CN111803512B - 蒺藜皂苷d在制备治疗银屑病的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了蒺藜皂苷D在治疗银屑病中的应用,属于中医药技术领域。本发明经药理试验发现,蒺藜皂苷D可改善银屑病样小鼠皮损组织病理形态,降低其表皮厚度,减少角质形成细胞增殖,减少树突状细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞等免疫细胞的数量,改善银屑病样小鼠焦虑行为学,降低神经递质SP的分泌,具有改善银屑病样皮损的作用。本发明提供了蒺藜皂苷D单体新的医疗用途,开拓了蒺藜皂苷D新的应用领域。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,涉及蒺藜皂苷D在制备治疗银屑病的药物中的应用。
背景技术
银屑病是一种心身免疫性疾病,其病理过程有多种免疫细胞参与,在外源性因素与内源性因素的作用下,免疫细胞被激活,释放多种炎性细胞因子,导致皮损局部产生炎症反应,并刺激角质形成细胞异常增殖分化。精神压力属于银屑病发病的外源性因素的之一,焦虑抑郁等消极情绪既是银屑病发病的起因,也是使症状加重的不利因素;这些消极情绪的发生会使机体神经元过度分泌神经递质,导致神经递质调控的免疫细胞过度活化产生细胞因子,加重皮损炎症反应,使疾病迁延不愈或恶化。Ward等发现,在切除KC-Tie2转基因银屑病小鼠神经后,银屑病小鼠局部免疫细胞数量减少、表皮厚度降低、皮肤炎症减轻;注射SP激活剂,银屑病皮损和炎症反应加重;注射SP拮抗剂,皮损和炎症反应都得到改善。由此可见,干预神经递质SP可作为治疗银屑病的靶点之一。
现有的临床药物治疗靶点多集中于IL-17、IL23、TNF-α等炎性细胞因子,且从国外进口费用昂贵,有一定副作用,停药后易复发;而中医药治疗银屑病具有安全、有效等优势。因此,基于银屑病治疗现状,挖掘中医药“宝库”,从中持续发现和研究新的药物十分必要,具有广阔的社会发展前景。
蒺藜皂苷D(Terrestrosin D,TED)是中草药刺蒺藜中的一种有效单体成分,
刺蒺藜是蒺藜科植物蒺藜的干燥成熟果实。蒺藜皂苷D分子结构如下:
刺蒺藜作为防治疾病的中草药已经有上千年的历史,现代研究表明,刺蒺藜具有改善性功能、保护心脏、保护神经细胞、抗糖尿病、抗炎、抗肿瘤和抗氧化作用的药物活性;此外还作为止痒药物用于皮肤化妆品的植物用药,治疗痤疮等皮肤疾病。
已有研究报道蒺藜皂苷D有抗肿瘤作用,但是,目前蒺藜皂苷D对银屑病的治疗作用及应用国内外尚无人报道。
发明内容
本发明的目的在于提供蒺藜皂苷D在制备治疗银屑病的药物中的应用。
为了达到上述目的,本发明采用以下技术方案予以实现:
本发明公开了蒺藜皂苷D在制备治疗银屑病的药物中的应用。
优选地,所述的药物为改善银屑病皮损的药物。
进一步优选地,所述的药物为改善银屑病皮损组织病理形态的药物。
进一步优选地,所述的药物为降低皮损表皮厚度的药物。
进一步优选地,所述的药物为减少角质形成细胞增殖的药物。
进一步优选地,所述的药物为减少免疫细胞数量的药物。
本发明公开了一种治疗银屑病的药物,所述的药物是将蒺藜皂苷D与可药用载体制成的药物。
优选地,该药物的动物(小鼠)给药剂量为:TED-H(高剂量)50mg/kg/d,TED-M(中剂量)25mg/kg/d,TED-L(低剂量)12.5mg/kg/d。
优选地,所述的药物为口服制剂或外用制剂。
优选地,所述口服制剂包括片剂、颗粒剂及胶囊剂;所述外用制剂包括膏剂、凝胶剂、擦剂及水溶剂。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明公开了蒺藜皂苷D在制备治疗银屑病的药物中的应用,通过建立银屑病的小鼠模型并进行相关的体内试验,支撑了本发明的上述创新研究结果,具体表现在:蒺藜皂苷D的药理作用显著,主要表现为:改善银屑病样小鼠皮损组织病理形态,降低其表皮厚度,减少角质形成细胞增殖,减少树突状细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞等免疫细胞的数量,改善银屑病样小鼠焦虑行为学,降低神经递质SP的分泌,从而改善银屑病样小鼠皮损。因此,可以得出蒺藜皂苷D对银屑病具有明显的治疗效果的结论。本发明提供了蒺藜皂苷D单体新的医疗用途,开拓了蒺藜皂苷D新的应用领域。
附图说明
图1为各组小鼠背部皮损的比较(第7天皮损情况)照片;
图2为各组皮损皮损面积严重指数(PASI)评分结果,其中,A为鳞屑评分;B为皮损浸润程度评分;C为皮损红斑评分;D为总分;
图3为各组小鼠表皮厚度统计柱状图;
图4为皮损病理组织形态学改变HE染色照片(×200);
图5为各组小鼠皮肤中Ki67表达情况(IF×200);
图6为皮损中Ki67阳性细胞数量统计;
图7为各组小鼠脾脏中免疫细胞的数量;其中,A为成熟的树突状细胞表面标志物CD11c+与I-A/I-E+;B为淋巴细胞表面标志物B220+;C为γδT淋巴细胞表面标志物CD3+与TCRγδT+;D为巨噬细胞表面标志物CD11b+与F4/80+;
图8为各组小鼠旷场实验行为活动评分;其中,A为小鼠运动总路程;B为中央区运动路程;C为中央区停留时间;
图9为各组小鼠OE%和OT%比较分析;其中,A为OE%;B为OT%;
图10为各组小鼠皮损组织中SP蛋白相对表达。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案,下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是,本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象,而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换,以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外,术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形,意图在于覆盖不排他的包含,例如,包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元,而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述:
1、实验材料
1.1蒺藜皂苷D混悬液的制备
配方:蒺藜皂苷D 100mg、羧甲基纤维素钠0.5g、双蒸水100ml。
制备方法:将羧甲基纤维素钠0.5g溶于100ml双蒸水中,配置成5%的羧甲基纤维素钠溶液,加入蒺藜皂苷D,制得蒺藜皂苷D混悬液。
分别配置为高(50mg/kg)、中(25mg/kg)、低(12.5mg/kg)不同剂量的混悬液。
1.2实验动物
BALB/c小鼠[北京华阜康生物科技股份有限公司提供,许可证号SCXK(京)2019-0008],体质量18-20g,6-8周龄,雄性48只。
1.3实验仪器
高速冷冻离心机(Centrifuge 5415D)购自德国Eppendorf公司;脱水机(ASP6025)、包埋机(EG1150)、石蜡切片机(RM2255)、烤片机(HI1220)、HE半自动染色仪(AU-TOSTAINER XL)均购自德国Leica公司,蔡司光学显微镜。流式细胞仪(BD Biosciences,MN,USA),旷场、高架迷宫由上海欣软信息科技有限公司提供,视频分析系统软件Supermaze。
1.4实验药物
5%咪喹莫特乳膏(四川明欣药业有限责任公司),蒺藜皂苷D(中国食品药品检定研究院)、3%(质量分数)H2O2去氧离子水、山羊血清工作液(北京中杉金桥生物技术有限公司,货号ALI-9022)。Substance P(Affinity,货号DF6541)。
2、实验方法
2.1动物造模、分组、给药
参考van der Fits等小鼠银屑病样模型制备方法造模。实验前戊巴比妥钠(80mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠,背部备皮,面积约2cm×3cm,备皮后单笼饲养。依据随机数字表法,将小鼠随机分为空白对照组、模型组、抑制剂组、蒺藜皂苷D高、低剂量组,每组8只。各组小鼠灌胃治疗2小时后造模,每日1次,连续6天,第七天取材。具体造模及给药方法如下:
1)空白对照组小鼠给予0.9%(质量分数)羧甲基纤维素钠溶液灌胃0.2mL;背部涂抹凡士林乳膏。
2)模型组小鼠给予0.9%(质量分数)羧甲基纤维素钠溶液灌胃0.2mL;背部涂抹5%咪喹莫特乳膏62.5mg。
3)抑制剂组小鼠给予1mg·kg-1NK1R抑制剂溶液0.2ml;造模同模型组。
4)蒺藜皂苷D高剂量组小鼠给予等量50mg kg-1药液,中剂量组给予等量25mg kg-1药液,低剂量组给予等量12.5mg kg-1药液;造模同模型组。
2.2小鼠银屑病样皮损面积和疾病严重程度评分(PASI评分)
每日对实验小鼠皮损进行拍照,根据PASI评分标准,鳞屑、浸润和红斑按0-4分评价:0=无;1=轻微;2=中度;3=重度;4=极严重。每日记录统计分析各组小鼠鳞屑、浸润和红斑分值,将三者分值相加计算总分,绘制PASI评分趋势图,动态观察小鼠皮损的变化情况。
2.3测量小鼠皮损表皮厚度
造模第7日取材,取一部分小鼠背部皮肤固定于福尔马林中,脱水、包埋后制备5μm石蜡切片。用苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色,通过光学显微镜观察各组小鼠皮肤形态学变化,每个标本选5张不同切片进行拍摄,采用ZEN软件测量表皮厚度。
2.4小鼠皮损中Ki67表达情况检测
制备5μm石蜡切片,进行Ki67染色,使用免疫荧光法(Immunofluorescence,IF)检测Ki67的表达,Ki67是一种增生细胞相关的核抗原,阳性细胞细胞核呈绿色荧光,在200倍镜下,每例标本随机选取5个视野并拍照,应用IPP 6.0图像分析系统记录数据。
2.5流式细胞术检测小鼠脾脏中免疫细胞的数量
从小鼠的背部取出脾脏并加入1640培养基进行研磨,过滤后,获得脾细胞悬液,将细胞悬液以1500rpm,4℃离心5分钟,加入CD11c等单克隆抗体染色后,室温避光条件下孵育30分钟;PBS洗涤后,1500rpm,4℃条件下离心5分钟,再加入200μl PBS混悬后,使用流式细胞仪进行分析。
2.6旷场实验
造模第5日进行旷场实验。该仪器由50cm×50cm×50cm的隔板箱组成,旷场上方安装摄像头,连接电脑,利用Supermaze软件将旷场划分25宫格,具体分为中央区和四边区两个测量区域。实验前,提前将待测小鼠放入临时笼盒适应,减少小鼠紧张;实验开始将小鼠放置于旷场中央区,记录5min内小鼠的活动情况,包括中央区运动路程、中央区停留时间和中央区进入频率。在每只小鼠测量间隙,用75%酒精清洁旷场内尿液、粪便,防止其他小鼠留下的气味影响实验。
2.7高架十字迷宫
造模第6日进行高架十字迷宫实验。该仪器由两条开放臂(50cm长×10cm宽)、两条闭合臂(50cm长×10cm宽×40cm高)及中央区(10cm长×10cm宽)组成,开臂与闭臂相互垂直“十”字交叉。高架十字迷宫上方安装摄像头,连接电脑,利用Supermaze软件将实验区域划分为中央区、开臂和闭臂区域;具体操作同旷场实验,将小鼠放入中央区且面对开臂,记录5min内小鼠的活动情况,包括进入开臂次数(Open arm entry,OE),开臂时间(Open armtime,OT),闭臂次数(Close arm entry,CE),闭臂时间(Close arm time,CT);根据上述指标分别计算出:进入开臂次数比例(OE%):OE/(OE+CE)×100%,开臂停留时间比例(OT%):OT/(OT+CT)×100%。
2.8 Western blot法检测皮损组织中SP蛋白表达
各组小鼠皮损组织加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液,电动匀浆机匀浆后,冰上裂解20min,12000rpm 4℃离心5min,分装保存上清液。BCA法进行蛋白定量。蛋白样品电泳后湿转膜,5%脱脂牛奶封闭,室温轻摇60min,加入一抗,4℃过夜。洗膜后二抗孵育1h,再次洗膜,胶片曝光,显影、定影。曝光后的胶片直接扫描,软件Image J读取条带的IOD值。
2.9统计学处理
将数据进行统计学处理并进行组间差异性检验,数据用x±s表示,组间差异采用SPSS统计软件进行单因素方差分析,以P<0.05为差异具有显著性。
3、实验结果
3.1蒺藜皂苷D对银屑病样小鼠皮损的影响
实验先通过观察各组小鼠皮损表现、PASI评分、病理组织形态学改变及表皮厚度来探究蒺藜皂苷D的药理作用。根据各组小鼠的皮损表现制作PASI评分趋势图,空白对照组小鼠皮肤始终白嫩光滑,无鳞屑、红斑和浸润现象,其鳞屑、红斑、浸润和总分分值始终为0;模型组于第2-3天开始出现轻微皮损,其背部皮肤鳞屑、红斑和浸润,随造模时间的变化不断加重,第7天皮损最严重,银白色鳞屑肥厚,表皮红肿,皮肤变硬变厚浸润明显,银屑病样皮损模型形成,鳞屑、浸润、红斑和总分分值最高;其余各组小鼠第三日背部出现皮损,其鳞屑、浸润、红斑和总分分值,随时间推移,不同程度的升高;抑制剂组和蒺藜皂苷D各剂量组与模型组同期相比,皮肤鳞屑、红斑和浸润情况减轻。结果参见图1和图2。
显微镜下统计表皮厚度的差异,统计并测量各组小鼠表皮厚度,分析结果发现,模型组小鼠与空白对照组相比,表皮层厚度显著增厚(P<0.001);抑制剂组、蒺藜皂苷D各剂量组表皮厚度均显著低于模型组(P<0.001),结果参见图3。
组织石蜡切片后HE染色观察病理组织形态学改变,参见图4,实验结果显示,空白对照组小鼠皮肤表皮层薄,细胞浸润少;模型组小鼠与空白对照组相比,表皮层明显增厚,角化不全及角化过度较多、炎性细胞浸润严重,角质层可见大量Munro微脓肿;抑制剂组、蒺藜皂苷D各剂量组与模型组相比,表皮层均变薄,角化不全和角化过度减少,炎性细胞浸润及Munro微脓肿减轻。
3.2蒺藜皂苷D对银屑病样小鼠皮损中Ki67表达的影响
免疫荧光染色法观察各组小鼠皮损中Ki67表达情况,结果参见图5,空白对照组小鼠表达于基底层细胞;模型组小鼠在基底层和颗粒层均有表达,其阳性细胞数量较空白对照组显著增多(P<0.001);抑制剂组、蒺藜皂苷D各剂量组小鼠阳性细胞数量均较模型组显著减少(P<0.001),结果参见图6。
3.3蒺藜皂苷D对银屑病样小鼠脾脏中免疫细胞数量的影响
参见图7,流式细胞术结果显示,模型组小鼠与空白对照组相比,成熟的树突状细胞表面标志物CD11c+与I-A/I-E+(图7中A),B淋巴细胞表面标志物B220+(图7中8),CD3与TCRγδT+(图7中C),以及巨噬细胞表面标志物CD11b+与F4/80+(图7中D)的比例显著升高(P<0.001),说明模型组小鼠脾脏中树突状细胞等免疫细胞的数量增多;蒺藜皂苷D各剂量组与模型组相比,这些免疫细胞的数量显著减少(P<0.01)。
3.4蒺藜皂苷D对银屑病样小鼠行为学实验的影响
参见图8,旷场实验结果显示,图8中A显示小鼠运动总路程:模型组小鼠与空白对照组相比,其运动总路程显著减少(P<0.05)、抑制剂组、蒺藜皂苷D高剂量组与模型组相比,运动总路程显著增多(P<0.05);图8中B显示中央区运动路程:模型组小鼠与空白对照组相比,中央区运动路程显著减少(P<0.001),蒺藜皂苷D高剂量组与模型组相比,中央区运动路程显著增多(P<0.05);图8中C显示中央区停留时间:模型组小鼠与空白对照组相比,中央区停留时间显著减少(P<0.01),蒺藜皂苷D各剂量组小鼠与模型组相比,中央区停留时间有升高趋势,但没有统计学意义(P>0.05)。
参见图9,高架十字迷宫实验结果显示,模型组小鼠与空白对照组相比,OE%显著降低(P<0.05),蒺藜皂苷D低、高剂量组与模型组相比,OE%显著升高(P<0.05)。
3.4蒺藜皂苷D对银屑病样小鼠皮损中SP蛋白表达的影响
参见图10,模型组小鼠皮损SP蛋白表达显著高于空白对照组(P<0.05),与模型组相比,蒺藜皂苷D各剂量组其皮损SP的表达有一定降低趋势。
综上所述,本发明提供了蒺藜皂苷D在治疗银屑病中的应用。本发明经药理试验发现,蒺藜皂苷D可改善银屑病样小鼠皮损组织病理形态,降低其表皮厚度,减少角质形成细胞增殖,减少树突状细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞等免疫细胞的数量,改善银屑病样小鼠焦虑行为学,降低神经递质SP的分泌,具有改善银屑病样皮损的作用。
以上内容仅为说明本发明的技术思想,不能以此限定本发明的保护范围,凡是按照本发明提出的技术思想,在技术方案基础上所做的任何改动,均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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