病毒转移载体应答是针对病毒转移载体的T细胞应答时，在伴随施用靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和病毒转移载体之前，将不含靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂的病毒转移载体施用于对象。在这样的一些实施方案中，在伴随施用和在其之前施用病毒转移载体之后，向对象施用一个或更多个重复剂量的病毒转移载体。
在一些实施方案中，当减弱的抗病毒转移载体应答是针对病毒转移载体的B细胞应答时，在伴随施用病毒转移载体和靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂之前，不向对象施用病毒转移载体。在这样的一些实施方案中，向对象施用一个或更多个重复剂量的病毒转移载体，并且每个重复剂量与靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂伴随施用。
在另一些实施方案中，当减弱的抗病毒转移载体应答是抗病毒转移载体抗体应答时，在伴随施用病毒转移载体和靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂之前，不向对象施用病毒转移载体。在这样的一些实施方案中，向对象施用一个或更多个重复剂量的病毒转移载体，并且每个重复剂量与靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂伴随施用。
用于测定抗体水平的方法可以使用ELISA测定。抗原特异性B细胞或T细胞回忆应答的测定包括但不限于ELISpot、细胞内细胞因子染色、细胞增殖和细胞因子产生测定。
在任一个实施方案中，在伴随施用病毒转移载体和靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂之后评价减弱的抗病毒转移载体应答。
在任一个实施方案中，可以确定用于建立减弱的抗病毒转移载体应答的方案。在这样的一个实施方案中，在另一个对象(例如测试对象)中确定所述方案。如此确定的方案可用于治疗需要用病毒转移载体治疗的其他对象。
实施例45：在施用病毒转移载体之前确定对象中预先存在的免疫力水平(预示)
样品(例如血液样品)可以从需要用本文中提供的病毒转移载体治疗的对象中获得，所述病毒转移载体例如本文中提供的(如在任一实施例中)的病毒转移载体中的任一种病毒转移载体。
使用来自对象的样品，可以测定抗体(例如中和抗体)的水平或免疫细胞(例如T细胞或B细胞)的抗原回忆应答。用于测定抗体水平的方法可以使用ELISA测定。抗原特异性B细胞或T细胞回忆应答的测定包括但不限于ELISpot、细胞内细胞因子染色、细胞增殖和细胞因子产生测定。可以通过使样品与病毒转移载体或其抗原接触来评估回忆应答。或者，还可以通过在向对象施用病毒转移载体或其抗原之后从对象取得的样品，然后测定所产生的抗体水平或B细胞或T细胞回忆应答，从而来评估回忆应答。
在一些实施方案中，其中通过测量对象中抗病毒转移载体抗体的水平(或B细胞应答)确定对象不具有针对病毒转移载体的预先存在的免疫力，则向对象i.v.、i.m.、s.c.或i.p.施用本文中提供的任一种病毒转移载体，如在任一实施例中，与本文中提供的靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂中的任一种伴随地(例如同时地)施用，例如在任何一个实施例中。靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂通过相同的途径施用。
在另一些实施方案中，其中通过对象中针对病毒转移载体的T细胞应答的水平确定对象不具有针对病毒转移载体的预先存在的免疫力，则在施用于对象病毒转移载体的剂量而未伴随施用靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂之后，将靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和病毒转移载体伴随地(例如同时地)i.v.、i.m.、s.c.或i.p.施用于对象。
在任一个实施方案中，向对象施用一个或更多个重复剂量的病毒转移载体。这些重复剂量可以与靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂伴随施用。
实施例46：病毒转移载体在对象中的提高的转基因表达(预示)
例如在任一实施例中，根据提高转基因表达的频率和剂量(转基因由病毒转移载体递送)，将本文中提供的任一种病毒转移载体与本文中提供的任一种靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂伴随地(例如同时)i.v.、i.m.、s.c.或i.p.施用，例如在任一实施例中。这可以通过测量在对象中的多种目的组织或系统中的转基因蛋白浓度来确定。转基因表达是否提高可以根据例如上述实施例中所述的方法来确定。根据病毒转移载体和靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂的频率和剂量进行施用，以使对象中的转基因表达提高。对象可以是任一种本文中所述的对象，例如不具有对病毒转移载体的预先存在的免疫力的对象，或者期望重复施用病毒转移载体的对象。
在任一个实施方案中，在另一个对象(例如测试对象)中测定实现转基因表达提高的频率和剂量。这也可以通过测量其他对象中的多种目的组织或系统中的转基因蛋白浓度来确定，例如使用上述方法。如果在另一个对象中，通过测量的转基因蛋白浓度所确定的频率和剂量实现了提高的转基因表达的，则根据所述频率和剂量伴随地(例如同时)施用病毒转移载体和靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂可用于治疗需要用病毒转移载体治疗的其他对象。
实施例47：以低剂量重复、伴随施用(预示)
如本文中提供的，可以评价对象对本文中提供的任一种病毒转移载体(例如任一个实施例的病毒转移载体)的预先存在的免疫力水平。或者，临床医生可以评价对象并确定如果施用病毒转移载体，如果病毒转移载体重复施用于对象，则对象是否预期会发生抗病毒转移载体免疫应答。可以基于病毒转移载体将产生这样的结果的可能性做出该确定，并且这可以基于其他对象(例如测试对象)中的这样的结果、关于用于产生病毒转移载体的病毒的信息、关于对象的信息等。一般来说，如果预期抗病毒转移载体免疫应答是可能的结果，则临床医生根据所预期的结果选择病毒转移载体的剂量。然而，根据发明人的发现，临床医生现在可以选择和使用比为对象本来选择的更低剂量的病毒转移载体。较低剂量的益处可包括与病毒转移载体给药相关的毒性降低，以及其他脱靶效应的降低。
因此，任一种本文中提供的对象可以重复、伴随(例如同时)施用本文中提供的任一种病毒转移载体和本文中提供的任一种靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂，其中如果对象预期由于重复剂量的病毒转移载体而发生抗病毒转移载体免疫应答，则将病毒转移载体的剂量选择为小于本来为对象选择的病毒转移载体的剂量。重复、伴随施用的病毒转移载体的每个剂量均可以小于本将被选择的剂量。
本申请还涉及以下实施方案：
1.包括以下的方法：
通过向对象伴随施用靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和基因表达调节病毒转移载体来在所述对象中建立减弱的抗基因表达调节病毒转移载体应答，
其中所述对象不具有针对所述基因表达调节病毒转移载体的预先存在的免疫力。
2.实施方案1所述的方法，其中所述减弱的抗病毒转移载体应答是针对所述病毒转移载体的T细胞应答，并且所述方法还包括在所述伴随施用所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和病毒转移载体之前，向所述对象施用所述病毒转移载体而不施用所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂。
3.实施方案2所述的方法，其中所述伴随施用所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和病毒转移载体是重复地伴随施用所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和病毒转移载体。
4.包括以下的方法：
通过向对象伴随施用靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和基因表达调节病毒转移载体来在所述对象中建立减弱的抗基因表达调节病毒转移载体应答，以及
向所述对象施用一个或更多个重复剂量的所述基因表达调节病毒转移载体。
5.实施方案4所述的方法，其中所述减弱的抗病毒转移载体应答是针对所述病毒转移载体的T细胞应答，并且所述方法还包括在所述伴随施用所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和病毒转移载体以及所述一个或更多个重复剂量的所述病毒转移载体之前，向所述对象施用所述病毒转移载体而不施用所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂。
6.实施方案1至5中任一项所述的方法，其中所述方法还包括单独地或与病毒转移载体组合地提供或获得靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂。
7.包括以下的方法：
通过首先向对象施用基因表达调节病毒转移载体而不施用靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂来减弱抗基因表达调节病毒转移载体应答，其中所述抗基因表达调节病毒转移载体应答是T细胞应答，以及
随后向所述对象伴随施用所述基因表达调节病毒转移载体和靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂。
8.实施方案7所述的方法，其还包括在向所述对象伴随施用所述病毒转移载体和所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂之后，向所述对象施用一个或更多个重复剂量的所述病毒转移载体。
9.包括以下的方法：
在向对象施用基因表达调节病毒转移载体之前，确定所述对象中针对所述基因表达调节病毒转移载体的预先存在的免疫力水平，
向所述对象伴随施用靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和基因表达调节病毒转移载体，以及
向所述对象施用所述基因表达调节病毒转移载体的剂量。
10.实施方案9所述的方法，其中所述确定包括在向所述对象施用所述病毒转移载体之前测量所述对象中抗病毒转移载体抗体的水平。
11.实施方案10所述的方法，其中所述确定包括在向所述对象施用所述病毒转移载体之前测量所述对象中针对所述病毒转移载体的T细胞应答水平。
12.实施方案9至11中任一项所述的方法，其中所述方法还包括一个或更多个重复剂量的所述病毒转移载体。
13.实施方案9至12中任一项所述的方法，其中所述预先存在的免疫力水平针对的是所述病毒转移载体的病毒抗原。
14.实施方案9至12中任一项所述的方法，其中所述预先存在的免疫力水平针对的是所述病毒转移载体的蛋白质转基因表达产物的抗原。
15.包括以下的方法：
通过向对象重复地伴随施用靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和基因表达调节病毒转移载体来提高所述对象中基因表达调节病毒转移载体的转基因表达。
16.实施方案15所述的方法，其中所述方法还包括确定提高对象中所述转基因表达的重复地伴随施用所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和病毒转移载体的频率和剂量。
17.包括以下的方法：
向对象重复地伴随施用靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和基因表达调节病毒转移载体，以及
选择所述基因表达调节病毒转移载体的一个或更多个剂量以使其小于当所述对象预期由于重复施用所述基因表达调节病毒转移载体而发生抗基因表达调节病毒转移载体免疫应答时会为所述对象选择的基因表达调节病毒转移载体剂量。
18.实施方案3至17中任一项所述的方法，其中所述重复剂量中所述病毒转移载体的量至少等于先前剂量中所述病毒转移载体的量。
19.实施方案3至17中任一项所述的方法，其中所述重复剂量中所述病毒转移载体的量小于先前剂量中所述病毒转移载体的量。
20.实施方案3至19中任一项所述的方法，其中所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂还与所述一个或更多个重复剂量的所述病毒转移载体伴随施用于所述对象。
21.实施方案3至19中任一项所述的方法，其中所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂不还与所述一个或更多个重复剂量的所述病毒转移载体中的至少一个伴随施用于所述对象。
22.实施方案4至21中任一项所述的方法，其中所述对象不具有针对所述病毒转移载体的预先存在的免疫力。
23.实施方案1至22中任一项所述的方法，其中所述伴随施用是同时施用。
24.前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述方法还包括确定所述对象中针对所述病毒转移载体的预先存在的免疫力水平。
25.包括以下的方法：
通过向实体传达伴随施用靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和基因表达调节病毒转移载体导致对象中减弱的抗基因表达调节病毒转移载体应答，来诱导所述实体购买或获得单独或与所述基因表达调节病毒转移载体组合的所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂。
26.包括以下的方法：
通过向实体传达通过向对象伴随施用靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和基因表达调节病毒转移载体进行有效的重复基因表达调节病毒转移载体给药是可能的，来诱导所述实体购买或获得单独或与所述基因表达调节病毒转移载体组合的所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂。
27.实施方案25或26所述的方法，其中所述对象不具有针对所述病毒转移载体的预先存在的免疫力。
28.实施方案25至27中任一项所述的方法，其中所述伴随施用是同时施用。
29.实施方案25至28中任一项所述的方法，其中所述传达还包括用于实施本文中所述的任一种方法的指导。
30.实施方案25至29中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂或病毒转移载体或二者分发至所述实体。
31.包括以下的方法：
确定伴随施用靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和基因表达调节病毒转移载体以在对象中产生减弱的抗基因表达调节病毒转移载体应答的频率和剂量，以及
根据所确定的频率和剂量指导向对象伴随施用所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和基因表达调节病毒转移载体。
32.包括以下的方法：
确定与一个或更多个重复剂量的基因表达调节病毒转移载体组合地伴随施用靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和基因表达调节病毒转移载体以在对象中产生减弱的抗基因表达调节病毒转移载体应答的频率和剂量，以及
根据所确定的频率和剂量指导向对象伴随施用所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和基因表达调节病毒转移载体，以及施用所述一个或更多个重复剂量的基因表达调节病毒转移载体。
33.实施方案32所述的方法，其中在至少一个所述重复剂量中所述病毒转移载体的量至少等于先前剂量中所述病毒转移载体的量。
34.实施方案32所述的方法，其中在至少一个所述重复剂量中所述病毒转移载体的量小于先前剂量中所述病毒转移载体的量。
35.实施方案32至34中任一项所述的方法，其中所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂还与所述一个或更多个重复剂量的所述病毒转移载体伴随施用于所述对象。
36.实施方案32至34中任一项所述的方法，其中所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂不还与所述一个或更多个重复剂量的所述病毒转移载体中的至少一个伴随施用于所述对象。
37.实施方案32至36中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在向对象伴随施用所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和病毒转移载体以及施用所述一个或更多个重复剂量的所述病毒转移载体之前，指导向所述对象施用所述病毒转移载体的剂量。
38.实施方案31至37中任一项所述的方法，其中所述对象不具有针对所述病毒转移载体的预先存在的免疫力。
39.实施方案31至38中任一项所述的方法，其中所述伴随施用是同时施用。
40.前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述对象是先前未曾向其施用所述病毒转移载体的对象。
41.前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述病毒转移载体是逆转录病毒转移载体、腺病毒转移载体、慢病毒转移载体或腺相关病毒转移载体。
42.实施方案41所述的方法，其中所述病毒转移载体是腺病毒转移载体，并且所述腺病毒转移载体是亚组A、亚组B、亚组C、亚组D、亚组E或亚组F腺病毒转移载体。
43.实施方案41所述的方法，其中所述病毒转移载体是慢病毒转移载体，并且所述慢病毒转移载体是HIV、SIV、FIV、EIAV或绵羊慢病毒载体。
44.实施方案41所述的方法，其中所述病毒转移载体是腺相关病毒转移载体，并且所述腺相关病毒转移载体是AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11腺相关病毒转移载体。
45.实施方案1至40中任一项所述的方法，其中所述病毒转移载体是嵌合病毒转移载体。
46.实施方案45所述的方法，其中所述嵌合病毒转移载体是AAV-腺病毒转移载体。
47.前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述基因表达调节转基因编码DNA结合蛋白或治疗性RNA。
48.实施方案47所述的方法，其中所述DNA结合蛋白是人工转录因子。
49.实施方案47所述的方法，其中所述治疗性RNA是mRNA翻译抑制剂、RNA干扰(RNAi)剂、催化活性RNA分子(核酶)、转移RNA(tRNA)或结合蛋白质或其他分子配体的RNA(适配体)。
50.实施方案49所述的方法，其中所述RNAi剂是双链RNA、单链RNA、微RNA、短干扰RNA、短发夹RNA或三链体形成寡核苷酸。
51.前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂包含红细胞结合治疗剂。
52.实施方案51所述的方法，其中所述红细胞结合治疗剂包含ERY1、ERY19、ERY59、ERY64、ERY123、ERY141和ERY162。
53.实施方案51或52所述的方法，其中所述红细胞结合治疗剂还包含病毒转移载体抗原。
54.实施方案53所述的方法，其中所述病毒转移载体抗原是病毒抗原。
55.实施方案1至50中任一项所述的方法，其中所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂包含带负电荷的颗粒。
56.实施方案55所述的方法，其中所述带负电荷的颗粒是聚苯乙烯、PLGA或金刚石颗粒。
57.实施方案55或56所述的方法，其中所述颗粒的ζ电位为负。
58.实施方案57所述的方法，其中所述颗粒的ζ电位低于-50mV。
59.实施方案57所述的方法，其中所述颗粒的ζ电位低于-100mV。
60.实施方案1至50中任一项所述的方法，其中所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂包含凋亡小体模拟物和一种或更多种病毒转移载体抗原。
61.实施方案60所述的方法，其中所述凋亡小体模拟物是包含所述一种或更多种病毒转移载体抗原和任选的一种或更多种凋亡信号分子的颗粒。
62.实施方案61所述的方法，其中所述一种或更多种病毒转移载体抗原包含一种或更多种病毒抗原。
63.实施方案61或62所述的方法，其中所述颗粒包含聚乙醇酸聚合物(PGA)、聚乳酸聚合物(PLA)、聚癸二酸聚合物(PSA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚乳酸-癸二酸共聚物(PLSA)、聚乙醇酸-癸二酸共聚物(PGSA)、聚丙交酯-乙交酯共聚物(PLG)或聚乙二醇(PEG)。
64.实施方案55至59和61至63中任一项所述的方法，其中所述颗粒的平均直径为0.1至5μm、0.1至4μm、0.1至3μm、0.1至2μm、0.1至1μm或0.1至500nm。
65.实施方案1至50中任一项所述的方法，其中所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂包含含有免疫抑制剂的合成纳米载体。
66.实施方案65所述的方法，其中所述合成纳米载体还包含病毒转移载体抗原。
67.实施方案66所述的方法，其中所述病毒转移载体抗原是病毒抗原。
68.实施方案65至67中任一项所述的方法，其中所述免疫抑制剂和/或所述抗原如果存在的话则包封在所述合成纳米载体中。
69.实施方案65至68中任一项所述的方法，其中所述合成纳米载体包含脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、金属纳米颗粒、基于表面活性剂的乳液、树枝状聚合物、巴基球、纳米线、病毒样颗粒或者肽或蛋白质颗粒。
70.实施方案69所述的方法，其中所述合成纳米载体包含聚合物纳米颗粒。
71.实施方案70所述的方法，其中所述聚合物纳米颗粒包含聚合物，其为非甲氧基封端的普朗尼克聚合物。
72.实施方案70或71所述的方法，其中所述聚合物纳米颗粒包含聚酯、与聚醚连接的聚酯、聚氨基酸、聚碳酸酯、聚缩醛、聚缩酮、多糖、聚乙基
Figure BDA0003336102440001071
唑啉或聚乙烯亚胺。
73.实施方案72所述的方法，其中所述聚酯包含聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚乳酸-乙醇酸共聚物或聚己内酯。
74.实施方案72或73所述的方法，其中所述聚合物纳米颗粒包含聚酯和与聚醚连接的聚酯。
75.实施方案72至74中任一项所述的方法，其中所述聚醚包含聚乙二醇或聚丙二醇。
76.实施方案65至75中任一项所述的方法，其中使用所述合成纳米载体群体的动态光散射获得的粒度分布的均值为大于110nm的直径。
77.实施方案76所述的方法，其中所述直径大于150nm。
78.实施方案77所述的方法，其中所述直径大于200nm。
79.实施方案78所述的方法，其中所述直径大于250nm。
80.实施方案76至79中任一项所述的方法，其中所述直径小于5μm。
81.实施方案80所述的方法，其中所述直径小于4μm。
82.实施方案81所述的方法，其中所述直径小于3μm。
83.实施方案82所述的方法，其中所述直径小于2μm。
84.实施方案83所述的方法，其中所述直径小于1μm。
85.实施方案84所述的方法，其中所述直径小于500nm。
86.实施方案85所述的方法，其中所述直径小于450nm。
87.实施方案86所述的方法，其中所述直径小于400nm。
88.实施方案87所述的方法，其中所述直径小于350nm。
89.实施方案88所述的方法，其中所述直径小于300nm。
90.实施方案65至89中任一项所述的方法，其中在所述合成纳米载体中所包含的免疫抑制剂的载荷在所述合成纳米载体中平均为0.1％至50％(重量/重量)。
91.实施方案90所述的方法，其中所述载荷为0.1％至25％。
92.实施方案91所述的方法，其中所述载荷为1％至25％。
93.实施方案92所述的方法，其中所述载荷为2％至25％。
94.实施方案65至93中任一项所述的方法，其中所述免疫抑制剂为NF-kB途径的抑制剂。
95.实施方案65至93中任一项所述的方法，其中所述免疫抑制剂为雷帕霉素。
96.实施方案65至95中任一项所述的方法，其中所述合成纳米载体群体的纵横比大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7或1∶10。
序列表
<110> 西莱克塔生物科技公司
<120> 用于减弱基因表达调节抗病毒转移载体免疫应答的方法和组合物
<130> S1681.70077WO00
<140> PCT/US2015/048770
<141> 2015-09-07
<150> US 62/101,841
<151> 2015-01-09
<150> US 62/101,861
<151> 2015-01-09
<150> US 62/101,872
<151> 2015-01-09
<150> US 62/101,882
<151> 2015-01-09
<150> US 62/051,255
<151> 2014-09-16
<150> US 62/051,258
<151> 2014-09-16
<150> US 62/051,263
<151> 2014-09-16
<150> US 62/051,267
<151> 2014-09-16
<150> US 62/047,034
<151> 2014-09-07
<150> US 62/047,044
<151> 2014-09-07
<150> US 62/047,054
<151> 2014-09-07
<150> US 62/047,051
<151> 2014-09-07
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 1
Asn Ser Leu Ala Asn Pro Gly Ile Ala
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 2
His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
1 5
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 3
ggtgtattgc atgatatgt 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 4
cgaaatttca ggtaagccga ggttatgaga tcttgggcct ctgc 44
<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 5
gaactttgca gagcctcaaa attaaatagg gcaggggaga taccatgatc 50
<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 6
ctagctagcg gtaaggacca gcttctttg 29
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 7
ctagctagcg gttagcgtac agtctac 27

Claims (92)

1.靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂用于制备用于以下的药物的用途：
在对象中建立减弱的抗基因表达调节病毒转移载体应答，其中所述建立包括重复地向所述对象伴随施用所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和基因表达调节病毒转移载体，并且
其中所述对象不具有针对所述基因表达调节病毒转移载体的预先存在的免疫力，并且其中所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂包含聚合物合成纳米载体，所述聚合物合成纳米载体包含免疫抑制剂。
2.权利要求1所述的用途，其中所述减弱的抗病毒转移载体应答是针对所述病毒转移载体的T细胞应答，并且所述建立还包括在所述伴随施用所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和病毒转移载体之前，向所述对象施用所述病毒转移载体而不施用所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂。
3.靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂用于制备用于以下的药物的用途：
在对象中建立减弱的抗基因表达调节病毒转移载体应答，其中所述建立包括重复地向所述对象伴随施用所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和基因表达调节病毒转移载体，以及
随后向所述对象施用一个或更多个重复剂量的所述基因表达调节病毒转移载体而不施用所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂，其中所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂包含聚合物合成纳米载体，所述聚合物合成纳米载体包含免疫抑制剂。
4.权利要求3所述的用途，其中所述减弱的抗病毒转移载体应答是针对所述病毒转移载体的T细胞应答，并且所述建立还包括在所述伴随施用所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和病毒转移载体以及所述一个或更多个重复剂量的所述病毒转移载体之前，向所述对象施用所述病毒转移载体而不施用所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂。
5.权利要求1至4中任一项所述的用途，其中所述建立还包括单独地或与病毒转移载体组合地提供或获得靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂。
6.靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂用于制备用于以下的药物的用途：
减弱抗基因表达调节病毒转移载体应答，其中所述抗基因表达调节病毒转移载体应答是T细胞应答，并且其中所述减弱包括首先向对象施用基因表达调节病毒转移载体而不施用靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂，以及
随后重复地向所述对象伴随施用所述基因表达调节病毒转移载体和靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂，并且其中所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂包含聚合物合成纳米载体，所述聚合物合成纳米载体包含免疫抑制剂。
7.靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂用于制备用于包括以下的方法的药物的用途：
在向对象施用所述基因表达调节病毒转移载体之前，确定所述对象中针对基因表达调节病毒转移载体的预先存在的免疫力水平，
重复地向所述对象伴随施用所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和所述基因表达调节病毒转移载体，其中所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂包含聚合物合成纳米载体，所述聚合物合成纳米载体包含免疫抑制剂，以及
向所述对象施用所述基因表达调节病毒转移载体的剂量而不施用所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂。
8.权利要求7所述的用途，其中所述确定包括在向所述对象施用所述病毒转移载体之前测量所述对象中抗病毒转移载体抗体的水平。
9.权利要求8所述的用途，其中所述确定包括在向所述对象施用所述病毒转移载体之前测量所述对象中针对所述病毒转移载体的T细胞应答水平。
10.权利要求7至9中任一项所述的用途，其中所述预先存在的免疫力水平针对的是所述病毒转移载体的病毒抗原。
11.权利要求7至9中任一项所述的用途，其中所述预先存在的免疫力水平针对的是所述病毒转移载体的蛋白质转基因表达产物的抗原。
12.靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂用于制备用于以下的药物的用途：
提高对象中基因表达调节病毒转移载体的转基因表达，其中所述提高包括向所述对象重复地伴随施用所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和所述基因表达调节病毒转移载体，其中所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂包含聚合物合成纳米载体，所述聚合物合成纳米载体包含免疫抑制剂，并且其中所述基因表达调节病毒转移载体的一个或更多个剂量小于当所述对象预期由于重复施用所述基因表达调节病毒转移载体而发生抗基因表达调节病毒转移载体免疫应答时会为所述对象选择的基因表达调节病毒转移载体剂量。
13.权利要求12所述的用途，其中所述提高还包括确定提高对象中所述转基因表达的重复地伴随施用所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和病毒转移载体的频率和剂量。
14.靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂用于制备用于包括以下的方法的药物的用途：
向对象重复地伴随施用所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和基因表达调节病毒转移载体，其中所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂包含聚合物合成纳米载体，所述聚合物合成纳米载体包含免疫抑制剂，以及
选择所述基因表达调节病毒转移载体的一个或更多个剂量以使其小于当所述对象预期由于重复施用所述基因表达调节病毒转移载体而发生抗基因表达调节病毒转移载体免疫应答时会为所述对象选择的基因表达调节病毒转移载体剂量。
15.权利要求3至14中任一项所述的用途，其中所述重复剂量中所述病毒转移载体的量至少等于先前剂量中所述病毒转移载体的量。
16.权利要求3至14中任一项所述的用途，其中所述重复剂量中所述病毒转移载体的量小于先前剂量中所述病毒转移载体的量。
17.权利要求3至16中任一项所述的用途，其中所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂还与所述一个或更多个重复剂量的所述病毒转移载体伴随施用于所述对象。
18.权利要求3至16中任一项所述的用途，其中所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂不还与所述一个或更多个重复剂量的所述病毒转移载体中的至少一个伴随施用于所述对象。
19.权利要求4至18中任一项所述的用途，其中所述对象不具有针对所述病毒转移载体的预先存在的免疫力。
20.权利要求1至19中任一项所述的用途，其中所述伴随施用是同时施用。
21.前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述方法还包括确定所述对象中针对所述病毒转移载体的预先存在的免疫力水平。
22.包括以下的方法：
通过向实体传达重复地伴随施用靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和基因表达调节病毒转移载体导致对象中减弱的抗基因表达调节病毒转移载体应答，来诱导所述实体购买或获得单独或与所述基因表达调节病毒转移载体组合的所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂，其中所述对象不具有针对所述基因表达调节病毒转移载体的预先存在的免疫力，其中所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂包含聚合物合成纳米载体，所述聚合物合成纳米载体包含免疫抑制剂。
23.包括以下的方法：
通过向实体传达通过向对象重复地伴随施用靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和基因表达调节病毒转移载体进行有效的重复基因表达调节病毒转移载体给药是可能的，来诱导所述实体购买或获得单独或与所述基因表达调节病毒转移载体组合的所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂，并且其中所述基因表达调节病毒转移载体的剂量小于当所述对象预期由于重复施用所述基因表达调节病毒转移载体而发生抗基因表达调节病毒转移载体免疫应答时会为所述对象选择的基因表达调节病毒转移载体剂量，其中所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂包含聚合物合成纳米载体，所述聚合物合成纳米载体包含免疫抑制剂。
24.权利要求23所述的方法，其中所述对象不具有针对所述病毒转移载体的预先存在的免疫力。
25.权利要求22至24中任一项所述的方法，其中所述伴随施用是同时施用。
26.权利要求22至25中任一项所述的方法，其中所述传达还包括用于实施本文中所述的任一种方法的指导。
27.权利要求22至26中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂或病毒转移载体或二者分发至所述实体。
28.靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂用于制备用于包括以下的方法的药物的用途：
确定重复地伴随施用所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和基因表达调节病毒转移载体以在对象中产生减弱的抗基因表达调节病毒转移载体应答的频率和剂量，其中所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂包含聚合物合成纳米载体，所述聚合物合成纳米载体包含免疫抑制剂，以及
根据所确定的频率和剂量指导向对象重复地伴随施用所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和基因表达调节病毒转移载体，并且其中所述基因表达调节病毒转移载体的剂量小于当所述对象预期由于重复施用所述基因表达调节病毒转移载体而发生抗基因表达调节病毒转移载体免疫应答时会为所述对象选择的基因表达调节病毒转移载体剂量。
29.与一个或更多个重复剂量的基因表达调节病毒转移载体组合的靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂用于制备用于包括以下的方法的药物的用途：
确定与所述一个或更多个重复剂量的基因表达调节病毒转移载体组合地重复地伴随施用所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和所述基因表达调节病毒转移载体以在对象中产生减弱的抗基因表达调节病毒转移载体应答的频率和剂量，其中所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂包含聚合物合成纳米载体，所述聚合物合成纳米载体包含免疫抑制剂，以及
根据所确定的频率和剂量指导向对象重复地伴随施用所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和基因表达调节病毒转移载体，以及施用所述一个或更多个重复剂量的基因表达调节病毒转移载体，并且其中所述基因表达调节病毒转移载体的剂量小于当所述对象预期由于重复施用所述基因表达调节病毒转移载体而发生抗基因表达调节病毒转移载体免疫应答时会为所述对象选择的基因表达调节病毒转移载体剂量。
30.权利要求29所述的用途，其中在至少一个所述重复剂量中所述病毒转移载体的量至少等于先前剂量中所述病毒转移载体的量。
31.权利要求29所述的用途，其中在至少一个所述重复剂量中所述病毒转移载体的量小于先前剂量中所述病毒转移载体的量。
32.权利要求29至31中任一项所述的用途，其中所述方法还包括在向对象伴随施用所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和病毒转移载体以及施用所述一个或更多个重复剂量的所述病毒转移载体之前，指导向所述对象施用所述病毒转移载体的剂量。
33.权利要求28至32中任一项所述的用途，其中所述对象不具有针对所述病毒转移载体的预先存在的免疫力。
34.权利要求28至33中任一项所述的用途，其中所述伴随施用是同时施用。
35.前述权利要求中任一项所述的用途或方法，其中所述对象是先前未曾向其施用所述病毒转移载体的对象。
36.前述权利要求中任一项所述的用途或方法，其中所述病毒转移载体是逆转录病毒转移载体、腺病毒转移载体、慢病毒转移载体或腺相关病毒转移载体。
37.权利要求36所述的用途或方法，其中所述病毒转移载体是腺病毒转移载体，并且所述腺病毒转移载体是亚组A、亚组B、亚组C、亚组D、亚组E或亚组F腺病毒转移载体。
38.权利要求36所述的用途或方法，其中所述病毒转移载体是慢病毒转移载体，并且所述慢病毒转移载体是HIV、SIV、FIV、EIAV或绵羊慢病毒载体。
39.权利要求36所述的用途或方法，其中所述病毒转移载体是腺相关病毒转移载体，并且所述腺相关病毒转移载体是AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11腺相关病毒转移载体。
40.权利要求1至35中任一项所述的用途或方法，其中所述病毒转移载体是嵌合病毒转移载体。
41.权利要求40所述的用途或方法，其中所述嵌合病毒转移载体是AAV-腺病毒转移载体。
42.前述权利要求中任一项所述的用途或方法，其中所述基因表达调节转基因编码DNA结合蛋白或治疗性RNA。
43.权利要求42所述的用途或方法，其中所述DNA结合蛋白是人工转录因子。
44.权利要求42所述的用途或方法，其中所述治疗性RNA是mRNA翻译抑制剂、RNA干扰(RNAi)剂、催化活性RNA分子(核酶)、转移RNA(tRNA)或结合蛋白质或其他分子配体的RNA(适配体)。
45.权利要求44所述的用途或方法，其中所述RNAi剂是双链RNA、单链RNA、微RNA、短干扰RNA、短发夹RNA或三链体形成寡核苷酸。
46.前述权利要求中任一项所述的用途或方法，其中所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂包含红细胞结合治疗剂。
47.权利要求46所述的用途或方法，其中所述红细胞结合治疗剂包含ERY1、ERY19、ERY59、ERY64、ERY123、ERY141和ERY162。
48.权利要求46或47所述的用途或方法，其中所述红细胞结合治疗剂还包含病毒转移载体抗原。
49.权利要求48所述的用途或方法，其中所述病毒转移载体抗原是病毒抗原。
50.权利要求1至48中任一项所述的用途或方法，其中所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂包含带负电荷的颗粒。
51.权利要求50所述的用途或方法，其中所述带负电荷的颗粒是聚苯乙烯、PLGA或金刚石颗粒。
52.权利要求50或51所述的用途或方法，其中所述颗粒的ζ电位为负。
53.权利要求52所述的用途或方法，其中所述颗粒的ζ电位低于-50mV。
54.权利要求52所述的用途或方法，其中所述颗粒的ζ电位低于-100mV。
55.权利要求1至45中任一项所述的用途或方法，其中所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂包含凋亡小体模拟物和一种或更多种病毒转移载体抗原。
56.权利要求55所述的用途或方法，其中所述凋亡小体模拟物是包含所述一种或更多种病毒转移载体抗原和任选的一种或更多种凋亡信号分子的颗粒。
57.权利要求56所述的用途或方法，其中所述一种或更多种病毒转移载体抗原包含一种或更多种病毒抗原。
58.权利要求50至54、56和57中任一项所述的用途或方法，其中所述颗粒的平均直径为0.1至5μm、0.1至4μm、0.1至3μm、0.1至2μm、0.1至1μm或0.1至500nm。
59.权利要求58所述的用途或方法，其中所述合成纳米载体还包含病毒转移载体抗原。
60.权利要求59所述的用途或方法，其中所述病毒转移载体抗原是病毒抗原。
61.权利要求58至60中任一项所述的用途或方法，其中所述免疫抑制剂和/或所述抗原如果存在的话则包封在所述合成纳米载体中。
62.权利要求58至61中任一项所述的用途或方法，其中所述合成纳米载体包含脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、金属纳米颗粒、基于表面活性剂的乳液、树枝状聚合物、巴基球、纳米线、病毒样颗粒或者肽或蛋白质颗粒。
63.权利要求62所述的用途或方法，其中所述合成纳米载体包含聚合物纳米颗粒。
64.权利要求63所述的用途或方法，其中所述聚合物纳米颗粒包含聚合物，其为非甲氧基封端的普朗尼克聚合物。
65.权利要求63或64所述的用途或方法，其中所述聚合物纳米颗粒包含聚酯、与聚醚连接的聚酯、聚氨基酸、聚碳酸酯、聚缩醛、聚缩酮、多糖、聚乙基
Figure FDA0003336102430000081
唑啉或聚乙烯亚胺。
66.权利要求64所述的用途或方法，其中所述聚酯包含聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚乳酸-乙醇酸共聚物或聚己内酯。
67.权利要求64或66所述的用途或方法，其中所述聚合物纳米颗粒包含聚酯和与聚醚连接的聚酯。
68.权利要求65至67中任一项所述的用途或方法，其中所述聚醚包含聚乙二醇或聚丙二醇。
69.权利要求58至68中任一项所述的用途或方法，其中使用所述合成纳米载体群体的动态光散射获得的粒度分布的均值为大于110nm的直径。
70.权利要求69所述的用途或方法，其中所述直径大于150nm。
71.权利要求70所述的用途或方法，其中所述直径大于200nm。
72.权利要求71所述的用途或方法，其中所述直径大于250nm。
73.权利要求69至72中任一项所述的用途或方法，其中所述直径小于5μm。
74.权利要求73所述的用途或方法，其中所述直径小于4μm。
75.权利要求74所述的用途或方法，其中所述直径小于3μm。
76.权利要求75所述的用途或方法，其中所述直径小于2μm。
77.权利要求76所述的用途或方法，其中所述直径小于1μm。
78.权利要求76所述的用途或方法，其中所述直径小于500nm。
79.权利要求78所述的用途或方法，其中所述直径小于450nm。
80.权利要求79所述的用途或方法，其中所述直径小于400nm。
81.权利要求80所述的用途或方法，其中所述直径小于350nm。
82.权利要求81所述的用途或方法，其中所述直径小于300nm。
83.权利要求59至82中任一项所述的用途或方法，其中在所述合成纳米载体中所包含的免疫抑制剂的载荷在所述合成纳米载体中平均为0.1％至50％(重量/重量)。
84.权利要求83所述的用途或方法，其中所述载荷为0.1％至25％。
85.权利要求84所述的用途或方法，其中所述载荷为1％至25％。
86.权利要求85所述的用途或方法，其中所述载荷为2％至25％。
87.权利要求59至86中任一项所述的用途或方法，其中所述免疫抑制剂为NF-kB途径的抑制剂。
88.权利要求59至87中任一项所述的用途或方法，其中所述合成纳米载体群体的纵横比大于1：1、1：1.2、1：1.5、1：2、1：3、1：5、1：7或1：10。
89.靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂用于制备用于以下的药物的用途：
通过向实体传达重复地伴随施用靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和基因表达调节病毒转移载体导致对象中减弱的抗基因表达调节病毒转移载体应答，来诱导所述实体购买或获得单独或与所述基因表达调节病毒转移载体组合的所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂，其中所述对象不具有针对所述基因表达调节病毒转移载体的预先存在的免疫力，其中所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂包含聚合物合成纳米载体，所述聚合物合成纳米载体包含免疫抑制剂。
90.靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂用于制备用于以下的药物的用途：：
通过向实体传达通过向对象重复地伴随施用靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂和基因表达调节病毒转移载体进行有效的重复基因表达调节病毒转移载体给药是可能的，来诱导所述实体购买或获得单独或与所述基因表达调节病毒转移载体组合的所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂，并且其中所述基因表达调节病毒转移载体的剂量小于当所述对象预期由于重复施用所述基因表达调节病毒转移载体而发生抗基因表达调节病毒转移载体免疫应答时会为所述对象选择的基因表达调节病毒转移载体剂量，其中所述靶向抗原呈递细胞之免疫抑制剂包含聚合物合成纳米载体，所述聚合物合成纳米载体包含免疫抑制剂。
91.前述权利要求中任一项所述的用途或方法，其中所述颗粒包含聚乙醇酸聚合物(PGA)、聚乳酸聚合物(PLA)、聚癸二酸聚合物(PSA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚乳酸-癸二酸共聚物(PLSA)、聚乙醇酸-癸二酸共聚物(PGSA)、聚丙交酯-乙交酯共聚物(PLG)或聚乙二醇(PEG)。
92.前述权利要求中任一项所述的用途或方法，其中所述免疫抑制剂为雷帕霉素或雷帕霉素类似物。
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