CN113933432B - 一种适用于烟叶中生物碱检测的高灵敏和高精密度的分析方法 - Google Patents

Abstract

一种适用于烟叶中生物碱检测的高灵敏和高精密度的分析方法，采用合成的离子液体分散液液微萃取烟叶中生物碱，萃取液体积微少，萃取效率高，大幅提高了方法灵敏度，采用含氮类的碱性分析保护剂，依托于在线气体发生器，实时保护目标物，显著改善色谱系统吸附导致的峰形拖尾、积分不准确以及信号响应精密度差等问题。与传统方法相比，选用的离子液体消耗体积少，萃取效率高，且可重复利用，更为经济、绿色、环保；分析保护剂实时在线产生，保护范围广，避免了常规的保护剂只保护部分目标物的缺陷，且其分子量小，不会沉积在衬管、色谱柱、离子源处，显著降低检测仪器的维护成本。

Description

一种适用于烟叶中生物碱检测的高灵敏和高精密度的分析 方法

技术领域

本发明属于色谱分析领域，具体涉及一种适用于烟叶中生物碱检测的高灵敏和高精密度的分析方法。

背景技术

生物碱是一组含有氮杂环的碱性物质，烟草中的生物碱绝大部分是2-吡啶基衍生物，烟草生物碱包括烟碱、降烟碱、新烟碱、麦斯明、假木贼碱，其组成与含量直接影响烟叶的香味品质、可用性及卷烟制品的生理强度、烟气特征和吸食安全性。

生物碱的检测通常采用二氯甲烷和丙酮等有机溶剂萃取，需要消耗大量的有机溶剂，导致进入仪器分析的目标物被严重稀释，最终影响方法的灵敏度。而离子液体具有不挥发、热稳定性高、可调的极性、溶解性和酸碱性等，可应用于液液微萃取，使萃取溶剂的体积大幅缩小，从而使方法的灵敏度得到提高。

烟叶中生物碱分析测试主要采用气相色谱测定，气相色谱流路（包括进样口、色谱柱以及检测器）表面存在许多活性位点，而生物碱含有两个氮杂环，特别容易跟活性位点作用，导致色谱峰严重拖尾，精密度差，定量不够准确。

在分析测试中，经常会加入分析保护剂（通常加入到萃取溶剂中），掩盖活性位点，达到基质补偿的目的。分析保护剂的极性要比目标物强，而色谱柱出峰时间要接近于目标物，如果色谱柱出峰时间间隔较远，达不到基质补偿的效果。目前，生物碱的检测常采用三乙胺作为分析保护剂，即在萃取溶剂中加入少量的三乙胺，之后用气相色谱分析测试，但是三乙胺的极性弱于生物碱，且两者分子量、沸点相差较远，在色谱柱的出峰时间也相隔很远，因此其对生物碱的基质补偿作用较弱，加入三乙胺后，色谱峰拖尾及定量不准的问题无有效改善。而采用其他分析保护剂如山梨糖醇、L-古洛糖酸-γ-内酯、橄榄油、聚乙二醇等，则存在另外一些问题，山梨糖醇、L-古洛糖酸-γ-内酯为水溶性化合物，配制保护剂时需加入水，而气相色谱系统引入水，会造成系统不稳定，且影响柱效。而且，此类保护剂极性强、分子量大，长期使用，会沉积在衬管、柱头、离子源处，从而形成新的活性位点，对目标物造成吸附，且会严重影响柱效。因此，使用此类分析保护剂不适用于长期大量的检测分析。

发明内容

本发明的目的正是基于上述现有技术中所存在的缺陷而提供的一种适用于烟叶中生物碱检测的高灵敏和高精密度的分析方法，该方法采用合成的离子液体分散液液微萃取目标物，萃取液大幅减少，提高了灵敏度，并在气相色谱分析中依托在线气体发生器，在载气中引入分析保护剂，实时保护目标物，明显改善了峰形拖尾、积分不准确以及色谱系统吸附导致的信号相应精密度差等问题。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种适用于烟叶中生物碱检测的高灵敏和高精密度的分析方法，包括样品萃取、萃取液进入气相色谱分析检测并在载气中加入分析保护剂，所述烟叶中生物碱包括烟碱、降烟碱、新烟碱、麦斯明、假木贼碱，其特征在于：

1）在样品萃取过程，取粉碎的烟叶样品0.5～2g，加入盐酸水溶液20 mL，超声10min，取上清液15 mL加入氢氧化钠溶液2 mL，之后加入合成的离子液体100 uL～500 uL ，超声5min后，将溶液转入离心管中，放置于冰水浴中5-30min，离心后，取下层析出的离子液体进样；所述合成的离子液体为1-胺戊基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐。

2）载气中加入分析保护剂的方式：载气与在线气体发生器连接，在线气体发生器加入分析保护剂，分析保护剂在气体发生器中产生一定的蒸气压，与载气气路在线连接后，载气中会一直含有一定浓度的分析保护剂，所述分析保护剂为1-丁基-2-吡咯烷酮、N-乙基-4-羟基哌啶、6-甲基-异吲哚啉-1-酮、环己甲酰胺、(1,3-二甲基哌啶-3-基)甲醇等五种成分组合，各组分体积比为1:1:1:1:1～1:10:10:10:10。正因为分析保护剂为五种组合，该分析保护剂包含极性强的醇羟基、酰胺基以及苯环，其易与色谱系统化合物发生强的氢键作用和π-π作用，保护效果更好。

所述离子液体1-胺戊基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐无市售产品，需合成制得。其合成方法如下：将1-胺戊基-3-甲基咪唑和旋蒸后的溴代异辛烷，按1:1～1:10的摩尔比例加入干燥的三颈烧瓶中，40℃～100℃下加热搅拌回流约1～5小时，随着反应进行，体系由透明变为浑浊，此时，缓慢升温至70℃～100℃；当反应体系为白色粘稠状不易搅拌时，反应温度迅速升至80℃～100℃，保温2～5小时；在反应结束时，停止搅拌，温度降至室温，加水溶解，用分液漏斗除去未反应的油相有机物；将六氟磷酸钾用水溶解后分批加入，室温下搅拌4～10小时；其间有淡黄色油状物不断产生；待反应完全后，静置，将上层的水相弃去，下层的油相反复水洗，以除去未反应的中间产物；直至水洗后的上层水层中加入硝酸银溶液后无沉淀产生；取下层油状离子液体，真空干燥箱内干燥24～48小时即得到产品。1-胺戊基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐因其结构与生物碱接近，其萃取效率高。

六氟磷酸钾和1-胺戊基-3-甲基咪唑的摩尔比为1:1。

本发明的离子液体可以回收，回收方法如下：可简单通过调节pH实现，将含离子液体的萃取溶液pH调至酸性，超声5min，离子液体中所含的生物碱溶于水中，之后放入冰水浴中，离心，离子液体与水不互溶，在下层析出，且不含有生物碱，实现了重复利用。

所述在线气体发生器为自行设计、制作，具体结构包括机体外壳、保护剂气体发生腔，在保护剂气体发生腔中悬挂有多道布帘且多道布帘呈间隔布置，发生腔下部为溶剂池并设有加热装置，布帘下部浸泡在溶剂池中，在保护剂气体发生腔两侧腔壁上对应开设有载气进气口和载气出气口，可使载气穿过多道布帘后携带保护剂挥发气一同由出气口喷出。

气体保护器中的加热装置调节温度范围为20°C—100°C，分析保护剂消耗的速度为1 µg/h—20 µg/h，在线气体发生器中的分析保护剂体积容量为3-15ml（优选5-15ml）。当加入5 mL时，其液面为装置高度的1/3处，半年之内，即使每天连续进样，也不用加入溶剂。采用本发明的分析保护剂，分析测试1000个样品，衬管、色谱柱、离子源不用维护，生物碱峰形良好，质谱响应未下降，精密度良好。

所述气相色谱分析检测条件如下：

GC分析条件：进样口温度：230 ℃；进样量：1 µL；PTV大体积进样模式；载气：氦气，恒流流速1.5 mL/min；色谱柱：DB-35MS，规格30 m×0.25 mm×0.25μm；程序升温：100 ℃保持3 min，然后以8 ℃/min的速率升至160 ℃，再以2 ℃/min的速率升至175 ℃，最后以10℃/min的速率升至260 ℃，保持10min；载气与在线气体发生器连接，在线气体发生器中加入的分析保护剂，分析保护剂信息表如表1所示。

表1 分析保护剂信息表

分析保护剂	CAS号	结构式
			1-丁基-2-吡咯烷酮	3470-98-2
N-乙基-4-羟基哌啶	3518-83-0
			6-甲基-异吲哚啉-1-酮	58083-55-9
环己甲酰胺	1122-56-1
			(1,3-二甲基哌啶-3-基)甲醇	915925-11-0

质谱条件：EI源，电离电压70eV，四级杆150℃，离子源230℃，扫描方式为SIM，其参数如表2所示：

表2 各目标化合物的定量离子、定性离子

化合物	定量离子(m/z）	定性离子（m/z）
			烟碱	133	162
降烟碱	147	119
			麦斯明	146	118
假木贼碱	162	133
			新烟碱	160	105
2，4′- 二联吡啶	156	129

表3 不同离子液体对生物碱的萃取效率（%）

化合物	1-乙基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐	1-戊基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐	1-胺乙基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐	1-胺戊基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐
					烟碱	70	75	89	95
降烟碱	75	78	85	97
					麦斯明	74	79	90	98
假木贼碱	70	73	89	99
					新烟碱	69	74	84	98
2，4′- 二联吡啶	72	77	87	97

本发明与现有的检测方法相比，具有以下技术优势：

1.本发明采用离子液体实现了液液微萃取烟叶中生物碱，萃取溶液体积小,为100uL～500 uL ，而传统的液液萃取一般为几十 mL甚至上百mL，，与传统的分析方法相比，本发明萃取液体积大幅缩小。本发明与常规的离子液体做了对比，如表3所示，采用本发明的离子液体萃取效率显著高于其他离子液体。另外，与传统的有机溶剂相比，离子液体不易挥发，更为绿色、环保。离子液体的回收利用一直是个难点，而本发明可简单通过调节pH实现离子液体的回收，实现了其简单有效的重复利用。

2.本发明提出了一种含氮类的碱性分析保护剂：1-丁基-2-吡咯烷酮、N-乙基-4-羟基哌啶、6-甲基-异吲哚啉-1-酮、环己甲酰胺、(1,3-二甲基哌啶-3-基)甲醇，极性强，适用于烟叶中生物碱体系，其与色谱系统的活性位点作用，显著改善生物碱峰形拖尾严重、定量不准确、信号响应精密度差等问题。依托在线气体发生器，分析保护剂实时产生，并实时与气相色谱系统的活性位点作用，可全部覆盖色谱系统的目标物，保护范围广，避免了常规的分析保护剂只保护部分目标物的缺陷。避免使用了传统的山梨糖醇、L-古洛糖酸-γ-内酯、橄榄油、聚乙二醇等分析保护剂，本发明的分析保护剂分子量小，不会沉积在衬管、色谱柱、离子源处，与传统的分析保护剂易造成二次污染相比，可长期不用维护气相色谱及离子源，显著降低维护成本，适用于大批样品的普查分析。

附图说明

图1：在线气体发生器的外观图。

图2：在线气体发生器的剖视图（即图1的剖视图）。

图3：在线气体发生器去掉基体外壳后的内部立体结构示意图。

注：图1～3中：1-机体、2-控制器、3-溶剂加入口、4-气体发生腔、5-机体盖、6 溶剂流出口、7-载气进气口、8-载气出气口、9-加热棒、10-温控探头、11-液体溶剂、12-布帘（棉布、尼龙布等）、12-1撑杆、13-撑杆压条。

图4为本发明目标物比对色谱图，

图中：A、C、E、G、I分别为加入三乙胺保护剂的烟碱、降烟碱、麦思明、假木贼、新烟碱的色谱图，B、D、F、H、J分别为采用本发明分析保护剂的色谱图。

具体实施方式

本发明以下结合实施例（附图）做进一步描述：

实施例1

(1) 1-胺戊基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液体合成：将1-胺戊基-3-甲基咪唑和旋蒸后的溴代异辛烷，按1∶1的摩尔比例加入干燥的三颈烧瓶中，40℃下加热搅拌回流约1小时，随着反应进行，体系由透明变为浑浊，此时，缓慢升温至70℃。当反应体系为白色粘稠状不易搅拌时，反应温度迅速升至80℃，保温2小时。在反应结束时，停止搅拌，温度降至室温，加水溶解，用分液漏斗除去未反应的油相有机物。将六氟磷酸钾用水溶解后分批加入，室温下搅拌4小时。其间有淡黄色油状物不断产生。待反应完全后，静置，将上层的水相弃去，下层的油相反复水洗，以除去未反应的中间产物。直至水洗后的上层水层中加入硝酸银溶液后无沉淀产生。取下层油状离子液体。真空干燥箱内干燥24小时即得到产品。

(2)样品的前处理：称取粉碎的烟叶样品0.5 g置于锥形瓶中，加入盐酸水溶液20mL，超声10 min，取上清液15 mL加入氢氧化钠溶液2 mL，加入500 uL离子液体，超声5 min后，将萃取液转入离心管中，放置于冰水浴中5 min，离心后，取下层析出的离子液体进样。

(3)样品的分析：

GC分析条件：进样口温度：230 ℃；进样量：1 µL；PTV大体积进样模式；载气：氦气，恒流流速1.5 mL/min；色谱柱：DB-35MS，规格30 m×0.25 mm×0.25μm；程序升温：100 ℃保持3 min，然后以8 ℃/min的速率升至160 ℃，再以2 ℃/min的速率升至175 ℃，最后以10℃/min的速率升至260 ℃，保持10min。载气与在线气体发生器连接，在线气体发生器中加入的分析保护剂信息表如表1所示。在线气体发生器结构如图1～3所示：包括机体外壳1、保护剂气体发生腔4，在保护剂气体发生腔中悬挂有多道布帘12且多道布帘呈间隔布置，发生腔下部为溶剂池（加有液体溶剂11）并设有加热装置（即加热棒9），布帘下部浸泡在溶剂池中，在保护剂气体发生腔两侧腔壁上对应开设有载气进气口7和载气出气口8，可使载气穿过多道布帘后携带保护剂挥发气一同由出气口喷出。

质谱条件：EI源，电离电压70eV，四级杆150℃，离子源230℃，扫描方式为SIM，其参数如表2所示。

分析保护剂条件：在线连接的气体发生器中，撑杆的布为厚度1mm的尼龙布，加入1-丁基-2-吡咯烷酮、N-乙基-4-羟基哌啶、6-甲基-异吲哚啉-1-酮、环己甲酰胺、(1,3-二甲基哌啶-3-基)甲醇均1 mL，温度为30 ℃。连接的载气压力为0.5 MPa。分析保护剂消耗的速度为0.9 µg/h。

对比了传统的加入三乙胺和本发明分析保护剂条件下，生物碱如烟碱、降烟碱、麦斯明、假木贼碱、新烟碱、2，4′- 二联吡啶的SIM色谱图，如图4所示，可以看出传统的三乙胺对生物碱几乎无基质补偿作用，生物碱峰形拖尾严重，而采用本发明的分析保护剂后，生物碱峰形良好，响应也提高很多。

Claims (9)

1.一种适用于烟叶中生物碱检测的高灵敏和高精密度的分析方法，包括样品萃取、萃取液进入气相色谱分析检测并在载气中加入分析保护剂，所述烟叶中生物碱包括烟碱、降烟碱、新烟碱、麦斯明、假木贼碱，其特征在于：

1）在样品萃取过程，取粉碎的烟叶样品，先加入盐酸水溶液，超声，取上清液加入氢氧化钠水溶液，之后加入合成的离子液体，超声后，将萃取液转入离心管中，放置于冰水浴中5-30min，离心后，取下层析出的离子液体进样；所述合成的离子液体为1-胺戊基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐；

2）载气中加入分析保护剂的方式：载气与在线气体发生器连接，在线气体发生器加入分析保护剂，分析保护剂在气体发生器中产生一定的蒸气压，与载气气路在线连接后，载气中会一直含有一定浓度的分析保护剂，所述分析保护剂为1-丁基-2-吡咯烷酮、N-乙基-4-羟基哌啶、6-甲基-异吲哚啉-1-酮、环己甲酰胺、(1,3-二甲基哌啶-3-基)甲醇五种成分组成。

2.根据权利要求1所述的适用于烟叶中生物碱检测的高灵敏和高精密度的分析方法，其特征在于：步骤1）中，取粉碎的烟叶样品0.5-2g，加入盐酸水溶液20ml，取上清液15ml加入2ml氢氧化钠溶液，之后加入合成的离子液体100μL-500μL。

3.根据权利要求1所述的适用于烟叶中生物碱检测的高灵敏和高精密度的分析方法，其特征在于：所述分析保护剂中的五种成分的配比为1:1:1:1:1～1:10:10:10:10。

4.根据权利要求1所述的适用于烟叶中生物碱检测的高灵敏和高精密度的分析方法，其特征在于：所述离子液体1-胺戊基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的合成方法如下：将1-胺戊基-3-甲基咪唑和旋蒸后的溴代异辛烷，按1:1～1:10的摩尔比例加入干燥的三颈烧瓶中，40℃～100℃下加热搅拌回流约1～5小时，随着反应进行，体系由透明变为浑浊，此时，缓慢升温至70℃～100℃；当反应体系为白色粘稠状不易搅拌时，反应温度迅速升至80℃～100℃，保温2～5小时；在反应结束时，停止搅拌，温度降至室温，加水溶解，用分液漏斗除去未反应的油相有机物；将六氟磷酸钾用水溶解后分批加入，室温下搅拌4～10小时；其间有淡黄色油状物不断产生；待反应完全后，静置，将上层的水相弃去，下层的油相反复水洗，以除去未反应的中间产物；直至水洗后的上层水层中加入硝酸银溶液后无沉淀产生；取下层油状离子液体，真空干燥箱内干燥24～48小时即得到产品。

5.根据权利要求4所述的适用于烟叶中生物碱检测的高灵敏和高精密度的分析方法，其特征在于：六氟磷酸钾和1-胺戊基-3-甲基咪唑的摩尔比为1:1。

6.根据权利要求1所述的适用于烟叶中生物碱检测的高灵敏和高精密度的分析方法，其特征在于：萃取后离子液体的回收方法如下：可简单通过调节pH实现，将萃取溶液pH调至酸性，离子液体中所含的生物碱溶于水中，将其放入冰水浴中，离心后，与水不互溶的离子液体，在下层析出，且不含有生物碱，实现了重复利用。

7.根据权利要求1所述的适用于烟叶中生物碱检测的高灵敏和高精密度的分析方法，其特征在于：所述在线气体发生器的包括机体外壳、保护剂气体发生腔，在保护剂气体发生腔中悬挂有多道布帘且多道布帘呈间隔布置，发生腔下部为溶剂池并设有加热装置，布帘下部浸泡在溶剂池中，在保护剂气体发生腔两侧腔壁上对应开设有载气进气口和载气出气口，可使载气穿过多道布帘后携带保护剂挥发气一同由出气口喷出。

8.根据权利要求7所述的适用于烟叶中生物碱检测的高灵敏和高精密度的分析方法，其特征在于：加热装置的调节温度范围为20°C—100°C，分析保护剂消耗的速度为1 µg/h—20 µg/h，在线气体发生器中的分析保护剂体积容量为3-15ml。

9.根据权利要求1所述的适用于烟叶中生物碱检测的高灵敏和高精密度的分析方法，其特征在于：所述气相色谱分析检测条件如下：

GC分析条件：进样口温度：230 ℃；进样量：1 µL；PTV大体积进样模式；载气：氦气，恒流流速1.5 mL/min；色谱柱：DB-35MS，规格30 m×0.25 mm×0.25μm；程序升温：100 ℃保持3min，然后以8 ℃/min的速率升至160 ℃，再以2 ℃/min的速率升至175 ℃，最后以10 ℃/min的速率升至260 ℃，保持10min；载气与在线气体发生器连接，在线气体发生器中加入的分析保护剂；

质谱条件：EI源，电离电压70eV，四级杆150℃，离子源230℃，扫描方式为SIM，其参数如下表所示：

各目标化合物的定量离子、定性离子

化合物 定量离子m/z 定性离子m/z 烟碱 133 162 降烟碱 147 119 麦斯明 146 118 假木贼碱 162 133 新烟碱 160 105

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