CN110742876A - 麝香草酚在制备治疗银屑病药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了麝香草酚在制备治疗银屑病药物中的用途。动物试验结果表明，麝香草酚具有抗炎、止痒、免疫调节作用，对银屑病具有很好的疗效，同时麝香草酚来源于天然植物，具有安全范围大，毒性小等优点。进一步研究表明，该药治疗银屑病与激活TRPM8有关。

Description

麝香草酚在制备治疗银屑病药物中的用途
技术领域
本发明属于制药领域，涉及麝香草酚的制药新用途，尤其是在制备治疗银屑病药物中的新用途。
背景技术
银屑病是一种常见易复发的慢性，顽固性皮肤病，目前尚无治疗本病的理想药物。银屑病的病因及发病机制尚未清楚，普遍认为是多种因素相互作用的多基因遗传病，通过免疫介导的共同通路最后引起角质形成细胞发生增殖。皮损处淋巴细胞、单核细胞浸润为银屑病的重要病理特征，表明免疫系统参与该病的发生发展。银屑病除皮肤损害外，还可伴有肝、眼、胃肠道、心血管、肾及代谢性疾病等并发症。
银屑病患者病情反复发作，临床表现为严重程度不同的慢性无传染性的皮肤损害，较重的患者可累及20-80％的全身皮肤，受累皮肤范围广泛，治疗的首要目的是在一定时间内清除皮肤损害，缓解患者的临床症状，如皮肤炎症、红肿、剥脱、瘙痒，疼痛等症状，防止复发，逐渐达到痊愈的目的。现在治疗银屑病的药物及方法主要有：1、抗肿瘤药物如甲氨喋呤：甲氨喋呤是一种叶酸还原酶抑制剂，可阻止表皮细胞增殖时DNA合成，抑制细胞核的有丝分裂，可抑制体内被激活的淋巴细胞增殖，减弱CD8细胞的功能和抑制中性粒细胞的趋化性，是全身治疗银屑病的标准用药，但其治疗量和中毒量很接近，长期用药可引起肝脏广泛性纤维化和肝硬化；2、糖皮质激素：长期使用可引起严重的副作用，而在减量或停药后，可发生“反跳”现象或诱发严重脓疱型及红皮病型银屑病，一般仅用于红皮病型、关节型或泛发性脓疱型银屑病并且使用其他药无效者；3、维A酸类药：此类药物治疗银屑病的机制主要是调节表皮增殖和分化以及免疫功能等。单独服用或与其他疗法联合应用治疗中重度银屑病，有较满意疗效，但其可致畸胎，长期服用可出现血脂升高、肝脏损害等；4、免疫疗法：主要有环孢素A、他克莫司等，其不良反应有肾毒性、高血压等；5、生物制剂疗法：如依那西普、阿法赛特等，生物制剂银屑病治疗史上又一大进展，但其价格昂贵，还存在不良反应等问题，需要进一步观察研究；6、作用于核受体的药物：利阿唑是咪唑类衍生物、维A酸模拟物及维A酸代谢阻滞剂，但不属于维A酸，通过增加组织和血液中内源性维A酸量来发挥疗效，常见的副作用有瘙痒、干燥、唇炎等；7、抗生素及维生素类药物：临床上不少银屑病的发生和复发与细菌、真菌、病毒等微生物感染有关，对这些病例可选用抗感染治疗，也有报道维生素A、维生素D2、氨肽素等对银屑病的治疗；其他还可应用紫外线，光化学疗法，宽谱中波紫外线疗法，窄谱中波紫外线疗法，水疗法，以及单抗药。但这些治疗方法特点是成本高、有副作用、不良反应等。故目前尚需探寻一类既安全又有效的治疗银屑病的药物。
麝香草酚，别名百里香酚，是一种单萜酚类物质，即5-甲基-2-异丙基苯酚(5-methyl-2-iso-propylpheno1)，其分子式为C10H14O，分子量为150.22，为无色或白色晶体，熔点51.5℃，沸点232.5℃，相对密度0.979，微溶于水，易溶于有机溶剂如乙醇等。已有文献报导麝香草酚具有抗炎、抗菌、镇静、抗肝损伤、抗缺氧、扩血管、抗心律失常、降血脂等作用，但尚没有用于银屑病的治疗。
发明内容
本发明的目的是提供一种麝香草酚在制备治疗银屑病药物中的新用途。
申请人利用咪喹莫特乳膏制备银屑病小鼠模型，通过小鼠皮下注射麝香草酚，考察了麝香草酚对模型小鼠挠痒行为学、血清炎症因子以及免疫功能的影响，结果发现：麝香草酚能显著减少小鼠挠痒次数，降低血清IL-6、TNF-α、IL-1β含量，减少造模部位的炎性浸润及肥大细胞数目，改善皮肤免疫功能，且具有量效关系。
申请人急性分离野生型及Trpm8-/-小鼠DRG细胞，通过钙成像技术，观察麝香草酚对DRG细胞钙离子的激活作用。结果表明0.2mmol/L麝香草酚溶液可激动野生型老鼠DRG细胞，且和薄荷脑(Menthol)激动的是同一类DRG细胞。该激动作用可被TRPM8抑制剂AMTB拮抗，麝香草酚对TRPM8-/-小鼠DRG的无激动作用。
以上结果表明，麝香草酚具有抗炎、止痒、免疫调节作用，对银屑病具有很好的疗效，同时麝香草酚来源于天然植物，具有安全范围大，毒性小等优点。进一步研究表明，该药治疗银屑病与激活TRPM8有关。
附图说明
图1麝香草酚不同剂量的止痒效果，图中，与空白组相比，###P＜0.001；与模型组相比，＊＊＊P＜0.001、＊＊P＜0.01。
图2麝香草酚对银屑病小鼠血清中TNF-α水平的影响，图中，与空白组相比，##P＜0.01；与模型组相比，＊＊＊P＜0.001。
图3麝香草酚对银屑病小鼠血清中IL-1β水平的影响，图中，与空白组相比，###P＜0.001；与模型组相比，＊＊P＜0.01，＊P＜0.05。
图4麝香草酚对银屑病小鼠血清中IL-6水平的影响，图中，与空白组相比，##P＜0.01；与模型组相比，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001。
图5麝香草酚对银屑病小鼠皮层厚度的影响，图中，与空白组相比，###P＜0.001；与模型组相比，＊＊＊P＜0.001。
图6麝香草酚对银屑病小鼠肥大细胞的影响，图中，与空白组相比，###P＜0.001；与模型组相比，＊＊＊P＜0.001。
图7麝香草酚对皮肤巨噬细胞的影响，图中，A是不同组别巨噬细胞数目统计，与空白组相比，##P＜0.01，与模型组相比，＊＊P＜0.01；B是空白组；C是模型组；D是麝香草酚给药组。
图8是麝香草酚对WT小鼠DRG的作用，图中的曲线表明0.2mM麝香草酚可激动DRG细胞引起强烈钙反应，且和TRPM8激动剂menthol激动的是同一类细胞，则麝香草酚可能是作用于DRG细胞上的TRPM8通道发挥作用。
图9是AMTB对麝香草酚激动WT小鼠DRG的影响。图9A的各条曲线表明在无TRPM8抑制剂AMTB时，0.2mM麝香草酚可激动DRG细胞引起强烈钙反应，图9B中各条曲线表明在TRPM8抑制剂AMTB作用下，0.05mM麝香草酚不能引起DRG细胞的钙反应，说明TRPM8抑制剂AMTB可拮抗麝香草酚对DRG细胞的激动作用。
图10是麝香草酚对Trpm8-/-小鼠DRG的作用，图中的曲线表明0.2mM麝香草酚不能引起Trpm8-/-小鼠DRG细胞的钙反应。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1麝香草酚对银屑病小鼠模型的影响
取6-7周C57小鼠48只，分为空白组、模型组、低剂量给药组、中剂量给药组、高剂量给药组和阳性药组。剃除小鼠颈背部毛发(2cm×2cm)使完全暴露皮肤。一天后，在剃毛部位涂抹45mg咪喹莫特乳膏(5％)，使乳膏均匀附着于皮肤上，待乳膏吸收后将小鼠放回笼盒，空白组涂抹等量凡士林。连续7天在同一时间以此方法造模。给药组于第6天上午，皮下注射麝香草酚150、100和50mg.kg-1，模型组皮下注射等量生理盐水。连续给药3天。阳性药组于第8天皮下注射地塞米松(5mg/kg)。通过摄像机在无人的观察室记录60min后爪抓挠行为，所有的行为学测试都是在观察盒的正上方进行录像，由不知情的观察者对实验动物进行行为学的评估(图1)。
行为学观察结束后，在洁净的超净台，(1)摘眼球取血后，样本静置2h，4℃条件下3000rpm，离心15min，分离小鼠血清，通过酶联免疫试剂盒测量小鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β的含量(图2-4)。
(2)脱颈处死小鼠后，H&E或甲苯胺蓝染色，收集小鼠颈部中央的部分皮肤并固定在4％多聚甲醛中，常规脱水后包埋在石蜡中并进行切片。使用标准程序将切片用苏木精和伊红(H&E)或甲苯胺蓝染色。将染色的切片脱水并用载玻片密封后，在显微镜下拍摄图像。使用Image J软件从HE染色图像中测量表皮厚度(图5)或从甲苯胺蓝染色图像中计数肥大细胞的数量(图6)。
(3)流式细胞仪操作测试免疫细胞指标，颈部皮肤的单细胞悬液的制备方法是：将真皮面朝下在500μL，0.25mg/mL Liberase TL中于37℃孵育90分钟，然后用FACS缓冲液(PBS，1％FBS)洗涤并离心(1500rpm,10min,4℃)弃去上清液。通过100μm细胞过滤器过滤后，将细胞悬液与CD45,CD11b,F4/80,I-Ab抗体在冰上孵育30分钟。然后洗涤染色的细胞，在测量之前，将300μL FACS缓冲液添加到每个试管中,运用BD FACSVerse流式细胞仪上机操作分析统计免疫细胞数据(图7)。
结果显示，麝香草酚150、100和50mg.kg-1均可抑制小鼠挠痒行为学(图1)，降低血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量(P<0.05)(图2-4)；模型组与给药组相对比，给药组颈部皮肤造模部位炎性浸润及肥大细胞数目明显减少(图5-6)。麝香草酚100mg.kg-1可显著抑制小鼠皮肤造模部位巨噬细胞数目(图7)，表明麝香草酚对实验性银屑病具有保护作用，该作用可能与其抑制炎性细胞浸润，减少肥大细胞数目，并降低血清IL-6、TNF-α、IL-1β水平有关。
实施例2麝香草酚对TRPM8的激动作用研究
取野生型及Trpm8-/-小鼠双侧背根神经节(DRG)，用含1μL饱和NaHCO3，0.35mg/L半胱氨酸和20U木瓜蛋白酶的无镁Hanks平衡盐溶液，在37℃水浴中消化10min。离心后，用含3.75mg胶原酶Ⅱ型和7.5mg分散酶的游离HBSS 1ml处理15min。再将消化后DRG用DMEM培养基吹散成单个细胞，用含神经生长因子的培养基重悬铺片，于37℃的CO2培养箱中培养至少24小时。将培养好的细胞用10μM Fura-2染料在CO2细胞培养箱中避光孵育2小时以上，吸走培养基加入钙成像缓冲溶液使细胞适应实验环境30分钟。使用具有NIS-Elements成像软件(Nikon Instruments，Inc.，Melville，NY，USA)的倒置尼康Ti-E显微镜在340nm和380nm激发波长下记录荧光。监测并记录反映刺激时钙离子变化的Fura-2比率(F340/F380)。如果细胞荧光比率>基线的10％，则认为细胞有反应。以相应的拮抗剂做对照，检测麝香草酚对TRPM8通道的作用。
TRPM8是温度感受器TRP通道子集中的成员，并且是冷感觉相关的主要受体。环境冷刺激和化学刺激均可激活TRPM8，例如，薄荷醇和桉树脑。已有文献报道TRPM8激动剂具有镇痛作用，而TRPM8与瘙痒之间的具体关系仍不清楚。通过钙成像分析结果显示，0.2mM麝香草酚可激动DRG细胞引起强烈钙反应，且和TRPM8激动剂menthol激动的是同一类DRG神经元亚群(图8)。这表明麝香草酚可能是作用于DRG细胞上的TRPM8通道发挥作用。而用TRPM8拮抗剂AMTB可以完全抑制麝香草酚引起的DRG细胞[Ca2+]i反应(图9A,B)。此外，麝香草酚未能激发从Trpm8-/-小鼠中分离出的DRG神经元[Ca2+]i反应(图10)。以上结果表明麝香草酚可通过激动DRG神经元中TRPM8依赖性[Ca2+]i反应而发挥止痒作用。

Claims (4)

1.麝香草酚在制备治疗银屑病药物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于：该用途与麝香草酚激活TRPM8有关。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物为皮下注射剂。
4.一种治疗银屑病的皮下注射剂，其特征在于：所述皮下注射剂中含有麝香草酚。
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