CN114558003A - 汉黄芩素衍生物gl-v9在制备银屑病治疗药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了汉黄芩素衍生物GL‑V9在制备银屑病治疗药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明通过动物实验和细胞实验探索了GL‑V9对于皮肤炎症银屑病的药效，实验证明GL‑V9作为治疗银屑病的药物能够明显缓解咪喹莫特诱导的银屑病样皮损局部的鳞屑形成、皮肤增厚，改善银屑病病理评分；还可以通过抑制免疫细胞（肥大细胞、Th1细胞及巨噬细胞)的浸润，从而实现对咪喹莫特诱导的银屑病的治疗。本发明首次发现GL‑V9的抗银屑病的作用，由于其低毒副作用，因而可作为抗银屑病的潜在药物进行后续开发。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及汉黄芩素衍生物GL-V9在制备银屑病治疗药物中的应用。
背景技术
银屑病是一种常见的由多种细胞参与慢性炎症性疾病，复发率高，无法完全治愈。其病理表现主要为表皮角化过度及角化不全、棘层细胞肥厚、免疫细胞浸润、炎症因子水平升高及血管扩张等。目前，全世界患病率约为1％-2％，由于其发病机制尚未完全阐明，造成临床治疗较为困难，只能对症治疗，以改善患者症状、提高患者生活质量为目的的采用相关治疗药物。
银屑病根据病情轻重可以分为轻度、中度、重度。轻度银屑病一般采用局部用药，包括皮质类固醇、甲氨蝶呤、环孢霉素、维生素D3类似物；而对于面积较大、无法局部给药的银屑病患者则采用NB-UVB(Narrowband Ultraviolet B)或者PUVA(补骨脂素-紫外线A)光疗法。但PUVA治疗通过UVA将补骨脂与DNA交联，具有高度诱变性，长期使用会诱导皮肤癌如黑色素瘤的发生。在更严重的病例中，除基础治疗外还需加入全身性药物，传统的口服药物，如维甲酸类、MTX或环孢菌素，这些小分子药物疗效好、使用方便且价格低廉，但其对肝脏、肾脏和骨髓的高毒性及致畸性限制了其在临床治疗中的应用。
目前对于银屑病的发病机制的一种解释是免疫系统细胞(如T细胞、巨噬细胞、DC细胞等)与皮肤角质形成细胞相互作用的结果。而其中，IL-23/TH17信号轴对银屑病的发生发展起着关键作用。因而，针对TNFα、IL-17等抗体类生物制剂目前被批准用于临床治疗银屑病。虽然，生物制剂治疗银屑病的疗效显著，但是用于其价格昂贵且存在潜在未知的风险而限制了其在临床上的应用。因而寻找有效且毒副作用小的小分子化合物，仍然是治疗银屑病的重要方向。
汉黄芩衍生物GL-V9为人工合成汉黄芩素的有效成分之一，为黄酮类化合物。GL-V9已被证实具有广泛的药理作用，包括抗癌、抗炎、抗衰老等。同时，近年来的研究显示多种黄酮类中药提取物通过对组织器官、免疫细胞及免疫分子的促进或抑制作用来进行免疫调节，而GL-V9也被报道对于肠炎具有一定程度的治疗作用，这提示了GL-V9可能具有相对广谱及安全的抗炎作用。但是目前还没有报道将GL-V9用于皮肤炎症的治疗。
发明内容
本发明的目的是提供汉黄芩素衍生物GL-V9在制备银屑病治疗药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
汉黄芩素衍生物GL-V9在制备银屑病治疗药物中的应用。
一种银屑病治疗药物，其活性成分为汉黄芩素衍生物GL-V9。
进一步地，所述银屑病治疗药物为口服制剂。
更进一步地，所述口服制剂还包括药学上可接受的载体。
汉黄芩素衍生物GL-V9在制备由咪喹莫特诱导的银屑病的治疗药物中的应用。
本发明中，所述汉黄芩素衍生物GL-V9的结构式如下式所示：
所述GL-V9在细胞水平上的剂量范围为2-100μM，优选50μM。
所述GL-V9作为治疗银屑病的药物能够明显缓解咪喹莫特诱导的银屑病样皮损局部的鳞屑形成、皮肤增厚，改善银屑病病理评分；所述GL-V9可通过抑制免疫细胞(肥大细胞、Th1细胞及巨噬细胞)的浸润，从而实现对咪喹莫特诱导的银屑病的治疗；所述GL-V9在细胞水平可以有效抑制T细胞的增殖和活化，同时抑制相关炎症因子的释放，进而实现对银屑病的治疗。
本发明首次发现GL-V9的抗银屑病的作用，由于其低毒副作用，因而可作为抗银屑病的潜在药物进行后续开发。
附图说明
图1为GL-V9对咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型的体重及病理评分的影响。其中：A为造模小鼠的图片；B为小鼠临床评分；C为模型小鼠血清中IL-17A及IL-23的含量。
图2为GL-V9对咪喹莫特诱导的银屑病模型小鼠皮肤组织的组织化学染色。(A)皮肤组织HE染色；(B)表皮厚度统计。
图3为GL-V9对咪喹莫特诱导的银屑病模型小鼠皮肤组织内肥大细胞染色(甲苯胺蓝染色)，Th1细胞以及巨噬细胞的免疫荧光染色结果。其中：A为皮肤组织甲苯胺蓝染色；B为甲苯胺蓝阳性细胞统计；C为皮肤组织CD4阳性T细胞免疫荧光染色；D为皮肤组织ly6G阳性中性粒细胞免疫荧光染色。
图4为GL-V9对T细胞及角质形成细胞的活化及炎症发展进程的影响。其中：A和B为GL-V9对人源T细胞的增殖影响以及其释放的IL-2表达水平的影响；C和D为GL-V9对人源巨噬细胞的增殖影响以及其对细胞极化状态的影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。附图中sham组为实验空白对照组。
实施例1
1、构建咪喹莫特(IMQ)诱导的银屑病小鼠模型
以0.1mL/10g 3.5％水合氯醛麻醉小鼠(C57BL/6小鼠，18-22g，6-8周)，剔除小鼠背部毛发，使小鼠背部暴露约2cm×3cm的皮肤，将咪喹莫特软膏(四川明欣药业，H20030129，62.5mg)连续涂抹于小鼠背部皮肤7d诱导银屑病，对照组给予同等剂量的凡士林软膏(Sham组)。在造模周期内，灌胃给予阳性药环孢霉素A(CSA，BBI，GB03BA0042，30mg/kg/day)或各剂量GL-V9(12.5、25、50、100mg/kg)。在造模过程中，每天监测小鼠生理指标(体重，皮肤变化)。临床症状采用PASI评分标准，从红斑、鳞屑、皮肤厚度3项指标进行评价，以0-4分进行记分，将3者积分相加得到总积分。PASI评分标准如下：0，无症状；1，轻度；2，中度；3，重度；4，极重度。造模第7天处死小鼠，取下小鼠的背部皮肤，进行后续评价。
如图1中A、B所示，GL-V9能明显缓解咪喹莫特诱导的银屑病样皮损局部的鳞屑形成，改善病理评分，缓解咪喹莫特诱导的小鼠体重的减轻，缓解咪喹莫特诱导的炎症症状。
2、苏木素-伊红(HE)、甲苯胺蓝(TB)检测
银屑病小鼠模型背部皮肤组织按常规方法预处理，石蜡包被、切片。石蜡切片脱蜡后形常规H.E.染色，或组织甲苯胺蓝染色，水中终止反应、苏木素反染。
如图2及图3中A、B所示，GL-V9能明显降低表皮厚度以及抑制肥大细胞浸润，其作用与阳性药CSA相当。
3、免疫荧光(IF)检测皮肤组织中炎症细胞浸润
银屑病小鼠模型背部皮肤组织按常规方法预处理，液氮冻存切片。冰切切片脱蜡后进行常规免疫荧光染色，切片复苏后封闭1h后，再孵育一抗(1:200)过夜，二抗(1:500)孵育1h。PBS漂洗后，滴加抗荧光猝灭剂，封片拍照分析。
如图3中C、D所示，GL-V9能明显降低T细胞及巨噬细胞的浸润，从而提示GL-V9可以通过抑制免疫细胞的浸润来抑制银屑病的发生发展。
4、酶联免疫吸附(ELISA)法检测炎症因子含量
收集银屑病小鼠模型及对照组血清，根据ELISA试剂盒说明书，检测细胞因子IL-17A和IL-23表达水平。大致流程如下：样品孔中加入100μL样品，50μL/well加入稀释后的Biotinylated antibody，混匀后盖上封板膜，37℃温育90min。洗板，100μL/well加入稀释后的Streptavidin-HRP。37℃温育30min，100μL/well加入TMB，37℃避光孵育5-30min，根据孔内蓝色深浅来判定终止反应。100μL/well加入Stop solution终止反应，10min之内检测450nm处吸光值。
如图1中C所示，GL-V9能明显降低血清中IL-17A及IL-23的表达水平。
5、免疫细胞活化实验及CCK8细胞活性鉴定及实时定量PCR鉴定
将Jurkat细胞和THP-1细胞分别接种于96孔培养板中，使每个孔细胞密度均一。细胞接种12h后，加入含不同浓度GL-V9的完全培养基(0μM,0.1μM,0.5μM,1μM,2.5μM,5μM,10μM和15μM)，使每个孔培养液体积一致，培养36h后进行CCK-8检测，具体步骤见诺唯赞CCK-8Cell Counting Kit(A311-01)使用说明书。
Jurkat细胞和THP-1细胞在佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA，P8139，sigma，100nM)的刺激12小时后，加入含不同浓度GL-V9(0μM,1μM及5μM)的完全培养基，培养48h，离心收集细胞后进行实时定量PCR鉴定炎症因子(IL-2)的表达水平。
如图4所示，GL-V9在一定浓度范围内不会杀伤免疫细胞但可以有效抑制免疫细胞的活化及释放促炎因子的能力。
Claims (5)
1.汉黄芩素衍生物GL-V9在制备银屑病治疗药物中的应用。
2.一种银屑病治疗药物，其特征在于：所述药物的活性成分为汉黄芩素衍生物GL-V9。
3.根据权利要求2所述的银屑病治疗药物，其特征在于：所述银屑病治疗药物为口服制剂。
4.根据权利要求3所述的银屑病治疗药物，其特征在于：所述口服制剂还包括药学上可接受的载体。
5.汉黄芩素衍生物GL-V9在制备由咪喹莫特诱导的银屑病的治疗药物中的应用。
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