CN117427075A - Tdmq20在制备抑制lps诱导的神经炎症的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物领域，公开了TDMQ20(结构式如下)在制备抑制和治疗LPS(脂多糖)诱导的神经炎症的药物中的应用。本申请通过对TDMQ20抑制LPS诱导的神经炎症的活性进行研究，结果表明TDMQ20能够有效抑制LPS对小胶质细胞的激活作用；有效抑制炎症因子IL‑6和TNF‑α炎症因子的表达；同时能够显著抑制由LPS诱导的NO产生，证明TDMQ20在调控神经炎症、降低炎症指标方面的作用。动物行为学研究表明，TDMQ20能够减缓LPS诱导的小鼠记忆障碍，改善小鼠记忆损伤，为TDMQ20作为一种有前景的、可以治疗与神经炎症相关疾病的潜在药物提供证据。
Description
技术领域
本发明属于药物技术领域，更具体地，涉及TDMQ20在制备抑制LPS诱导的神经炎症药物中的应用。
背景技术
专利CN 114632082A公开了一种四齿单喹啉铜离子螯合剂在制备治疗阿尔茨海默病以及精神分裂症药物中的应用，旨在解决现有四齿单喹啉铜离子螯合剂在脑中的生化效应和作用，然而其作用机制尚不清楚，导致四齿单喹啉铜离子螯合剂在药物中的应用受限的问题。本申请的前期研究提供了用TDMQ20治疗的三种不同AD模型小鼠脑组织的蛋白质组学结果，这三种模型包括两种脑定位注射AD小鼠模型(hippo-CuAβ、icv-CuAβ)和一种转基因5xFAD小鼠模型。对这些蛋白质组学结果进行生物信息学分析，结果表明：TDMQ20在调节神经退行性疾病相关蛋白的表达中发挥着重要作用。因此，可将四齿单喹啉铜离子螯合剂用于制备治疗阿尔茨海默病以及精神分裂症的药物。以上从蛋白质组学角度提供了相应的效果，本发明旨在从不同角度，即从LPS(脂多糖)诱导的神经炎症出发，以获得更多更深入的TDMQ20针对上述神经炎症的相关作用和效果。
发明内容
为解决现有技术中神经炎症模型上的更多补充，本申请提供了TDMQ20在制备抑制LPS(脂多糖)诱导的神经炎症疾病的药物中的应用。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
TDMQ20在作为制备改善和抑制神经炎症的药物中的应用，所述TDMQ20的结构式如下：
所述药物包括药学上可接受的盐。
所述药学上可接受的盐的结构式如下：
进一步地，所述药物以TDMQ20作为活性成分，用以改善对脂多糖诱导的记忆和认知损伤。
进一步地，所述药物用以保护脂多糖诱导神经元损伤。
进一步地，所述药物用以抑制脂多糖诱导的小胶质细胞活化。
进一步地，所述药物用以抑制脂多糖诱导的炎症因子释放水平。
更进一步地，炎症因子为IL-6或TNF-α。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本申请通过多个脂多糖诱导的神经炎症研究，表明TDMQ20能减缓脂多糖诱导的小鼠记忆障碍的影响，改善小鼠记忆损伤；抑制对脂多糖诱导的小胶质细胞活化程度；有效抑制炎症因子IL-6和TNF-α炎症因子的表达。同时能够显著性抑制由LPS诱导的NO产生，为TDMQ20作为一种有前景的、可以协助治疗与神经炎症相关的神经退行性疾病的潜在药物提供证据。
附图说明
图1是TDMQ20对LPS所致的记忆和认知损伤的改善作用图(A图表示定向导航实验(隐藏平台)中小鼠行动轨迹图；B图表示定向导航实验中(隐藏平台)的小鼠潜伏期；C图表示空间探索实验中(撤除平台)小鼠行动轨迹图，D图表示空间探索实验中(撤除平台)小鼠在目标象限所花的时间图；所有组别与LPS组的差异显著性表示为*
(p<0.05))；
图2是TDMQ20对LPS所致神经元损伤的保护作用图(A图为实验小鼠脑组织海马和大脑皮层尼氏染色切片图；B图为海马体CA1区正常神经元的数目；C图为大脑皮层区正常神经元的数目；图中柱状图数据均以Mean±SEM表示(n＝12)，所有组别与LPS组的差异显著性表示为*(p<0.05)，**(p<0.01)，***p＜(0.001)，****p＜(0.0001))；
图3是TDMQ20对LPS诱导的小胶质细胞活化程度的抑制作用(A图为实验小鼠脑组织海马区免疫荧光切片图；B图为小鼠脑组织中海马体CA1区中Iba-1蛋白的表达量；图中柱状图数据均以Mean±SEM表示(n＝12)，所有组别与LPS组的差异显著性表示为*(p<0.05)，**(p<0.01)，***p＜(0.001)，****p＜(0.0001))；
图4是TDMQ20对LPS诱导的IL-6表达水平的抑制作用(A图为实验小鼠脑组织海马区免疫组化切片图；B图免疫组化表征海马CA1区中IL-6的表达量；C图免疫组化表征大脑皮层区中IL-6的表达量，图中柱状图数据均以Mean±SEM表示(n＝12)，所有组别与LPS组的差异显著性表示为(*(p<0.05)，**(p<0.01)，***p＜(0.001，****p＜(0.0001))；
图5是TDMQ20对LPS诱导的TNF-α表达水平的抑制作用(A图为实验小鼠脑组织海马区免疫组化切片图；B图免疫组化表征海马CA1区中TNF-α的表达量；C图免疫组化表征大脑皮层区中TNF-α的表达量，图中柱状图数据均以Mean±SEM表示(n＝12)，所有组别与LPS组的差异显著性表示为(*(p<0.05)，**(p<0.01)，***p＜(0.001，****p＜(0.0001))；
图6是TDMQ20对BV2细胞活力的影响(与空白组相比，显著性表示为*p<0.05，**p<0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001)；
图7是TDMQ20对LPS诱导的BV2细胞活力的影响(与LPS组相比，显著性表示为*p<0.05，**p<0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001)；
图8是TDMQ20对LPS诱导的BV2细胞中NO含量影响(与LPS组相比，显著性表示为*(p<0.05)，**(p<0.01)，***p＜0.001，****p＜0.0001)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例和附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行制备。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1TDMQ20对小鼠神经炎症的抑制作用
1.1材料与方法
1.1.1实验动物
SPF级7周龄雄性C57BL/6J小鼠，实验动物在清洁级层流架中饲养，饲养环境温度保持为23±2℃，湿度50-60％，照明时间12h/d，自由进食和饮水，适应性饲养至小鼠8周龄开始实验。
1.1.2动物模型建立
将动物随机分为7组，具体的分组及给药情况如表：
表1实验动物分组及给药处理
按照表中给药剂量给药。根据组别连续2周给予相应药物预处理，从第7天开始，除了空白组外，其余组别TTP488，DEX，TDMQ20的小鼠均进行腹腔注射LPS(为期7天)。TTP488的溶剂为0.2％羧甲基纤维素钠，DEX的溶剂为0.9％生理盐水，LPS溶剂为0.9％生理盐水。
1.1.3Morris水迷宫实验
1.1.4动物取材与样品处理
水迷宫测试后一天处死小鼠，采用眼球取血收集小鼠血液，采集完毕后将离心管轻轻晃动混匀获得小鼠全血样本。然后在低温环境下，立即解剖小鼠脑组织，并迅速置于4％的多聚甲醛溶液中备用。
1.1.5尼氏染色检测
1.1.6免疫荧光检测
首次将切片放入环保型脱蜡液Ⅰ10min-环保型脱蜡液Ⅱ10min-环保型脱蜡液Ⅲ10min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-无水乙醇Ⅲ5min-蒸馏水洗。柠檬酸抗原修复液修复抗原，组化笔圈出组织范围后加入自发荧光淬灭剂，随后冲洗；加入3％BSA封闭30min,开始一抗孵育4℃过夜。一抗洗涤后二抗孵育1h。二抗洗涤后DAPI复染，孵育10min，最后洗涤封片。切片置于荧光显微镜下，采集图像进行分析。
1.1.7免疫组化检测
取石蜡切片进行免疫组化，以考察炎症因子如TNF-α和IL-6的原位表达情况。石蜡切片依次经过脱蜡至水、抗原修复、阻断内源性过氧化酶、血清封闭后，分别加入不同炎症因子对应的一抗，于4℃冰箱孵育过夜后再洗涤；随后又在切片上滴加对应一抗的二抗，室温孵育50min后洗涤切片。然后进行DAB显色、苏木素复染细胞核，之后脱水透明后镜检观察。用全自动数字玻片扫描机扫描，得到切片扫描图。最后对图像进行分析。
1.1.8统计学处理方法
先采用Image-J软件对大脑图像进行分析，后采用Graph PadPrism 8.0进行实验数据分析，数据以Mean±SEM表示，组间差异性分析使用One-way或Two-way ANOVA检验，p<0.05代表数据间的差异性具有统计学意义。
1.2实验结果与分析
1.2.1TDMQ20对LPS所致的记忆和认知损伤的改善作用
在水迷宫定向导航实验中，如图1中A和B图所示，将逃生平台设置在第1象限的中央。LPS组小鼠寻找逃生平台所花的时间，即逃避潜伏期，均长于Control组小鼠的逃避潜伏期，表明腹腔注射LPS导致小鼠的记忆功能受损，说明建模成功。在定向导航实验的4个象限中，给予低、中、高剂量TDMQ20的实验组小鼠，寻找逃生平台所花的时间，均比LPS模型组明显缩短，表明记忆功能得到不同程度的改善。。
在水迷宫空间探索实验中，如图1中C和D图所示，通过小鼠在第1象限(此时平台已撤去)停留时间比较，考察小鼠的认知功能。停留时间越小，表明小鼠的认知功能越差，反之，则越好。实验结果表明，相比于Control组，LPS组小鼠在目标象限所花的时间减少了，且具有显著的差异性(p<0.05)，说明建模成功。其次，阳性药对照组TTP488组和DEX组，以及TDMQ20低、中、高剂量组的小鼠在目标象限所花的时间均大于LPS组，且高剂量组表现出统计学的差异性(p<0.05)。表明TDMQ20能减缓LPS诱导的小鼠记忆障碍的影响，可以改善小鼠记忆损伤。
1.2.2TDMQ20对LPS所致神经元损伤的保护作用
实验结果如图2所示，正常空白组小鼠海马和皮层区域的神经锥体细胞中含有大量的尼氏小体，着色较深，细胞核清晰可见。而注射LPS导致神经细胞中尼氏小体显著减少，着色较少，细胞核模糊不清。给药组均不同程度改善了尼氏小体数目减少的情况。其中，给药组切片染色结果与TTP488组，DEX组的接近，各区域染色均较深，表示尼氏小体数目较多，改善效果好。通过海马体CA1区和大脑皮层的正常神经元的计数可知，LPS组的正常神经元数目较Control组的极其显著地减少(p<0.0001)，说明神经炎症模型小鼠的成功建立。相比于LPS组，TTP488，DEX组的正常神经元数目明显增加(p<0.01，p<0.001，P<0.0001)，TDMQ20低、中、高剂量的正常神经元数目均依次明显增加(p<0.01，p<0.001，P<0.0001),具有剂量依赖性。
1.2.3TDMQ20对LPS激活小胶质细胞的抑制作用
结果如图3所示，LPS组Iba-1蛋白的IOD值较Control组的高，且具有显著差异(p<0.001，P<0.0001)，模型组中大量的小胶质细胞被激活，红色荧光明显增多，表明：注射LPS引起了神经炎症的反应。给药组中，TTP488，DEX组的Iba-1蛋白表达量的IOD值，明显少于LPS组(P<0.05,P<0.001)，低、中、高剂量组Iba-1蛋白的IOD值较LPS组明显减少(P<0.01,P<0.001)，且具有剂量依赖性，表明：给药后，小胶质细胞的活化水平被抑制，红色荧光标记的细胞明显减少。
1.2.4TDMQ20对LPS诱导的炎症因子释放水平的抑制作用
实验结果表明，TDMQ20具有抑制炎症因子释放的作用。实验结果如图4所示，无论在大脑皮层还是在海马体CA1区，LPS组的IL-6的表达均明显地高于Control组(P<0.0001),说明LPS诱导的神经炎症模型建模成功。相比于LPS组，TTP488组在大脑皮层和海马体CA1区显著降低IL-6的作用(P<0.0001)；DEX在大脑皮层区表现降低IL-6的表达(P<0.0001)；在大脑皮层和CA1区，TDMQ20低、中、高剂量组明显抑制IL-6的表达水平(P<0.001,P<0.0001),且具有剂量依赖性。
实验结果如图5所示，相比于Control组，LPS组的TNF-α表达水平较高，表现出显著的差异性(p<0.0001),说明LPS诱导的神经炎症模型建模成功。在大脑皮层区和CA1区，TTP488组，DEX组均表现降低IL-6的作用，且具有统计学意义(p<0.0001)。TDMQ20低、中、高剂量组明显抑制IL-6的表达水平(P<0.01,P<0.0001),且具有剂量依赖性。
以上主要通过Morris水迷宫实验、尼氏染色、免疫荧光、免疫组化等实验，考察TDMQ20改善认知障碍的作用以及抑制神经炎症的效果。空间探索实验和定向导航实验的结果表明，TDMQ20表现出不同程度改善小鼠认知障碍的作用；尼氏染色实验结果显示，TDMQ20能发挥保护脑组织中神经元的作用，低、中、高剂量的TDMQ20依次不同程度地降低炎症作用；免疫荧光的实验结果表明，TDMQ20能明显抑制小胶质细胞的激活；免疫组化实验的结果表明，TDMQ20能有效抑制炎症因子IL-6和TNF-α炎症因子的表达。
实施例2采用神经炎症细胞模型进行体外TDMQ20抗炎活性评价
2.1材料与方法
本申请采用的BV2细胞为小鼠小胶质细胞
2.1.3Griess Reagent法测定BV2细胞上清液的NO含量
BV2细胞受到LPS激活后，NO表达大幅提高。对LPS诱导的BV2细胞上清液中的NO进行定量测定。在12孔板中接种BV2细胞，细胞悬液为106个细胞/mL，每孔加入1mL细胞悬液，置于培养箱中培养24h。计时结束后，小心将原来的培养基吸出，每孔加入1mL含有不同浓度的TDMQ20，药物作用1h后，加入10μL的1μg/mL LPS的培养基，空白组加入相同体积的培养基，每组设置3个复孔，置于培养箱培养48h。计时结束后，每孔取50μL的细胞培养上清液置于新的96孔板中，每孔加入50μL Griess A试剂和50μL Griess B试剂，反应5min后，置于酶标仪于562nm波长处测OD值。将测得的吸光度值代入标准曲线中，算得NO含量。
2.2实验结果与分析
2.2.1TDMQ20对BV2细胞增殖的影响
采用MTT法来考察TDMQ20对BV2细胞活力的影响，结果如图6。当TDMQ20的浓度低于10μM时，TDMQ20对BV2细胞增殖没有显著的抑制作用。当浓度达到15μM及以上时，TDMQ20对BV2的细胞增殖的抑制较大。为避免细胞毒性影响BV2的正常生长状态，我们后续选用10μM及以下的浓度开展实验。选择TDMQ20浓度低于10μM、LPS浓度1μg/mL、作用48h作为后续研究条件。在此基础上，同时检测TDMQ20对LPS诱导的BV2细胞活力是否有毒性作用。结果发现，如图7所示，1μg/mL LPS处理BV2细胞48h后，会显著降低细胞活力至86％(p<0.0001)。将TDMQ20以浓度梯度(1,5,10μM)与LPS共处理BV2细胞48h后，结果显示：当TDMQ20的浓度低于10μM时的TDMQ20对LPS诱导的BV2细胞没有显著的抑制作用，因此在下一步实验研究中继续选取低于10μM的浓度作为TDMQ20的处理浓度。
2.2.3TDMQ20对LPS诱导NO的抑制作用
本发明采用Griess Reagent方法对LPS诱导的BV2细胞上清液中NO含量进行检测，探讨TDMQ20对LPS诱导的NO信号通路的调控，结果如图8所示。在经过LPS(1μg/mL)处理48h后，BV2细胞培养基中NO含量显著提高(p<0.05,p<0.0001)，说明LPS诱导的BV2细胞神经炎症模型的建模成功。其中阳性药DEX显著地抑制了NO的释放(p<0.0001)，且TDMQ20呈梯度依赖性显著抑制LPS诱导的NO的释放(p<0.0001)，当TDMQ20的浓度为10μM时，与阳性药效果相当，可见，TDMQ20具有调控神经炎症的潜力。
综上，当TDMQ20的浓度低于10μM时，TDMQ20对BV2细胞增殖没有明显的抑制作用。当浓度达到15μM及以上时，TDMQ20对BV2的细胞增殖的抑制较大；1μg/mL LPS处理BV2细胞48h后，会显著降低细胞活力至86％(p<0.0001)，而浓度低于10μM时，TDMQ20对LPS诱导的BV2细胞无明显的毒性作用；在NO实验中，1μg/mL LPS处理48h后，BV2细胞培养基中NO含量显著提高(p<0.0001)，TDMQ20的浓度在10μM时能够显著性抑制由LPS诱导的NO产生(p<0.0001)，以上的研究结果证明TDMQ20在调控神经炎症、降低炎症指标方面的作用，为TDMQ20作为一种有前景的、可以协助治疗与神经炎症相关的神经退行性疾病的潜在药物提供证据。
本发明的上述实施例仅仅是为了清楚地说明本发明技术方案的所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.TDMQ20在制备改善和抑制神经炎症的药物中的应用，其特征在于，所述TDMQ20的结构式如下：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述TDMQ20作为活性成分，用以改善对LPS诱导的记忆和认知损伤。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述化合物TDMQ20用以保护LPS诱导的神经元损伤。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述化合物TDMQ20用以抑制LPS诱导的小胶质细胞活化。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述化合物TDMQ20用以抑制LPS诱导的炎症因子释放水平。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，炎症因子为IL-6或TNF-α。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，TDMQ20可以抑制LPS诱导的NO的产生。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，TDMQ20的抑制浓度为10μM。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包括药学上可接受的盐。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物可接受的盐的结构式如下：
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