CN112656763B - 一种基于剪切力响应的载药纳米胶束的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明的一种基于剪切力响应的载药纳米胶束的制备方法属于纳米材料技术领域。主要步骤包括PGED‑PPS的制备、载药纳米胶束的制备、剪切力响应的载药纳米胶束的制备等。本发明制备的纳米胶束吸附在红细胞上使其具有良好的生物相容性，既可以在体内长效循环同时又具备剪切应力敏感，保证药物在动脉粥样硬化部位释放。

Description

一种基于剪切力响应的载药纳米胶束的制备方法

技术领域

本发明属于纳米材料技术领域，具体涉及一种既能在体内长效循环又具备在血管狭窄较大剪切应力处响应性释放的纳米载药体系的制备与应用。

背景技术

据报道，心血管疾病已成为当今世界死亡率最高的一种疾病，而动脉粥样硬化(AS)是许多心血管疾病的主要诱因。迄今为止，辛伐他汀(SV)是抗血栓最有效的药物之一，然而，SV是一种亲脂性药物，水溶性低，在水中不稳定并且体内半衰期短，使得治疗效果大打折扣。长期自由给药不仅导致动脉粥样硬化斑块处的药物浓度过低，还会引发一系列副作用，如：心肌病、糖尿病和出血性中风等问题。

纳米药物是一种解决以上问题的很有前途的方法，已被广泛应用于药物输送系统中，如细胞靶向、改善难溶药物的溶解、促进药物穿过上皮或内皮细胞的紧密屏障、有效地将大分子药物输送到细胞内作用部位。纳米颗粒(MC)已经被证明具有被动靶向的优势。然而，非特异性纳米粒子在体内循环时往往不可避免地导致药物在非患病处的泄漏而降低药物利用率。为了提高纳米药物的利用率，实现纳米颗粒的靶向释放，可以将纳米颗粒设计成特异性响应药物递送系统。

基于响应性药物载体，可以根据病变组织的异常特征释放药物。触发因素包括：温度、pH、氧化还原和外界信号等条件。对于病理环境特征更准确的理解可以更好的设计响应性纳米载体。然而动脉粥样硬化的发病机制尚未完全阐明且生理环境复杂，这就使得响应性纳米载体的设计较为不便。但是，十分确定的是动脉粥样硬化会导致血管狭窄，病理导致的狭窄改变了血流形态使得剪切力急剧上升。剪切力在病理生理过程中起着重要作用。剪切力影响内皮细胞表型、基因表达、血小板和红细胞聚集和血管壁重塑等重要生物学反应。在正常生理条件下，循环系统的剪应力水平一般保持在70dynes/cm2以下，然而，在动脉血管疾病中剪切力可上升两个数量级。考虑到病患处中可分辨的剪切力，剪切力敏感的药物递送系统可能成为血管相关疾病的非侵入性治疗的一种很有前景的治疗手段。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种基于剪切力响应的纳米载药体系的制备方法。

本发明的技术方案如下：

一种基于剪切力响应的载药纳米胶束的制备方法，具有以下步骤：

1)PGED-PPS的制备

无水无氧状态下，在圆底烧瓶中加入氯化亚铜和2,2'-联吡啶，络合10分钟后再加入甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和2-溴代异丁酸乙酯(EBiB)；按质量比，氯化亚铜:2,2'-联吡啶:甲基丙烯酸缩水甘油酯:N,N-二甲基甲酰胺:2-溴代异丁酸乙酯＝1:0.5～2:500～1500:500～2000:10～30，全部加入后于50℃下反应3～8h，反应结束后，将反应物溶于氯仿中，过中性氧化铝柱子，收集滤液，旋蒸浓缩液体后于甲醇中沉淀，反复纯化后置于真空烘箱干燥30～50h，得到白色粉状产物PGMA；

在氮气氛围下按质量比1:5～20:10～20将上述制得的PGMA、二甲基亚砜(DMSO)和乙二胺(EDA)加入圆底烧瓶，80℃下搅拌3～6h后，用反应液的40～80倍蒸馏水稀释反应液，然后用透析膜(Da＝1000)透析30～50h，最后将透析液冻干24～36h，得到白色固体产物PGED(乙二胺开环型聚甲基丙烯酸缩水甘油酯)；

将PGED与二甲基亚砜(DMSO)加入圆底烧瓶，冷却至0℃后，加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)、吡啶和4-甲苯磺酰氯(TsCl)；按质量比，PGED:二甲基亚砜:4-二甲氨基吡啶:吡啶:4-甲苯磺酰氯＝50:200～1000:1～3:2～5:20～100；室温下搅拌10～20h，反应结束后用透析膜(Da＝2000)透析30～50h，透析结束后通过冻干得浅黄色固体PGED-Ts；

将PGED-Ts溶于二甲基亚砜(DMSO)中，然后加入三乙胺(TEA)和硫代乙酸钾；按质量比，PGED-Ts:二甲基亚砜:三乙胺:硫代乙酸钾＝2:5～20:5～15:1～5；室温下反应5～15h，然后用透析袋(Da＝2000)透析30～50h，透析结束后通过冻干得淡黄色固体PGED-硫代乙酸酯；

将PGED-硫代乙酸酯溶解在体积比1:1～5的THF和甲醇混合液中，加入乙醇钠室温下搅拌0.5～1.5h，冷却至0℃后加入硫化丙烯，其中PGED-硫代乙酸酯、甲醇钠和硫化丙烯的质量比为10:1～5:10～40，0.5～1h后恢复室温继续搅拌8～15h，随后用去离子水透析(Da＝2000)30～50h，然后冷冻干燥得到PGED-PPS；

2)载药纳米胶束的制备

将PGED-PPS和抗血栓药物完全溶解在DMF中，混合液在超声处理下滴加到冷的去离子水中，其中PGED-PPS、抗血栓药物、DMF和水的质量比为10:1～4:1000～3000:5000～15000，滴加完毕后用去离子水透析1～3d，以获得载药胶束溶液；

3)剪切力响应的载药纳米胶束的制备

首先提取红细胞，将动物的新鲜全血样品以1000～2000r/min离心10～30min，除去血浆，白细胞，血小板和缓冲液，并将剩余的红细胞用无菌等渗磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，直到在上清液中观察不到血浆的痕迹，最后，将红细胞重新悬浮在PBS中，将步骤2)制备的载药胶束溶液添加到重悬的红细胞中，并在室温下孵育1～3h后离心洗涤，得到剪切力响应的载药纳米胶束；其中红细胞和所述的载药胶束的体积比为1～3:1。

步骤2)中所述的抗血栓药物优选辛伐他汀。

本发明选择了人体血管中的天然长期循环的红细胞(RBCs)作为SV MC的载体，由于RBCs不能穿透紧密的血管壁，只能在血管中循环，因此它们是血管内给药的良好生物载体候选物。同时由于红细胞的存在减少了肾脏对SV MC的捕获，实现胶束在体内的长期循环。此外，由于唾液酸保留在红细胞膜上，使得红细胞具有带负电荷的表面，因此带正电荷的SV MC可以通过静电引力吸附到红细胞膜表面(SV MC@RBCs)。由于斑块处剪切力的明显增加，可以迫使SV MC从红细胞表面脱附，而SV MC@RBCs可以承受正常血管内循环所受的剪切应力，从而实现剪切应力敏感药物释放。

综上，本发明有以下有益效果：

1、纳米胶束吸附在红细胞上使其具有良好的生物相容性。

2、SV MC@RBCs具有在低剪切力稳定高剪切力下响应性脱离的特性。

3、本发明制备的纳米载药体系既可以在体内长效循环同时又具备剪切应力敏感，保证药物在动脉粥样硬化部位释放。

附图说明

图1是实施例1中聚合物PGED-PPS和PGMA的核磁图。

图2是实施例3中SV MC的透射电镜图。

图3是实施例4中SV和SV MC的溶血率图。

图4是实施例5中HUVEC细胞存活能力图。

图5是实施例6中SV MC@RBCs的扫描电镜图。

图6是实施例7中SV MC和SV MC@RBCs的细胞摄取能力图。

图7是实施例8中SV MC@RBCs的体外剪切应力响应图。

图8是实施例9中SV MC@RBCs的体内治疗效果的彩超对比图。

具体实施方式

实施例1：PGED-PPS两亲型聚合物的合成

将5g DMF加入到含有0.048g CuCl和0.048g bpy的50mL圆底烧瓶中。然后，在脱气条件下，将12g GMA和0.24g EBiB依次加入上述溶液。在氩气气氛50℃下聚合4h，通过使溶液通过氧化铝除去催化剂，随后用冷甲醇沉淀，产物通过反复重结晶纯化，然后在室温下真空干燥24h，得到6g PGMA。取5g PGMA溶解在20g DMSO中，然后加入过量的EDA。反应在氮气气氛下于80℃进行4h。用过量的去离子水稀释反应溶液，然后将反应液置于透析膜(MWCO1.0kDa)中用去离子水透析48h以消除过量的EDA。冻干后获得6.6g白色粉末PGED。将1gPGED完全溶解在14g DMSO中。冷却至0℃后，加入43mg DMAP、1g吡啶和1g TsCl。将反应物在室温下搅拌12h，反应结束后将反应液置于透析袋(MWCO 2.0kDa)中透析48h。冷冻干燥获得2.04g浅黄色PGED-对甲苯磺酸酯。将2g PGED-对甲苯磺酸酯溶解在10g DMSO中。再向溶液中加入11g TEA和3g硫代乙酸钾。反应在室温下进行过夜。然后用透析膜(MWCO 2.0kDa)将溶剂用去离子水透析48h。用冻干机冷冻干燥后，得到1.04g淡黄色固体PGED-硫代乙酸酯。PGED-硫代乙酸酯和硫化丙烯的质量比为1∶1的合成方法如下:将0.5g PGED硫代乙酸酯溶解在THF和甲醇的混合物(v/v，10/10)中。加入64mg CH3ONa，然后将混合物在室温下搅拌1h，冷却至0℃后加入1g硫化丙烯。30min后，移走冷却设备，溶液在室温下搅拌过夜。随后，将混合物用去离子水透析(MWCO 2.0kDa)2d，并冷冻干燥，得到1.57g聚合物PGED-PPS。图1中可看出目标产物各H位置和峰面积均有很好的归属，证明了PGED-PPS和PGMA的成功合成。

实施例2：PGED-PPS纳米胶束的制备

将PGED-PPS(10mg)完全溶解在3g DMF中，混合液在超声处理下滴加到8g冷的去离子水中，然后用去离子水透析(MWCO 3.0kDa)一天，以获得胶束溶液(MC)。

实施例3：SV MC载药纳米胶束的制备

将PGED-PPS(10mg)和辛伐他汀(3mg)完全溶解在3g DMF中，混合液在超声处理下滴加到8g冷的去离子水中，然后用去离子水透析(MWCO 3.0kDa)一天，以获得胶束溶液(SVMC)。图2透射电镜图中可以看出SV MC的成功制备。

用相同的方法制备NR MC和FITC MC，其中，NR为0.1mg，FITC为0.1mg，PGED-PPS均为10mg。

实施例4：体外溶血的测定

将200μL不同浓度的SV MC、MC和SV分别加入5mL生理盐水中，在水浴中于37℃孵育30分钟。然后加入100μL新鲜红细胞溶液继续孵育1小时，去离子水和红细胞作为阳性对照溶液，盐水和红细胞作为阴性对照溶液。之后，混合物溶液以1500转/分钟离心15分钟，上清液的吸光度值通过紫外可见分光光度计在540nm处测得，图3证明MC可以降低SV的溶血率。

实施例5：细胞毒性的测定

应用MTT法分析评估SV，SV MC在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中的细胞毒性。将HUVEC接种到96孔板(5000/孔)中，并在5％CO2湿润的气氛中，在含有10％FBS，1％100U/mL青-链霉素的DMEM培养基中于37℃下培养24小时至细胞密度达到80％。将每个样品以0至64μg/mL的浓度添加到孔中，并将细胞培养24小时后，使用MTT检测每个板上的细胞活力，利用酶联免疫吸附测定仪(Tecan Spark，瑞士)测定每个孔中溶液在492nm处的吸光度。图4表明聚合物具有降低SV细胞毒性的作用。

实施例6：SV MC@RBCs的制备

首先提取红细胞，将0.5mL动物的新鲜全血样品(柠檬酸钠作为抗凝剂)以2000r/min离心10min。除去血浆，白细胞，血小板和缓冲液，并将剩余的RBCs用无菌等渗磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤五次，直到在上清液中未观察到血浆的痕迹。最后，红细胞重新悬浮在5mLPBS中。此步骤后，将50μL SV MC添加到重新悬浮的RBCs中，并在室温下孵育1h后离心洗涤，以获得SV MC@RBCs。图5通过扫描电镜图形貌表明SV MC@RBCs的成功制备。

用相同的方法制备FITC MC@RBCs和NR MC@RBCs。

实施例7：细胞摄取的测定

将RAW 264.7的悬浮液(2.0×105个细胞/孔)添加到6孔板中，并在37℃下培养。将细胞温育直至观察到80-90％的聚集，然后在37℃下，将它们分别暴露于NR MC或NR MC@RBC(使用NR代替SV)3小时，然后除去培养基，用PBS冲洗细胞3次后用lysoGreen处理细胞1h并用PBS洗涤3次，将细胞浸入4％PFA中20分钟，并在室温下于黑暗条件中使用DAPI染色10分钟。最后，将细胞再次用PBS洗涤3次并用CLSM检查。图6证明RBCs在3h内可以有效的抑制RAW264.7对SV MC@RBCs的内化。

实施例8：体外剪切应力响应的测定

用FITC代替SV制备胶束(FITC MC)，红细胞膜用NR染色。为模拟生理条件，采用由蠕动泵(BT100-1F，中国保定兰格恒流泵有限公司)、硅胶管(直径1.6mm、长1m)、作为细胞溶液储存库的注射器和可穿过硅胶管的带孔(直径4.8mm、长10cm)的有机玻璃板组成的心血管系统模型。其中，有机玻璃板可通过调节硅胶管的直径产生脉动流来模拟血液循环过程中产生的剪切力。为了评价FITC MC在剪切应力的作用下从红细胞上解吸附的可行性，在血液动力学条件下，将FITC MC@RBCs置于上述体外剪切系统中。实验前，整个系统用75％乙醇消毒，然后用4mL磷酸盐漂洗。为了减少悬浮的FITC MC@RBCs与试管和注射器的粘附，系统用1.0g/L的BSA溶液预处理。然后，在注射器中加入5mL FITC MC@RBCs悬浮液，注射器通过硅胶管与蠕动泵连接，孵育温度为37℃。根据泊松定律，管内剪切应力τ(dyne/cm2)由τ＝4μQ/(πR3)计算，其中Q为流速(0.027～27mL/min)，μ为液体粘度(细胞培养液为0.01dyne·s/cm2)，R为硅胶管半径(0.8mm)。通过调节硅胶管的流量和管径来确定剪切应力的大小。在流动实验中，采用τ1＝2Pa(τ1＝20dyne/cm2)和τ2＝10Pa(τ2＝100dyne/cm2)两种不同的剪切应力，这些值在报告的生理范围内。剪切后，用激光共聚焦显微镜观察细胞悬浮液荧光变化。图7证明了剪切应力为100dyne/cm2时，红细胞上的绿色荧光明显弱于20dyne/cm2时的绿色荧光，说明大量FITC MC从RBCs上脱落，FITC MC@RBCs具有剪切应力响应性。

实施例9：体内血栓的治疗效果测试

新西兰大白兔用3％戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉，用棉绳固定四肢和头部后，利用外科剪刀和玻璃分针将迷走神经及其周围组织从下颌分离到胸骨上切迹，显露一段左侧颈动脉。注射SV MC@RBCs、SV MC或SV后，用含30％FeCl3的滤纸处理左侧颈动脉形成血栓。使用多普勒彩色超声监测颈动脉血流，当血流被阻断时记录所需的时间。如图8所示，SV MC@RBCs组中，血流在30min时堵塞长度是最小的，SV MC组的血管堵塞长度小于SV组，但高于SVMC@RBCs组，而对照组在30min时已经完全堵塞，说明本发明制备的具有剪切应力响应的载药体系在体内血栓的治疗中起到了积极的作用。

Claims (2)

1.一种基于剪切力响应的载药纳米胶束的制备方法，具有以下步骤：

1)PGED-PPS的制备

无水无氧状态下，在圆底烧瓶中加入氯化亚铜和2,2'-联吡啶，络合10分钟后再加入甲基丙烯酸缩水甘油酯、N,N-二甲基甲酰胺和2-溴代异丁酸乙酯；按质量比，氯化亚铜:2,2'-联吡啶:甲基丙烯酸缩水甘油酯:N,N-二甲基甲酰胺:2-溴代异丁酸乙酯＝1:0.5～2:500～1500:500～2000:10～30，全部加入后于50℃下反应3～8h，反应结束后，将反应物溶于氯仿中，过中性氧化铝柱子，收集滤液，旋蒸浓缩液体后于甲醇中沉淀，反复纯化后置于真空烘箱干燥30～50h，得到白色粉状产物PGMA；

在氮气氛围下按质量比1:5～20:10～20将上述制得的PGMA、二甲基亚砜和乙二胺加入圆底烧瓶，80℃下搅拌3～6h后，用反应液的40～80倍蒸馏水稀释反应液，然后用透析膜透析30～50h，最后将透析液冻干24～36h，得到白色固体产物PGED；

将PGED与二甲基亚砜加入圆底烧瓶，冷却至0℃后，加入4-二甲氨基吡啶、吡啶和4-甲苯磺酰氯；按质量比，PGED:二甲基亚砜:4-二甲氨基吡啶:吡啶:4-甲苯磺酰氯＝50:200～1000:1～3:2～5:20～100；室温下搅拌10～20h，反应结束后用透析膜透析30～50h，透析结束后通过冻干得浅黄色固体PGED-Ts；

将PGED-Ts溶于二甲基亚砜中，然后加入三乙胺和硫代乙酸钾；按质量比，PGED-Ts:二甲基亚砜:三乙胺:硫代乙酸钾＝2:5～20:5～15:1～5；室温下反应5～15h，然后用透析袋透析30～50h，透析结束后通过冻干得淡黄色固体PGED-硫代乙酸酯；

将PGED-硫代乙酸酯溶解在体积比1:1～5的THF和甲醇混合液中，加入乙醇钠室温下搅拌0.5～1.5h，冷却至0℃后加入硫化丙烯，其中PGED-硫代乙酸酯、甲醇钠和硫化丙烯的质量比为10:1～5:10～40，0.5～1h后恢复室温继续搅拌8～15h，随后用去离子水透析30～50h，然后冷冻干燥得到PGED-PPS；

2)载药纳米胶束的制备

将PGED-PPS和抗血栓药物完全溶解在DMF中，混合液在超声处理下滴加到冷的去离子水中，其中PGED-PPS、抗血栓药物、DMF和水的质量比为10:1～4:1000～3000:5000～15000，滴加完毕后用去离子水透析1～3d，以获得载药胶束溶液；

3)剪切力响应的载药纳米胶束的制备

首先提取红细胞，将动物的新鲜全血样品以1000～2000r/min离心10～30min，除去血浆，白细胞，血小板和缓冲液，并将剩余的红细胞用PBS洗涤，直到在上清液中观察不到血浆的痕迹，最后，将红细胞重新悬浮在PBS中，将步骤2)制备的载药胶束溶液添加到重悬的红细胞中，并在室温下孵育1～3h后离心洗涤，得到剪切力响应的载药纳米胶束；其中红细胞和所述的载药胶束的体积比为1～3:1。

2.根据权利要求1所述的一种基于剪切力响应的载药纳米胶束的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述的抗血栓药物是辛伐他汀。

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