CN114767866B

CN114767866B - Nurr1基因作为靶点在制备非酒精性脂肪肝治疗药物中的应用

Info

Publication number: CN114767866B
Application number: CN202210517985.XA
Authority: CN
Inventors: 赵菁; 张玲; 倪骋
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2022-05-12
Filing date: 2022-05-12
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2042-05-12
Also published as: CN114767866A

Abstract

本发明涉及生物医药领域，公开了一种NURR1基因作为靶点在制备非酒精性脂肪肝治疗药物中的应用。本发明揭示了NURR1的激动剂具有维持肝细胞稳态和线粒体功能的功能，对于非酒精性脂肪肝的治疗具有积极作用，可望为以后的非酒精性脂肪肝的治疗提供新的理论依据及新的药物治疗靶点。

Description

NURR1基因作为靶点在制备非酒精性脂肪肝治疗药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及NURR1的激动剂的一种新应用。

背景技术

非酒精性脂肪肝病在全球肝脏疾病中作为最为重要的病因之一，在我国的发病率和病死率呈逐年上升的趋势，最终有发展成肝细胞癌可能的风险。作为全球最普遍的原发性肝病之一，几乎可以发展成各种疾病，从简单的脂肪变性到非酒精性脂肪肝炎，再到纤维化，最终导致肝硬化和肝细胞癌；其中从非酒精性脂肪肝病发展过程中导致肝硬化的比例可达到20%之多，其发病率呈逐年上升的趋势，伴随着现代生活条件的改善与肥胖的流行相关，非酒精性脂肪肝的全球发病率约为25%；在中国的发病率甚至高达29.81%，且数字还在不断攀升当中，因而找到切实可靠治疗该疾病的药物靶点非常重要且迫在眉睫。但截止到目前为止，该疾病的发病机制尚未完全阐明，且治疗该疾病的药物尚未被发明，故无法被食品及药品监督管理局所批准。所以发现一种安全有效的药物靶点对于攻克该疾病具有非常重要的意义。

NURR1作为体内一种孤核受体，C-DIM12作为一种核受体NURR1的激活剂，在以往的研究中大多集中在神经细胞的抗炎作用并主要通过NF-κB这种广泛研究的通路抑制炎症发挥神经的保护作用，其在非酒精性脂肪肝上的作用尚未有人研究。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种NURR1基因作为靶点在制备非酒精性脂肪肝治疗药物中的应用。本发明揭示了NURR1的激动剂对非酒精性脂肪肝的肝细胞具有保护作用，可望为以后的非酒精性脂肪肝的治疗提供新的理论依据及新的药物治疗靶点。

本发明的具体技术方案为：

第一方面，本发明提供了NURR1基因作为靶点在制备非酒精性脂肪肝治疗药物中的应用。

第二方面，本发明提供了NURR1的激动剂在制备非酒精性脂肪肝治疗药物中的应用。

第三方面，本发明提供了NURR1的激动剂在制备可维持肝细胞稳态的药物中的应用。

第四方面，本发明提供了NURR1的激动剂在制备可维持线粒体功能的药物中的应用。

C-DIM12 [1,1-bis(3'-indolyl)-1- (p-chlorophenyl) methane; 3,3'-((4-氯苯基)亚甲基)双(1H-吲哚) ; C₂₃H₁₇ClN₂ ]，是一类芳香族吲哚类化合物，其有一种强有力的选择性核受体NURR1（NR4A2）激活剂，可激活一些细胞中的NURR1，抑制细胞的炎症信号转导。所述NR4A2，是一种核受体和转录因子，具有独特的生理特征；其在中枢神经系统的细胞核中被广泛表达并被鉴定为多巴胺能神经元分化，存活和维持的关键调节因子，在多发性硬化症患者的外周血单核细胞中下调，是神经保护治疗中可靠的治疗靶点。

由上可知，C-DIM12作为一种核受体NURR1的激活剂，在以往的研究中大多集中在神经细胞的抗炎作用并主要通过NF-κB这种广泛研究的通路抑制炎症发挥神经的保护作用，其在非酒精性脂肪肝上的作用尚未有人研究。本发明通过对非酒精性脂肪肝模型下给与C-DIM12药物口服后明显改善了动物脂肪肝的形成，降低肝细胞脂质沉积，减少了脂肪肝形成的体积。据此，本发明揭示了C-DIM12可在小鼠体内及小鼠肝细胞中的脂肪肝模型下改善油脂产生，保护线粒体功能等重要作用，目前国际上尚无相关报道，因此本发明提出的“C-DIM12对非酒精性脂肪肝的肝细胞的保护作用”可望为以后的非酒精性脂肪肝的治疗提供新的理论依据及新的药物治疗靶点。

具体地，本发明通过研究发现，C-DIM12可以为改善肝细胞线粒体的结构和功能提供保护作用。该保护作用是以C-DIM12为底物，通过与NURR1结合，激活NURR1使NURR1过表达，进而达到上述疗效。NURR1，作为核因子κB（NF-κB）相关神经炎症基因的抑制因子，与上述C-DIM12化合物可以良好的结合，突破过表达的能力，抑制NF-κB和下调下游NOD样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体等措施来抑制炎症反应。NLRP3作为一种炎症小体，其激活发生在非酒精性脂肪性肝病中；NLPR3炎症小体的激活已被证明是非酒精性脂肪肝病发展的一个促成因素。NLRP3炎症小体作为半胱天冬酶-1激活平台，对于处理关键的促炎细胞因子至关重要。非酒精性脂肪肝病中涉及的各种刺激可以激活NLRP3炎症小体，这取决于它们引起的细胞应激反应。半胱天冬酶-1，是一种炎症性半胱天冬酶，通过形成炎症小体复合物来激活，以响应病原体来源和内源性介质；此外，半胱天冬酶-1还包含多种功能，并且它是诸多细胞对于压力和炎症反应的中心。

本发明还提供了所述C-DIM12在LDLR基因敲除小鼠验证实验中的应用，可为未来相关的试验方案提供参考。

进一步地，所述NURR1的激动剂为3,3'-((4-氯苯基)亚甲基)双(1H-吲哚)。

再进一步地，所述NURR1的激动剂为C-DIM12。

作为优选，所述药物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。

作为优选，所述药物为注射制剂或口服制剂。

与现有技术对比，本发明的有益效果是：本发明揭示了NURR1的激动剂具有维持肝细胞稳态和线粒体功能的功能，对于非酒精性脂肪肝的治疗具有积极作用，可望为以后的非酒精性脂肪肝的治疗提供新的理论依据及新的药物治疗靶点。

附图说明

图1 为体外培养的小鼠肝细胞上经过棕榈酸处理后同时C-DIM12药物处理后细胞的生存曲线；

图2为体外培养的小鼠肝细胞上经过棕榈酸处理后同时C-DIM12药物处理后油红O染色细胞形态；

图3为体外培养的小鼠肝细胞上经过棕榈酸处理后同时C-DIM12药物处理后JC-1染色结果；

图4为C-DIM12药物处理后高脂喂养的小鼠肝脏形态以及肝脏重量及体重结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

总实施例

进一步地，所述NURR1的激动剂为3,3'-((4-氯苯基)亚甲基)双(1H-吲哚)。再进一步地，所述NURR1的激动剂为C-DIM12。

作为优选，所述药物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。该药物为注射制剂或口服制剂。

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明所述小鼠肝脏细胞制备方法：（品种）小鼠颈椎脱臼处死，70％酒精浸泡5min，无菌剥取肝脏，PBS冲洗肝脏，差数贴壁法获得小鼠肝脏细胞。

实施例1：小鼠肝细胞上同时使用棕榈酸及C-DIM12处理后细胞的存活状况

1.材料与仪器

实验动物：雄性小鼠，饲养于浙江中医药大学动物中心SPF环境中。

实验仪器与试剂：细胞恒温培养箱（Thermo 240i），棕榈酸（Sigma P0500），C-DIM12药物（Sigma SML1508），PBS（浙江森瑞生物科技有限公司），高糖DMEM培养基（Gibco11965092），新生胎牛血清（Biological I ndustries）。

1）PA细胞模型制备

使用（400μM浓度/剂量）棕榈酸（购入来源/公司）处理体外培养的小鼠肝细胞（24小时长）后，获得PA细胞模型。

2）分组与给药

将上述细胞分为WT组，PA组及C-DIM12药物组，将C-DIM12药物组分成1nM、10nM、100nM、1μM、10μM、100μM剂量分别处理。

3）指标检测

细胞计数5×10³接种于96孔板中（处理24小时时长）后在显微镜观察各组细胞，每组（n≥6重复），并设培养基对照组（空白组）、细胞阴性对照组（阴性对照组）、PA细胞模型(模型组)、PA+C-DIM12药物组（给药组）后，分别在细胞上清中加入10μl Cck-8试剂加入培养基上清2小时后将细胞放置于全波长酶标仪中进行读数，计算细胞活力450nm及630nm测定吸光度读数，作为参考波长进行双波长测定。记录各组细胞生存状况。

4）统计学处理

使用GraphPad软件进行数据处理分析，结果均用平均数±方差表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

5）实验结果

图1 为体外培养的小鼠肝细胞上经过棕榈酸处理后同时C-DIM12药物处理后细胞的生存曲线；其中：****p＜0.0001 PA模型组对比WT细胞明显减少，**p＜0.01 C-DIM12（1nM）给药组对比PA模型组，****p＜0.0001 C-DIM12（10nM、100nM、1μM、10μM、100μM）给药组分别对比PA模型组。结论：PA细胞对比WT细胞，存活率明显下降；对比PA细胞，C-DIM12药物1nM、10nM、100nM、1μM、10μM剂量处理后细胞生存率明显升高，且差异具有统计学意义，其中以100nM剂量效果最明显；100μM剂量的C-DIM12药物处理后细胞大量致死。

实施例2：小鼠肝细胞上同时使用棕榈酸及C-DIM12处理后的细胞形态

1.材料与仪器

实验仪器与试剂：细胞恒温培养箱（Thermo 240i），棕榈酸（Sigma P0500），C-DIM12药物（Sigma SML1508），PBS（浙江森瑞生物科技有限公司），高糖DMEM培养基（Gibco11965092），新生胎牛血清（Biological I ndustries）油红O染液（北京索莱宝科技有限公司G1262），4%多聚甲醛（阿拉丁）。

1）PA细胞模型制备

同实施例1步骤1。

2）分组与给药

将上述细胞分为WT组，PA组及C-DIM12药物组，C-DIM12药物组使用C-DIM12处理。

3）检测指标

使用PBS洗涤细胞2次，4%多聚甲醛固定10min，随后再用PBS冲洗两次， 60%异丙醇浸洗5min，加入新配制好的（ORO Stain A：ORO Stain B3：2）油红O染液染色10min，弃掉油红O染液，使用蒸馏水终止染色，并于显微镜下观察并用Image Pro Plus分析脂滴的面积。

4）统计学处理

5）实验结果

图2为体外培养的小鼠肝细胞上经过棕榈酸处理后同时C-DIM12药物处理后油红O染色细胞形态，明显改善了肝细胞脂滴的形成，减少了脂滴的面积及数量，**p＜0.01 PA模型组对比WT明显脂滴数量增多，**p＜0.01 C-DIM12给药组对比PA模型组脂滴明显减少。结论：经PA处理后肝细胞脂滴对比WT细胞明显增多，脂滴面积增大；而C-DIM12药物处理后肝细胞脂滴数量对比PA组减小，且差异均具有统计学意义。

实施例3：小鼠肝细胞上同时使用棕榈酸及C-DIM12处理后的细胞线粒体膜电位

1.材料与仪器

实验仪器与试剂：细胞恒温培养箱（Thermo 240i），棕榈酸（Sigma P0500），C-DIM12药物（Sigma SML1508），PBS（浙江森瑞生物科技有限公司），高糖DMEM培养基（Gibco11965092），新生胎牛血清（Biological I ndustries），JC-1工作液（碧云天生物技术有限公司C2006 200×原液稀释）。

1）PA细胞模型制备

同实施例1步骤1。

2）分组与给药

同实施例2步骤2。

3）检测指标

细胞计数2×10⁴接种于24孔板中每组（n≥3重复），并设培养基对照组（空白组）、细胞阴性对照组（阴性对照组）、PA细胞模型(模型组)、PA+C-DIM12药物组（给药组）24小时后，吸去培养皿内的细胞培养液，每空加入200μlJC-1工作液，覆盖所有细胞。于37℃，5%培养箱内孵育20min，弃去JC-1工作液，使用PBS清洗2次，于荧光显微镜下观察20X拍照记录红色及绿色荧光并通过Image Pro Plus统计细胞平均荧光强度分析线粒体膜电位情况。

4）统计学处理

5）实验结果

图3为体外培养的小鼠肝细胞上经过棕榈酸处理后同时C-DIM12药物处理后JC-1染色结果，其中红色表示正常细胞线粒体的膜电位，绿色表示线粒体受损后的细胞膜电位。该结果表示经过C-DIM12药物处理明显保护小鼠肝脏细胞的线粒体膜电位。结论：在使用PA处理细胞后，对比WT细胞，细胞内线粒体膜电位大量受损；而使用C-DIM12处理后细胞线粒体膜电位相较PA模型组，受损程度减轻，线粒体膜电位状况好转，差异具有统计学意义。

实施例4：高脂喂养的LDLR基因敲除小鼠及C-DIM12给药后肝脏及血清中指标变化

1.材料与仪器

实验动物：雄性LDLR基因敲除小鼠，饲养于浙江中医药大学动物中心SPF环境中。

实验仪器与试剂：C-DIM12药物（Sigma SML1508），（各个检测试剂盒）。

1）模型制备

雄性小鼠，普通饲料加（百分比）胆固醇、（百分比）猪油、（其他添加），自由饮水和进食喂养（时长）。

2）分组与给药

将上述小鼠分为正常对照组、模型组、C-DIM12低剂量组、C-DIM12高剂量组，C-DIM12组（腹腔/静脉/灌胃）注射（剂量）C-DIM12，1次/1d，模型组给予同等体积生理盐水，给药（时长）。

3）检测指标

各组小鼠称量体重后颈椎脱臼处死，取肝脏并称重，拍照观察。取血液，检测血清中的低密度脂蛋白、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、甘油三酯含量。

4）统计学处理

5）实验结果

图4为高脂喂养的小鼠肝脏，C-DIM12药物处理后明显改善了高脂喂养的小鼠肝脏形态，减轻了肝脏重量及体重。在体重、肝脏重量、LDL、TG、ALT的检测中，**P＜0.01 模型组对比正常组，体重及肝脏重量上升，LDL、TG、ALT含量上升；*P＜0.05模型组对比正常组，AST含量上升。*P＜0.05 H-C-DIM12给药组对比模型组，体重及肝脏重量下降，LDL、TG、ALT、AST含量下降；*P＜0.05 L-C-DIM12给药组对比模型组，ALT含量下降。其他指标含量也有下降，但差异不具有统计学意义。结论：高脂喂养的小鼠对比正常小鼠，肝脏体积重量均明显增大，体重上升，血清中低密度脂蛋白、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、甘油三酯含量上升；而C-DIM12高低剂量组给药后，与模型组比较，肝脏体积减小，肝脏重量和体重下降，血清中低密度脂蛋白、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、甘油三酯含量上升，且具有剂量依赖性，高剂量组效果优于低剂量组。

本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims

1.一种体外维持肝细胞稳态的方法，其特征在于：利用NURR1的激动剂3,3'-((4-氯苯基)亚甲基)双(1H-吲哚)促进NURR1基因的过表达，改善体外肝细胞脂滴的形成，减少脂滴的面积及数量。

2.一种体外维持肝细胞线粒体膜电位的方法，其特征在于：利用NURR1的激动剂3,3'-((4-氯苯基)亚甲基)双(1H-吲哚)促进NURR1基因的过表达，维持体外肝细胞线粒体膜电位。