CN111836896A

CN111836896A - 免疫逃避载体及其在基因治疗中的用途

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Publication number: CN111836896A
Application number: CN201980018276.3A
Authority: CN
Inventors: G·温斯洛
Original assignee: Chameleon Biotechnology Co ltd
Current assignee: Chameleon Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-01-11
Filing date: 2019-01-11
Publication date: 2020-10-27
Also published as: RU2020126574A; BR112020014093A2; JP2023160938A; JP2021510522A; AU2019206639A1; SG11202006298XA; KR20200128519A; MX2020007390A; CA3088897A1; EP3737768A1; US20200338216A1; JP7406253B2; WO2019140311A1; CL2020001850A1; IL275951A

Abstract

提供一种有包膜的病毒载体以及制备和使用其的方法，所述有包膜的病毒载体包含由包膜包围的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒包含异源转基因，并且所述包膜包含脂质双层和一种或多种免疫抑制分子。

Description

免疫逃避载体及其在基因治疗中的用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年1月11日提交的美国临时申请号62/616,167和2018年11月16日提交的美国临时申请号62/768,779的优先权权益，其全部公开内容通过提述并入本文。

以ASCII文本文件提交的序列表

以下ASCII文本文件提交内容通过提述以其整体并入本文：计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名称：774392000140SeqList.txt，记录日期：2019年1月11日，大小：29KB)。

发明领域

本公开总体上涉及具有降低的免疫原性的用于基因治疗的改良载体。

发明背景

AAV基因疗法的临床试验已表明，AAV可以安全地用于逆转若干单基因疾病的疾病表型，所述单基因疾病包括脊髓性肌萎缩症(SMA)(Meliani等人(2017)Blood Advances,1(23):2019-31)、B血友病(Nathwani等人(2011)N Engl J Med,365:2357-65)，以及由RPE65基因中的突变引起的遗传性视网膜疾病(Simonelli等人(2010)Molecular Therapy,18(3):643-650)。除了有希望的人类临床试验数据外，还有使用AAV基因疗法的有希望的临床前数据的更多实例；例如肌微管素肌病(Childers等人(2014)Sci Transl Med,6:220ra10)。尽管有积极的临床和临床前数据，但对重组AAV和/或新表达的治疗性蛋白产生的免疫应答仍然是AAV基因疗法更广泛地用于治疗单基因病症的障碍(Mingozzi等人(2013)Blood,122(1):23-36；Chermule等人(1999)Gene Therapy；6,1574-1583；Masat等人(2013)Discov Med,15(85):379-389)。

尽管基于AAV的基因疗法有望有效已变得越来越明显，但围绕单一治疗的寿命存在疑问。有证据表明AAV介导了长达三年的治疗性蛋白功能的递送(Nathwani等人(2014)NEngl J Med,371:1994-2004)，但终生转基因表达尚未得到证实，在某些情况下是不可能的。基于AAV的载体以游离型元件(不整合到细胞染色体中的双链DNA环结构)形式存在。出于此原因，AAV基因组不随着细胞分裂而复制和分裂，并且可以通过细胞分裂而被稀释。为了确保延长的转基因表达，AAV基因疗法研究人员针对的是缓慢分裂或根本不分裂的细胞类型；例如肌肉、肝脏或神经元细胞。因此，尚不清楚AAV递送的治疗基因是否表达持续患者终生。这在影响年幼儿童的威胁生命的疾病(如脊髓性肌萎缩症)中尤其如此，因为随着儿童的成长，年幼儿童的肌肉细胞将比成年肌肉细胞经历更多的细胞分裂。尽管临床数据表明AAV递送治疗性基因可以改善已定义的SMA疾病终点，但在儿童的整个生命中都将维持表达水平是不可能的。实际上，由于稀释了在转导细胞中的AAV基因组，甚至在缓慢分裂或不分裂的细胞中接受AAV基因疗法的成年人也可能会在患者的一生中经历治疗性蛋白水平的降低。因此，能够递送额外剂量的AAV基因疗法产品将是有利的。

对AAV基因疗法的宿主免疫应答仍然是在更广泛地使用AAV基因疗法之前必须克服的障碍。由于AAV是天然存在的病毒，因此部分患者群体具有针对不同AAV血清型的预先存在的抗体。例如，可以在多达60％的人群中发现针对AAV2(最常见的血清型)的预先存在的抗体(Chiermule等人(1999)Gene Therapy；6,1574–1583)。其他AAV血清型较不常见，但不能用于靶向所有组织类型；例如AAV5优先感染肝脏，而AAV8优先靶向肌肉细胞(Asokan等人(2012)Molecular Therapy,20(4)699–708)。在逃避预先存在的针对AAV的抗体的同时可以选择性地靶向特定组织的下一代AAV载体将增加潜在的患者群体，并能够使用单个制造平台来解决针对多种疾病靶标的载体。

由于衣壳特异性适应性免疫应答，对AAV基因疗法的宿主免疫应答可阻止第二剂量的产品的施用。此外，T细胞对新表达的治疗性蛋白的应答可降低AAV基因疗法产品的功效(Mingozzi等人(2013)Blood,122(1):23-36)。

已经做出努力以减少宿主免疫应答对AAV疗法的影响。例如，已证明有包膜的AAV(也称为“exo-AAV”)比无包膜的AAV更有效，据信这是由于在某种程度上屏蔽了载体免受抗AAV抗体体内和体外清除载体的能力(Gyorgy等人(2014)Biomaterials,35(26):7598-7609；Hudry等人(2016)Gene Ther,Apr,23(4):380-92；US 2013/020559)。同样，有一些证据表明，编码PD-L1或PD-L2的AAV与CTLA-4-Ig的共同施用可延长转基因表达并导致更少的转基因响应性T细胞(Adriouch等人(2011)Front Microbiol,2:199)。本发明使用与检查点免疫调节分子结合的有包膜的AAV技术来产生效应载体，以减少免疫应答和给药限制，并促进治疗性基因的重复给药。

仍然需要改善转基因传递和表达同时将宿主免疫应答的影响降至最低的新的病毒载体和方法。

本文引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物，通过提述以其整体并入本文。

发明概述

本文提供了有包膜的病毒载体，其包含由包膜包围的载体颗粒，其中所述载体颗粒包含转基因，并且所述包膜包含一种或多种免疫抑制分子。还提供了一种药物组合物，其包含有包膜的病毒载体和一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。

还提供了一种将转基因递送至细胞或受试者的方法，其包括向所述细胞或受试者施用所述有包膜的病毒载体，以及一种通过向受试者施用所述有包膜的病毒载体来治疗所述受试者的疾病或病症的方法。

进一步提供了一种产生有包膜的病毒载体的方法，该方法包括(a)在生成有包膜的病毒颗粒的条件下培养病毒生产细胞(即体外)，其中所述病毒生产细胞包含编码一种或多种膜结合型免疫抑制分子的核酸，和(b)收集所述有包膜的病毒载体。

在一些方面，本发明提供了一种包含有包膜的病毒载体的组合物，其中所述有包膜的病毒载体包含由包膜包围的载体颗粒，其中所述包膜包含一种或多种提供免疫效应功能的分子。在一些实施方案中，与没有免疫效应分子的载体相比，所述免疫效应功能降低有包膜的载体的免疫原性。在一些实施方案中，所述免疫效应功能刺激免疫抑制剂。在其他实施方案中，所述免疫效应功能抑制免疫刺激分子。在一些实施方案中，所述包膜包含刺激免疫抑制剂的分子和抑制免疫刺激分子的分子。在一些实施方案中，提供免疫效应功能的一种或多种分子包括但不限于CTLA4、B7-1、B7-2、PD-1、PD-L1、PD-L2、CD28或VISTA中的一种或多种。在一些实施方案中，所述包膜包含CTLA4和PD-L1、CTLA和PD-L2、CTLA-4和VISTA、PD-L1和PD-L2、PD-L1和VISTA、PD-L2和VISTA、CTLA4和PD-L1和PD-L2、CTLA4和PD-L1和VISTA、CTLA4和PD-L2和VISTA、PD-L1和PD-L2和VISTA、或CTLA4和PD-L1和PD-L2和VISTA。在一些实施方案中，提供免疫效应功能的一种或多种分子包含跨膜结构域。在一些实施方案中，所述包膜进一步包含靶向分子，其将载体靶向至一种或多种细胞类型。在一些实施方案中，所述靶向分子为所述有包膜的载体赋予组织特异性。在一些实施方案中，所述靶向分子是抗体。在一些实施方案中，所述抗体是抗体8D7。在一些实施方案中，所述一种或多种靶向分子包含跨膜结构域。

在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述病毒载体包含病毒颗粒。在一些实施方案中，所述病毒颗粒包含病毒衣壳和病毒基因组。在一些实施方案中，所述病毒基因组包含一种或多种异源转基因。在一些实施方案中，所述异源转基因编码多肽。在一些实施方案中，所述异源转基因编码治疗性多肽或报告多肽。在一些实施方案中，所述治疗性多肽是因子VIII、因子IX、肌微管素、SMN、RPE65、NADH-泛醌氧化还原酶链4、CHM、亨廷顿蛋白、α-半乳糖苷酶A、酸性β-葡萄糖苷酶、α-葡糖苷酶、鸟氨酸转羧酶、精氨酰琥珀酸合成酶、β-球蛋白、γ-球蛋白、苯丙氨酸羟化酶或ALD。在一些实施方案中，所述异源转基因编码治疗性核酸。在一些实施方案中，所述治疗性核酸是siRNA、miRNA、shRNA、反义RNA、核酶(RNAzyme)或脱氧核酶(DNAzyme)。在一些实施方案中，所述异源转基因编码一种或多种基因编辑基因产物。在一些实施方案中，所述一种或多种基因编辑基因产物是CAS核酸酶和/或一种或多种指导序列和/或一种或多种供体序列。

在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体或慢病毒载体。在一些实施方案中，所述病毒载体是腺相关病毒载体。在一些实施方案中，所述AAV载体包含来自人AAV血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12的衣壳。在一些实施方案中，所述AAV载体包含AAV病毒基因组，其包含来自人AAV血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、rAAV10的反向末端重复(ITR)序列。在一些实施方案中，所述AAV衣壳和所述AAV ITR来自相同血清型或来自不同血清型。

在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些实施方案中，所述慢病毒载体衍生自人免疫缺陷病毒、猿猴免疫缺陷病毒或猫免疫缺陷病毒。在一些实施方案中，所述慢病毒载体是非复制型的。在一些实施方案中，所述慢病毒载体是非整合的。

在一些实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含任何上述组合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂。

在一些方面，本发明提供一种向个体递送转基因的方法，其包括向所述个体施用包含有包膜的病毒载体的组合物，其中所述有包膜的病毒载体包含由包膜包围的载体颗粒，其中所述包膜包含一种或多种提供免疫效应功能的分子，且其中所述病毒颗粒包含含有所述转基因的病毒基因组。在一些方面，本发明提供一种治疗患有疾病或病症的个体的方法，其包括向有此需要的个体施用包含有包膜的病毒载体的组合物，其中所述有包膜的病毒载体包含由包膜包围的载体颗粒，其中所述包膜包含一种或多种提供免疫效应功能的分子，且其中所述病毒颗粒包含含有治疗性转基因的病毒基因组。在一些实施方案中，与没有免疫效应分子的载体相比，所述免疫效应功能降低有包膜的载体的免疫原性。在一些实施方案中，所述免疫效应功能刺激免疫抑制剂。在其他实施方案中，所述免疫效应功抑制免疫刺激分子。在一些实施方案中，所述包膜包含刺激免疫抑制剂的分子和抑制免疫刺激分子的分子。在一些实施方案中，提供免疫效应功能的一种或多种分子包括CTLA4、B7-1、B7-2、PD-1、PD-L1、PD-L2、CD28或VISTA中的一种或多种。在一些实施方案中，所述包膜包含CTLA4和PD-L1、或CTLA和PD-L2。在一些实施方案中，提供免疫效应功能的一种或多种分子包含跨膜结构域。在一些实施方案中，所述包膜进一步包含靶向分子，其将载体靶向至一种或多种细胞类型。在一些实施方案中，所述靶向分子为所述有包膜的载体赋予组织特异性。在一些实施方案中，所述靶向分子是抗体。在一些实施方案中，所述抗体是抗体8D7。在一些实施方案中，所述一种或多种靶向分子包含跨膜结构域。

在上述方法的一些实施方案中，所述病毒载体包含病毒颗粒。在一些实施方案中，所述病毒颗粒包含病毒衣壳和病毒基因组。在一些实施方案中，所述病毒基因组包含一种或多种异源转基因。在一些实施方案中，所述异源转基因编码多肽。在一些实施方案中，所述异源转基因编码治疗性多肽或报告多肽。在一些实施方案中，所述治疗性多肽是因子VIII、因子IX、肌微管素、SMN、RPE65、NADH-泛醌氧化还原酶链4、CHM、亨廷顿蛋白、α-半乳糖苷酶A、酸性β-葡萄糖苷酶、α-葡糖苷酶、鸟氨酸转羧酶、精氨酰琥珀酸合成酶、β-球蛋白、γ-球蛋白、苯丙氨酸羟化酶或ALD。在一些实施方案中，所述异源转基因编码治疗性核酸。在一些实施方案中，所述治疗性核酸是siRNA、miRNA、shRNA、反义RNA、核酶或脱氧核酶。在一些实施方案中，所述异源转基因编码一种或多种基因编辑基因产物。在一些实施方案中，所述一种或多种基因编辑基因产物是CAS核酸酶和/或一种或多种指导序列和/或一种或多种供体序列。

在上述方法的一些实施方案中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体或慢病毒载体。在一些实施方案中，所述病毒载体是腺相关病毒载体。在一些实施方案中，所述AAV载体包含来自人AAV血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12的衣壳。在一些实施方案中，所述AAV载体包含AAV病毒基因组，其包含来自人AAV血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、r AAV10的反向末端重复(ITR)序列。在一些实施方案中，所述AAV衣壳和所述AAV ITR来自相同血清型或来自不同血清型。

在上述方法的一些实施方案中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些实施方案中，所述慢病毒载体衍生自人免疫缺陷病毒、猿猴免疫缺陷病毒或猫免疫缺陷病毒。在一些实施方案中，所述慢病毒载体是非复制型的。在一些实施方案中，所述慢病毒载体是非整合的。

在上述方法的一些实施方案中，所述组合物是包含有包膜的病毒载体和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

在上述方法的一些实施方案中，所述个体是人。在一些实施方案中，所述疾病或病症是单基因疾病。在一些实施方案中，所述疾病或病症是肌微管素肌病、脊髓性肌萎缩症、莱伯氏先天性黑内障、血友病A、血友病B、无脉络膜症、亨廷顿氏病、贝顿氏病、莱伯遗传性视神经病、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)缺乏症、庞贝病、法布里病、1型瓜氨酸血症、苯丙酮尿症(PKU)、肾上腺脑白质营养不良、镰刀状细胞病或β地中海贫血。

在一些方面，本发明提供了一种产生具有降低的免疫原性的有包膜的病毒载体的方法，所述方法包括：a)在生成有包膜的病毒颗粒的条件下培养病毒生产细胞，其中所述病毒生产细胞包含编码一种或多种膜结合型免疫效应功能的核酸，所述膜结合型免疫效应功能降低有包膜的载体的免疫原性，和b)收集所述有包膜的病毒载体。在一些实施方案中，所述免疫效应功能降低有包膜的载体的免疫原性。在一些实施方案中，所述免疫效应功能刺激免疫抑制剂。在一些实施方案中，所述免疫效应功能抑制免疫刺激分子。在一些实施方案中，所述病毒生产细胞包含编码刺激免疫抑制剂的分子和抑制免疫刺激分子的分子的核酸。在一些实施方案中，一种或多种提供免疫效应功能的分子包括CTLA4、B7-1、B7-2、PD-1、PD-L1、PD-L2、CD28或VISTA中的一种或多种。在一些实施方案中，所述病毒生产细胞包含编码CTLA4和PD-L1或CTLA和PD-L2的核酸。在一些实施方案中，一种或多种提供免疫效应功能的分子包含跨膜结构域。在一些实施方案中，将编码一种或多种提供免疫效应功能的分子的核酸瞬时引入病毒生产细胞。在一些实施方案中，编码一种或多种提供免疫效应功能的分子的核酸被稳定地保持在所述病毒生产细胞中。在一些实施方案中，将编码一种或多种提供免疫效应功能的分子的核酸整合到所述病毒生产细胞的基因组中。

在上述方法的一些实施方案中，所述病毒生产细胞包含编码一种或多种将所述载体靶向至一种或多种细胞类型的靶向分子的核酸。在一些实施方案中，所述靶向分子为所述有包膜的载体赋予组织特异性。在一些实施方案中，所述靶向分子是抗体。在一些实施方案中，所述抗体是抗体8D7。在一些实施方案中，一种或多种靶向分子包含跨膜结构域。在一些实施方案中，将编码所述一种或多种靶向分子的核酸瞬时引入所述病毒生产细胞。在一些实施方案中，编码所述一种或多种靶向分子的核酸被稳定地保持在所述病毒生产细胞中。在一些实施方案中，将编码一种或多种靶向分子的分子的核酸整合到所述病毒生产细胞的基因组中。

在上述方法的一些实施方案中，所述有包膜的病毒载体是有包膜的AAV载体。在一些实施方案中，所述病毒生产细胞包含a)编码AAV rep和cap基因的核酸，b)编码包含转基因和至少一个ITR的AAV病毒基因组的核酸，和c)AAV辅助功能。在一些实施方案中，将所述编码AAV rep和cap基因的核酸和/或AAV病毒基因组瞬时引入生产细胞系。在一些实施方案中，所述编码AAV rep和cap基因的核酸和/或AAV病毒基因组被稳定地保持在生产细胞系中。在一些实施方案中，将所述编码AAV rep和cap基因的核酸和/或AAV病毒基因组稳定地整合到生产细胞系的基因组中。在一些实施方案中，所述rAAV基因组包含两个AAV ITR。在一些实施方案中，质粒、腺病毒、稳定整合到细胞基因组中的核酸或单纯疱疹病毒(HSV)中的一种或多种提供一种或多种AAV辅助功能。在一些实施方案中，AAV辅助功能包含腺病毒E1A功能、腺病毒E1B功能、腺病毒E2A功能、腺病毒E4功能和腺病毒VA功能中的一种或多种。在一些实施方案中，AAV辅助功能包括HSV UL5功能、HSV UL8功能、HSV UL52功能和HSVUL29功能中的一种或多种。

在上述方法的一些实施方案中，所述有包膜的病毒载体是慢病毒载体。在一些实施方案中，所述慢病毒载体是人免疫缺陷病毒、猿猴免疫缺陷病毒或猫免疫缺陷病毒。在一些实施方案中，所述病毒生产细胞包含a)编码慢病毒gag基因的核酸，b)编码慢病毒pol基因的核酸，c)编码包含转基因、'长末端重复序列(LTR)和3'LTR的慢病毒转移载体的核酸，其中3'LTR的U3区域的全部或部分被异源调节元件、引物结合位点、GAG基因的全部或部分、中央聚嘌呤管道、GAG序列中的合成终止密码子、rev响应元件和env剪接受体替代。

在上述方法的一些实施方案中，有包膜的载体被进一步纯化。

在一些方面，本发明提供一种包含本文所述的任何组合物的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包括使用说明书。

在一些方面，本发明提供一种组合物，其用于按照本文所述的任何方法将核酸递送至有此需要的个体。在一些实施方案中，本发明提供一种组合物，其用于按照本文所述的任何方法治疗有此需要的个体的疾病或病症。在一些实施方案中，本发明提供如本文所述的组合物在制备用于将核酸递送至有此需要的个体的药物中的用途。在一些实施方案中，本发明提供如本文所述的组合物在制备用于治疗患有疾病或病症的个体的药物中的用途。在一些实施方案中，所述疾病或病症是肌微管素肌病、脊髓性肌萎缩症、莱伯氏先天性黑内障、血友病A、血友病B、无脉络膜症、亨廷顿病、贝敦氏症、莱伯遗传性视神经病、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)缺乏症、庞贝病、法布里病、1型瓜氨酸血症、苯丙酮尿症(PKU)、肾上腺脑白质营养不良、镰刀状细胞病或β地中海贫血。

在一些方面，本发明提供一种制品，其包含如本文所述的组合物。

如本发明的以下详细描述中所述，提供了另外的组合物和方法。

附图简述

图1显示了效应载体的示例性示意图。在此具体的实例中，AAV载体被包裹在细胞膜中，所述细胞膜经工程化以在有包膜的病毒颗粒的表面上呈现免疫效应功能以及细胞靶向功能。

图2显示了示例性效应分子。

图3显示了在逃避者(EVADER)载体的包膜上存在小鼠PDL1(左图)和小鼠CTLA4。FACS直方图显示了用抗小鼠PDL1或抗小鼠CTLA-4抗体染色的有包膜的AAV和逃避者载体。有包膜的AAV直方图叠加在效应载体直方图上，以显示经纯化的载体的更高水平的PDL-1或CTLA-4染色。效应载体比有包膜的AAV载体具有更高水平的PDL-1和CTLA-4。逃避者是效应载体。

图4显示了显示在初始注射后3周和6周时小鼠中人FIX水平的图。对于3周的雌性小鼠：*p＝0.036；**p+0.002；****p<0.0001。对于三周的雄性小鼠：****p<0.0001。对于6周的雌性小鼠：std对比逃避者p＝0.0002；exo对比逃避者p＝0.0006。逃避者是mEV-AAV-hFIX。Exo是有包膜的AAV。

图5显示了在第3和第6周来自小鼠的血清中抗AAV8 IgG抗体的滴度的图。

图6显示了在第3周和第6周的针对AAV8的中和抗体的滴度的图。

图7显示了描绘在第3周和第6周来自雄性或雌性小鼠的肝脏的载体基因组拷贝数(VGCN)的图。

图8显示了描绘在第3周和第6周来自组合的雄性和雌性小鼠的肝脏的载体基因组拷贝数(VGCN)的图。

图9显示了描绘了在第6周时来自组合的雄性和雌性小鼠的肝脏的载体基因组拷贝数(VGCN)的图，包括统计分析。

发明详述

本文提供了一种有包膜的病毒载体，其包含由包膜部分或完全包围的病毒颗粒，其中所述包膜包含脂质双层和一种或多种免疫抑制分子，诸如检查点免疫下调剂。在一些实施方案中，通过从病毒生产细胞的膜上“出芽”以产生有包膜的病毒(例如，AAV或慢病毒)。因此，嵌入在生产细胞膜中的免疫调节分子被转移到有包膜的病毒中，因为包膜包含生产细胞膜的一部分。如以下部分中详细描述的，有包膜的病毒载体可用于将核酸(转基因)递送至细胞或受试者，并被认为对宿主产生的免疫应答具有抗性。有包膜的病毒载体及其使用和生产方法在以下部分中详细介绍。

I.通用技术

本领域技术人员通常容易理解本文描述或引用的技术和程序并且通常使用常规方法来采用本文描述或引用的技术和程序，诸如，例如，Molecular Cloning:A LaboratoryManual(Sambrook等人,第4版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.,2012)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel,等人eds.,2003)；the series Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；PCR 2:APractical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames and G.R.Taylor eds.,1995)；Antibodies,A Laboratory Manual(Harlow and Lane,eds.,1988)；Culture of AnimalCells:A Manual of Basic Technique and Specialized Applications(R.I.Freshney,第6版,J.Wiley和Sons,2010)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis,ed.,Academic Press,1998)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,Plenum Press,1998)；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.,J.Wiley andSons,1993-8)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell,eds.,1996)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller andM.P.Calos,eds.,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人,eds.,1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人,eds.,1991)；ShortProtocols in Molecular Biology(Ausubel等人,eds.,J.Wiley and Sons,2002)；Immunobiology(C.A.Janeway等人,2004)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:APractical Approach(D.Catty.,ed.,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal Antibodies:APractical Approach(P.Shepherd和C.Dean,eds.,Oxford University Press,2000)；Using Antibodies:A Laboratory Manual(E.Harlow和D.Lane,Cold Spring HarborLaboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra,eds.,HarwoodAcademic Publishers,1995)；和Cancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等人,eds.,J.B.Lippincott Company,2011)中描述的广泛使用的方法。

II.定义

出于解释本说明书的目的，除非另外说明，否则以下定义将适用。只要适当，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。如果以下提出的任何定义与通过提述并入本文的任何文件相抵触，则以提出的定义为准。

如本文所使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数引用，除非另有说明。

术语“至少一种”之后是一个或多个项目的列表(例如，“A和B中的至少一种”)应理解为是指从所列项目中选择的一个项目(A或B)或所列项目中的两个或更多个的任意组合(A和B)，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。

应当理解，本文描述的本公开的方面和实施方案包括“包含”，“组成”这些方面和实施方式和“基本上由这些方面和实施方式组成”。

对于本文所述的所有组合物，以及使用本文所述的组合物的所有方法，所述组合物可以包含所列组分或步骤，或者可以“基本上由所列组分或步骤组成”或“由所列组分或步骤组成”。当组合物被描述为“基本上由所列组分组成”时，该组合物含有所列组分，并且可以含有实质上不影响所公开的方法的其他组分，但是不含有实质上影响所公开的方法的除明确列出的组分外的任何其他组分；或者，如果该组合物确实含有实质上影响所公开的方法的除所列的组分之外的额外组分，则该组合物不含有足够浓度或量的额外组分而实质上影响所公开的方法。当方法被描述为“基本上由所列步骤组成”时，该方法含有所列步骤，并且可以包含实质上不影响所公开的方法的其他步骤，但是该方法不含有实质上影响所公开的方法的除明确列出的那些步骤外的任何其他步骤。作为非限制性的具体实例，当组合物被描述为“基本上由组分组成”时，该组合物可以另外含有任何量的药学上可接受的载体、媒介物或稀释剂，以及不会实质上影响所公开的组合物或方法的性质的其他此类组分。

如本文所用，术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的各个值的通常误差范围。本文中对“约”值或参数的提及包括(并描述)针对该值或参数本身的实施方案。

本文所用的术语“多核苷酸”或“核酸”是指任意长度的核苷酸、核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或其组合的聚合形式。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合物或包含嘌呤和嘧啶碱基的聚合物、或其他天然、化学或生化修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基。多核苷酸的主链可包含糖和磷酸基团(通常可在RNA或DNA中发现)，或修饰或取代的糖或磷酸基团。可替换地，多核苷酸的主链可以包含合成亚基(诸如氨基磷酸酯)的聚合物，因此可以是寡脱氧核苷氨基磷酸酯(P-NH2)或混合型氨基磷酸酯-磷酸二酯低聚物。另外，可以通过合成互补链并在适当条件下退火该链，或通过使用DNA聚合酶与适当引物从头合成互补链，而从化学合成的单链多核苷酸产物获得双链多核苷酸。

术语“多肽”和“蛋白质”可互换地使用，是指氨基酸残基的聚合物，并且不限于任何特定的最小或最大长度。此类氨基酸残基的聚合物可含有天然或非天然氨基酸残基，并且包括但不限于肽、寡肽、氨基酸残基的二聚体、三聚体和多聚体。该定义涵盖全长蛋白质及其片段。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如，糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。此外，出于本发明的目的，“多肽”是指这样的蛋白质，其包括对天然序列的修饰，诸如缺失、添加和取代(本质上通常是保守的)，只要该蛋白质保持所期望的活性。这些修饰可能是故意的，如通过定点诱变，或者可能是偶然的，如通过产生蛋白质的宿主突变或由于PCR扩增引起的错误。

“病毒载体”是指包含一个或多个异源序列(即非病毒来源的核酸序列)的多核苷酸载体，所述异源序列的侧翼为至少一个或两个重复序列(例如，用于AAV的反向末端重复序列(ITR)或用于慢病毒的长末端重复序列(LTR))。异源核酸被称为“有效载荷(payload)”，其以“盒”的形式递送，并且通常侧接至少一个或两个重复序列(例如，用于AAV的反向末端重复序列(ITR)或用于慢病毒的长末端重复序列(LTR))。只要宿主细胞提供基本功能，此类病毒载体当存在于宿主细胞中时就可以复制并包装成感染性病毒颗粒。当病毒载体被整合到较大的多核苷酸中时(例如，整合到染色体中或另一种载体如用于克隆或转染的质粒中)，那么该病毒载体可以称为“前载体”，其可以在存在病毒复制和包装功能的情况下，通过复制和衣壳化而被“拯救”。可以将病毒载体包装到病毒衣壳中以生成“病毒颗粒”。在一些方面，病毒颗粒是指病毒衣壳连同病毒基因组和异源核酸有效载荷。

“异源的”意指衍生自与与其相比或者引入或整合其的实体其余部分在基因型上不同的实体。例如，通过基因工程技术引入至不同细胞类型的多核苷酸是异源多核苷酸(并且当表达时，可以编码异源多肽)。类似地，并入病毒载体的细胞序列(例如，基因或其部分)是相对于载体而言的异源核苷酸序列。异源核酸可以指源自与其余实体的核酸相比基因型不同的实体的核酸，或者被引入其余实体的中或并入其余实体中的核酸。异源也可用于指对其所引入的物种而言是非天然的其他生物组分(例如蛋白质)。例如，在细胞中由异源核酸表达的蛋白质相对于该细胞将是异源蛋白质。通过基因工程技术引入细胞或生物体中的核酸可被认为对于细胞或生物体是“外源的”，无论其对于该细胞或生物体而言是异源还是同源。因此，例如，可以使用载体将人基因的额外拷贝引入人细胞中。引入细胞中的基因，即使可能含有同源(天然)核酸序列，也会对细胞而言是外源的。

“分离的”分子(例如，核酸或蛋白质)或细胞意指已经从其自然环境的组分中鉴定且分离和/或回收的分子。

“工程化”或“基因工程化”以及类似的术语用于指被人工遗传修饰(例如，使用实验室技术)或由这种遗传修饰产生的生物材料。

如本文所用，“治疗”是用于获得有益或期望的临床结果的方法。出于本发明的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于减轻症状、降低疾病程度、稳定(例如不恶化)疾病状态、防止疾病扩散(例如转移)、延迟或减慢疾病的进展、改善或减轻疾病状态以及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可意味着与未接受治疗的预期存活相比的存活延长。

如本文所用，术语“预防性治疗”是指这样的治疗，其中已知或怀疑个体患有病症或处于患有病症的风险，但未表现出该病症的症状或最小症状。进行预防性治疗的个体可以在症状发作之前得到治疗。

“有效量”是足以产生有益或期望结果，包括临床结果(例如，症状的改善、临床终点的实现等)的量。有效量可以以一次或多次施用来施用。就疾病状态而言，有效量是足以改善、稳定或延迟疾病发展的量。

对于本文描述的任何结构和功能特征，确定这些特征的方法是本领域已知的。

III.载体

本文提供一种有包膜的病毒载体，其包含由包膜部分或完全包围的病毒颗粒，其中所述包膜包含脂质双层和一种或多种免疫抑制分子。效应载体的示意图如图1所示。在一些实施方案中，本文提供的有包膜的病毒载体可以比没有包膜或不被工程化成在包膜中包含免疫抑制分子的包膜的相同的有包膜的载体更有效和/或更有效地递送核酸转基因有效载荷。

在一些实施方案中，与天然病毒颗粒相比，有包膜的病毒颗粒经工程化以降低对病毒颗粒的免疫性。在一些实施方案中，与包含编码转基因产物的天然病毒颗粒的载体相比，有包膜的病毒颗粒经工程化以降低对病毒转基因产物的免疫性。在一些实施方案中，有包膜的病毒颗粒不以其典型的天然状态被包裹；例如腺相关病毒(AAV)颗粒和腺病毒颗粒。在其他实施方案中，天然病毒颗粒被包裹；例如，逆转录病毒和疱疹病毒，其中包膜经工程化以调节对病毒颗粒和/或病毒转基因产物的免疫性。

例如，在一些实施方案中，如本文所提供的，在包膜中包含免疫抑制分子的有包膜的病毒载体(例如，有包膜的AAV)在以单剂量向受试者施用后3周提供转基因表达水平，该转基因表达水平与在相同条件下(例如，相同的转基因、相同的受试者、相同的施用剂量和施用途径等，其中仅载体不同)通过施用相同类型的无包膜的病毒载体产生的转基因表达水平相比，增加了约50％或更多(约75％或更多、约100％或更多、约125％或更多、约150％或更多、约175％或更多，或甚至约200％或更多)。

另外，在一些实施方案中，如本文所提供的，在包膜中包含免疫抑制分子的有包膜的病毒载体(例如，有包膜的AAV)在以单剂量(例如，2×10¹¹至2×10¹²vg/kg)向受试者施用后3周提供转基因表达水平，该转基因表达水平与在相同条件下(例如，相同的转基因、相同的受试者、相同的施用剂量和施用途径等，其中仅载体不同)通过施用相同类型的不具有免疫抑制分子的有包膜的病毒载体(从相同类型的生产细胞中生产，但宿主细胞被工程化以表达免疫抑制分子)产生的转基因表达水平相比，增加了约20％或更多(约50％或更多、约75％或更多、约100％或更多、约125％或更多、约150％或更多、约175％或更多，或甚至约200％或更多)。

进一步认为，本文提供的包含免疫抑制分子的有包膜的载体使由于施用可溶性免疫抑制分子(例如CTLA4/Ig，阿巴西普)而产生的整体免疫抑制最小化。在一些实施方案中，如本文所提供的，在包膜中包含免疫抑制分子的有包膜的病毒载体(例如，有包膜的AAV)以有效量(例如，2×10¹¹vg/kg的剂量或5×10¹¹vg/kg的剂量)施用于受试者特别是人后，引起总体免疫抑制，该总体免疫抑制小于单次施用10mg/kg CTLA4/Ig(或者，在某些实施方案中为2mg/kg CTLA4/Ig)引起的总体免疫抑制，如在施用后2至3周内根据循环中的总抗IgG抗体的增加或抗原特异性抗体的增加，或由除衍生自所施用的载体的抗原外的抗原刺激的活化的CD4+或CD8+T细胞所测量的。

不希望受限于任何特定的理论或作用机制，认为本文提供的有包膜的病毒载体通过抑制宿主-免疫应答和/或使载体免受宿主产生的免疫应答的作用而逃避了对该载体或病毒转基因产物的宿主免疫应答效应。例如，本发明的载体可减少由宿主产生的载体中和抗体的数量，或可降低那些抗体中和该病毒的有效性。类似地，本发明的载体可以降低宿主产生的针对该病毒转基因产物的抗体的数量，或者可以降低那些抗体抑制该转基因产物表达的有效性。同样，本发明的载体可以降低通常与常规基因疗法载体有关的炎症，从而导致转基因表达增加。

因此，在一些实施方案中，与天然或无包膜的病毒颗粒或相同类型但包膜未被工程化以包含免疫抑制分子的有包膜的病毒颗粒相比，所述有包膜的病毒载体在宿主中具有降低的免疫原性。在一些实施方案中，与包含天然或无包膜的病毒颗粒或相同类型的但包膜未经工程化以在包膜中包括免疫抑制分子的相同类型的载体相比，该有包膜的病毒载体降低了宿主对该病毒转基因产物的免疫性。

(A)病毒载体

可以使用可以与脂质双层结合以提供有包膜的病毒的任何病毒载体。在一些实施方案中，有包膜的病毒颗粒是通常不以其天然状态(如腺相关病毒(AAV)颗粒和腺病毒颗粒)被包裹的类型。在其他实施方案中，天然病毒颗粒是通常被包膜的类型，如逆转录病毒和疱疹病毒。

在一些实施方案中，病毒载体包含AAV病毒颗粒。AAV是细小病毒家族的成员，通常不用作有包膜的病毒。可以使用任何适于递送转基因的AAV载体。AAV颗粒可包含来自任何血清型的AAV衣壳蛋白和AAV病毒基因组。AAV血清型包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12。在一些实施方案中，AAV病毒颗粒包含来自相同血清型的AAV病毒衣壳和AAV病毒基因组。在其他实施方案中，AAV病毒基因组和AAV衣壳具有不同的血清型。例如，AAV病毒衣壳可以是AAV6病毒衣壳，而AAV病毒基因组可以是AAV2病毒基因组。在一些实施方案中，AAV是自互补AAV(scAAV)。在一些实施方案中，所述载体是AAV8或AAV2/8载体，特别是scAAV8或scAAV2/8。

在一些实施方案中，有包膜的病毒载体包含慢病毒颗粒。可以使用适合于转基因递送的任何慢病毒，其包括但不限于人免疫缺陷病毒、猿猴免疫缺陷病毒和猫免疫缺陷病毒。通常，慢病毒载体是非复制型的。慢病毒载体可以是整合的或非整合的慢病毒载体。在一些实施方案中，慢病毒基因组缺乏vif、vpr、vpu、tat、rev、nef基因。在一些实施方案中，慢病毒基因组包含异源转基因、5'长末端重复序列(LTR)和3'LTR，其中3'LTR的U3区的全部部分被去除或被异源调控元件替代。

病毒颗粒，特别是病毒基因组，将包括待递送的异源核酸(例如，转基因)(“有效载荷”)或者可以是空载体。待递送的核酸的特定性质取决于期望的最终用途，并且本发明的有包膜的载体不限于任何特定用途或有效载荷。在一些实施方案中，有效载荷核酸将表达生物蛋白，例如因子VIII(例如人F8(UniProtKB-Q2VF45)、B结构域缺失的(BDD)人因子VIII基因的SQ-FVIII变体(Lind等人,1995 Eur J Biochem.Aug 15；232(1):19-27))或其他已知变体)、因子IX(例如，人因子IX UniProtKB-P00740；或人因子IX(R338L)“Padua”(Monahan等人,2015 Hum Gene Ther.,26(2):69-81，或其他已知变体)、肌微管素、SMN、RPE65、NADH-泛醌氧化还原酶链4、CHM、亨廷顿蛋白、α半乳糖苷酶A、酸性β葡糖苷酶、α葡糖苷酶、鸟氨酸转羧酶、精氨酰琥珀酸合成酶、β-球蛋白、γ-球蛋白、苯丙氨酸羟化酶或ALD。在一些实施方案中，有效载荷核酸序列编码人因子VIII氨基酸序列SEQ ID NO.1或衍生自氨基酸序列SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，有效载荷核酸序列编码与氨基酸序列SEQ IDNO.1具有超过约80％、85％、90％或99％中任一个的同一性的人因子VIII氨基酸序列。在一些实施方案中，有效载荷核酸序列编码人IX因子氨基酸序列SEQ ID NO.1。在一些实施方案中，有效载荷核酸序列编码与氨基酸序列SEQ ID NO.2具有超过约80％、85％、90％或99％中任一个的同一性的人因子IX氨基酸序列。在其他实施方案中，有效载荷核酸编码报告分子，例如绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、萤光素酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶。在其他实施方案中，有效载荷核酸编码治疗性核酸，例如siRNA、miRNA、shRNA、反义RNA、核酶或脱氧核酶。在其他实施方案中，有效载荷核酸编码一种或多种基因编辑基因产物，如RNA指导的核酸内切酶(例如，Cas9、CPF1等)、用于RNA指导的核酸内切酶的指导核酸、供体核酸或其组合。

异源核酸可以在合适的启动子的控制下，所述启动子可以是组织特异性启动子。例如，如果待将载体递送至肝脏，则为肝脏特异性启动子(例如，肝脏特异性人α1-抗胰蛋白酶(hAAT)启动子)。也可以包括可适合于给定应用的其他调控元件。

(B)具有免疫抑制分子的工程化包膜

本文提供的病毒载体的包膜包含部分或完全围绕病毒颗粒的脂质双层。可以使用任何脂质双层，包括天然存在的或合成的(人工)脂质双层。合成脂质双层包括例如脂质体。天然存在的脂质双层包括本领域已知的多种类型的细胞外囊泡(EV)中的任何一种，包括外来体、微囊泡(例如，脱落的囊泡或核外颗粒体)等。例如，载体包膜的脂质双层可以由细胞膜的一部分提供，该部分细胞膜是从生产细胞“萌芽”出来，特别是与相同类型的非经工程化的生产细胞相比，已经经工程化以过表达一种或多种免疫抑制分子的生产细胞。这样的脂质双层包括该脂质双层从其脱落的细胞膜的一部分。在一些实施方案中，脂质双层包含内体相关蛋白(Alix、Tsg101和Rab蛋白)；四跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81、CD82、CD53和CD37)；脂筏相关蛋白(糖基磷脂酰肌醇和阀蛋白)和/或包含胆固醇、鞘磷脂和/或甘油磷脂的脂质。在一些实施方案中，脂质双层是外来体脂质双层(例如，脂质双层是外来体)，特别是生产细胞的外来体脂质双层(即，从以其他方式衍生自生产细胞或由生产细胞产生的脱落物)，其经工程化以过表达一种或多种本文所述的免疫抑制分子。

尽管任何细胞类型都可以提供EV，但在本发明的背景下，避免使用肿瘤细胞作为生产细胞有时是有利的，因为有可能被有利于肿瘤细胞永生化的并且可能是致癌的或在其他方面对受试者有害的药剂(例如遗传元件)污染的可能性。因此，在一些实施方案中，脂质双层是非肿瘤EV脂质双层，例如非肿瘤外来体脂质双层(例如，脂质双层来自非肿瘤EV如非肿瘤外来体，这意味着EV或外来体不具有肿瘤细胞起源)。在其他实施方案中，脂质双层是来自293细胞(例如，HEK293或HEK293T)细胞的EV脂质双层(例如，外来体脂质双层或外来体)，特别是EV脂质双层(例如，外来体脂质双层或外来体)非肿瘤生产细胞(即，任何其他方式从生产细胞衍生或由生产细胞产生的脱落物)，例如293细胞，其经工程化以过表达一种或多种本文所述的免疫抑制分子。

包膜还包含免疫抑制分子。免疫抑制分子可以以任何方式与包膜的脂质双层结合。在一些实施方案中，免疫抑制分子嵌入在脂质双层内或脂质双层上。例如，免疫抑制分子可天然或合成地包含整合到脂质双层中的跨膜结构域。跨膜结构域是本领域已知的，包括但不限于PDGR跨膜结构域。并入跨膜结构域的方法(例如，通过产生融合蛋白)是本领域已知的。

所述免疫抑制分子可以是，与没有所述包膜或包膜未被工程化为包含免疫抑制分子的相同载体相比，降低宿主对本发明的有包膜的载体的免疫应答的任何分子。免疫抑制分子包括但不限于下列分子(例如蛋白质)，该分子通过任何机制下调宿主的免疫功能，所述机制例如通过刺激或上调免疫抑制剂或通过抑制或下调免疫刺激分子和激活剂，或与没有免疫抑制分子的有包膜的载体相比通过其他方式降低该有包膜的病毒载体的免疫原性。免疫抑制分子包括但不限于免疫检查点受体和配体。免疫抑制分子的非限制性实例包括，例如CTLA-4及其配体(例如，B7-1和B7-2)、PD-1及其配体(例如，PDL-1和PDL-2)、VISTA、TIM-3及其配体(例如GAL9)、TIGIT及其配体(例如CD155)、LAG3、VISTA和BTLA及其配体(例如HVEM)。还包括任何前述检查点分子的活性片段和衍生物；任何前述检查点分子的激动剂，如针对任何前述检查点分子的激动性抗体；阻断免疫刺激受体(共刺激受体)或其配体的抗体，如抗CD28抗体；或模拟免疫检查点分子的免疫功能的肽。在所期望的免疫抑制分子天然不包括跨膜结构域的程度上，可以通过产生包含细胞外结构域、跨膜结构域、以及全长细胞内结构域或维持嵌合分子表达并与其配体或受体结合所必需的任何最小细胞间结构域的嵌合分子，将免疫抑制分子工程化以嵌入脂质双层中；如图2所示。效应分子的跨膜结构域和细胞间结构域可包含免疫球蛋白Fc受体结构域(或其跨膜区)或维持表达和配体结合活性所必需的任何其他功能结构域。

包膜可以包含任何一种或多种不同类型的免疫抑制分子；然而，在一些实施方案中，包膜包含两种或更多种不同的免疫抑制分子(例如，三种或更多种不同的免疫抑制分子、四种或更多种不同的免疫抑制分子、或甚至五种或更多种不同的免疫抑制分子)的组合。因此，例如，在一些实施方案中，包膜包含两种或更多种不同的免疫检查点分子(例如，三种或更多种不同的免疫检查点分子、四种或更多种不同的免疫检查点分子，或者甚至五种或更多种不同的免疫检查点分子)的组合，任选地，两种或更多种(例如，三种或更多种、四种或更多种、或者甚至五种或更多种)选自以下的分子：CTLA-4及其配体(例如B7-1和B7-2)、PD-1及其配体(例如PDL-1和PDL-2)、VISTA、TIM-3及其配体(例如GAL9)、TIGIT及其配体(例如CD155)、LAG3、VISTA和BTLA及其配体(例如HVEM)；任何前述检查点分子的活性片段和衍生物；任何前述检查点分子的激动剂，诸如针对任何前述检查点分子的激动性抗体；阻断免疫刺激受体(共刺激受体)或其配体的抗体，诸如抗CD28抗体；或模拟免疫检查点分子的免疫功能的肽。在一些实施方案中，包膜单独或以多达4种不同分子的组合包含CTLA-4和PD-L1和PD-L2和VISTA，或这些的任何组合，或其他免疫抑制分子。在一些实施方案中，所述包膜包含CTLA-4和PD-L1、CTLA-4和PD-L2、CTLA-4和PD-1、CTLA-4和VISTA、CTLA-4和抗CD28、PD-1和VISTA、B7-1和PD-L1、B7-1和PD-L2、B7-1和PD-1、B7-1和VISTA、B7-1和抗CD28、B7-2和PD-L1、B7-2和PD-L2、B7-2和PD-1、B7-2和VISTA、B7-2和抗CD28、PD-1和VISTA、PD-1和抗CD-28、VISTA和抗CD28、PD-L1和VISTA、PD-L1和抗CD-28、PD-L2和VISTA、PD-L2和抗CD-28、或VISTA和抗CD28。在一些实施方案中，所述包膜包含CTLA4和PD-L1、CTLA和PD-L2、CTLA-4和VISTA、PD-L1和PD-L2、PD-L1和VISTA、PD-L2和VISTA、CTLA4和PD-L1和PD-L2、CTLA4和PD-L1和VISTA、CTLA4和PD-L2和VISTA、PD-L1和PD-L2和VISTA、或CTLA4和PD-L1和PD-L2和VISTA。在一些实施方案中，免疫抑制分子包括，或经工程化以包括，跨膜结构域。载体中使用的免疫抑制分子应该是将要被施用该载体的哺乳动物物种的免疫抑制分子。因此，对于人类使用，应使用免疫抑制分子的人类直系同源物，其蛋白质在本领域中是众所周知的。在特定的实施方案中，包含在包膜中的免疫抑制分子包含CTLA-4和PD-L1、基本上由CTLA-4和PD-L1组成或由CTLA-4和PD-L1组成。人CTLA-4由例如NCBI参考序列:NP_005205.2鉴定的蛋白质提供，且PD-L1由例如NCBI参考序列:NP_054862.1鉴定的蛋白质提供。在一些实施方案中，所述免疫抑制分子是(或衍生自)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的CTLA-4分子。在一些实施方案中，所述免疫抑制分子是(或衍生自)CTLA-4分子，其包含与氨基酸序列SEQID NO:3具有大于约80％、85％、90％或99％中任一的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫抑制分子是(或衍生自)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的PDL-1分子。在一些实施方案中，所述免疫抑制分子是(或衍生自)PDL-1分子，其包含与氨基酸序列SEQ ID NO:4具有大于约80％、85％、90％或99％任一的同一性的氨基酸序列。

所述包膜可以包含任何合适量或浓度的免疫抑制分子。在一些实施方案中，所述包膜包含足以与未经工程化以包含免疫抑制分子的相同的有包膜的载体相比改善转基因的递送和表达的量的免疫抑制分子。如结合产生有包膜的载体的方法更详细地解释的，可以通过工程化宿主(生产)细胞以便与天然宿主细胞相比过表达免疫抑制分子，来提供在包膜中包含足够浓度的免疫抑制分子的有包膜的载体。因此，在一些实施方案中，本文提供的载体的包膜包含一种或多种(或全部)免疫抑制分子，其量大于由未经工程化而过表达免疫抑制分子的相同宿主细胞产生的相同的有包膜的载体中的量。例如，在一些实施方案中，本文提供的载体的包膜包含一种或多种(或全部)免疫抑制分子，其量比由未经工程化而过表达免疫抑制分子的相同宿主细胞产生的相同的有包膜的载体大了约2倍或更多、约3倍或更多、约5倍或更多、约10倍或更多、约20倍或更多、约50倍或更多、甚至约100倍或更多(例如，约1000倍或更多)。在一些实施方案中，与未经工程化以过表达免疫抑制分子的相同宿主细胞相比，该宿主细胞经工程化以使一种或多种(或全部)免疫抑制分子过表达约2倍或更多、约3倍或更多、约5倍或更多、约10倍或更多、约20倍或更多、约50倍或更多、或甚至约100倍或更多(例如约1000倍或更多)。如上所述，在一些实施方案中，宿主细胞是经工程改造以过表达免疫抑制分子的非肿瘤宿主细胞，并且包膜包含来自经工程化以过表达免疫抑制分子的非肿瘤细胞的非肿瘤EV脂质双层(例如非肿瘤外来体脂质双层)。在特定的实施方案中，脂质双层是来自经工程化以过表达免疫抑制分子的293细胞(例如HEK293或其任何变体，例如HEK293E、HEK293F、HEK293T等)的EV脂质双层(例如，外来体脂质双层或外来体)。载体表面上(例如在载体包膜中)的免疫抑制分子的量可以使用本领域已知的多种技术来确定。例如，ELISA可用于测量载体表面上此类分子的量和确定不同载体上此类分子的相对量。

本文提供的有包膜的病毒载体可以具有任何合适的颗粒尺寸。通常，有包膜的病毒颗粒的大小在约30-600nm范围内，如约50-300nm，平均颗粒尺寸在约75-150nm范围内，如约80-120nm(例如约90-115nm)，如根据制造商的方案使用NANOSIGHT^TM NS300(MalvernInstruments,Malvern,United Kingdom)测量的。有包膜的病毒载体可各自在单个包膜内包含单个衣壳或多个衣壳。

(C)其他包膜部分

本文提供的有包膜的病毒载体可根据需要进一步在包膜中包含另外部分以提供不同的功能。例如，可以将包膜工程化为含有将载体靶向至所期望的细胞或组织类型的膜表面蛋白，例如，与所期望的细胞类型上的配体或受体特异性结合的分子。在一些病毒载体诸如AAV中，可以至少部分地通过病毒的血清型来确定载体的细胞或组织特异性。通过工程化本文提供的载体以含有与期望的细胞类型上的配体或受体结合的包膜结合的靶向部分(例如靶向蛋白)，载体使得能够进行更精确的靶向以及与仅依赖AAV血清型特异性相比，靶向更多选择的细胞类型。例如，为了使用人因子IX蛋白治疗血友病B，可以将载体的包膜工程化以包括特异性或优先结合在肝细胞上特异性或优先表达的表面蛋白(例如特异性结合去唾液酸糖蛋白受体1(ASGR1)的蛋白，诸如膜结合的抗原结合结构域(例如，克隆8D7的结构域，BD Biosciences)的部分。取决于对于载体的所期望目的，可以使用靶向不同细胞或组织类型的其他靶向分子。非限制性实例包括以下中的一种或多种：肝脏、肌肉、心脏、大脑(例如神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞等)、肾脏、肺、胰腺、胃、肠、骨髓、血细胞(例如白细胞、淋巴细胞、红细胞)、卵巢、子宫、睾丸或任何类型的干细胞。如结合产生载体的方法更详细地解释的，这种载体包膜可以通过使宿主细胞(产生细胞)工程化以表达高水平的膜结合的靶向部分来提供。因此，在一些实施方案中，本发明提供包含包膜的病毒载体，其中所述包膜包含免疫抑制分子和靶向分子。

所述有包膜的病毒载体可进一步包含改善载体的有效性或效率或改进产生的额外元件。例如，跨膜四蛋白CD9在生产细胞中的外源表达可以改进载体产生而不会降解载体性能(Shiller等人,Mol Ther Methods Clin Dev,(2018)9:278-287)。因此，载体可在包膜中包含CD9。然而，在一些实施方案中，有包膜的病毒载体基本上或完全不含显著损害该载体将核酸递送至受试者的效率或有效性、使该载体不适用于人类(例如，根据FDA规定)、或实质上损害载体产生的元件。

IV.应用和使用方法

本文提供的有包膜的病毒载体可用于将核酸(转基因)递送至细胞或受试者和表达核酸(转基因)。因此，本发明提供一种通过向细胞或受试者施用有包膜的病毒载体而将核酸(转基因)递送至细胞或受试者的方法。

在一些实施方案中，在包膜中包含免疫抑制分子的有包膜的病毒载体可以比相同类型的无包膜的病毒载体或相同类型但无经工程化以包含免疫抑制分子的包膜的有包膜的病毒载体更有效或更高效地将核酸(转基因)递送至细胞或受试者。在一些实施方案中，更有效或高效的递送导致每个靶细胞的病毒基因组拷贝更高，和/或转基因产物(如适用)在细胞或受试者中的更高表达。例如，在一些实施方案中，如本文所提供的，在包膜中包含免疫抑制分子的有包膜的病毒载体(例如，有包膜的AAV)在施用至受试者3周后提供转基因表达水平，该转基因表达水平与在相同条件下(例如，相同的转基因、相同的受试者、相同的施用剂量和施用途径等，例如仅载体不同)通过施用相同类型的无包膜的病毒载体相比，增加了约50％或更多(约75％或更多、约100％或更多、约125％或更多、约150％或更多、约175％或更多、或甚至约200％或更多)。同样，在一些实施方案中，如本文所提供的，在包膜中包含免疫抑制分子的有包膜的病毒载体(例如，有包膜的AAV)在向受试者施用后3周提供转基因表达水平，该转基因表达水平与在相同条件下(例如，相同的转基因、相同的受试者、相同的施用剂量和施用途径等，例如仅载体不同)通过施用相同类型而无免疫抑制分子的有包膜的病毒载体(从除了未经工程化以表达免疫抑制分子之外相同类型的生产细胞产生的)所产生的转基因表达水平相比，增加了约20％或更多(约约50％或更多、约75％或更多、约100％或更多、约125％或更多、约150％或更多、约175％或更多、或甚至约200％或更多)。

另外，或可替代地，认为包含免疫抑制分子的有包膜的病毒载体的一些实施方案降低了宿主对载体或转基因产物的免疫应答，或宿主免疫应答对转基因递送和/或表达的影响。因此，在一些实施方案中，本文提供的有包膜的病毒载体允许重复给药载体和/或向对给定病毒类型(例如，特定血清型的AAV)具有预先存在的免疫性的受试者给药。因此，在一方面，该方法包括将有包膜的病毒载体施用至先前暴露于有包膜的病毒载体中包含的相同类型病毒的受试者(通过天然暴露于天然病毒或通过先前施用该病毒载体)，或以其它方式具有预先存在的对该病毒的免疫性的受试者(例如，具有预先存在的对该病毒的抗体的患者)。因此，所述方法可以包括以重复给药方案向受试者施用有包膜的病毒载体，该重复给药方案包括两次或更多次分开施用一定剂量的有包膜的病毒载体，其以适当的时间间隔分开(例如，两次或更多次施用一定剂量的有包膜的病毒载体，其由至少一天、至少一周、至少两周、至少三周、至少四周或一个月、至少两个月、至少三个月、至少六个月或甚至至少一年或更长时间分开)。

尽管载体包含免疫抑制分子，但是在一定剂量的载体中免疫抑制分子的总量通常将小于当以可溶性免疫抑制剂施用时使用的免疫抑制分子的剂量。因此，例如，CTLA4/Ig可以以10mg/kg的剂量用作免疫抑制剂。但是，在一些实施方案中，单剂量的载体(例如2×10¹¹vg/kg或甚至5×10¹¹vg/kg)将具少得多的免疫抑制剂(例如，膜结合的CTLA4)，如少于约5mg/kg，少于约2mg/kg，少于约1mg/kg，或甚至少于约0.5mg/kg(例如，少于约0.1mg/kg)。因此，在一些实施方案中，本文提供的包含免疫抑制分子的有包膜的载体使由于施用可溶性免疫抑制剂(例如CTLA4/Ig，阿巴西普)而产生的整体免疫抑制最小化。在一些实施方案中，如本文提供的，当以有效量(例如，2×10¹¹vg/kg的剂量或5×10¹¹vg/kg的剂量)施用至受试者特别是人时，在包膜中包含免疫抑制分子的有包膜的病毒载体(例如，有包膜的AAV)引起的总体免疫抑制小于通过单次施用10mg/kg CTLA4/Ig(或者，在某些实施方案中为2mg/kg CTLA4/Ig)引起的总体免疫抑制，如在施用后2至3周内根据循环中的总抗IgG抗体的增加或抗原特异性抗体的增加，或由除衍生自所施用的载体的抗原外的抗原刺激而活化的CD4+或CD8+T细胞测量的。

可以施用有包膜的病毒载体以将核酸(转基因)递送至细胞或受试者以达到任何最终目的。在一些实施方案中，该最终目的可以是为了研究目的或用于蛋白质的生产或其他生物生产过程而在体外在细胞中表达该转基因。在其他实施方案中，有包膜的病毒载体用于治疗个体的疾病或病症。该疾病或病症可以是易于通过递送和表达(如果适用)核酸或转基因来治疗的任何疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是单基因疾病。在一些实施方案中，所述疾病或病症是溶酶体贮积病。在一些实施方案中，所述疾病或病症是糖原贮积病。在一些实施方案中，所述疾病或病症是血红蛋白病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是肌肉骨骼病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是CNS疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是心血管疾病，包括心脏病或中风。在一些实施方案中，所述疾病是癌症。

疾病的更具体的示例性但非限制性实例包括：肌球蛋白肌病、脊髓性肌萎缩症，莱伯先天性黑内障、血友病A和B、尼曼-匹克病(例如尼曼-匹克A型、尼曼-匹克B型、尼曼-匹克C型)、无脉络膜症、亨廷顿氏病、贝顿氏病、莱伯遗传性视神经病变、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)缺乏症、糖原贮积病、庞贝病、威尔森氏病、1型瓜氨酸血症、PKU(苯丙酮尿症)、肾上腺脑白质营养不良、血红蛋白病症(包括镰刀状细胞病)、β地中海贫血、中枢性疾病神经系统障碍和肌肉骨骼病症。因此，在所述方法的一些实施方案中，将有包膜的病毒载体施用至患有此类疾病或病症或处于发展成该疾病或病症的风险(例如携带用于该疾病或病症的突变或具有该疾病或病症的家族史)的受试者。此外，当用于治疗疾病或病症时，有包膜的病毒载体包含有效载荷核酸，其表达可治疗受试者的疾病。作为非限制性实例，该核酸可编码以下一种或多种：因子VIII、因子IX、肌微管素、SMN、RPE65、NADH-泛醌氧化还原酶链4、CHM、亨廷顿蛋白、α-半乳糖苷酶A、酸性β-葡糖苷酶、α-葡糖苷酶、鸟氨酸转羧酶、精氨酰琥珀酸合成酶、β-珠蛋白、γ-球蛋白、苯丙氨酸羟化酶或ALD。

所述方法还可以用于将治疗性核酸递送至细胞或受试者以治疗疾病或用于任何其他目的。在一些实施方案中，所述治疗性核酸是siRNA、miRNA、shRNA、反义RNA、核酶或脱氧核酶。

还提供一种使用有包膜的病毒载体将编码一种或多种基因编辑基因产物的核酸体外或体内递送至细胞的方法。在一些实施方案中，所述一种或多种基因编辑基因产物是RNA指导的核酸内切酶(例如，Cas9或Cpf1)、用于RNA指导的核酸内切酶的一种或多种指导序列和/或一种或多种供体序列。

在任何前述方法中，所述细胞可以是任何类型的细胞，特别是哺乳动物细胞或人细胞。所述受试者可以是任何受试者，诸如人、非人灵长类动物或其他哺乳动物(包括啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、兔子、狗、猫、马、牛、猪、绵羊)、青蛙或鸟。

在任何前述治疗方法中，通过任何合适的施用途径将治疗有效量的有包膜的病毒载体施用至受试者。有效剂量和施用途径将取决于适应症，并且可以由执业医生确定。在一些实施方案中，有包膜的病毒载体是全身性递送的；例如，静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、口服或通过吸入。在其他实施方案中，将有包膜的病毒载体直接递送至组织(例如，器官、肿瘤等)，或施用至CNS(例如，鞘内，施用至脊髓、至脑的特定部位，如脑室、下丘脑、垂体、大脑、小脑等)。

有包膜的病毒载体可以用作包含该有包膜的病毒载体和适当载体如药学上可接受的载体如盐水的组合物的一部分。用于配制病毒载体组合物的合适的载体、配制缓冲液和其他赋形剂是本领域已知的，并且适用于当前提供的组合物。

在具体的实施方案中，提供一种治疗血友病B的方法，该方法包括向需要治疗的受试者施用本文提供的有包膜的病毒载体，其中异源转基因编码人因子IX(FIX)蛋白(例如，人因子IX UniProtKB-P00740；人因子IX(R338L)“Padua”(Monahan等人,(2015)Hum GeneTher.,26(2):69-81，或其它已知的变体)，且其中病毒载体的包膜是包含CTLA-4和PD-L1的工程化脂质双层。在更具体的实施方案中，病毒载体是AAV(例如，AAV8或AAV2/8，或scAAV8或scAAV2/8)，任选地，其中所述包膜是由经工程化以包含CTLA-4和PD-L1的外来体(例如，来自经工程化以过表达CTLA-4和PD-L1的生产细胞(例如，HEK293细胞)的外来体)提供的。在一些实施方案中，人因子IX包含氨基酸序列SEQ ID NO.1。在一些实施方案中，人因子IX包含与氨基酸序列SEQ ID NO.2具有大于约80％、85％、90％或99％中任一的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CTLA-4包含或衍生自包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的CTLA。在一些实施方案中，CTLA-4包含与氨基酸序列SEQ ID NO.3具有大于约80％、85％、90％或99％中任一的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，PDL-1包含或衍生自包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的PDL-1。在一些实施方案中，PDL-1包含与氨基酸序列SEQ ID NO.4具有大于约80％、85％、90％或99％中任一的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述有包膜的病毒载体被递送至肝脏，并且异源转基因包括肝脏特异性启动子。在一些实施方案中，将载体静脉内施用，任选地施用至肝动脉。在一些实施方案中，将以受试者每千克体重2×10¹¹至2×10¹²个载体基因组(vg)(例如，受试者每千克体重2×10¹¹至8×10¹¹、或3×10¹¹至6×10¹¹个载体基因组)的剂量施用载体。在一些实施方式中，所述方法包括施用2个或更多个剂量(例如3个或更多个剂量、4个或更多个剂量、或5个或更多个剂量)，在剂量之间的间隔为至少一天(至少一天、至少一周、至少两周、至少三周、至少四周或一个月、至少两个月、至少三个月、至少六个月或甚至至少一年或更长)。

在另一特定的实施方案中，提供一种治疗血友病A的方法，该方法包括向需要治疗的受试者施用本文提供的有包膜的病毒载体，其中异源转基因编码人因子VIII(例如人F8(UniProtKB-Q2VF45)、B结构域缺失的(BDD)人F8基因的SQ-FVIII变体(Lind等人,(1995)Eur J Biochem.Aug 15；232(1):19-27)，或其他已知的变体)，且其中病毒载体的包膜是包含CTLA-4和PD-L1的工程化脂质双层。在更具体的实施方案中，病毒载体是AAV(例如，AAV8或scAAV8，或scAAV8或scAAV2/8)，任选地，其中所述包膜由经工程化以过表达CTLA-4和PD-L1的宿主细胞(例如，HEK293细胞)产生的外来体提供。在一些实施方案中，人因子VIII包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或衍生自氨基酸序列SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，人因子VIII包含与氨基酸序列SEQ ID NO.1具有大于约80％、85％、90％或99％中任一的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CTLA-4包含或衍生自包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的CTLA。在一些实施方案中，CTLA-4包含与氨基酸序列SEQ ID NO.3具有大于约80％、85％、90％或99％中任一的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，PDL-1包含或衍生自包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的PDL-1。在一些实施方案中，PDL-1包含与氨基酸序列SEQ ID NO.4具有大于约80％、85％、90％或99％中任一的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述有包膜的病毒载体被递送至肝脏，并且异源转基因包括肝脏特异性启动子。在一些实施方案中，将载体静脉内施用，任选地施用至肝动脉。在一些实施方案中，将以受试者每千克体重2×10¹¹至2×10¹²个载体基因组(vg)的剂量施用载体(例如受试者每千克体重2×10¹¹至8×10¹¹、或3×10¹¹至6×10¹¹个载体基因组(vg))。在一些实施方式中，所述方法包括施用2个或更多个剂量(例如3个或更多个剂量、4个或更多个剂量、或5个或更多个剂量)，在剂量之间的间隔为至少一天(至少一天、至少一周、至少两周、至少三周、至少四周或一个月、至少两个月、至少三个月、至少六个月、甚至至少一年或更长)。

VI.制备

本文提供的有包膜的病毒载体可以通过任何合适的方法产生。US2013/020559提供了非限制性示例，其通过提述并入本文。

一种特别有利的方法涉及从生产细胞系产生有包膜的载体，所述生产细胞系经工程化以过表达期望包含在载体的包膜中的免疫抑制分子。因此，本文提供一种通过如下制备如本文所述的具有包含免疫抑制分子的包膜的有包膜的病毒载体的方法，通过(a)在产生有包膜的病毒颗粒的条件下培养病毒生产细胞，其中所述病毒生产细胞包含编码一种或多种膜结合的免疫抑制分子的核酸，和(b)收集所述有包膜的病毒载体。

(A)生产细胞工程化

适用于常规产生用于病毒载体中的病毒的任何生产细胞都可以用来产生本发明的有包膜的病毒载体。合适的生产细胞包括但不限于293细胞(例如，HEK293、HEK293E、HEK293F、HEK293T等)和Hela细胞。可以通过任何合适的方法对生产细胞进行工程化，使其表达所期望的免疫抑制分子。在本发明的一些实施方案中，通过将编码免疫抑制分子的外源核酸(例如质粒或其他载体)稳定或瞬时转染到生产细胞中来表达免疫抑制分子。通过表达这种外源核酸，该生产细胞与未用编码免疫抑制分子的外源核酸转染的相同生产细胞相比过表达免疫抑制分子，从该生产细胞出芽的有包膜的病毒反过来与未经工程化以过表达免疫抑制分子的相同生产细胞中出芽的有包膜的病毒相比，具有增加的免疫抑制分子的量。在一些实施方案中，宿主细胞被工程化以与未经工程化以过表达免疫抑制分子的相同宿主细胞相比过表达免疫抑制分子了约2倍或更多、约3倍或更多、约5倍或更多、约10倍或更多、约20倍或更多、约50倍或更多、或甚至约100倍或更多。

免疫抑制分子的表达可以由启动子驱动，诸如组成型启动子(例如，CMV启动子)。在一些实施方案中，编码效应分子的基因之后是效应分子编码区下游的聚腺苷酸化信号(例如，血红蛋白聚腺苷酸化信号)。在一些实施方案中，将内含子插入启动子的下游。例如，可以在启动子下游使用血红蛋白衍生的人工内含子来增加效应分子的产生。用于瞬时转染的方法包括但不限于磷酸钙转染。产生表达单一或组合的免疫调节剂的稳定细胞系的方法包括但不限于逆转录病毒基因转移或连环体转染，然后进行选择(Throm等人(2009)Blood,113(21):5104-5110)。以这种方式使生产细胞工程化，以表达单一免疫抑制分子，或以表达不同的免疫抑制分子组合，如在有包膜的载体中所期望的。生产细胞也可以以本领域已知的其他方式进行工程化以提高生产率。例如，可以对生产细胞进行工程化以过表达跨膜四蛋白CD9以改善载体的产生(Shiller等人,(2018)Mol Ther Methods Clin Dev,9:278-287)。

(B)有包膜的病毒载体的产生

本文所述的有包膜的载体可以通过任何合适的技术从工程化的生产细胞中产生。使用的特定技术将取决于有包膜的病毒载体中使用的病毒类型。例如，可以通过共转染编码病毒产生基因(例如，Rep/Cap和辅助基因)的质粒或其他表达载体和包含AAV ITR和有效载荷核酸的质粒或其他构建体来产生有包膜的AAV载体。可以以任何方式完成转染，例如通过使用磷酸钙转染、聚乙烯亚胺(PEI)转染或通过使用基于HSV的生产系统(Booth等人(2004)Gene Ther,11(10):829-837)。就AAV而言，病毒基因可包括但不限于侧接AAV2 ITR的AAV2、5、6、8或9结构基因Rep和Cap，以及必要的辅助病毒基因(Ayuso等人(2014)HumGene Ther,25:977-987)。可以以任何合适的方式进行生产，例如通过使用粘附或悬浮液生产系统，在有或没有血清的情况下进行(Ayuso等人(2014)Hum Gene Ther,25:977-987；Xiao等人(1998),J Virol,72(3):2224-2232；Ryu等人(2013)Mol Ther,Volume 21.B，其方法可以任选地包括以下修改：在氯化铯或碘克沙醇梯度纯化之前，在亲和纯化柱上使用澄清的收获上清液用于富集有包膜的病毒)。当有包膜的病毒载体包括如本文所述的靶向部分时，该靶向部分可以用作亲和配体以帮助分离/纯化。用于产生有包膜的AAV载体的其他方法以及产生不同类型的有包膜的病毒(例如，有包膜的慢病毒)的方法是已知的并且可以被使用，只要生产细胞经工程化以过表达所期望的免疫抑制分子。在基于慢病毒的载体的情况下，通过共转染多个质粒使用相似的纯化方法来提供必需的病毒基因。

在根据经验确定的时间长度后收获载体，然后使用本领域已知的多种技术中的任一种进行纯化，条件是所用的纯化不会从病毒中去除包膜。纯化技术可以包括但不限于离子交换色谱、尺寸排阻色谱、亲和色谱和切向流过滤。超速离心，包括连续超速离心，可用于纯化有包膜的病毒载体。

可以使用多种方法增加每升生产细胞产生的有包膜的病毒载体的量。这些方法可以包括但不限于添加在发酵过程中抑制细胞凋亡或延迟细胞分裂为生产细胞的分子。改变生产细胞膜的脂质组成的分子或化合物也可用于增加每升的载体的产生。另外，增加外来体产生的化合物或分子，包括膜融合分子。

因此，在一些实施方案中，本发明提供一种产生本文所述的有包膜的病毒载体的方法，该方法包括(a)在产生有包膜的病毒颗粒的条件下培养病毒生产细胞，其中所述病毒生产细胞包含编码一种或多种膜结合的免疫抑制分子的核酸，和(b)收集所述有包膜的病毒载体。有包膜的病毒载体可以具有本文关于本发明的有包膜的病毒载体所述的任何特征和元件。此外，生产细胞可以具有前述部分中描述的任何特征和元件，并且产生有包膜的病毒载体的方法可以进一步包括通过例如用编码所述一种或多种膜结合的免疫抑制分子的核酸转化生产细胞来提供生产细胞的步骤。在一些实施方案中，与未经工程化以过表达免疫抑制分子的相同宿主细胞相比，该宿主细胞经工程化以使免疫抑制分子(例如，包含一种或多种编码免疫抑制分子的外源核酸)过表达约2倍或更多、约3倍或更多、约5倍或更多、约10倍或更多、约20倍或更多、约50倍或更多、或甚至约100倍或更多。在一些实施方案中，宿主细胞是非肿瘤细胞，诸如293细胞(例如，HEK293、HEK293T、HEK293E、HEK293F等)。

有包膜的病毒载体的收集可包括从培养的病毒生产细胞的培养液中分离有包膜的病毒。可以通过任何不从病毒中去除包膜的方法来进行收集。因此，例如，收集可以包括通过超速离心或其他合适的方法从细胞培养物中分离有包膜的病毒。所述方法优选避免使用去垢剂。此外，所述方法优选在收集有包膜的病毒之前最小化或避免生产细胞的裂解，因为生产细胞的裂解将无包膜的病毒释放到培养物中。

在一些实施方案中，有包膜的病毒载体是有包膜的AAV载体，并且病毒生产细胞包含(i)编码AAV rep和cap基因的核酸，(ii)编码包含转基因和至少一个ITR的AAV病毒基因组的核酸，和(iii)编码AAV辅助基因的核酸。在一些实施方案中，将编码AAV rep和cap基因和/或AAV病毒基因组的核酸瞬时引入生产细胞系。在一些实施方案中，编码AAV rep和cap基因和/或AAV病毒基因组的核酸被稳定地保持在生产细胞系中。在一些实施方案中，将编码AAV rep和cap基因和/或AAV病毒基因组的核酸稳定整合到生产细胞系的基因组中。在一些实施方案中，AAV基因组包含两个AAV ITR(例如，病毒基因组包含侧接AAV ITR的异源转基因)。在一些实施方案中，质粒、腺病毒、稳定整合到细胞基因组中的核酸或单纯疱疹病毒(HSV)中的一种或多种提供一种或多种AAV辅助功能。在一些实施方案中，AAV辅助功能包括腺病毒E1A功能、腺病毒E1B功能、腺病毒E2A功能、腺病毒E4功能和腺病毒VA功能中的一种或多种。在一些实施方案中，将一种或多种AAV辅助功能稳定地整合到宿主细胞基因组中，并且其他AAV辅助功能被瞬时递送。例如，在一些实施方案中，在表达腺病毒E1A和E1B功能的293细胞中制备AAV有包膜的载体。其他辅助功能是暂时递送的；例如，通过质粒或复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，AAV辅助功能包含HSV UL5功能、HSV UL8功能、HSV UL52功能和HSV UL29功能中的一种或多种。

在一些实施方案中，本发明提供了产生如本文所述的有包膜的慢病毒载体的方法，该方法包括(a)在产生有包膜的病毒颗粒的条件下培养病毒生产细胞，其中所述病毒生产细胞包含编码一种或多种一种或多种膜结合的免疫抑制分子的核酸，和(b)收集所述有包膜的慢病毒载体。在一些实施方案中，慢病毒载体是人免疫缺陷病毒、猿猴免疫缺陷病毒或猫免疫缺陷病毒。在一些实施方案中，病毒生产细胞包含(a)编码慢病毒gag基因的核酸，(b)编码慢病毒pol基因的核酸，(c)编码包含转基因、5'长末端重复序列(LTR)和3'LTR的慢病毒转移载体的核酸，其中3'LTR的U3区域的全部或部分被异源调控元件替代或如所述(Ryu等人(2013)Mol Ther 2013,Volume 21.B.；Meliani等人(2015)Hum Gene TherMethods,26:45-53)。

VI.试剂盒

本发明还提供用于根据本发明的方法向细胞或受试者施用本文所述的有包膜的病毒载体的试剂盒。所述试剂盒可包含本发明的任何有包膜的病毒载体。例如，所述试剂盒可包括本文所述的有包膜的AAV载体或有包膜的慢病毒载体。

在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包括用于效应载体递送的说明书。从商业和用户的角度来看，本文所述的试剂盒可进一步包括其他所需材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器和带有用于进行本文所述的任何方法的说明书的包装插页。也可以包括合适的包装材料，并且可以是本领域已知的任何包装材料，包括例如小瓶(例如密封的小瓶)、器皿、安瓿、瓶、广口瓶、软包装(例如密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。这些制品可以进一步被灭菌和/或密封。在一些实施方案中，所述试剂盒包含使用本文所述的任何方法和/或效应载体来治疗本文所述的疾病或病症的说明书。所述试剂盒可包括适合于注射至个体的药学上可接受的载体，以及缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器和带有用于对哺乳动物进行注射的说明书的包装插页中的一种或多种。

在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含一种或多种本文所述的缓冲液和/或药学上可接受的赋形剂(例如，如REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Pub.Co.,N.J.1991)中所述的)。在一些实施方案中，所述试剂盒包括一种或多种本文所述的药学上可接受的赋形剂、载体、溶液和/或额外的成分。本文所述的试剂盒可以单个单位剂量或多剂量形式包装。所述试剂盒的内容物通常被配制成无菌的，并且可以被冻干或以基本上等渗的溶液形式提供。

示例性实施例

仅出于进一步说明本文提供的组合物和方法的目的提供以下实施方案，并且以下实施方案不限制本发明：

实施方案1.一种包含有包膜的病毒载体的组合物,其中所述有包膜的病毒载体包含由包膜包围的病毒颗粒,其中所述包膜包含一种或多种提供免疫效应功能的分子(即，免疫抑制分子)。

实施方案2.根据实施方案1所述的组合物，其中与无免疫效应分子的载体相比，所述免疫效应功能降低所述有包膜的载体的免疫原性。

实施方案3.根据实施方案1或2所述的组合物，其中所述免疫效应功能刺激免疫抑制剂。

实施方案4.根据实施方案1或2所述的组合物，其中所述免疫效应功能抑制免疫刺激分子。

实施方案5.根据实施方案1-4中任一项所述的组合物，其中包膜包含刺激免疫抑制剂的分子和抑制免疫刺激分子的分子。

实施方案6.根据实施方案1-5中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种提供免疫效应功能的分子包括CTLA4、B7-1、B7-2、PD-1、PD-L1、PD-L2、CD28、VISTA TIM-3、GAL9、TIGIT、CD155、LAG3、VISTA、BTLA或HVEM中的一种或多种。

实施方案7.根据实施方案1-6中任一项所述的组合物，其中所述包膜包含CTLA4和PD-L1、CTLA和PD-L2、CTLA-4和VISTA、PD-L1和PD-L2、PD-L1和VISTA、PD-L2和VISTA、CTLA4和PD-L1和PD-L2、CTLA4和PD-L1和VISTA、CTLA4和PD-L2和VISTA、PD-L1和PD-L2和VISTA或CTLA4和PD-L1和PD-L2和VISTA。

实施方案8.根据实施方案1-7中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种提供免疫效应功能的分子包含跨膜结构域。

实施方案9.根据实施方案1-8中任一项所述的组合物，其中所述包膜进一步包含将所述载体靶向至一种或多种细胞类型的靶向分子。

实施方案10.根据实施方案9所述的组合物，其中所述靶向分子为所述有包膜的载体赋予组织特异性。

实施方案11.根据实施方案10所述的组合物，其中所述靶向分子是抗体。

实施方案12.根据实施方案11所述的组合物，其中所述抗体是抗体8D7。

实施方案13.根据实施方案9-12中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种靶向分子包含跨膜结构域。

实施方案14.根据实施方案1-13中任一项所述的组合物，其中所述病毒载体包含病毒颗粒。

实施方案15.根据实施方案14所述的组合物，其中所述病毒颗粒包含病毒衣壳和病毒基因组，或有包膜的衣壳和病毒基因组，诸如逆转录病毒。

实施方案16.根据实施方案15所述的组合物，其中所述病毒基因组包含一种或多种异源转基因。

实施方案17.根据实施方案16所述的组合物，其中所述异源转基因编码多肽。

实施方案18.根据实施方案17所述的组合物，其中所述异源转基因编码治疗性多肽或报告多肽。

实施方案19.根据实施方案18所述的组合物，其中所述治疗性多肽是因子VIII、因子IX、肌微管素、SMN、RPE65、NADH-泛醌氧化还原酶链4、CHM、亨廷顿蛋白、α-半乳糖苷酶A、酸性β葡糖苷酶、α-葡糖苷酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨酰琥珀酸合成酶、β-球蛋白、γ-球蛋白、苯丙氨酸羟化酶或ALD。

实施方案20.根据实施方案16所述的组合物，其中所述异源转基因编码治疗性核酸。

实施方案21.根据实施方案20所述的组合物，其中所述治疗性核酸是siRNA、miRNA、shRNA、反义RNA、核酶或脱氧核酶。

实施方案22.根据实施方案16所述的组合物，其中所述异源转基因编码一种或多种基因编辑基因产物。

实施方案23.根据实施方案22所述的组合物，其中所述一种或多种基因编辑基因产物是CAS核酸酶和/或一种或多种指导序列和/或一种或多种供体序列。

实施方案24.根据实施方案1-23中任一项所述的组合物，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体或慢病毒载体。

实施方案25.根据实施方案1-24中任一项所述的组合物，其中所述病毒载体是腺相关病毒载体。

实施方案26.根据实施方案25所述的组合物，其中所述AAV载体包含来自人AAV血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12的衣壳。

实施方案27.根据实施方案25或26所述的组合物，其中所述AAV载体包含AAV病毒基因组，其包含来自人AAV血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、rAAV10的反向末端重复(ITR)序列。

实施方案28.根据实施方案27所述的组合物，其中所述AAV衣壳和所述AAV ITR来自相同的血清型或来自不同的血清型。

实施方案29.根据实施方案1-24所述的组合物，其中所述病毒载体是慢病毒载体。

实施方案30.根据实施方案29所述的组合物，其中所述慢病毒载体衍生自人免疫缺陷病毒、猿猴免疫缺陷病毒或猫免疫缺陷病毒。

实施方案31.根据实施方案29或30所述的组合物，其中所述慢病毒载体是非复制型的。

实施方案32.根据实施方案29-30中任一项所述的组合物，其中所述慢病毒载体是非整合的。

实施方案33.一种药物组合物，其包含根据实施方案1-32中任一项所述的组合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂。

实施方案34.一种将转基因递送至个体的方法，其包括向所述个体施用包含有包膜的病毒载体的组合物，其中所述有包膜的病毒载体包含由包膜包围的病毒颗粒，其中所述包膜包含一种或多种提供免疫效应功能的分子且其中所述病毒颗粒包含包含所述转基因的病毒基因组。

实施方案35.一种治疗患有疾病或病症的个体的方法，其包括向有此需要的个体施用包含有包膜的病毒载体的组合物，其中所述有包膜的病毒载体包含由包膜包围的病毒颗粒，其中所述包膜包含一种或多种提供免疫效应功能的分子且其中所述病毒颗粒包含包含治疗性转基因的病毒基因组。

实施方案36.根据实施方案34或35所述的方法，其中所述免疫效应功能降低所述有包膜的载体的免疫原性。

实施方案37.根据实施方案34-36中任一项所述的组合物，其中所述免疫效应功能刺激免疫抑制剂。

实施方案38.根据实施方案34-36中任一项所述的方法，其中所述免疫效应功能抑制免疫刺激分子。

实施方案39.根据实施方案34-38中任一项所述的方法，其中包膜包含刺激免疫抑制剂的分子和抑制免疫刺激分子的分子。

实施方案40.根据实施方案34-39中任一项所述的方法，其中所述一种或多种提供免疫效应功能的分子包括CTLA4、B7-1、B7-2、PD-1、PD-L1、PD-L2、CD28、VISTA、TIM-3、GAL9、TIGIT、CD155、LAG3、VISTA、BTLA或HVEM中的一种或多种。

实施方案41.根据实施方案34-40中任一项所述的方法，其中所述包膜包含CTLA4和PD-L1、CTLA和PD-L2、CTLA-4和VISTA、PD-L1和PD-L2、PD-L1和VISTA、PD-L2和VISTA、CTLA4和PD-L1和PD-L2、CTLA4和PD-L1和VISTA、CTLA4和PD-L2和VISTA、PD-L1和PD-L2和VISTA或CTLA4和PD-L1和PD-L2和VISTA。

实施方案42.根据实施方案34-41中任一项所述的方法，其中所述一种或多种提供免疫效应功能的分子包含跨膜结构域。

实施方案43.根据实施方案34-42中任一项所述的方法，其中所述包膜进一步包含将所述载体靶向至一种或多种细胞类型的靶向分子。

实施方案44.根据实施方案43所述的方法，其中所述靶向分子为所述有包膜的载体赋予组织特异性。

实施方案45.根据实施方案44所述的方法，其中所述靶向分子是抗体。

实施方案46.根据实施方案45所述的方法，其中所述抗体是抗体8D7。

实施方案47.根据实施方案43-46中任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶向分子包含跨膜结构域。

实施方案48.根据实施方案34-47中任一项所述的方法，其中所述异源转基因编码多肽。

实施方案49.根据实施方案48所述的方法，其中所述异源转基因编码治疗性多肽或报告多肽。

实施方案50.根据实施方案49所述的方法，其中所述治疗性多肽是因子VIII、因子IX、因子VIII、因子IX、肌微管素、SMN、RPE65、NADH-泛醌氧化还原酶链4、CHM、亨廷顿蛋白、α-半乳糖苷酶A、酸性β葡糖苷酶、α-葡糖苷酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨酰琥珀酸合成酶、β-球蛋白、γ-球蛋白、苯丙氨酸羟化酶或ALD。

实施方案51.根据实施方案34-47中任一项所述的方法，其中所述异源转基因编码治疗性核酸。

实施方案52.根据实施方案51所述的方法，其中所述治疗性核酸是siRNA、miRNA、shRNA、反义RNA、核酶或脱氧核酶。

实施方案53.根据实施方案52所述的方法，其中所述异源转基因编码一种或多种基因编辑基因产物。

实施方案54.根据实施方案34-53中任一项所述的方法，其中所述一种或多种基因编辑基因产物是CAS核酸酶和/或一种或多种指导序列和/或一种或多种供体序列。

实施方案55.根据实施方案34-54中任一项所述的方法，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体或慢病毒载体。

实施方案56.根据实施方案34-55中任一项所述的方法，其中所述病毒载体是腺相关病毒载体。

实施方案57.根据实施方案56所述的方法，其中所述AAV载体包含来自人AAV血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12的衣壳。

实施方案58.根据实施方案56或57所述的方法，其中所述AAV载体包含AAV病毒基因组，其包含来自人AAV血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、rAAV10的反向末端重复(ITR)序列。

实施方案59.根据实施方案58所述的方法，其中所述AAV衣壳和所述AAV ITR来自相同的血清型或来自不同的血清型。

实施方案60.根据实施方案34-55所述的方法，其中所述病毒载体是慢病毒载体。

实施方案61.根据实施方案60所述的方法，其中所述慢病毒载体衍生自人免疫缺陷病毒、猿猴免疫缺陷病毒或猫免疫缺陷病毒。

实施方案62.根据实施方案60或61所述的方法，其中所述慢病毒载体是非复制型的。

实施方案63.根据实施方案60-62中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体是非整合的。

实施方案64.根据实施方案34-63中任一项所述的方法，其中所述组合物是包含有包膜的病毒载体的药物和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

实施方案65.根据实施方案34-64中任一项所述的方法，其中所述个体是人。

实施方案66.根据实施方案35所述的方法，其中所述疾病或病症是单基因疾病。

实施方案67.根据实施方案35所述的方法，其中所述疾病或病症是肌微管素肌病、脊髓性肌萎缩症、莱伯氏先天性黑内障、血友病A、血友病B、无脉络膜症、亨廷顿氏病、贝顿氏病、莱伯遗传性视神经病、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)缺乏症、庞贝病、法布里疾病、1型瓜氨酸血症、苯丙酮尿症(PKU)、肾上腺脑白质营养不良、镰刀状细胞病或β地中海贫血。

实施方案68.一种产生具有降低的免疫原性的有包膜的病毒载体的方法，所述方法包括a)在生成有包膜的病毒颗粒的条件下培养病毒生产细胞，其中所述病毒生产细胞包含编码一种或多种膜结合的免疫效应功能的核酸，所述免疫效应功能降低所述有包膜的载体的免疫原性，和b)收集所述有包膜的病毒载体。

实施方案69.根据实施方案68所述的方法，其中所述免疫效应功能降低有包膜的载体的免疫原性。

实施方案70.根据实施方案68或69所述的方法，其中所述免疫效应功能刺激免疫抑制剂。

实施方案71.根据实施方案68或69所述的方法，其中所述免疫效应功能抑制免疫刺激分子。

实施方案72.根据实施方案68-71中任一项所述的方法，其中所述病毒生产细胞包含编码刺激免疫抑制剂的分子和抑制免疫刺激分子的分子的核酸。

实施方案73.根据实施方案68-72中任一项所述的方法，其中所述一种或多种提供免疫效应功能的分子包括CTLA4、B7-1、B7-2、PD-1、PD-L1、PD-L2、CD28、VISTA、TIM-3、GAL9、TIGIT、CD155、LAG3、VISTA、BTLA或HVEM中的一种或多种。

实施方案74.根据实施方案68-73中任一项所述的方法，其中所述病毒生产细胞包含编码CTLA4和PD-L1、CTLA和PD-L2、CTLA-4和VISTA、PD-L1和PD-L2、PD-L1和VISTA、PD-L2和VISTA、CTLA4和PD-L1和PD-L2、CTLA4和PD-L1和VISTA、CTLA4和PD-L2和VISTA、PD-L1和PD-L2和VISTA或CTLA4和PD-L2和PD-L1和VISTA的核酸。

实施方案75.根据实施方案68-74中任一项所述的方法，其中所述一种或多种提供免疫效应功能的分子包含跨膜结构域。

实施方案76.根据实施方案68-75中任一项所述的方法，其中将编码所述一种或多种提供免疫效应功能的分子的核酸瞬时引入所述病毒生产细胞。

实施方案77.根据实施方案68-76中任一项所述的方法，其中编码所述一种或多种提供免疫效应功能的分子的核酸被稳定地保持在所述病毒生产细胞中。

实施方案78.根据实施方案77所述的方法，其中编码所述一种或多种提供免疫效应功能的分子的核酸被整合到所述病毒生产细胞的基因组中。

实施方案79.根据实施方案68-78中任一项所述的方法，其中所述病毒生产细胞包含编码一种或多种将所述载体靶向至一种或多种细胞类型的靶向分子的核酸。

实施方案80.根据实施方案79所述的方法，其中所述靶向分子为所述有包膜的载体赋予组织特异性。

实施方案81.根据实施方案80所述的方法，其中所述靶向分子是抗体。

实施方案82.根据实施方案71所述的方法，其中所述抗体是抗体8D7。

实施方案83.根据实施方案79-82中任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶向分子包含跨膜结构域。

实施方案84.根据实施方案79-83中任一项所述的方法，其中将编码所述一种或多种靶向分子的核酸瞬时引入所述病毒生产细胞。

实施方案85.根据实施方案79-84中任一项所述的方法，其中编码所述一种或多种靶向分子的核酸被稳定地保持在所述病毒生产细胞中。

实施方案86.根据实施方案85所述的方法，其中将编码所述一种或多种分子靶向分子的核酸整合到所述病毒生产细胞的基因组中。

实施方案87.根据实施方案68-86中任一项所述的方法，其中所述有包膜的病毒载体是有包膜的AAV载体。

实施方案88.根据实施方案87所述的方法，其中所述病毒生产细胞包含a)编码AAVrep和cap基因的核酸，b)编码包含转基因和至少一种ITR的AAV病毒基因组的核酸，和c)AAV辅助功能。

实施方案89.根据实施方案88所述的方法，其中所述编码AAV rep和cap基因的核酸和/或AAV病毒基因组被瞬时引入所述生产细胞系。

实施方案90.根据实施方案88所述的方法，其中所述编码AAV rep和cap基因的核酸和/或AAV病毒基因组被稳定地保持在所述生产细胞系中。

实施方案91.根据实施方案90所述的方法，其中所述编码AAV rep和cap基因的核酸和/或AAV病毒基因组被稳定地整合到所述生产细胞系的基因组中。

实施方案92.根据实施方案88-91中任一项所述的方法，其中所述rAAV基因组包含两个AAV ITR。

实施方案93.根据实施方案88-92中任一项所述的方法，其中质粒、腺病毒、稳定整合到细胞基因组中的核酸或单纯疱疹病毒(HSV)中的一种或多种提供一种或多种AAV辅助功能。

实施方案94.根据实施方案88-93中任一项所述的方法，其中AAV辅助功能包含腺病毒E1A功能、腺病毒E1B功能、腺病毒E2A功能、腺病毒E4功能和腺病毒VA功能中的一种或多种。

实施方案95.根据实施方案88-93中任一项所述的方法，其中AAV辅助功能包括HSVUL5功能、HSV UL8功能、HSV UL52功能和HSV UL29功能中的一种或多种。

实施方案96.根据实施方案68-86中任一项所述的方法，其中所述有包膜的病毒载体是慢病毒载体。

实施方案97.根据实施方案96所述的方法，其中所述慢病毒载体是人免疫缺陷病毒、猿猴免疫缺陷病毒或猫免疫缺陷病毒。

实施方案98.根据实施方案96或97所述的方法，其中病毒生产细胞包含a)编码慢病毒gag基因的核酸，b)编码慢病毒pol基因的核酸，c)编码包含转基因、5'长末端重复序列(LTR)和3'LTR的慢病毒转移载体的核酸，其中3'LTR的U3区域的全部或部分被异源调节元件替代。

实施方案99.根据实施方案68-98中任一项所述的方法，其中所述有包膜的载体被进一步纯化。

实施方案100.一种试剂盒，其包含根据实施方案1-33中任一项所述的组合物。

实施方案101.根据实施方案100所述的试剂盒，其进一步包含使用说明书。

实施方案102.一种组合物，其用于按照实施方案34-67中任一项所述将核酸递送至有此需要的个体。

实施方案103.一种组合物，其用于按照实施方案34-67中所述治疗有此需要的个体的疾病或病症。

实施方案104.根据实施方案1-33中任一项所述的组合物在制备用于将核酸递送至有此需要的个体的药物中的用途。

实施方案105.根据实施方案1-33中任一项所述的组合物在制备用于治疗患有疾病或病症的个体的药物中的用途。

实施方案106.根据实施方案105所述的用途，其中所述疾病或病症是肌微管素肌病、脊髓性肌萎缩症、莱伯氏先天性黑内障、血友病A、血友病B、无脉络膜症、亨廷顿氏病、贝顿氏病、莱伯遗传性视神经病,鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)缺乏症、庞贝病、法布里疾病、1型瓜氨酸血症、苯丙酮尿症(PKU)、肾上腺脑白质营养不良、镰刀状细胞病或β地中海贫血.

实施方案107.一种制品，其包含根据实施方案1-33中任一项所述的组合物。

实施方案108.一种有包膜的病毒载体，其包含由包膜包围的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒包含异源转基因，且所述包膜包含脂质双层和一种或多种免疫抑制分子。

实施方案109.根据实施方案108所述的有包膜的病毒载体，其中与在脂质双层中无免疫抑制分子的相同类型的载体相比，所述有包膜的病毒具有降低的免疫原性。

实施方案110.根据实施方案108或109所述的有包膜的病毒载体，其中所述一种或多种免疫抑制分子包含一种或多种免疫检查点蛋白。

实施方案111.根据实施方案108-110中任一项所述的有包膜的病毒载体，其中所述一种或多种免疫抑制分子包含CTLA4、B7-1、B7-2、PD-1、PD-L1、PD-L2、CD28、VISTA、TIM-3、GAL9、TIGIT、CD155、LAG3、VISTA、BTLA或HVEM中的一种或多种。

实施方案112.根据实施方案108-111中任一项所述的有包膜的病毒载体，其中所述包膜包含两种或更多种、三种或更多种、或四种或更多种不同的免疫抑制分子；或包含两种或更多种、三种或更多种、或四种或更多种不同的检查点蛋白。

实施方案113.根据实施方案108-112中任一项所述的有包膜的病毒载体，其中所述包膜包含CTLA4和PD-L1；CTLA和PD-L2；CTLA-4和VISTA；PD-L1和PD-L2；PD-L1和VISTA；PD-L2和VISTA；CTLA4和PD-L1和PD-L2；CTLA4和PD-L1和VISTA；CTLA4和PD-L2和VISTA；PD-L1和PD-L2和VISTA；或CTLA4和PD-L1和PD-L2和VISTA。

实施方案114.根据实施方案108-113中任一项所述的有包膜的病毒载体，其中所述免疫抑制分子中的一种或多种包含跨膜结构域。

实施方案115.根据实施方案108-114中任一项所述的有包膜的病毒载体，其中所述包膜进一步包含靶向分子。

实施方案116.根据实施方案115所述的有包膜的病毒载体，其中所述靶向分子为所述有包膜的载体赋予细胞特异性或组织特异性。

实施方案117.根据实施方案116所述的有包膜的病毒载体，其中所述靶向分子是抗体。

实施方案118.根据实施方案115-117中任一项所述的有包膜的病毒载体，其中所述一种或多种靶向分子包含跨膜结构域。

实施方案119.根据实施方案108-118中任一项所述的有包膜的病毒载体，其中所述包膜包含来自细胞的细胞膜的一部分，所述细胞包含编码所述一种或多种免疫抑制分子的一种或多种外源核酸。

实施方案120.根据实施方案119所述的有包膜的病毒载体，其中所述病毒颗粒包含病毒衣壳和病毒基因组，且所述病毒基因组包含异源转基因。

实施方案121.根据实施方案120所述的有包膜的病毒载体，其中所述异源转基因编码多肽。

实施方案122.根据实施方案121所述的有包膜的病毒载体，其中所述异源转基因编码治疗性多肽或报告多肽。

实施方案123.根据实施方案122所述的有包膜的病毒载体，其中所述异源转基因编码因子VIII、因子IX、肌微管素、存活运动神经元蛋白(SMN)、类视黄醇异构水解酶(RPE65)、NADH-泛醌氧化还原酶链4、脉络膜蛋白(CHM)、亨廷顿蛋白、α-半乳糖苷酶A、酸性β葡糖苷酶、α-葡糖苷酶、鸟氨酸转羧酶、精氨酰琥珀酸合成酶、β-球蛋白、γ-球蛋白、苯丙氨酸羟化酶或肾上腺脑白质营养不良蛋白(ALD)。

实施方案124.根据实施方案120所述的有包膜的病毒载体，其中所述异源转基因编码治疗性核酸。

实施方案125.根据实施方案124所述的有包膜的病毒载体，其中所述治疗性核酸是siRNA、miRNA、shRNA、反义RNA、核酶或脱氧核酶。

实施方案126.根据实施方案120所述的有包膜的病毒载体，其中所述异源转基因编码一种或多种基因编辑产物。

实施方案127.根据实施方案126所述的有包膜的病毒载体，其中所述一种或多种基因编辑产物是RNA指导的核酸酶、指导核酸和/或供体核酸。

实施方案128.根据实施方案108-127中任一项所述的有包膜的病毒载体，其中所述病毒颗粒包含腺相关病毒载体(AAV)。

实施方案129.根据实施方案128所述的有包膜的病毒载体，其中所述AAV载体包含来自人AAV血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12的衣壳。

实施方案130.根据实施方案128或129所述的有包膜的病毒载体，其中所述AAV包含包含反向末端重复(ITR)序列的AAV病毒基因组，其中所述AAV衣壳和AAV ITR来自相同的AAV血清型或不同的AAV血清型。

实施方案131.根据实施方案108或128-130中任一项所述的有包膜的病毒载体，其中所述有包膜的病毒载体是包含编码人因子IX的异源转基因的有包膜的AAV，并且所述包膜是经工程化以含有CTLA-4和PD-L1的外来体。

实施方案132.根据实施方案108或128-131中任一项所述的有包膜的病毒载体，其中所述包膜是来自生产细胞的外来体，所述生产细胞经工程化以过表达CTLA-4和PD-L1。

实施方案133.根据实施方案108或128-130中任一项所述的有包膜的病毒载体，其中所述有包膜的病毒载体是包含编码人因子VIII的异源转基因的有包膜的AAV，并且所述包膜是经工程化以包含CTLA-4和PD-L1的外来体。

实施方案134.根据实施方案133所述的有包膜的病毒载体，其中所述包膜是来自生产细胞的外来体，所述生产细胞经工程化以过表达CTLA-4和PD-L1。

实施方案135.根据实施方案108-127中任一项所述的有包膜的病毒载体，其中所述病毒颗粒包含慢病毒载体。

实施方案136.根据实施方案135所述的有包膜的病毒载体，其中所述慢病毒载体是人免疫缺陷病毒、猿猴免疫缺陷病毒或猫免疫缺陷病毒。

实施方案137.根据实施方案108-136中任一项所述的有包膜的病毒载体，其中当以单剂量向受试者施用时，所述载体在向受试者施用后3周提供转基因表达水平，所述转基因表达水平与通过以相同量和相同条件下施用相同类型的无包膜的病毒载体产生的转基因表达相比增加约50％或更多。

实施方案138.根据实施方案108-137中任一项所述的有包膜的病毒载体，其中所述载体在以单剂量向受试者施用后3周提供转基因表达水平，所述转基因表达水平与通过在相同条件下以相同量施用相同类型的而没有免疫抑制分子的有包膜的病毒载体产生的转基因表达相比增加约20％或更多。

实施方案139.一种组合物，其包含根据实施方案108-138中任一项所述的有包膜的病毒载体和一种或多种药学上可接受的赋形剂。

实施方案140.一种将转基因递送至细胞或受试者的方法，所述方法包括向所述细胞或受试者施用根据实施方案108-138中任一项所述的有包膜的病毒载体或根据实施方案139所述的组合物。

实施方案141.根据实施方案140所述的方法，其中所述受试者具有可以通过转基因的递送和表达来治疗的疾病或病状。

实施方案142.一种治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据实施方案108-138中任一项所述的有包膜的病毒载体或根据实施方案139所述的组合物。

实施方案143.根据实施方案140-142中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

实施方案144.根据实施方案141-143中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是单基因疾病。

实施方案145.根据实施方案141-143中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是肌微管素肌病、脊髓性肌萎缩症、莱伯氏先天性黑内障、、血友病A、血友病B、无脉络膜症、亨廷顿氏病、贝敦氏症、莱伯遗传性视神经病、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)缺乏症、庞贝病、法布里疾病、1型瓜氨酸血症、苯丙酮尿症(PKU)、肾上腺脑白质营养不良、镰刀状细胞病、尼曼-匹克病或β地中海贫血。

实施方案146.根据实施方案141-143中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是血友病A或血友病B。

实施方案147.根据实施方案141-143中任一项所述的方法，其中所述受试者具有血友病B，所述有包膜的病毒载体包含AAV，所述AAV包含编码因子IX的异源转基因，并且所述包膜是经工程化以包含CTLA-4和PD-L1的外来体。

实施方案148.根据实施方案141-143中任一项所述的方法，其中所述受试者具有血友病A，所述有包膜的病毒载体包含有包膜的AAV，所述有包膜的AAV包含编码人因子VIII的异源转基因，并且所述包膜是经工程化以包含CTLA-4和PD-L1的外来体。

实施方案149.根据实施方案147或148所述的方法，其中所述包膜是来自经工程化以过表达CTLA-4和PD-L1的生产细胞的外来体。

实施方案150.根据实施方案140-149中任一项所述的方法，其中所述方法包括以每个剂量之间1天或更长的间隔向所述受试者施用两个或更多个剂量的所述有包膜的病毒载体。

实施方案151.一种产生根据实施方案108-138中任一项所述的有包膜的病毒载体的方法，所述方法包括在产生有包膜的病毒颗粒的条件下体外培养病毒生产细胞，其中所述病毒生产细胞包含编码一种或多种膜结合的免疫抑制分子的核酸，以及收集所述有包膜的病毒载体。

实施方案152.根据实施方案151所述的方法，其中所述病毒产生细胞包含编码所述膜结合的免疫抑制分子的外源核酸。

实施方案153.根据实施方案151或152所述的方法，其中所述病毒生产细胞包含编码所述膜结合的免疫抑制分子的异源核酸。

实施方案154.根据实施方案151-153中任一项所述的方法，其中所述膜结合的免疫抑制分子包含CTLA4、B7-1、B7-2、PD-1、PD-L1、PD-L2、CD28、VISTA、TIM-3、GAL9、TIGIT、CD155、LAG3、VISTA、BTLA或HVEM中的一种或多种。

实施方案155.根据实施方案151-153中任一项所述的方法，其中所述膜结合的免疫抑制分子包含CTLA4和PD-L1、CTLA和PD-L2、CTLA-4和VISTA、PD-L1和PD-L2、PD-L1和VISTA、PD-L2和VISTA、CTLA4和PD-L1和PD-L2、CTLA4和PD-L1和VISTA、CTLA4和PD-L2和VISTA、PD-L1和PD-L2和VISTA、或CTLA4和PD-L1和PD-L2和VISTA。

实施方案156.根据实施方案151-155中任一项所述的方法，其中所述病毒生产细胞包含编码CTLA-4和PD-L1的异源核酸。

实施方案157.根据实施方案151-156中任一项所述的方法，其中将所述编码一种或多种膜结合的免疫抑制分子的核酸瞬时引入所述病毒生产细胞。

实施方案158.根据实施方案151-156中任一项所述的方法，其中将所述编码一种或多种膜结合的免疫抑制分子的核酸稳定地保持在所述病毒生产细胞中。

实施方案159.根据实施方案158所述的方法，其中将所述编码一种或多种膜结合的免疫抑制分子的核酸整合到所述病毒生产细胞的基因组中。

实施方案160.根据实施方案151-159中任一项所述的方法，其中所述病毒生产细胞包含编码一种或多种靶向分子的核酸。

实施方案161.根据实施方案151-160中任一项所述的方法，其中所述有包膜的病毒载体是有包膜的AAV载体。

实施方案162.根据实施方案161所述的方法，其中所述病毒产生细胞包含编码AAVrep和cap基因的核酸，编码包含转基因和至少一个ITR的AAV病毒基因组的核酸，以及AAV辅助功能。

实施方案163.根据实施方案162所述的方法，其中将所述编码AAV rep和cap基因的核酸和/或所述AAV病毒基因组瞬时引入所述生产细胞系。

实施方案164.根据实施方案162所述的方法，其中将所述编码AAV rep和cap基因的核酸和/或所述AAV病毒基因组稳定地保持在所述生产细胞系中。

实施方案165.根据实施方案164所述的方法，其中将所述编码AAV rep和cap基因的核酸和/或所述AAV病毒基因组稳定地整合到所述生产细胞系的基因组中。

实施方案166.根据实施方案151-165中任一项所述的方法，其中一种或多种AAV辅助功能由质粒、腺病毒、稳定整合到所述细胞基因组中的核酸或单纯疱疹病毒(HSV)中的一种或多种提供。

实施方案167.根据实施方案151-166中任一项所述的方法，其中AAV辅助功能包括腺病毒E1A功能、腺病毒E1B功能、腺病毒E2A功能、腺病毒E4功能和腺病毒VA功能中的一种或多种。

实施方案168.根据实施方案151-166中任一项所述的方法，其中AAV辅助功能包括HSV UL5功能、HSV UL8功能、HSV UL52功能和HSV UL29功能中的一种或多种。

实施方案169.根据实施方案151-160中任一项所述的方法，其中所述有包膜的病毒载体是慢病毒载体。

实施方案170.根据实施方案169所述的方法，其中所述慢病毒载体是人免疫缺陷病毒、猿猴免疫缺陷病毒或猫免疫缺陷病毒。

实施方案171.根据实施方案169或170所述的方法，其中所述病毒生产细胞包含编码慢病毒gag基因的核酸、编码慢病毒pol基因的核酸、编码包含转基因、5'长末端重复序列(LTR)和3'LTR的慢病毒转移载体的核酸，其中3'LTR的U3区域的全部或部分被异源调控元件、引物结合位点、GAG基因的全部或部分、中央聚嘌呤管道、GAG序列中的合成终止密码子、rev响应元件和env剪接受体替代。

实施方案172.根据实施方案151-171中任一项所述的方法，其中所述有包膜的载体被进一步纯化。

实施方案173.一种试剂盒，其包含根据实施方案108-138中任一项所述的有包膜的病毒载体或根据实施方案139所述的组合物。

实施方案174.根据实施方案173所述的试剂盒，其进一步包括使用说明书。

实施方案175.根据实施方案108-138中任一项所述的有包膜的病毒载体或根据实施方案139所述的组合物，其用于将核酸递送至受试者。

实施方案176.根据实施方案108-138中任一项所述的有包膜的病毒载体或根据实施方案139所述的组合物，其用于治疗受试者的疾病或病症。

实施方案177.根据实施方案175或176所述的有包膜的病毒载体或组合物，其用于按照实施方案140-143中任一项所述将核酸递送至受试者。

实施方案178.根据实施方案108-138中任一项所述的有包膜的病毒载体或根据实施方案139所述的组合物在制备用于将核酸递送至有此需要的个体的药物中的用途。

实施方案179.根据实施方案108-138中任一项所述的有包膜的病毒载体或根据实施方案139所述的组合物在制备用于治疗患有疾病或病症的个体的药物中的用途。

实施方案180.根据实施方案179所述的用途，其中所述疾病或病症是肌微管素肌病、脊髓性肌萎缩症、莱伯氏先天性黑内障、血友病A、血友病B、无脉络膜症、亨廷顿氏病、贝顿氏病、莱伯遗传性视神经病、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)缺乏症、庞贝病、法布里疾病、1型瓜氨酸血症、苯丙酮尿症(PKU)、肾上腺脑白质营养不良、镰刀状细胞病、尼曼-匹克病或β地中海贫血。

实施方案181.根据实施方案180所述的用途，其中所述疾病或病症是血友病A或血友病B。

实施方案182.一种制品，其包含根据实施方案108-138中任一项所述的有包膜的病毒载体或根据实施方案139所述的组合物。

实施例

实施例1：抗AAV免疫应答降低的确定

在细胞中进行了一系列实验以证明本发明。使用从AAV阳性个体中纯化的PBMC进行的混合淋巴细胞反应(MLR)是为了确定与血清型匹配的无包膜的载体相比，效应载体可以降低多少衣壳特异性免疫应答。类似地，与无包膜的载体相比，MLR用于测试效应载体是否可以抑制T细胞对治疗性蛋白的应答。该第二MLR如下进行：首先将抗原呈递细胞与治疗性蛋白一起孵育，然后在存在效应载体或血清型匹配的无包膜的载体的情况下添加PBMC(含有T和B细胞)。使用FACS分析测量T细胞活化，以计数包括CD3+、CD4+、CD8+、CD25+(IL2R)和FoxP3+在内的总T细胞。使用来自抗AAV衣壳抗体测试呈阳性的个体的血清进行中和抗体测定。该测定如Meliani等人(2015)Hum Gene Ther Methods,26:45–53中所述进行。

实施例2：载体产生

使用用AAV生产质粒转染的生产细胞表达载体来产生AAV。将有包膜的AAV与部分细胞膜(包膜)一起流进培养基中，并通过不去除包膜的方法从培养基中收集有包膜的AAV。通过裂解生产细胞以收集无包膜的病毒颗粒来获得无包膜的AAV。

更详细地，如Simonelli等人(2010)Molecular Therapy,18(3):643-650中所述在HEK293T细胞中产生标准(无包膜的)AAV(在结果和附图中称作“标准”或“std”载体)和有包膜的AAV载体(在结果和附图中称作“exo”载体)。两种载体类型均使用相同的AAV产生质粒。载体基因组质粒(pAAV.MCS.cb.Hu FIX)包含人因子IX基因，如Nathwani等人(2011)N EnglJ Med,365:2357-65所述的。包装和辅助质粒是先前使用的那些(同上)。如Melaini等人(2017)Blood Advances,1(23):2019-31，使用PEI将产生质粒转染到293T细胞中，并如Nathwani等人(2011)N Engl J Med,365:2357-65中所述纯化产生质粒。这些制备物是从293T生产细胞的24×150mm组织培养皿中产生的。

离心生产细胞培养物，并将生产细胞与上清液分离。使用两步超速离心从上清液中分离并纯化有包膜的AAV，然后将其重悬于PBS中，从而得到平均颗粒大小约为100nm的有包膜的AAV颗粒群体。通过在细胞裂解缓冲液中裂解细胞，然后使用标准碘克沙醇梯度方案纯化，从生产细胞中收获标准(无包膜的)AAV(Melaini等人(2017)Blood Advances,1(23):2019-31)。方案和载体产率的额外详细信息如表1所示。

表1.载体的产生

除了将生产HEK293T细胞除了AAV产生质粒外还与pCMV.mCTLA-4和pCMV.mPDL-1表达载体共转染，使用与针对有包膜的AAV的方法相同的方法分两批产生具有包含CTLA-4和PD-L1的包膜的有包膜的载体(在结果和附图中称为“逃避者”或“效应”载体或命名为“EF”)。pCMV.mCTLA-4含有由CMV启动子驱动的鼠CTLA-4cDNA序列(Sino Biological目录号MG50503-UT)。pCMV.mPDL-1含有由CMV启动子驱动的鼠PDL-1cDNA序列(Sino Biological目录号MG50010-M)。总共制备了2份24×150mm组织培养皿的制备物。方案和载体产率的额外详细信息如表1所示。

为了确认纯化的载体是否具有包膜，使用抗CD9抗体进行了western印迹。CD9用作标记物以指示存在衍生自产生的细胞的包膜。有包膜的AAV和逃避者载体均含有CD9，其预测的大小为约25KDa。如所预期的，标准(无包膜的)AAV8-FIX不含有包膜组分，这由缺少CD9证明。

逃避者和有包膜的AAV上的鼠CTLA-4和PDL-1的水平使用基于珠的FACS分析使用荧光标记的抗体：抗鼠CTLA-4(抗CTLA-4PECy7，Abcam目录号ab134090)和抗鼠PDL-1(抗PDL-1-PE-A，Abcam目录号ab213480)进行定量。FACS分析表明，逃避者载体在表面上具有高水平的CTLA-4和PDL-1(分别为83.6％和75.3％)，如图3中所示，其中逃避者直方图在每个图中向右移动表示，与有包膜的AAV相比，大多数该颗粒分别对CTLA-4和PD-L1分别呈阳性。

实施例3：小鼠中的体内基因转移

以下实施例例示性说明了实施例2中产生的载体用于在C57Bl/6小鼠中进行体内基因转移的用途。

给C57Bl/6小鼠(七只雄性和七只雌性)静脉内注射1×10⁹个载体基因组。给药组包括：1)仅PBS(媒介物对照)，2)AAV8-hFIX，3)Exo-AAV8-hFIX和4)EV-AAV8-hFIX。

给药后第3周，给小鼠放血并分析(a)人FIX水平(VisuLize^TM因子IX(FIX)抗原试剂盒,Affinity Biologicals)，(b)通过ELISA使用抗AA V8 IgG分析的AAV8结合抗体(BAb)和(c)使用中和抗体测定的AAV8中和抗体(NAb)(Meliani等人(2015)Hum Gene TherMethods,26:45-53)。体外中和测定用于测量阻止测试AAV载体感染靶细胞的抗体的滴度。简而言之，该测定需要将一定优化感染复数(MOI)的含有报告基因(如萤光素酶)的测试载体与测试抗体的系列稀释液一起孵育，然后使载体感染允许性靶细胞。24小时后测量来自经感染细胞的荧光量，并指示中和抗体的滴度。样品的中和滴度确定为第一稀释度，在该稀释度下测量到萤光素酶表达被抑制50％或更高。

同样，在给药后第三周，处死每组的两只雄性和两只雌性小鼠，并通过qPCR分析动物肝脏的每个细胞的载体基因组拷贝数(VGCN)。根据制造商的说明书，使用Magna Pure96DNA和病毒NA小体积试剂盒(Roche Diagnostics,Indianapolis IN)从整个器官中提取组织DNA。使用ABI PRISM 7900HT序列检测器(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)通过TaqMan实时PCR定量载体基因组拷贝数。小鼠肌联蛋白基因用作归一化物。用于定量的引物和探针如下：

hAAT启动子：

正向5'GGCGGGCGACTCAGATC-3'，(SEQ ID NO:5)

反向5'-GGGAGGCTGCTGGTGAATATT-3'(SEQ ID NO:6)

探针FAM 5’-AGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTG-3’(SEQ ID NO:7)

肌联蛋白：

正向5’-AAAACGAGCAGTGACGTGAGC-3’，(SEQ ID NO:8)

反向5’-TTCAGTCATGCTGCTAGCGC-3’(SEQ ID NO:9)

探针VIC 5’-TGCACGGAAGCGTCTCGTCTCAGTC-3’(SEQ ID NO:10)

然后(给药后三周)向其余动物施用与对于每个给药组与最初施用相同的AAV载体。在第六周，再次对小鼠放血并通过相同方案分析人FIX水平、AAV8结合抗体(BAb)和AAV8中和抗体(NAb)。然后处死所有剩余的动物，并使用先前的方案通过qPCR分析动物肝脏中每个细胞的载体基因组。

与对照动物相比，因子IX(FIX)的血液水平升高表明成功进行了基因转移和表达，其中对照动物接受了PBS而非载体。如图4所示，用EV-AAV8-hFIX处理的小鼠中的FIX血液水平显著高于在用标准包膜的病毒或无包膜的病毒处理的小鼠中的FIX血液水平。这在三周和六周的时间点均可观察到。雄性和雌性小鼠中IX因子水平之间的差异归因于已经确立的动物模型制品，其中传统上雄性小鼠用AAV载体转染肝脏的效率高于雌性小鼠。这种基于性别的转导效率差异是小鼠模型的人为现象，在人类中不会发生。出于该数据的目的，仅考虑雄性小鼠。接受PBS的对照小鼠在第3周和第6周之间的IX因子水平的变化是由于日复一日的测定可变性接近检测极限。接受PBS的组和标准AAV的组二者中的小鼠在第3周显示出相当的因子IX水平，约为0.1μg/mL。在第3周，经EV-AAV8-hFIX处理的小鼠中的水平比用标准无包膜的AAV处理的小鼠高约22倍，比在包膜中没有免疫抑制分子的有包膜的AAV高约5.6倍。类似地，在第6周，EV-AAV8-hFIX处理的小鼠中的FIX水平比用标准无包膜的AAV处理的小鼠高约20倍，比在包膜中没有免疫抑制分子的有包膜的AAV高约5倍。这些结果表明，与标准AAV或标准有包膜的AAV相比，在包膜中包含免疫抑制分子的逃避者载体提供了显著增强的体内因子IX基因表达。

图7-9显示了被处死的动物的肝脏中每个细胞的病毒基因组数目。再次，在六周时间点，与其他处理组相比，EV-AAV8-hFIX处理的小鼠在肝脏中显示出更高数量的病毒基因组，这表明与标准AAV相比，其转导效率更高。

图5和6显示在经处理的小鼠血液中总的AAV结合抗体和中和AAV抗体的水平。观察到用EV-AAV8-hFIX处理的小鼠具有比用其他载体处理的小鼠更高的抗体水平。分析了载体的内毒素水平(Genscript的TOXINSENSOR^TM Chromogenic LAL内毒素测定试剂盒)，因为内毒素是抗体产生和炎症的有效刺激剂，并可能导致观察到的抗体产生水平增加。结果列于表2。根据表2中的结果，通过将内毒素量归一化至标准AAV8-FIX小鼠接受的剂量来计算施用至小鼠的内毒素的量。针对剂量1和2施用的相对内毒素水平是相似的，因此图4仅显示了第一剂量的相对量。计算得出，用EV-AAV8-hFIX载体处理的小鼠接受的每只动物每剂量的内毒素水平比标准AAV8-hFIX载体高约300倍，而用exo-AAV8-hFIX载体处理的小鼠接受的每只动物每剂量的内毒素水平比用标准AAV8-FIX处理的小鼠高约50倍。因此，在该实验中，经EV-AAV8-hFIX处理的小鼠中较高的抗体滴度很可能是由于内毒素水平增加所致。

表2

尽管经EV-AAV8-hFIX处理的小鼠中BAb和NAb水平增加，但是与所有其他处理组相比，EV-AAV8-hFIX载体能够递送hFIX转基因并显著增加FIX表达。这表明，EV-AAV8-hFIX载体的包膜中免疫抑制分子的存在对转基因表达具有明显的积极作用。

除非在本文中另有指示，否则本文中数值范围的引用仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的速记方法，并且将每个单独值并入本说明书中，就如同其被分别列举在本文中一样。除非本文另外指示或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。除非另外要求，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明所公开的主题，并且不对本公开的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于实践本文所公开的主题是必不可少的。

本文描述了包括最佳操作方式的实施方案。在阅读前述描述之后，那些实施方案的变型对于本领域普通技术人员而言将变得显而易见，并且申请人可以预期此类变型。因此，本公开包括适用法律所允许的所附权利要求书中记载的主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另有指示或与上下文明显矛盾，否则本公开涵盖上述要素在其所有可能的变型中的任何组合。

序列表

人F8(UniProtKB-Q2VF45)、B结构域缺失(BDD)的SQ-FVIII变体

(SEQ ID NO:1)

人因子IX UniProtKB-P00740

(SEQ ID NO:2)

人CTLA-4：NCBI参考序列：NP_005205.2

(SEQ ID NO:3)

人PDL-1：NCBI参考序列：NP_054862.1

(SEQ ID NO:4)

序列表

<110> 变色龙生物科技股份有限公司

<120> 免疫逃避载体及其在基因治疗中的用途

<130> 77439-20001.40

<140> 尚未分配

<141> 与此同时

<150> US 62/616,167

<151> 2018-01-11

<150> US 62/768,779

<151> 2018-11-16

<160> 10

<170> 针对Windows版本4.0的FastSEQ

<210> 1

<211> 2351

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 1

Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe

1 5 10 15

Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser

20 25 30

Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg

35 40 45

Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val

50 55 60

Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile

65 70 75 80

Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln

85 90 95

Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser

100 105 110

His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser

115 120 125

Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp

130 135 140

Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu

145 150 155 160

Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser

165 170 175

Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile

180 185 190

Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr

195 200 205

Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly

210 215 220

Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp

225 230 235 240

Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr

245 250 255

Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val

260 265 270

Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile

275 280 285

Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser

290 295 300

Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met

305 310 315 320

Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His

325 330 335

Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro

340 345 350

Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp

355 360 365

Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser

370 375 380

Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr

385 390 395 400

Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro

405 410 415

Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn

420 425 430

Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met

435 440 445

Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu

450 455 460

Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu

465 470 475 480

Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro

485 490 495

His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys

500 505 510

Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe

515 520 525

Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp

530 535 540

Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg

545 550 555 560

Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu

565 570 575

Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val

580 585 590

Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu

595 600 605

Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp

610 615 620

Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val

625 630 635 640

Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp

645 650 655

Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe

660 665 670

Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr

675 680 685

Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro

690 695 700

Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly

705 710 715 720

Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp

725 730 735

Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys

740 745 750

Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro

755 760 765

Ser Thr Arg Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp

770 775 780

Ile Glu Lys Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys

785 790 795 800

Ile Gln Asn Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gln Ser

805 810 815

Pro Thr Pro His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gln Glu Ala Lys Tyr

820 825 830

Glu Thr Phe Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asn

835 840 845

Ser Leu Ser Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gln Leu His His Ser Gly

850 855 860

Asp Met Val Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gln Leu Arg Leu Asn Glu

865 870 875 880

Lys Leu Gly Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys

885 890 895

Val Ser Ser Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile Pro Ser Asp Asn

900 905 910

Leu Ala Ala Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met

915 920 925

Pro Val His Tyr Asp Ser Gln Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys

930 935 940

Ser Ser Pro Leu Thr Glu Ser Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu

945 950 955 960

Asn Asn Asp Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gln Glu

965 970 975

Ser Ser Trp Gly Lys Asn Val Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe

980 985 990

Lys Gly Lys Arg Ala His Gly Pro Ala Leu Leu Thr Lys Asp Asn Ala

995 1000 1005

Leu Phe Lys Val Ser Ile Ser Leu Leu Lys Thr Asn Lys Thr Ser Asn

1010 1015 1020

Asn Ser Ala Thr Asn Arg Lys Thr His Ile Asp Gly Pro Ser Leu Leu

1025 1030 1035 1040

Ile Glu Asn Ser Pro Ser Val Trp Gln Asn Ile Leu Glu Ser Asp Thr

1045 1050 1055

Glu Phe Lys Lys Val Thr Pro Leu Ile His Asp Arg Met Leu Met Asp

1060 1065 1070

Lys Asn Ala Thr Ala Leu Arg Leu Asn His Met Ser Asn Lys Thr Thr

1075 1080 1085

Ser Ser Lys Asn Met Glu Met Val Gln Gln Lys Lys Glu Gly Pro Ile

1090 1095 1100

Pro Pro Asp Ala Gln Asn Pro Asp Met Ser Phe Phe Lys Met Leu Phe

1105 1110 1115 1120

Leu Pro Glu Ser Ala Arg Trp Ile Gln Arg Thr His Gly Lys Asn Ser

1125 1130 1135

Leu Asn Ser Gly Gln Gly Pro Ser Pro Lys Gln Leu Val Ser Leu Gly

1140 1145 1150

Pro Glu Lys Ser Val Glu Gly Gln Asn Phe Leu Ser Glu Lys Asn Lys

1155 1160 1165

Val Val Val Gly Lys Gly Glu Phe Thr Lys Asp Val Gly Leu Lys Glu

1170 1175 1180

Met Val Phe Pro Ser Ser Arg Asn Leu Phe Leu Thr Asn Leu Asp Asn

1185 1190 1195 1200

Leu His Glu Asn Asn Thr His Asn Gln Glu Lys Lys Ile Gln Glu Glu

1205 1210 1215

Ile Glu Lys Lys Glu Thr Leu Ile Gln Glu Asn Val Val Leu Pro Gln

1220 1225 1230

Ile His Thr Val Thr Gly Thr Lys Asn Phe Met Lys Asn Leu Phe Leu

1235 1240 1245

Leu Ser Thr Arg Gln Asn Val Glu Gly Ser Tyr Asp Gly Ala Tyr Ala

1250 1255 1260

Pro Val Leu Gln Asp Phe Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn Arg Thr

1265 1270 1275 1280

Lys Lys His Thr Ala His Phe Ser Lys Lys Gly Glu Glu Glu Asn Leu

1285 1290 1295

Glu Gly Leu Gly Asn Gln Thr Lys Gln Ile Val Glu Lys Tyr Ala Cys

1300 1305 1310

Thr Thr Arg Ile Ser Pro Asn Thr Ser Gln Gln Asn Phe Val Thr Gln

1315 1320 1325

Arg Ser Lys Arg Ala Leu Lys Gln Phe Arg Leu Pro Leu Glu Glu Thr

1330 1335 1340

Glu Leu Glu Lys Arg Ile Ile Val Asp Asp Thr Ser Thr Gln Trp Ser

1345 1350 1355 1360

Lys Asn Met Lys His Leu Thr Pro Ser Thr Leu Thr Gln Ile Asp Tyr

1365 1370 1375

Asn Glu Lys Glu Lys Gly Ala Ile Thr Gln Ser Pro Leu Ser Asp Cys

1380 1385 1390

Leu Thr Arg Ser His Ser Ile Pro Gln Ala Asn Arg Ser Pro Leu Pro

1395 1400 1405

Ile Ala Lys Val Ser Ser Phe Pro Ser Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr

1410 1415 1420

Arg Val Leu Phe Gln Asp Asn Ser Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr

1425 1430 1435 1440

Arg Lys Lys Asp Ser Gly Val Gln Glu Ser Ser His Phe Leu Gln Gly

1445 1450 1455

Ala Lys Lys Asn Asn Leu Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr

1460 1465 1470

Gly Asp Gln Arg Glu Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser

1475 1480 1485

Val Thr Tyr Lys Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp Leu

1490 1495 1500

Pro Lys Thr Ser Gly Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys Val His Ile Tyr

1505 1510 1515 1520

Gln Lys Asp Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser Pro Gly His

1525 1530 1535

Leu Asp Leu Val Glu Gly Ser Leu Leu Gln Gly Thr Glu Gly Ala Ile

1540 1545 1550

Lys Trp Asn Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Val Pro Phe Leu Arg Val

1555 1560 1565

Ala Thr Glu Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser Lys Leu Leu Asp Pro Leu

1570 1575 1580

Ala Trp Asp Asn His Tyr Gly Thr Gln Ile Pro Lys Glu Glu Trp Lys

1585 1590 1595 1600

Ser Gln Glu Lys Ser Pro Glu Lys Thr Ala Phe Lys Lys Lys Asp Thr

1605 1610 1615

Ile Leu Ser Leu Asn Ala Cys Glu Ser Asn His Ala Ile Ala Ala Ile

1620 1625 1630

Asn Glu Gly Gln Asn Lys Pro Glu Ile Glu Val Thr Trp Ala Lys Gln

1635 1640 1645

Gly Arg Thr Glu Arg Leu Cys Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg

1650 1655 1660

His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu

1665 1670 1675 1680

Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe

1685 1690 1695

Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys

1700 1705 1710

Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr

1715 1720 1725

Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly

1730 1735 1740

Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly

1745 1750 1755 1760

Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly

1765 1770 1775

Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val

1780 1785 1790

Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu

1795 1800 1805

Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn

1810 1815 1820

Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His

1825 1830 1835 1840

His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr

1845 1850 1855

Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly

1860 1865 1870

Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg

1875 1880 1885

Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu

1890 1895 1900

Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala

1905 1910 1915 1920

Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg

1925 1930 1935

Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val

1940 1945 1950

Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser

1955 1960 1965

Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val

1970 1975 1980

Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly

1985 1990 1995 2000

Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg

2005 2010 2015

Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu

2020 2025 2030

Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser

2035 2040 2045

Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln

2050 2055 2060

Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala

2065 2070 2075 2080

Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala

2085 2090 2095

Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe

2100 2105 2110

Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly

2115 2120 2125

Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val

2130 2135 2140

Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn

2145 2150 2155 2160

Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser

2165 2170 2175

Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser

2180 2185 2190

Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln

2195 2200 2205

Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro

2210 2215 2220

Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro

2225 2230 2235 2240

Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr

2245 2250 2255

Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr

2260 2265 2270

Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His

2275 2280 2285

Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly

2290 2295 2300

Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu

2305 2310 2315 2320

Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile

2325 2330 2335

Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr

2340 2345 2350

<210> 2

<211> 461

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr

1 5 10 15

Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu

20 25 30

Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn

35 40 45

Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys

50 55 60

Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn

65 70 75 80

Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly Asp Gln

85 90 95

Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp Ile

100 105 110

Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys

115 120 125

Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe

130 135 140

Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly

145 150 155 160

Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe

165 170 175

Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala

180 185 190

Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu

195 200 205

Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe

210 215 220

Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro Trp

225 230 235 240

Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile

245 250 255

Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly

260 265 270

Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu

275 280 285

His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His His Asn

290 295 300

Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Glu

305 310 315 320

Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys Ile

325 330 335

Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr

340 345 350

Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val

355 360 365

Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg

370 375 380

Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His

385 390 395 400

Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val

405 410 415

Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly

420 425 430

Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser

435 440 445

Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr

450 455 460

<210> 3

<211> 223

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala

1 5 10 15

Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro

20 25 30

Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala

35 40 45

Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly

50 55 60

Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln

65 70 75 80

Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr

85 90 95

Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val

100 105 110

Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile

115 120 125

Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly

130 135 140

Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser

145 150 155 160

Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe

165 170 175

Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys

180 185 190

Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu

195 200 205

Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn

210 215 220

<210> 4

<211> 290

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu

1 5 10 15

Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr

20 25 30

Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu

35 40 45

Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile

50 55 60

Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser

65 70 75 80

Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn

85 90 95

Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr

100 105 110

Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val

115 120 125

Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val

130 135 140

Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr

145 150 155 160

Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser

165 170 175

Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn

180 185 190

Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr

195 200 205

Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu

210 215 220

Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His

225 230 235 240

Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr

245 250 255

Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys

260 265 270

Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu

275 280 285

Glu Thr

290

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 5

ggcgggcgac tcagatc 17

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 6

gggaggctgc tggtgaatat t 21

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 7

agcccctgtt tgctcctccg ataactg 27

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 8

aaaacgagca gtgacgtgag c 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 9

ttcagtcatg ctgctagcgc 20

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 10

tgcacggaag cgtctcgtct cagtc 25

Claims

1.一种有包膜的病毒载体，其包含由包膜包围的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒包含异源转基因，并且所述包膜包含脂质双层和一种或多种免疫抑制分子。

2.根据权利要求1所述的有包膜的病毒载体，其中与所述脂质双层中没有免疫抑制分子的相同类型的载体相比，所述有包膜的病毒具有降低的免疫原性。

3.根据权利要求1或2所述的有包膜的病毒载体，其中所述一种或多种免疫抑制分子包含一种或多种免疫检查点蛋白。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的有包膜的病毒载体，其中所述一种或多种免疫抑制分子包含CTLA4、B7-1、B7-2、PD-1、PD-L1、PD-L2、CD28、VISTA、TIM-3、GAL9、TIGIT、CD155、LAG3、VISTA、BTLA或HVEM中的一种或多种。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的包膜病毒载体，其中所述包膜包含两种或更多种，三种或更多种或四种或更多种不同的免疫抑制分子；或包含两种或更多种、三种或更多种或四种或更多种不同的检查点蛋白。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的有包膜的病毒载体，其中所述包膜包含CTLA4和PD-L1；CTLA和PD-L2；CTLA-4和VISTA；PD-L1和PD-L2；PD-L1和VISTA；PD-L2和VISTA；CTLA4和PD-L1和PD-L2；CTLA4和PD-L1和VISTA；CTLA4和PD-L2和VISTA；PD-L1和PD-L2和VISTA；或CTLA4和PD-L1和PD-L2和VISTA。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的有包膜的病毒载体，其中所述免疫抑制分子中的一种或多种包含跨膜结构域。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的有包膜的病毒载体，其中所述包膜进一步包含靶向分子。

9.根据权利要求8所述的有包膜的病毒载体，其中所述靶向分子赋予对所述有包膜的载体的细胞或组织特异性。

10.根据权利要求9所述的有包膜的病毒载体，其中所述靶向分子是抗体。

11.根据权利要求8-10中任一项所述的有包膜的病毒载体，其中所述一种或多种靶向分子包含跨膜结构域。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的有包膜的病毒载体，其中所述包膜包含来自细胞的细胞膜的一部分，所述细胞包含编码所述一种或多种免疫抑制分子的一种或多种外源核酸。

13.根据权利要求12所述的有包膜的病毒载体，其中所述病毒颗粒包含病毒衣壳和病毒基因组，并且所述病毒基因组包含异源转基因。

14.根据权利要求13所述的有包膜的病毒载体，其中所述异源转基因编码多肽。

15.根据权利要求14所述的有包膜的病毒载体，其中所述异源转基因编码治疗性多肽或报告多肽。

16.根据权利要求13所述的有包膜的病毒载体，其中所述异源转基因编码因子VIII、因子IX、肌微管素、存活运动神经元蛋白(SMN)、类视黄醇异构水解酶(RPE65)、NADH-泛醌氧化还原酶链4、无脉络膜蛋白(CHM)、亨廷顿蛋白、α-半乳糖苷酶A、酸性β-葡糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、鸟氨酸转羧酶、精氨酰琥珀酸合成酶、β-球蛋白、γ-球蛋白、苯丙氨酸羟化酶或肾上腺脑白质营养不良蛋白(ALD)。

17.根据权利要求13所述的有包膜的病毒载体，其中所述异源转基因编码治疗性核酸。

18.根据权利要求17所述的有包膜的病毒载体，其中所述治疗性核酸是siRNA、miRNA、shRNA、反义RNA、核酶(RNAzyme)或脱氧核酶(DNAzyme)。

19.根据权利要求13所述的有包膜的病毒载体，其中所述异源转基因编码一种或多种基因编辑产物。

20.根据权利要求19所述的有包膜的病毒载体，其中所述一种或多种基因编辑产物是RNA指导的核酸酶、指导核酸和/或供体核酸。

21.根据权利要求1-20中任一项所述的有包膜的病毒载体，其中所述病毒颗粒包含腺相关病毒载体(AAV)。

22.根据权利要求21所述的有包膜的病毒载体，其中所述AAV载体包含来自人AAV血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12的衣壳。

23.根据权利要求21或22所述的有包膜的病毒载体，其中所述AAV包含AAV病毒基因组，所述AAV病毒基因组包含反向末端重复(ITR)序列，其中所述AAV衣壳和AAV ITR来自相同的AAV血清型或来自不同的AAV血清型。

24.根据权利要求1或21-23中任一项所述的有包膜的病毒载体，其中所述有包膜的病毒载体是包含编码人因子IX的异源转基因的有包膜的AAV，并且所述包膜是经工程化以含有CTLA-4和PD-L1的外来体。

25.根据权利要求1或21-24中任一项所述的有包膜的病毒载体，其中所述包膜是来自生产细胞的外来体，所述生产细胞经工程化以过表达CTLA-4和PD-L1。

26.根据权利要求1或21-23中任一项所述的有包膜的病毒载体，其中所述有包膜的病毒载体是包含编码人因子VIII的异源转基因的有包膜的AAV，并且所述包膜是经工程化以包含CTLA-4和PD-L1的外来体。

27.根据权利要求26所述的有包膜的病毒载体，其中所述包膜是来自生产细胞的外来体，所述生产细胞经工程化以过表达CTLA-4和PD-L1。

28.根据权利要求1至20中任一项所述的有包膜的病毒载体，其中所述病毒颗粒包含慢病毒载体。

29.根据权利要求28所述的有包膜的病毒载体，其中所述慢病毒载体是人免疫缺陷病毒、猿猴免疫缺陷病毒或猫免疫缺陷病毒。

30.根据权利要求1-29中任一项所述的有包膜的病毒载体，其中当以单剂量向受试者施用时，所述载体在向受试者施用后3周提供转基因表达水平，所述转基因表达水平与通过以相同量和相同条件下施用相同类型的无包膜的病毒载体所产生的转基因表达相比增加约50％或更多。

31.根据权利要求1至30中任一项所述的有包膜的病毒载体，其中所述载体在以单剂量向受试者施用后3周提供转基因表达水平，所述转基因表达水平与通过在相同条件下以相同量施用相同类型的有包膜的病毒载体而没有免疫抑制分子产生的转基因表达相比增加约20％或更多。

32.一种组合物，其包含根据权利要求1-31中任一项所述的有包膜的病毒载体和一种或多种药学上可接受的赋形剂。

33.一种将转基因递送至细胞或受试者的方法，所述方法包括向所述细胞或受试者施用根据权利要求1-31中任一项所述的有包膜的病毒载体或根据权利要求32所述的组合物。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述受试者具有可以通过转基因的递送和表达来治疗的疾病或病状。

35.一种治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1-31中任一项所述的有包膜的病毒载体或根据权利要求32所述的组合物。

36.根据权利要求33-35中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

37.根据权利要求34-36中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是单基因疾病。

38.根据权利要求34-36中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是肌球蛋白肌病、脊髓性肌萎缩症、莱伯先天性黑内障、血友病A、血友病B、无脉络膜症、亨廷顿氏病、贝顿氏病、莱伯遗传性视神经病变、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)缺乏症、庞贝病、法布里(Fabry)病、1型瓜氨酸血症、苯丙酮尿症(PKU)、肾上腺脑白质营养不良、镰刀状细胞病，尼曼-匹克病或β地中海贫血。

39.根据权利要求34-36中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是血友病A或血友病B。

40.根据权利要求34-36中任一项所述的方法，其中所述受试者具有血友病B，所述有包膜的病毒载体包含AAV，所述AAV包含编码因子IX的异源转基因，并且所述包膜是经工程化以包含CTLA-4和PD-L1的外来体。

41.根据权利要求34-36中任一项所述的方法，其中所述受试者患有血友病A，所述有包膜的病毒载体包含有包膜的AAV，所述有包膜的AAV包含编码人因子VIII的异源转基因，并且所述包膜是经工程以包含CTLA-4和PD-L1的外来体。

42.根据权利要求40或41所述的方法，其中所述包膜是来自经工程化以过表达CTLA-4和PD-L1的生产细胞的外来体。

43.根据权利要求33-42中任一项所述的方法，其中所述方法包括以每个剂量之间1天或更长的间隔向所述受试者施用两个或更多个剂量的所述有包膜的病毒载体。

44.一种产生根据权利要求1-31中任一项所述的有包膜的病毒载体的方法，所述方法包括

a)在产生有包膜的病毒颗粒的条件下体外培养病毒生产细胞，其中所述病毒生产细胞包含编码一种或多种膜结合型免疫抑制分子的核酸，以及

b)收集所述有包膜的病毒载体。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述病毒生产细胞包含编码所述膜结核型免疫抑制分子的外源核酸。

46.根据权利要求44或45所述的方法，其中所述病毒生产细胞包含编码所述膜结合型免疫抑制分子的异源核酸。

47.根据权利要求44-46中任一项所述的方法，其中所述膜结合型免疫抑制分子包含CTLA4、B7-1，B7-2、PD-1、PD-L1、PD-L2、CD28、VISTA、TIM-3、GAL9、TIGIT、CD155、LAG3、VISTA、BTLA或HVEM中的一种或多种。

48.根据权利要求44-46中任一项所述的方法，其中所述膜结合型免疫抑制分子包含CTLA4和PD-L1、CTLA和PD-L2、CTLA-4和VISTA、PD-L1和PD-L2、PD-L1和VISTA、PD-L2和VISTA、CTLA4和PD-L1和PD-L2、CTLA4和PD-L1和VISTA、CTLA4和PD-L2和VISTA、PD-L1和PD-L2和VISTA、或CTLA4和PD-L1和PD-L2和VISTA。

49.根据权利要求44-48中任一项所述的方法，其中所述病毒生产细胞包含编码CTLA-4和PD-L1的异源核酸。

50.根据权利要求44-49中任一项所述的方法，其中将所述编码一种或多种膜结合型免疫抑制分子的核酸瞬时引入所述病毒生产细胞。

51.根据权利要求44-49中任一项所述的方法，其中将所述编码一种或多种膜结合型免疫抑制分子的核酸稳定地保持在所述病毒生产细胞中。

52.根据权利要求51所述的方法，其中将所述编码一种或多种膜结合型免疫抑制分子的核酸整合到所述病毒生产细胞的基因组中。

53.根据权利要求44-52中任一项所述的方法，其中所述病毒生产细胞包含编码一种或多种靶向分子的核酸。

54.根据权利要求44-53中任一项所述的方法，其中所述有包膜的病毒载体是有包膜的AAV载体。

55.根据权利要求54所述的方法，其中所述病毒生产细胞包含

a)编码AAV rep和cap基因的核酸，

b)编码包含转基因和至少一个ITR的AAV病毒基因组的核酸，以及

c)AAV辅助功能。

56.根据权利要求55所述的方法，其中将所述编码AAV rep和cap基因的核酸和/或所述AAV病毒基因组瞬时引入生产细胞系。

57.根据权利要求55所述的方法，其中所述编码AAV rep和cap基因的核酸和/或所述AAV病毒基因组被稳定地保持在所述生产细胞系中。

58.根据权利要求57所述的方法，其中将所述编码AAV rep和cap基因的核酸和/或所述AAV病毒基因组稳定地整合到所述生产细胞系的基因组中。

59.根据权利要求44-58中任一项所述的方法，其中一种或多种AAV辅助功能由质粒、腺病毒、稳定整合到所述细胞基因组的核酸或单纯疱疹病毒(HSV)中的一种或多种提供。

60.根据权利要求44-59中任一项所述的方法，其中AAV辅助功能包括腺病毒E1A功能、腺病毒E1B功能、腺病毒E2A功能、腺病毒E4功能和腺病毒VA功能中的一种或多种。

61.根据权利要求44-59中任一项所述的方法，其中AAV辅助功能包括HSV UL5功能、HSVUL8功能、HSV UL52功能和HSV UL29功能中的一种或多种。

62.根据权利要求44-53中任一项所述的方法，其中所述有包膜的病毒载体是慢病毒载体。

63.根据权利要求62所述的方法，其中所述慢病毒载体是人免疫缺陷病毒、猿猴免疫缺陷病毒或猫免疫缺陷病毒。

64.根据权利要求62或63所述的方法，其中所述病毒生产细胞包含

a)编码慢病毒gag基因的核酸，

b)编码慢病毒pol基因的核酸，

c)编码包含转基因、5'长末端重复序列(LTR)和3'LTR的慢病毒转移载体的核酸，其中3'LTR的U3区域的全部或部分被异源调控元件、引物结合位点、所述GAG基因的全部或部分、中央聚嘌呤管道、所述GAG序列中的合成终止密码子、rev响应元件和env剪接受体代替。

65.根据权利要求44-64中任一项所述的方法，其中所述有包膜的载体被进一步纯化。

66.一种试剂盒，其包含根据权利要求1-31中任一项所述的有包膜的病毒载体或根据权利要求32所述的组合物。

67.根据权利要求66所述的试剂盒，其进一步包括使用说明书。

68.根据权利要求1-31中任一项所述的有包膜的病毒载体或根据权利要求32所述的组合物，用于将核酸递送至受试者。

69.根据权利要求1-31中任一项所述的有包膜的病毒载体或根据权利要求32所述的组合物用于治疗受试者的疾病或病症。

70.根据权利要求68或69所述的有包膜的病毒载体或组合物用于根据权利要求33-43中任一项将核酸递送至受试者。

71.根据权利要求1-31中任一项所述的有包膜的病毒载体或根据权利要求32所述的组合物在制备用于将核酸递送至有此需要的个体的药物中的用途。

72.根据权利要求1-31中任一项所述的有包膜的病毒载体或根据权利要求32所述的组合物在制备用于治疗患有疾病或病症的个体的药物中的用途。

73.根据权利要求72所述的用途，其中所述疾病或病症是肌球蛋白肌病、脊髓性肌萎缩症、莱伯氏先天性黑内障、血友病A、血友病B、无脉络膜症、亨廷顿氏病、贝顿氏病、莱伯遗传性视神经病变、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)缺乏症、庞贝病、法布里病、1型瓜氨酸血症、苯丙酮尿症(PKU)、肾上腺脑白质营养不良、镰刀状细胞病、尼曼-匹克病或β地中海贫血。

74.根据权利要求73所述的用途，其中所述疾病或病症是血友病A或血友病B。

75.一种制品，其包含根据权利要求1-31中任一项所述的有包膜的病毒载体或根据权利要求32所述的组合物。