CN113332416A

CN113332416A - 丙谷二肽在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的应用

Info

Publication number: CN113332416A
Application number: CN202110531903.2A
Authority: CN
Inventors: 李龙; 赵玉芬; 胡嘉继
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2021-05-17
Filing date: 2021-05-17
Publication date: 2021-09-03
Anticipated expiration: 2041-05-17
Also published as: CN113332416B

Abstract

本发明公开了一种丙谷二肽（Ala‑Gln）在制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中的用途，特点是：丙谷二肽或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物在蛋氨酸‑胆碱缺乏的饮食（MCD）诱导的非酒精性脂肪肝小鼠模型上的治疗应用，通过药理学实验发现丙谷二肽给药可以显著减少肝脏内脂质蓄积，改善肝脏组织的空泡样病变，降低肝脏内甘油三酯水平，下调血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶等肝功能指数，抑制肝脏内炎症反应和氧化应激，优点是：丙谷二肽为临床治疗非酒精性脂肪肝提供了一种新选择。

Description

丙谷二肽在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种丙谷二肽在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的应用。

背景技术

非酒精性脂肪肝病(Non-Alcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)是我国最常见的慢性肝病之一，被认为是肝硬化、肝癌的重要诱因，根据其病理特征可分为单纯的非酒精性脂肪肝变性、非酒精性脂肪肝炎和脂肪肝诱发的肝纤维化/肝硬化。其临床病理表征类似于酒精性肝损伤(酒精性脂肪肝病)，但它发生在无过量饮酒史的患者。随着社会的进步，国人生活水平的提高和饮食习惯的改变，NAFLD在我国的发病率明显上升，据不完全统计，我国NAFLD患者高达20-30％，特别是在沿海发达地区，并且其发病年龄趋于年轻化，在儿童肝脏疾病中也占15％。NAFLD的发病机制极为复杂，目前主要认为与肥胖等代谢性综合症有直接的关联，数据显示，在肥胖人群中脂肪肝患病率高达74％。

非酒精性脂肪肝可以是独立性疾病，但更多见的是全身系统性代谢紊乱而引起的肝脏损伤的病理状态，主要表现为脂肪变性伴随炎症发生。目前对NAFLD的发病机制尚未完全清楚，普遍认为NAFLD的发生是一系列连续性的诱导步骤，它无法用单一的机制进行解释，更有可能的是，NAFLD的发展是“多次打击”的结果。从细胞分子学角度可表现为细胞炎症因子的改变、脂质过氧化过程、肝细胞氧化应激、肝星状细胞激活和肝细胞线粒体功能障碍等，“多次打击”可以导致疤痕形成或“纤维化”出现，进而恶化发展成肝硬化/肝癌。根据NAFLD发生发展的机制，临床上常采用降脂药、胰岛素增敏剂、抗氧化剂来缓解NAFLD发生发展过程中的甘油三酯蓄积、胰岛素抵抗和氧化应激等病理现象，但目前临床仍然没有对NAFLD有确定疗效的药物。

丙谷二肽，又被称为L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-Alanyl-L-Glutamine，Ala-Gln)，是一种由L-丙氨酸和L-谷氨酰胺残基构成的二肽分子。丙谷二肽在临床上被用作肠外营养药物，广泛应用于严重感染、创伤、大手术、大面积烧伤及恶性肿瘤等疾病的肠外营养补充。近期研究发现，丙谷二肽的生物功能和药理作用是多方面的，可以促进肌肉蛋白合成，改善危重病人的免疫功能及临床生化指标，在耐力运动过程中可以增进体能；给患有慢性稳定性心脏功能衰竭的病人服用丙谷二肽，可以改善患者的生存质量。在体外细胞实验中发现，丙谷二肽对多种免疫细胞的免疫功能均具有调节作用；对多种因素刺激诱发的肠道上皮细胞损伤、胰岛beta-细胞功能损伤、以及大脑缺血再灌注损伤均具有较好的保护作用。根据以上文献调研我们发现丙谷二肽在多种细胞组织损伤可发挥保护作用，目前尚没有任何关于丙谷二肽应用于治疗非酒精性脂肪肝药物的公开报道。

发明内容

本发明的第一个目的是，为了解决上述现有技术中存在的不足，提供丙谷二肽在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的应用。

本发明的第二个目的是，提供一种用于治疗非酒精性脂肪肝的药物制剂。

为实现上述第一个目的，本发明采用的技术方案为：丙谷二肽在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的应用。

所述的丙谷二肽作为单一活性成分或者与其他治疗非酒精性脂肪肝的药物共同作为活性成分。

为实现上述第二个目的，本发明采用的技术方案为：一种用于治疗非酒精性脂肪肝的药物制剂，所述的药物制剂的活性成分含有所述的丙谷二肽及其在药学上可接受的盐、酯、溶剂合物的一种或多种形式的组合物。

在一些实施方式中，还含有药学上可接受的载体或赋形剂，制成药学上可接受的剂型。

在一些实施方式中，所述的药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。

在一些实施方式中，所述的药学上可接受的剂型包括但不限于注射剂、乳剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明公开了一种丙谷二肽在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的应用，是丙谷二肽或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物在蛋氨酸胆碱缺乏(methionine choline-deficient,MCD)饮食诱导的非酒精性脂肪肝模型上的治疗应用。通过体内实验发现了丙谷二肽给药可以显著呈药物浓度梯度依赖性地降低肝脏内脂质蓄积，减少肝脏组织内空泡性变性和炎症细胞浸润，改善肝功能和肝脏内炎症反应、氧化应激的发生。

本发明的研究表明丙谷二肽具有治疗MCD饮食诱导的非酒精性脂肪肝的能力，对于非酒精性脂肪肝的治疗具有重要的临床应用价值和广阔的应用前景，为丙谷二肽成分制备治疗非酒精性脂肪肝的药物提供了基础。

附图说明

图1为经苏木素-伊红(HE)染色的小鼠肝脏组织病理变化结果比较图，图中Control：空白对照组，AG-1500：丙谷二肽对照组，Model：MCD饮食模型组，M+AG-500：丙谷二肽低剂量(500mg/kg)实验组，M+AG-1500：丙谷二肽高剂量(1500mg/kg)实验组；

图2为小鼠肝脏组织油红O染色结果比较图，图中Control：空白对照组，AG-1500：丙谷二肽对照组，Model：MCD饮食模型组，M+AG-500：丙谷二肽低剂量(500mg/kg)实验组，M+AG-1500：丙谷二肽高剂量(1500mg/kg)实验组。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但不作为对本发明的限定。

本发明的一种实施方式中，提供了丙谷二肽在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的应用。

本发明的又一种实施方式中，提供了一种用于治疗非酒精性脂肪肝的药物制剂，该药物制剂包括丙谷二肽作为单一活性成分或者与其他治疗非酒精性脂肪肝的药物共同作为活性成分。

药物制剂的活性成分含有所述的丙谷二肽及其在药学上可接受的盐、酯、溶剂合物的一种或多种形式的组合物。

药物制剂还含有药学上可接受的载体或赋形剂，制成药学上可接受的剂型。

药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。

药学上可接受的剂型包括但不限于注射剂、乳剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。

实施例1丙谷二肽对MCD饮食诱导的非酒精性脂肪肝的保护作用

一、实验材料：

本实施例中采用的丙谷二肽主体化合物为实验室合成。

其中，丙谷二肽主体为含有丙谷二肽及其在药学上可以接受的盐、酯、溶剂合物的一种或多种形成的组合物。

其中，药物载体包括了水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、抑菌水、乙醇、多元醇及其混合物，以及脂质体、高分子纳米粒。这些组合物必须是无菌的并且是可注射的液体。

二、实验方法：

(1)非酒精性脂肪肝模型构建及丙谷二肽给药处理：

本实验在恒温恒湿的SPF级实验动物中心进行，将体重为23-25g的雄性C57BL/6小鼠随机分为5组，分别为空白对照组、丙谷二肽对照组、MCD饮食模型组、丙谷二肽低剂量实验组、丙谷二肽高剂量实验组，每组6-8只小鼠。各分组小鼠处理方式如下：空白对照组小鼠未做处理，同时给予正常饮食；丙谷二肽对照组未做模型诱导，单独给予高剂量的丙谷二肽(1500mg/kg)处理，同时给予正常饮食；MCD饮食模型组：给予MCD饮食，不给予药物处理；丙谷二肽低剂量实验组：在MCD饮食的基础上，给予低剂量丙谷二肽(500mg/kg)处理；丙谷二肽高剂量实验组：在MCD饮食的基础上，给予高剂量丙谷二肽(1500mg/kg)处理。以上饮食造模及丙谷二肽药物处理同时进行4周后，小鼠麻醉后取血清和肝脏组织做后续检测。

(2)组织病理学检测：

收取新鲜的肝脏组织后，转入4％多聚甲醛组织固定液中，固定24小时之后，一部分经石蜡包埋及切片后，用苏木素-伊红(HE)染液进行组织染色；另一部分经OCT包埋及冰冻切片后，用油红O染液进行组织染色。以上染色的切片在显微镜(徕卡，DMi1)下观察拍照，分析肝脏组织病理学变化及肝脏内脂滴分布情况。

(3)血清生化分析：

离心收取小鼠血清后，使用多功能酶标仪(MD,SpectraMax Paradigm)，按照甘油三酯(TG)、谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)试剂盒(南京建成)提供的操作步骤操作，测定血清中TG、ALT和AST水平变化。

(4)统计学分析：

实验数据以X±SEM表示，使用Graphpad prism软件进行One-way ANOVA分析，并进行Tukey多重比较，当P＜0.05时认为具有统计学显著性差异。

三、实验结果：

(1)组织病理学检测：

HE染色检测情况如图1所示，可以看到相对于空白对照组，单独给予丙谷二肽的丙谷二肽对照组小鼠肝脏组织结构清晰、未见明显病理变化。而MCD饮食诱导后的模型组小鼠肝组织结构排列紊乱、呈现空泡样变性伴随炎性细胞浸润。在造模的同时，给予低剂量的丙谷二肽(500mg/kg)处理，小鼠肝脏组织脂肪变性及炎性细胞浸润程度得到显著的改善。高剂量的丙谷二肽处理(1500mg/kg)更为显著的减少了肝细胞脂肪变性及炎症发生，组织结构排列趋近于空白对照组。

油红O染色结果如图2所示，空白对照组及单独给予丙谷二肽处理的丙谷二肽对照组均无明显的油红O阳性染色。MCD饮食诱导的模型组小鼠肝组织有大量的脂滴分布。丙谷二肽低剂量(500mg/kg)给药处理可显著减少肝组织内的脂滴数量，并降低脂滴的大小。丙谷二肽高剂量(1500mg/kg)处理同样显著减少了肝组织中的脂滴数量和大小，与丙谷二肽低剂量组相比，脂滴分布更趋近于正常对照组。

(2)TG检测分析：

非酒精性脂肪肝的最重要病理现象就是肝脏中以甘油三酯为主的脂质蓄积，在经过油红O染色观察肝脏组织中的脂滴分布之后，我们通过TG检测试剂盒直接分析了肝脏组织的甘油三酯(TG)水平，结果如表1所示。由表中可见丙谷二肽对照组的TG水平与空白对照组无显著性差异。MCD饮食诱导的非酒精性脂肪肝模型组的TG水平显著升高。与模型组相比，不同浓度的丙谷二肽给药处理可以不同程度地显著下调TG水平，说明丙谷二肽呈现浓度梯度依赖性地降低MCD诱导的肝脏内TG的蓄积。

表1各组小鼠血清中TG水平

其中：***，与空白对照组相比P＜0.001；##，与模型组相比P＜0.01；###，与模型组相比P＜0.001。

(3)肝功能指数：

非酒精性脂肪肝的发生伴随着慢性肝脏损伤，ALT和AST是最主要的肝功能指标，用于评价肝细胞损伤程度。血清中ALT和AST水平的检测结果如表2所示，丙谷二肽对照组的ALT和AST水平与空白对照组无显著性差异，说明丙谷二肽的长时间慢性给药没有造成肝细胞损伤。MCD饮食诱导的非酒精性脂肪肝模型组的ALT与AST水平均呈现显著上升，提示肝功能受损严重。与模型组相比，不同浓度的丙谷二肽给药处理可以不同程度的显著下调ALT和AST的表达水平，其中以丙谷二肽高剂量实验组(1500mg/kg)的降低效果最为明显(P＜0.001)，说明丙谷二肽对于MCD诱导的非酒精性脂肪肝相关的肝脏损伤具有保护作用。

表2各组小鼠血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶活力水平

其中：***，与空白对照组相比P＜0.001；#，与模型组相比P＜0.05；##，与模型组相比P＜0.01；###，与模型组相比P＜0.001。

实施例2丙谷二肽对MCD诱导的肝脏炎症的影响

一、实验方法：

(1)MCD饮食诱导的非酒精性脂肪肝小鼠模型构建及丙谷二肽给药处理：同实施例1

(2)荧光定量PCR分析：使用RNA simple总RNA提取试剂盒(天根)从肝组织样本中提取总RNA，通过FastQuant反转录试剂盒(天根)合成cDNA。利用SYBR Green荧光定量试剂盒(天根)在CFX Connect荧光定量PCR仪(伯乐)上进行实时荧光定量PCR分析，GAPDH作为内参校正基因。

二、实验结果：

非酒精性脂肪肝在早期表现为单纯的肝脏脂肪变性，随着炎症的发生会发展为非酒精性脂肪肝炎(NASH)，炎症反应是参与到非酒精性脂肪肝进展的重要因素。MCD饮食诱导的非酒精性脂肪肝模型属于典型的NASH模型。如表3所示，在MCD模型中，肝脏中的炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β、CCL-2和CCL-5表达水平均呈现出显著上调。在丙谷二肽给药后，丙谷二肽高剂量(1500mg/kg)和低剂量(500mg/kg)处理均可以降低TNF-α、IL-6、IL-1β、CCL-2和CCL-5的表达水平(P＜0.05，P＜0.01)。丙谷二肽高剂量组比低剂量组抗炎效果更明显。

表3各组小鼠肝组织中炎症因子水平(相对值)

其中：*，与空白对照组相比P＜0.05；**，与空白对照组相比P＜0.01；***，与空白对照组相比P＜0.001；#，与模型组相比P＜0.05；##，与模型组相比P＜0.01；###，与模型组相比P＜0.001。

实施例3丙谷二肽对MCD诱导的肝脏内氧化应激水平的影响

一、实验方法：

(1)MCD诱导的非酒精性脂肪肝模型构建及丙谷二肽给药处理：同实施例1

(2)肝组织氧化应激指标分析：

小鼠肝脏组织加生理盐水研磨获得肝组织匀浆，使用多功能酶标仪(MD,SpectraMax Paradigm)，按照丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)试剂盒(南京建成)提供的操作步骤操作，测定肝组织中MDA、SOD和GSH-px水平变化。

二、实验结果：

在非酒精性脂肪肝的发生发展过程中，肝脏中氧化应激的出现是促进非酒精性脂肪肝进展的重要因素，也是衡量非酒精性脂肪肝等级的重要指标。实验结果如表4所示，在模型组的小鼠肝脏中，MDA显著降低，抗氧化酶SOD和GSH-px活力明显下降。与模型组相比，不同浓度的丙谷二肽处理不同程度的逆转了相关氧化应激指标的变化。说明丙谷二肽在MCD诱导的非酒精性脂肪肝模型中发挥了肝内抗氧化作用。

表4各组小鼠肝组织中MDA、SOD和GSH-px水平

其中：***，与空白对照组相比P＜0.001；#，与模型组相比P＜0.05；##，与模型组相比P＜0.01。

综上结果所述，本发明充分表明了丙谷二肽或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物在MCD饮食诱导的非酒精性脂肪肝模型上的治疗的可行性和有效性。通过药理学实验发现了丙谷二肽给药可以显著改善肝脏组织脂肪变性，减少肝脏组织的脂滴蓄积，降低肝脏中甘油三酯水平，下调血清中的谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平，改善肝功能。同时，丙谷二肽在MCD饮食诱导的非酒精性脂肪肝模型中表现出显著的抗炎作用和抗氧化作用，以上保护作用均呈现出药物浓度梯度依赖性。

值得注意的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非因此限定本发明的专利保护范围，本发明还可以对上述各种技术特征进行任意方式相互结合起来使用，或者是采用技术等同物进行替换。故凡运用本发明的说明书及图示内容所作的等效变化，或直接或间接运用于其他相关技术领域均同理皆包含于本发明所涵盖的范围内。

Claims

1.丙谷二肽在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的应用。

2.一种用于治疗非酒精性脂肪肝的药物制剂，其特征在于：所述的药物制剂的活性成分含有权利要求1所述的丙谷二肽及其在药学上可接受的盐、酯、溶剂合物的一种或多种形式的组合物。

3.根据权利要求2所述的用于治疗非酒精性脂肪肝的药物制剂，其特征在于：还含有药学上可接受的载体或赋形剂，制成药学上可接受的剂型。

4.根据权利要求3所述的用于治疗非酒精性脂肪肝的药物制剂，其特征在于：所述的药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。

5.根据权利要求3所述的用于治疗非酒精性脂肪肝的药物制剂，其特征在于：所述的药学上可接受的剂型包括但不限于注射剂、乳剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。