CN112237590A - 台湾藜汁液及其用途以及减脂组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种台湾藜汁液及其用途以及减脂组合物。其中，台湾藜汁液是由含水的溶剂进行提取。本发明可应用于制备抵抗自然衰老、促进脂肪分解及减少脂肪堆积。
Description
技术领域
本发明涉及一种台湾藜汁液的用途，特别是关于台湾藜汁液用于制备抵抗自然衰老、促进脂肪分解及减少脂肪堆积的组合物的用途以及减脂组合物。
背景技术
台湾藜(学名：Chenopodium formosanum)是一种中国台湾特有植物，一年生大型草本植物，为藜麦的近亲。属于藜科(Chenopodiaceae)藜属 (Chenopodium)。分布于中国台湾地区的中南部中低海拔山区，在原住民耕作史上有超过百年历史，目前以东部的排湾族人保有最丰物的种原。
台湾藜的蛋白质含量是稻米的两倍。台湾藜的果实通常被晒干并去壳后与其他谷类混合成一般食用米，于食品加工上可利用不同加工方式(蒸煮、微波、烤、炸及膨发)，制造成饭团、饼干、薯球、泡芙、麻糬、松饼及米香等具特色产品。台湾藜可以增进食品的天然色泽，并且具有丰富的营养价值，逐渐受到愈来愈多消费者的喜爱。
发明内容
有鉴于此，为了更积极提升台湾藜其他层面的开发与应用，故而提出一种减脂组合物及台湾藜汁液，其可应用于制备抵抗自然衰老、促进脂肪分解及减少脂肪堆积的组合物。
在一些实施例中，一种台湾藜汁液，其是由一种含水的溶剂进行提取，其中台湾藜汁液包含以下至少一成分：鸟苷(Guanosine)、反式-3-吲哚丙烯酸 (trans-3-Indoleacrylic acid)、4-葡萄糖基香草酸(4-Glucosylvanillic acid)、淫羊藿次甙B1(Icariside B1)、原儿茶酸(Protocatechuic acid)、龙胆酸(Gentisic acid)、咖啡酸(Caffeic acid)、香草酸(Vanillic acid)、芦丁(Rutin)、槲皮素-3-芦丁糖苷-7-鼠李糖苷(Quercetin-3-O-rutinoside-7-O-rhamnoside)、香豆酸(Coumaric acid)、阿魏酸(Ferulic acid)、20-羟基蜕皮酮(20-Hydroxyecdysone)、槲皮苷(Quercetrin)、黄芪苷(Astragalin)、山奈酚-3-鼠李糖苷(kaempferol-3-rhamnoside)、山奈酚-7-鼠李糖苷(Kaempferol-7-rhamnoside)、槲皮素(Quercetin)、山奈酚(Kaempferol)、齐墩果酸(Oleanolic acid)、白前苷B(Vincetoxicoside B)。
在一些实施例中，台湾藜汁液包含以下至少一成分：齐墩果酸、槲皮素、山奈酚、槲皮苷、白前苷B、黄芪苷、山奈酚-3-鼠李糖苷、山奈酚-7-鼠李糖苷、芦丁、槲皮素-3-芦丁糖苷-7-鼠李糖苷、香豆酸、阿魏酸、反式-3-吲哚丙烯酸、 4-葡萄糖基香草酸。
在一些实施例中，台湾藜汁液包含以下至少一成分：芦丁、槲皮素-3-芦丁糖苷-7-鼠李糖苷、香豆酸、4-葡萄糖基香草酸。
在一些实施例中，一种台湾藜汁液用于制备抵抗自然衰老的组合物的用途，其中台湾藜汁液是通过提高细胞中抗老回春相关基因表现量达到抵抗自然衰老的组合物的用途，且台湾藜汁液是以一种含水的溶剂进行提取。
在一些实施例中，台湾藜汁液可以延缓细胞老化。
在一些实施例中，抗老回春相关基因包括CCT8基因、Pink1基因、Atg1 基因、Atg8基因、FOXO3基因、PARP1基因、UBL5基因、NADSYN1基因及MRPS5基因其中至少一项。
在一些实施例中，台湾藜汁液的浓度为0.5％以上。
在一些实施例中，一种台湾藜汁液用于制备促进脂肪分解的组合物的用途，其中台湾藜汁液是以一种含水的溶剂进行提取。在一些实施例中，台湾藜汁液包含以下至少一成分：反式-3-吲哚丙烯酸、该4-葡萄糖基香草酸。
在一些实施例中，一种台湾藜汁液用于制备减少脂肪堆积的组合物的用途，台湾藜汁液是以含水的溶剂进行提取。
在一些实施例中，台湾藜汁液包含以下至少一成分：齐墩果酸、槲皮素、山奈酚、槲皮苷、白前苷B、黄芪苷、山奈酚-3-鼠李糖苷、山奈酚-7-鼠李糖苷、芦丁、槲皮素-3-芦丁糖苷-7-鼠李糖苷、香豆酸、阿魏酸。
在一些实施例中，台湾藜汁液的浓度为0.125％以上。
在一些实施例中，含水的溶剂为纯水或含有有机酸的水溶剂。在一些实施例中，有机酸的浓度为0.05％-1.00％。
在一些实施例中，台湾藜汁液是以含水的溶剂形成初萃液，初萃液经糖化酵素酵解而形成台湾藜汁液。
在一些实施例中，一种用于减脂的组合物，其包括选自下列成分：鸟苷(Guanosine)、反式-3-吲哚丙烯酸(trans-3-Indoleacrylic acid)、4-葡萄糖基香草酸(4-Glucosylvanillic acid)、淫羊藿次甙B1(Icariside B1)、原儿茶酸 (Protocatechuicacid)、龙胆酸(Gentisic acid)、咖啡酸(Caffeic acid)、香草酸(Vanillic acid)、芦丁(Rutin)、槲皮素-3-芦丁糖苷-7-鼠李糖苷 (Quercetin-3-O-rutinoside-7-O-rhamnoside)、香豆酸(Coumaric acid)、阿魏酸(Ferulic acid)、20-羟基蜕皮酮(20-Hydroxyecdysone)、槲皮苷(Quercetrin)、黄芪苷(Astragalin)、山奈酚-3-鼠李糖苷(kaempferol-3-rhamnoside)、山奈酚-7-鼠李糖苷(Kaempferol-7-rhamnoside)、槲皮素(Quercetin)、山奈酚 (Kaempferol)、齐墩果酸(Oleanolic acid)、白前苷B(Vincetoxicoside B) 其中至少一种或其组合。
在一些实施例中，减脂的组合物包括选自下列成分：齐墩果酸、槲皮素、山奈酚、槲皮苷、白前苷B、黄芪苷、山奈酚-3-鼠李糖苷、山奈酚-7-鼠李糖苷、芦丁、槲皮素-3-芦丁糖苷-7-鼠李糖苷、香豆酸、阿魏酸其中至少一种或其组合，其中减脂组合物用以抑制脂肪生成。
在一些实施例中，减脂组合物包括选自下列成分：反式-3-吲哚丙烯酸、4- 葡萄糖基香草酸其中至少一种或其组合，其中减脂组合物用以促进脂肪分解。
在一些实施例中，减脂的组合物中的鸟苷、反式-3-吲哚丙烯酸 (trans-3-Indoleacrylic acid)、4-葡萄糖基香草酸、淫羊藿次甙B1、原儿茶酸、龙胆酸、咖啡酸、香草酸、芦丁、槲皮素-3-芦丁糖苷-7-鼠李糖苷、香豆酸、阿魏酸、20-羟基蜕皮酮、槲皮苷、黄芪苷、山奈酚-3-鼠李糖苷、山奈酚-7-鼠李糖苷、槲皮素、山奈酚、齐墩果酸、白前苷B是分离自一台湾藜(Chenopodium formosanum)汁液。
综上所述，任一实施例的台湾藜汁液可用以制备抵抗自然衰老的组合物。任一实施例的台湾藜汁液可用以制备提高细胞中抗老回春相关基因(如，CCT8 基因、Pink1基因、Atg1基因、Atg8基因、FOXO3基因、PARP1基因、UBL5 基因、NADSYN1基因及MRPS5基因)表现量的组合物。任一实施例的台湾藜汁液可用以制备延缓细胞老化的组合物。任一实施例的台湾藜汁液可用以制备促进脂肪分解的组合物。任一实施例的台湾藜汁液可用以制备减少脂肪堆积的组合物。
以下结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述，但不作为对本发明的限定。
附图说明
图1是一实施例的台湾藜汁液制备方法流程图。
图2是另一实施例的台湾藜汁液制备方法流程图。
图3是范例二的抗老回春相关基因实验组及控制组表现比例图。
图4是范例三的实验组及控制组的脂肪细胞红油O染色显微镜照片图。
图5是范例三的实验组及控制组的相对脂肪油滴含量比例图。
图6是范例四的实验组及控制组的相对脂肪分解量比例图。
图7是范例五的NADSYN1基因实验组及控制组表现比例图。
图8是范例六的台湾藜汁液的生物活性导引分离方法系统图。
图9是范例七的实验组及控制组的脂肪细胞红油O染色显微镜照片图。
图10是范例七的实验组及控制组的相对脂肪油滴含量比例图。
图11是范例九的实验组及控制组的脂肪细胞红油O染色显微镜照片图。
图12是范例九的实验组及控制组的相对脂肪油滴含量比例图。
图13是范例十的实验组及控制组的相对脂肪分解量比例图。
图14是一实施例的台湾藜汁液的指纹分析图谱。
具体实施方式
如本文中所使用，术语“汁液”指借由提取作用所制备的产物。该汁液可以溶于溶剂中的溶液形式呈现，或汁液可为不含或大体上不含溶剂的浓缩物或精华呈现。
如本文所用“台湾藜原料”通常指植物种子，其中种子可包含原始、经干燥或以其他物理方式加工以利于处理的种子，其可进一步包含完整、剁碎、切丁、碾磨、研磨或以其他方式经加工以影响原物料的大小及实体完整性的种子。
参考图1。在一些实施例中，一种台湾藜汁液，其是由一种含水的溶剂对台湾藜原料进行提取。在一些实施例中，台湾藜汁液(Chenopodium formosanum extract)是将台湾藜原料依序进行粉碎程序S01、加热程序S02、过滤程序S04、及浓缩程序S06后得到。
在一些实施例中，台湾藜原料可以是去壳或含壳的台湾藜种子。在一些实施例中，台湾藜原料可以是新鲜或干燥的台湾藜种子。在一些实施例中，台湾藜原料可以是黄金藜(kapulapula)种子、红藜(odidile)种子及橙藜(uda-udasa) 种子其中一种或其组合。于此，黄金藜、红藜及橙藜是依据其花穗的颜色进一步细分而得。
在一些实施例中，粉碎程序S01是指将台湾藜原料搅打至分裂为粉状。举例而言，粉碎可以采用果汁机、调理机或均质机。
在一些实施例中，加热程序S02是指将粉状的台湾藜原料与含水的溶剂混合后加热一段固定时间。在一些实施例中，加热是指将台湾藜原料与含水的溶剂的温度提升到50℃～100℃。在一些实施例中，一段固定时间是指0.5小时到 3小时。举例而言，将台湾藜原料与含水的溶剂的温度提升到85℃进行提取1 小时。
在一些实施例中，加热程序S02中的重量比例(含水的溶剂：台湾藜原料) 为5～20：1～5。举例而言，含水的溶剂：台湾藜原料为10:1。
在一些实施例中，含水的溶剂可以是纯水或含有有机酸的水溶剂。在一些实施例中，有机酸的浓度为0.05％到1.00％。在一些实施例中，有机酸可是可食用酸。在一些实施例中，可食用酸可以是柠檬酸(Citric Acid)、苹果酸、酒石酸、乳酸、葡萄糖酸、醋酸等，并不以此为限。
举例而言，采用90公斤重的台湾藜原料、900公斤重的水及0.63公斤重的柠檬酸混合后持续加热到100℃，并维持100℃持续0.5小时。举例而言，采用 90公斤重的台湾藜原料、900公斤重的水及0.7公斤重的柠檬酸混合后持续加热到85℃，并维持85℃持续1小时。
在一些实施例中，过滤程序S04是指将加热后(或降温后)的台湾藜原料及溶剂通过筛网以将溶剂内的固体滤除形成过滤液。举例而言，筛网可以是400 网目(mesh)的筛网。
参考图2。在一些实施例中，加热程序S02与过滤程序S04之间还包括降温程序S03，降温程序S03是指将加热后的台湾藜原料及溶剂静置以自然降温至室温。
在一些实施例中，浓缩程序S06是指将过滤程序S04所得到的过滤液进行减压浓缩(厂牌/型号：BUCHI-Rotavapor R-100)以得到初萃液。在一些实施例中，浓缩程序S06所得的初萃液可即为台湾藜汁液。在浓缩程序S06的一些实施例中，在40℃～70℃之间进行减压浓缩。举例而言，台湾藜汁液是将台湾藜原料依序进行粉碎程序S01、加热程序S02、过滤程序S04及浓缩程序S06 后得到。
在一些实施例中，过滤程序S04与浓缩程序S06之间可以更包括酵解程序 S05，或是浓缩程序S06可替换为酵解程序S05。于此，酵解程序S05是指将过滤程序S04所得到的过滤液添加淀粉糖化酵素(Amylase)搅拌充分混合后，再并静置1小时以上得到酵解液。借由酵素的酵解作用进一步提升台湾藜汁液内有效成分的含量。在一些实施例中，淀粉糖化酵素可以是α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、异淀粉酶至少一或其混合。在一些实施例中，淀粉糖化酵素可以是葡萄糖淀粉酶(glucan 1,4-alpha-glucosidase)。在一些实施例中，淀粉糖化酵素的添加量为含水的溶剂的0.06％，在一些实施例中，该含水的溶剂可为水。在一些实施例中，酵解程序S05是指将过滤程序所得到的过滤液添加0.06％淀粉糖化酵素并加热到55℃之后维持1小时以上得到酵解液。
在另一些实施例中，浓缩程序S06则是将酵解程序S05所得到的酵解液进行减压浓缩以得到初萃液。
在一些实施例中，浓缩程序S06之后更包括再过滤程序S07是指将酵解液通过400网目(mesh)的筛网以将酵解液内的固形物滤除形成台湾藜汁液。举例而言，台湾藜汁液是将台湾藜原料依序进行粉碎程序S01、加热程序S02、过滤程序S04、酵解程序S05、浓缩程序S06及再过滤程序S07后得到。
在一些实施例中，台湾藜汁液包含以下至少一成分：鸟苷(Guanosine)、反式-3-吲哚丙烯酸(trans-3-Indoleacrylic acid)、4-葡萄糖基香草酸 (4-Glucosylvanillicacid)、淫羊藿次甙B1(Icariside B1)、原儿茶酸(Protocatechuic acid)、龙胆酸(Gentisic acid)、咖啡酸(Caffeic acid)、香草酸(Vanillic acid)、芦丁(Rutin)、槲皮素-3-芦丁糖苷-7-鼠李糖苷 (Quercetin-3-O-rutinoside-7-O-rhamnoside)、香豆酸(Coumaric acid)、阿魏酸(Ferulic acid)、20-羟基蜕皮酮(20-Hydroxyecdysone)、槲皮苷(Quercetrin)、黄芪苷(Astragalin)、山奈酚-3-鼠李糖苷(kaempferol-3-rhamnoside)、山奈酚-7-鼠李糖苷(Kaempferol-7-rhamnoside)、槲皮素(Quercetin)、山奈酚(Kaempferol)、齐墩果酸(Oleanolic acid)、白前苷B(Vincetoxicoside B)。
上述各种成分的结构式如下表一所示：
表一
在一些实施例中，台湾藜汁液用于制备抵抗自然衰老的组合物的用途，其中台湾藜汁液是通过提高细胞中抗老回春相关基因表现量达到抵抗自然衰老，且台湾藜汁液是以一种含水的溶剂进行提取。自然衰老是指在无其他疾病或非自然外力等影响下，一个人身体的组成随着时间形成而产生自然改变的过程。
在一些实施例中，台湾藜汁液可以延缓细胞老化。于此，所指的老化(Aging) 是指细胞随着时间变化而发生各种机能下降或死亡的过程。
在一些实施例中，抗老回春相关基因包括下列基因中的至少一者：CCT8 基因(GeneID:10694)、Pink1基因(GeneID:65018)、Atg1基因(GeneID: 8408)、Atg8基因(ID:11345)、FOXO3基因(GeneID:2309)、PARP1基因(GeneID:142)、UBL5基因(GeneID:59286)、NADSYN1基因(GeneID: 55191)及MRPS5基因(GeneID:64969)。
在一些实施例中，浓度为0.5％以上的台湾藜汁液可提升抗老化回春相关基因的表现量，借以延缓细胞老化。
其中，在老化过程中生物维持体内蛋白质质量的能力会逐渐下降，受损蛋白质和错误折迭的蛋白质的累积起来会造成细胞死亡和细胞功能故障。CCT8 基因可以调控TRiC/CCT复合体，而这个复合体负责折迭大约生物体内10％的细胞蛋白质。
其中，PINK-1基因为PTEN促进激酶1(PTEN-induced putative kinase 1,Pink1)相关基因，和保护细胞免受氧化压力及促进粒线体健康有关。
其中，UBL5基因(Ubiquitin-like protein 5)可以调节烟碱酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+(Nicotinamide adenine dinucleotide)，而有实验指出增加年老小鼠体内的NAD+浓度，能使其生理状况更为年轻，因此NAD+被认为与延缓个体老化相关。
其中，Atg1基因及Atg8基因与自噬作用(autophagy)相关，自噬作用是清除入侵微生物及毒性蛋白质聚合物的重要细胞机制，因此，Atg1基因及Atg8 基因在感染、老化、及人类疾病的发病机制上扮演重要的角色。
其中，PARP1基因(Poly ADP-ribose polymerase 1)是一种DNA修复酶，当DNA发生断裂时，PARP1基因会识别并结合到断裂部位并吸引其他DNA 修复酶到达受损处进行修复。
其中，FOXO3基因的功能提升时能减少胰岛素生长因子的受体，在实验中可以延长线虫寿命接近二倍，以及减少线虫的食物摄取量。
其中，MRPS5(粒线体核糖蛋白S5 mitochondrial ribosomal protein S5)基因所编码的蛋白与粒腺体合成有重要的关系。
NADSYN1基因协助合成NAD+提供血液粒线体能量来源，亦可以进一步协助代谢脂肪。
换言之，台湾藜汁液可借由提高上述各种基因的表现量，能有效延缓细胞的老化，达到全身性抗衰老，且具有使成熟细胞回复到干细胞状态的潜力。
在一些实施例中，台湾藜汁液可以用于制备促进脂肪分解的组合物的用途。在一些实施例中，具有促进脂肪分解的能力的台湾藜汁液包含以下至少一成分：反式-3-吲哚丙烯酸、该4-葡萄糖基香草酸。
在一些实施例中，台湾藜汁液用于制备减少脂肪堆积的组合物的用途。在一些实施例中，具有减少脂肪堆积的能力的台湾藜汁液包含以下至少一成分：齐墩果酸、槲皮素、山奈酚、槲皮苷、白前苷B、黄芪苷、山奈酚-3-鼠李糖苷、山奈酚-7-鼠李糖苷、芦丁、槲皮素-3-芦丁糖苷-7-鼠李糖苷、香豆酸、阿魏酸。
在一些实施例中，浓度为0.125％以上的台湾藜汁液可以促进脂肪分解及/ 或减少脂肪堆积。
在一些实施例中，前述的组合物可为医药品。换言之，此医药品包含有有效含量的台湾藜汁液。
在一些实施例中，前述的医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于经肠道或口服的投药剂型。这些投药剂型包括，但不限于：锭剂(tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pill)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersiblepowder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂(elixir)、浓浆(slurry)以及类似之物。
在一些实施例中，前述的医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于非经肠地道(parenterally)或局部地(topically)投药的剂型，这些投药剂型包括，但不限于：注射品(injection)、无菌的粉末(sterile powder)、外部制剂(externalpreparation)以及类似之物。在一些实施例中，该医药品可以一选自于由下列所构成的群组中的非经肠道途径(parenteral routes)来投药：皮下注射(subcutaneous injection)、表皮内注射(intraepidermal injection)、皮内注射(intradermal injection)以及病灶内注射(intralesional injection)。
在一些实施例中，医药品可进一步包含有被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，医药上可接受的载剂可包含下列的试剂中一种或多种：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizingagent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润湿剂 (wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorptiondelaying agent)、脂质体(liposome)以及类似之物。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
在一些实施例中，医药上可接受的载剂包含有一选自于由下列所构成的群组中的溶剂：水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline,PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)。
在一些实施例中，前述的组合物可为可食用组合物。在一些实施例中，此可食用组合物可以制成食品产品或可为食品添加物(food additive)，意即借由习知方法于食材制备时添加而制得食品产品，或是于食品产品的制作过程中添加。于此，食品产品可以是与可食性材料配制成供人类或动物摄食的产品。
在一些实施例中，食品产品可为但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermented foods)、烘培产品(bakery products)、健康食品(health foods) 以及膳食补充品(dietary supplements)。
范例一：台湾藜汁液的制备
制备A组台湾藜汁液：粉碎程序S01中将含壳的干燥黄金藜(Kapulapula) 作为台湾藜原料并进行粉碎。于此，采用osterizer品牌的10speed blender进行粉碎。接着，加热程序S02中以水为溶剂，将粉碎后的台湾藜原料与水以1:10 的重量比例混合后在85℃下提取1小时。于此，提取可以是将台湾藜原料浸泡在水中。后续，降温程序S03将粉碎后的台湾藜原料与水降温到室温(25℃)。此后，过滤程序S04将降温后的台湾藜原料及水通过400网目的筛网以形成过滤液。接着，浓缩程序S06于60℃下对过滤液进行减压浓缩而得到A组台湾藜汁液。
制备B组台湾藜汁液：粉碎程序S01中将含壳的干燥黄金藜(Kapulapula) 作为台湾藜原料并进行粉碎。于此，采用osterizer品牌的10speed blender进行粉碎。接着，加热程序S02中在水加入0.07％的柠檬酸为溶剂，将粉碎后的台湾藜原料与溶剂以1:10的重量比例混合后在85℃下提取1小时。后续，降温程序S03将粉碎后的台湾藜原料与溶剂降温到室温(25℃)。此后，过滤程序 S04将降温后的台湾藜原料及溶剂通过400网目的筛网以形成过滤液。然后将过滤液进行酵解程序S05，意即将过滤液添加0.06％的淀粉糖化酵素后，在55 ℃下进行酵解1小时得到酵解液。于此，采用市售AMG品牌的300L酵素。接着，浓缩程序S06于60℃下对酵解液进行减压浓缩而得到初萃液。之后，再过滤程序S07以400网目的滤网过滤上述初萃液而得B组台湾藜汁液。
制备C组台湾藜汁液：粉碎程序S01中将含壳的干燥黄金藜(Kapulapula) 作为台湾藜原料并进行粉碎。于此，采用osterizer品牌的10speed blender进行粉碎。接着，加热程序S02中以水溶剂，将粉碎后的台湾藜原料与溶剂以1:10 的重量比例混合后在85℃下提取1小时。后续，降温程序S03将粉碎后的台湾藜原料与溶剂降温到室温(25℃)。此后，过滤程序S04将降温后的台湾藜原料及溶剂通过400网目的筛网以形成过滤液。然后将过滤液进行酵解程序S05，意即将过滤液添加0.06％的淀粉糖化酵素后，在55℃下进行酵解1小时得到酵解液。于此，采用市售AMG品牌的300L酵素。接着，浓缩程序S06于60℃下对酵解液进行减压浓缩而得到初萃液。之后，再过滤程序S07以400网目的滤网过滤上述初萃液而得B组台湾藜汁液。
范例二：台湾藜汁液的抗老化基因试验
于此，培养基采用VIVOTM 10Serum-free hematopoietic cell medium(购自Lonza，瑞士，编号BE02-055Q)。首先，将人类外围血液单核球细胞(Human peripheralblood mononuclear cell,后续简称PBMC细胞)以每孔1×105个细胞量培养于含有2mL上述培养液的六孔培养盘中，并在37℃下培养16小时，然后将PBMC细胞分为以下二组：实验组与控制组。
实验组：依照每毫升培养液含有0.5毫克B组台湾藜汁液的比例(即，浓度为0.5％)制得含汁液的培养液，将PBMC细胞更换为含汁液的培养液中继续培养。
控制组：不作任何处理，即不额外添加其他化合物至含有培养后的PBMC 细胞的培养液中。
实验组与控制组于培养48小时后，将培养后的实验组及控制组细胞以细胞裂解液分别破细胞膜以形成二组的细胞溶液。
接着，使用RNA浸提试剂套组(购自Geneaid公司，台湾，Lot No.FC24015-G)分别收集二组细胞溶液内的RNA。接着，每组取2000奈克(ng) 所提取出的RNA为模板，借由
III反转录酶(购自Invitrogene 公司，美国，编号18080-051)以表一中的引子黏合进行反转录作用产生相应的cDNA。后续利用ABI StepOnePlusTM Real-Time PCRsystem(Thermo Fisher Scientific公司，美国)，以及KAPA SYBR FAST(购自Sigma公司，美国，编号38220000000)将二组反转录后产物分别以表一的组合引子进行定量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitative real-time reverse transcription polymerase chainreaction)以观察实验组和控制组的PBMC细胞的基因的表现量。定量实时反转录聚合酶连锁反应的仪器设定条件为95℃反应1秒，60℃反应20 秒，总共40个循环，并使用2-ΔCt方法进行基因定量。于此，借由cDNA进行定量实时反转录聚合酶连锁反应可间接定量各基因的mRNA表现量，进而推断各基因编码的蛋白质的表现量。
表一
需要特别说明的是，下文述及的图式中显示的各基因的相对基因表现系以相对倍率呈现，其中使用Excel软件的STDEV公式计算标准偏差，并在Excel 软件中以单尾学生t检验(Student t-test)分析是否具有统计上的显著差异。图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p 值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著。
请参阅图3。将控制组的CCT8基因的表现量视为1(即100％)时，实验组相对于控制组的CCT8基因的表现量为1.2(即120％)，代表实验组的CCT8 基因的表现量为控制组的1.2倍。
将控制组的Pink1基因的表现量视为1(即100％)时，实验组相对于控制组的Pink1基因的表现量为1.3(即130％)，代表实验组的Pink1基因的表现量为控制组的1.3倍。
将控制组的Atg1基因的表现量视为1(即100％)时，实验组相对于控制组的Atg1基因的表现量为1.5(即150％)，代表实验组的Atg1基因的表现量为控制组的1.5倍。
将控制组的Atg8基因的表现量视为1(即100％)时，实验组相对于控制组的Atg8基因的表现量为1.2(即120％)，代表实验组的Atg8基因的表现量为控制组的1.2倍。
将控制组的FOXO3基因的表现量视为1(即100％)时，实验组相对于控制组的FOXO3基因的表现量为1.2(即120％)，代表实验组的FOXO3基因的表现量为控制组的1.2倍。
将控制组的PARP1基因的表现量视为1(即100％)时，实验组相对于控制组的PARP1基因的表现量为1.1(即110％)，代表实验组的PARP1基因的表现量为控制组的1.1倍。
将控制组的PARP2基因的表现量视为1(即100％)时，实验组相对于控制组的PARP2基因的表现量为0.9(即90％)，代表实验组的PARP2基因的表现量为控制组的0.9倍。
将控制组的MRPS5基因的表现量视为1(即100％)时，实验组相对于控制组的MRPS5基因的表现量为1.2(即120％)，代表实验组的MRPS5基因的表现量为控制组的1.2倍。
将控制组的UBL5基因的表现量视为1(即100％)时，实验组相对于控制组的UBL5基因的表现量为1.6(即160％)，代表实验组的UBL5基因的表现量为控制组的1.6倍。
由此可知，当PBMC细胞台湾藜汁液处理后，PBMC细胞内与抗老回春相关基因的各种基因表现量提高，代表细胞由老化状态回复到未老化前的回春状态，有效的延缓了细胞的老化。
范例三：台湾藜汁液的抑制脂肪堆积功效试验
脂肪细胞内以油滴(Lipid droplet)的形式贮存脂肪。基此，本次试验分析染色后的油滴，以观察细胞内油滴的数量，借以确认脂肪堆积的状态。后续，再将染剂溶出并分析以作为量化的数值指标。
本次试验采用小鼠骨髓基质细胞(后续简称OP9细胞)，OP9细胞购自美国典型培养物保存中心(American Type Culture Collection，
)的OP9 细胞株(ATCC CRL-2749)。
首先，取24孔培养盘将每孔接种8×104个OP9细胞及500μL培养基 (Medium)，培养基其中包含90％的MEMAM(Minimum Essential Medium Alpha Medium，购自Gibco，美国)细胞培养液、20％的胎牛血清(Fetal Bovine Serum，购自Gibco，美国，Cat#10437-028)，且加入0.1％的青霉素/链霉素 (Penicillin-streptomycin，购自Gibco，美国)，在37℃下培养7天。此7天的细胞培养期间每隔3天更换培养基。7天后，以显微镜(ZEISS；放大倍率400x) 观察细胞内油滴形成，借以确认细胞已完全分化为脂肪细胞。
然后，将分化完成的脂肪细胞分为二组：实验组与控制组。
实验组：依照每孔500μL培养基含有62.5μL的C组台湾藜汁液的比例 (即，浓度为0.125％)将C组台湾藜汁液添加至含分化后的培养基中，在37 ℃下培养7天。在7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。
控制组：不作任何处理，即不额外添加其他化合物至含分化后的脂肪细胞的分化培养基中，在37℃下培养7天。此7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。
接下来，依据下列步骤进行红油O的染色。于7天细胞处理后，将培养基移除，以1mL的磷酸盐缓冲溶液(Phosphate buffered saline,PBS)清洗脂肪细胞两次，再加入1mL的10％甲醛并于室温下反应30分钟以固定脂肪细胞。接着移除甲醛后以1mL的PBS轻轻地清洗脂肪细胞两次，接着于每孔细胞内加入1mL的60％异丙醇，反应1分钟后，移除异丙醇并加入1mL的油红O作用溶液与脂肪细胞反应，于室温下反应1小时，接着移除与脂肪细胞作用的油红 O作用溶液并迅速地以1mL的60％异丙醇进将脂肪细胞行脱色5秒钟，再使用显微镜观察并拍摄细胞，如图4所示。
参考图4。实验组经由台湾藜汁液的处理之后可见油滴数量明显少于控制组。换言之，在脂肪细胞的成长过程中，经由台湾藜汁液的作用可以有效降低脂肪细胞堆积油脂。
后续，将染色后的各组再依下列步骤进行红油O的定量。加入100％异丙醇于染色的细胞中，并置于振荡器上反应10分钟以溶解油滴，接着取100μL 至96孔培养盘中，以测量ELISA读取仪(BioTek)读取各组的OD510nm读值。其中，利用Excel软件进行student t-test以决定两个样本群体之间是否在统计上具有显著差异，如图5所示(图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p 值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著)。
参考图5。将控制组的脂肪油滴含量视为1(即100％)时，实验组的脂肪油滴含量为81.2％。意即经由台湾藜汁液处理之后能显著地减少18.8％的脂肪堆积量。此结果显示，台湾藜汁液能有效阻断脂肪细胞的增大，以减少脂肪细胞中油滴的含量，而达到抑制脂肪堆积功效。
范例四：台湾藜汁液的减脂功效试验
减脂是指脂肪被分解，而脂肪分解(Lipolysis)作用是指脂肪细胞内所贮存的三酸甘油酯(triglyceride,TG)被逐步降解为脂肪酸(fatty acid,FA)与甘油(Glycerol)的过程。基此，本次试验分析脂肪细胞中甘油(Glycerol)的含量作为量化指标，以观察是否有产生脂肪分解作用。
本次试验采用小鼠骨髓基质细胞(后续简称OP9细胞)，购自美国典型培养物保存中心(American Type Culture Collection，
)的OP9细胞株 (ATCC CRL-2749)。
首先，取24孔培养盘将每孔接种8×104个OP9细胞及500μL培养基 (Medium)，前培养基其中包含90％的MEMAM(Minimum Essential Medium Alpha Medium，购自Gibco，美国)细胞培养液、20％的胎牛血清(Fetal Bovine Serum，购自Gibco，美国，Cat#10437-028)，且加入0.1％的青霉素/链霉素 (Penicillin-streptomycin，购自Gibco，美国)，在37℃下培养7天。此7天的细胞培养期间每隔3天更换培养基。7天后，以显微镜(ZEISS；放大倍率400x)观察细胞内油滴形成，借以确认细胞已完全分化为脂肪细胞。
然后，将分化完成的脂肪细胞分为二组：实验组与控制组。
实验组：依照每孔500μL培养基含有62.5μL的B组台湾藜汁液的比例 (即，浓度为0.125％)将B组台湾藜汁液添加至含分化后的培养基中，在37 ℃下培养7天。在7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。
控制组：不作任何处理，即不额外添加其他化合物至含分化后的培养基中，在37℃下培养7天。在7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。
于7天的细胞处理后，使用细胞甘油基检测试剂套组(Glycerol cell-basedassay kit，购自Cayman，美国，产品编号10011725)依据下列步骤测量甘油含量。收集各组的上清液，并各取其中的25μL转移到新的96孔培养盘中，并于各孔中加入100μL的重构游离甘油测定试剂(Reconstituted free glycerol assay reagent)，再于室温下作用15分钟后，将培养盘以ELISA读数器读取各组的OD540nm的吸亮度，以量化各组脂肪细胞分解并释放至细胞培养液中的甘油量，如图6所示。于此，甘油量的多寡与脂肪的分解量成正比。其中，利用 Excel软件进行student t-test以决定两个样本群体之间是否在统计上具有显著差异(图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著)。
参考图6。将控制组的脂肪分解量视为100％时，实验组的脂肪分解量为 105％，也就是说台湾藜汁液处理的之后能显著地提升5％的脂肪分解量。此结果显示，台湾藜汁液能直接且有效促进脂肪细胞中脂肪的分解，以减少脂肪细胞中脂肪的含量，而达到燃脂减肥的功效。
范例五：台湾藜汁液提升粒线体活性试验
粒线体(mitochondrion)是细胞内的一种胞器，其主要合成三磷酸腺苷 (ATP)以为细胞能量的来源，当细胞内粒线体充足时通常代表细胞较为年轻有活力，并且代表细胞的代谢率高，可以有效代谢脂肪。故而，本次试验量测粒线体活性相关基因NADSYN1基因的mRNA表现量。由于血液流通于全身，因此以人类外围血液单核球(Human peripheral bloodmononuclear cell,后续简称PBMC细胞)做为实验细胞株进行抗老化以及提升代谢率的试验，以延伸为全身性的功效。
于此，培养基采用VIVOTM 10Serum-free hematopoietic cell medium(购自Lonza，瑞士，编号BE02-055Q)。首先，将上述PBMC细胞以每孔1×105个细胞量培养于含有2mL上述培养液的六孔培养盘中，并在37℃下培养16小时，然后将培养后的PBMC细胞分为以下二组：实验组与控制组。
实验组：依照每毫升培养液含有0.5毫克B组台湾藜汁液的比例(即，浓度为0.5％)将B组台湾藜汁液添加至含有培养后的PBMC细胞的培养液中。
控制组：不作任何处理，即不额外添加其他化合物至含有培养后的PBMC 细胞的培养液中。
于各组细胞接续培养48小时后，将培养后的实验组及控制组细胞以细胞裂解液分别破细胞膜以形成二组的细胞溶液。接着，使用RNA浸提试剂套组(购自Geneaid公司，台湾，Lot No.FC24015-G)分别收集二组细胞溶液内的RNA。接着，每组取2000奈克(ng)所提取出的RNA为模板，借由
III 反转录酶(购自Invitrogene公司，美国，编号18080-051)以表一中的引子黏合进行反转录作用产生相应的cDNA。后续利用ABIStepOnePlusTM Real-Time PCR system(Thermo Fisher Scientific公司，美国)，以及KAPA SYBR FAST (购自Sigma公司，美国，编号38220000000)将二组反转录后产物分别以表一的组合引子进行定量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitative real-time reversetranscription polymerase chain reaction)以观察实验组和控制组的PBMC 细胞的基因的表现量。定量实时反转录聚合酶连锁反应的仪器设定条件为95℃反应1秒，60℃反应20秒，总共40个循环，并使用2-ΔCt方法进行基因定量。于此，借由cDNA进行定量实时反转录聚合酶连锁反应可间接定量各基因的mRNA表现量，进而推断各基因编码的蛋白质的表现量，如图7所示。
表二
需要特别说明的是，下文述及的图式中显示的各基因的相对基因表现系以相对倍率呈现，其中使用Excel软件的STDEV公式计算标准偏差，并在Excel 软件中以单尾学生t检验(Student t-test)分析是否具有统计上的显著差异。图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p 值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著。
参考图7。将控制组的NADSYN1基因的表现量视为1(即100％)时，实验组相对于控制组的NADSYN1基因的表现量为1.6(即160％)，代表实验组的NADSYN1基因的表现量为控制组的1.6倍。
由此可知，当PBMC细胞以台湾藜汁液处理后，PBMC细胞内的NADSYN1 基因表现量提高。其可以代表细胞由老化状态回复到未老化前的状态，并且提升的细胞的代谢率。基此，NADSYN1基因表现量提高对于脂肪细胞的新陈代谢率也有相当的提升，可以促进脂肪的分解表现。
范例六：台湾藜汁液的生物活性物质成分分析
天然植物的汁液通常包含多种成分，非属纯物质。不同的生物活性物质在不同的溶剂中溶解度具有差异性，本试验利用相互不相溶的溶剂，将台湾藜汁液中的某一特定成分转移到另一溶剂中。
参考图8。首先，取B组台湾藜汁液10公升(L)经由乙酸乙酯与水等比例液相分配的方式进行分离，分别取得乙酸乙酯层提取液与第一水层提取液。再将第一水层提取液经由正丁醇与水等比例液相分配的方式进行分离，分别取得正丁醇层提取液与第二水层提取液。基此，低极性物质会在乙酸乙酯层提取液，高极性物质在正丁醇层提取液，水溶性物质就留在第二水层提取液。
接着，将乙酸乙酯层提取液经减压浓缩干燥可得乙酸乙酯层提取物(EAF) 14.6克。将正丁醇层提取液经减压浓缩干燥可得正丁醇层提取物(BUF)29.3 克。第二水层提取液经减压浓缩干燥可得水层提取物(WF)98.9克。
据此可计算得知以B组台湾藜汁液10公升(L)可分离提取得到共142.8 克的粉末状浸提物，其中乙酸乙酯层提取物(EAF)占10.2％、正丁醇层提取物(BUF)20.5％以及第二水层提取物(WF)69.3％。
台湾藜汁液的生物活性物质成分分析试验中采用的设备仪器、设定方式与设备来源说明如下：
(1)核磁共振光谱仪(Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer,NMR)。 1D与2D光谱使用Ascend 400MHz,Bruker Co.,Germany，以δ表示化学位移 (chemical shift)，单位为ppm。
(2)质谱仪(Mass Spectrometer,MS)串联质谱-二维离子阱串联傅立叶变换质谱及ESI-MS/MS：使用Bruker amaZon SL system测定，单位为m/z。
(3)中压液相层析仪(Medium pressure liquid chromatography,MPLC):
Rf+,Teledyne ISCO,Lincoln,NE，高效能液相层析仪(High PerformanceLiquid Chromatography,HPLC)：高效液相层析仪(High Performance LiquidChromatography,HPLC)系Agilent 1200系列：脱气装置系Agilent真空脱气装置1322A；冲提溶剂输送系Agilent四元帮浦G1311A；可变波长侦测器系(Multiple WavelengthDetector,MWD)Agilent G1314B；光二极管数组侦测器(Diode Array Detector,DAD)系Agilent 1260Infinity DAD VL G1315D，侦测波长为210nm，280nm，320nm，365nm(AgilentGermany)。
(4)分析管柱:
5μm C18(2)
(250x10mm,Phenomenex, USA)
(5)管柱层析(Column Chromatography)填充材料:Sephadex LH-20 (Pharmacia,Piscataway,NJ,USA).Diaion HP-20(Mitsubishi Chemical Co., Japan)MerckKieselgel 60(40-63um,Art.9385)Merck
RP-18 (40-63um,Art.0250)。
(6)薄层色层分析(Thin-Layer Chromatography)采用TLC aluminium sheets(Silica gel 60 F254,0.25mm,Merck,Germany)及TLC aluminium sheets (RP-18 F254-S,0.25mm,Merck,Germany)。
(7)紫外光灯(UV Lamp):UVP UVGL-25，波长为254nm及365nm。
(8)采用溶剂(solvent)及其来源说明：正己烷(n-hexane)、乙酸乙酯 (ethylacetate)、丙酮(acetone)、甲醇(methanol)、乙醇(ethanol)、乙腈(acetonitrile)(采购至默克台湾)、氯仿-d1(deuteration degree 99.5％)、甲醇-d4(deuteration degree99.5％)、重水deuterium oxide(deuteration degree> 99.8％)、Dimethyl sulfoxide-d6(deuteration degree>99.9％)(默克台湾)。
范例七：不同分层台湾藜汁液的抑制脂肪堆积功效试验
脂肪细胞内以油滴(Lipid droplet)的形式贮存脂肪。基此，本次试验分析染色后的油滴，以直接观察细胞内油滴的数量以确认脂肪堆积的状态。后续，再将染剂溶出并分析作为量化的数值指标。
本次试验采用小鼠骨髓基质细胞(后续简称OP9细胞)，购自美国典型培养物保存中心(American Type Culture Collection，
)的OP9细胞株 (ATCC CRL-2749)。
依下述步骤将OP9细胞培养并分化为脂肪细胞。首先，取24孔培养盘将每孔接种8×104个OP9细胞及500μL培养基(Medium)，培养基其中包含 90％的MEMAM(MinimumEssential Medium Alpha Medium，购自Gibco，美国)细胞培养液、20％的胎牛血清(FetalBovine Serum，购自Gibco，美国， Cat#10437-028)，且加入0.1％的青霉素/链霉素(Penicillin-streptomycin，购自 Gibco，美国)，在37℃下培养7天。此7天的细胞培养期间每隔3天更换培养基。7天后，以显微镜(ZEISS；放大倍率400x)观察细胞内油滴形成，借以确认细胞已完全分化为脂肪细胞，然后将完全分化后的脂肪细胞分为以下五组：实验组一至实验四与控制组。
实验组一：依照每1毫升(mL)培养基添加10微克(μg)汁液的比例将 B组台湾藜汁液添加至含分化后脂肪细胞的培养基中，在37℃下培养7天。此 7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。
实验组二：首先，将乙酸乙酯层提取物EFA与DMSO培养液(友和，D2650-100ML)调制得10mg/ml的乙酸乙酯层稀释液，再依照每1毫升(mL) 培养基添加10微克(μg)乙酸乙酯层稀释液的比例将范例六中的乙酸乙酯层提取物EFA添加至培养基中，以此含提取物的的培养基在37℃下培养分化后的脂肪细胞7天。此7天的细胞处理期间每隔3天更换上述含乙酸乙酯层稀释液的培养基。
实验组三：首先，将正丁醇层提取物BFU与DMSO培养液调制得10mg/ml 的正丁醇层稀释液，再依照每1毫升(mL)培养基添加10微克(μg)正丁醇层稀释液的比例将范例六中的正丁醇层提取物BFU添加至培养基中，以此含正丁醇层稀释液的培养基在37℃下分化后的脂肪细胞培养7天。此7天的细胞处理期间每隔3天更换上述含正丁醇层稀释液的培养基。
实验组四：首先，将第二水萃层提取物WF与DMSO培养液调制得10mg/ml 的第二水萃层稀释液，再依照每1毫升(mL)培养基添加10微克(μg)第二水萃层稀释液的比例将范例六中的第二水层提取WF物添加至培养基中，以此含第二水萃层稀释液的培养基在37℃下培养7天。此7天的细胞处理期间每隔 3天更换上述含第二水萃层稀释液培养基。
控制组：不作任何处理，即不额外添加其他化合物至含分化后脂肪细胞的培养基中，在37℃下培养7天。此7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。
于7天的细胞处理后，将各组别依据下列步骤进行红油O的染色。首先将培养基移除，以1mL的磷酸盐缓冲溶液(Phosphate buffered saline,PBS)清洗脂肪细胞两次，再加入1mL的10％甲醛并于室温下反应30分钟以固定脂肪细胞。接着移除甲醛后以1mL的PBS轻轻地清洗脂肪细胞两次，接着于每孔细胞内加入1mL的60％异丙醇，反应1分钟后，移除异丙醇并加入1mL的油红 O作用溶液与脂肪细胞反应，于室温下反应1小时，接着移除与脂肪细胞作用的油红O作用溶液并迅速地以1mL的60％异丙醇进将脂肪细胞行脱色5秒钟，再使用显微镜观察并拍摄细胞。
参考图9。实验组一到实验组四经由不同分层台湾藜汁液处理之后可见油滴数量皆少于控制组。其中，尤其以实验组二效果最为明显，不但油滴数量减少，并且油滴也明显缩小许多。换言之，初步可以推论在脂肪细胞的成熟过程中，经由台湾藜汁液的作用可以有效降低脂肪细胞堆积油脂。更进一步而言，台湾藜汁液的乙酸乙酯层提取物EFA对于降低脂肪细胞堆积油脂的效用更是明显。
后续，将染色后的各组再依下列步骤进行红油O的定量。加入100％异丙醇于染色的细胞中，并置于振荡器上反应10分钟以溶解油滴，接着取100μL 至96孔培养盘中，以测量ELISA读取仪(BioTek)读取各组的OD510nm读值。其中，利用Excel软件进行student t-test以决定两个样本群体之间是否在统计上具有显著差异(图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著)。
参考图10。将控制组的脂肪油滴含量视为1(即100％)的情况下。实验组一的脂肪油滴含量为83.2％，意即经由台湾藜汁液处理之后能显著地减少 16.8％的脂肪堆积量。实验组二的脂肪油滴含量为75％，意即经由EFA处理之后能显著地减少25％的脂肪堆积量。实验组三的脂肪油滴含量为86％，意即经由BFU处理之后能显著地减少14％的脂肪堆积量。实验组四的脂肪油滴含量为84.3％，意即经由WF处理之后能显著地减少15.7％的脂肪堆积量。
范例八：台湾藜汁液的乙酸乙酯层提取液内生物活性物质分析
依上述范例七的试验结果，台湾藜汁液的乙酸乙酯层提取物对于降低脂肪细胞堆积油脂的效用明显。基此，更进一步对台湾藜汁液的乙酸乙酯层提取物进行分析。
本次试验依据生物活性导引分离方法(Bioassay guided fractionation)，以甲醇为冲提液对乙酸乙酯层提取物进行葡聚糖凝胶管柱层析(Sephadex LH-20 columnchromatography)，后续利用薄层色层分析(Thin-Layer Chromatography)，合并相似结果的冲提物，得到10个分离部分别为EAF01、EAF02、EAF03、 EAF04、EAF05、EAF06、EAF07、EAF08、EAF09、EAF10。
续参考图8。其中，EAF02经逆向-HPLC纯化(体积比甲醇/水＝1/9)，得到生物活性物质TCI-CFG-21，经氢-核磁共振光谱(1H-NMR)与电喷洒离子化质谱(ESIMS)分析其化学结构后，确认其为鸟苷(Guanosine)。
其中，EAF03经逆向-HPLC纯化(体积比甲醇/水＝3/17)，得到生物活性物质TCI-CFG-16与TCI-CFG-20，经氢-核磁共振光谱(1H-NMR)与电喷洒离子化质谱(ESIMS)分析其化学结构后，确认TCI-CFG-16为反式-3-吲哚丙烯酸(trans-3-Indoleacrylic acid)，TCI-CFG-20为4-葡萄糖基香草酸 (4-Glucosylvanillic acid)。
其中，EAF04经逆向-HPLC纯化(体积比甲醇/水＝1/4)，得到生物活性物质TCI-CFG-03、TCI-CFG-17与TCI-CFG-19，经1H-NMR与ESIMS分析其化学结构后，确认TCI-CFG-03为淫羊藿次甙B1(Icariside B1)；TCI-CFG-17 为原儿茶酸(Protocatechuic acid)，TCI-CFG-19为龙胆酸(Gentisic acid)。
其中，EAF05经逆向-HPLC纯化(体积比甲醇/水＝3/7)，得到生物活性物质TCI-CFG-14与TCI-CFG-18，经1H-NMR与ESIMS分析其化学结构后，确认TCI-CFG-14为咖啡酸(Caffeic acid)，TCI-CFG-18为香草酸(Vanillic acid)。
其中，EAF06经逆向-HPLC纯化(体积比甲醇/水＝2/3)，得到生物活性物质TCI-CFG-11、TCI-CFG-12、TCI-CFG-13与TCI-CFG-15，经1H-NMR与ESIMS 分析其化学结构后，确认TCI-CFG-11芦丁(Rutin)，TCI-CFG-12为槲皮素 -3-芦丁糖苷-7-鼠李糖苷(Quercetin-3-O-rutinoside-7-O-rhamnoside)， TCI-CFG-13为香豆酸(Coumaric acid)，TCI-CFG-15为阿魏酸(Ferulic acid)。
其中，EAF07经逆向-HPLC纯化(体积比甲醇/水＝1/1)，得到生物活性物质TCI-CFG-01、TCI-CEG-06、与TCI-CFG-08，经1H-NMR与ESIMS分析其化学结构后，确认TCI-CF-01为20-羟基蜕皮酮(20-Hydroxyecdysone)； TCI-CFG-06为槲皮苷(Quercetrin)；TCI-CFG-08为黄芪苷(Astragalin)。
其中，EAF08经逆向-HPLC纯化(体积比甲醇/水＝11/9)，得到生物活性物质TCI-CFG-07、TCI-CFG-09与TCI-CFG-10，经1H-NMR与ESIMS分析其化学结构后，确认TCI-CFG-07为白前苷B(Vincetoxicoside B)、TCI-CFG-09 为山奈酚-3-鼠李糖苷(kaempferol-3-rhamnoside)，TCI-CFG-10为山奈酚-7- 鼠李糖苷(Kaempferol-7-rhamnoside)。
其中，EAF09经逆向-HPLC纯化(体积比甲醇/水＝6/4)，得到生物活性物质TCI-CFG-04与TCI-CFG-05，经1H-NMR与ESIMS分析其化学结构后，确认TCI-CFG-04为槲皮素(Quercetin)，TCI-CFG-05为山奈酚(Kaempferol)。
其中，EAF10经逆向-HPLC纯化(体积比甲醇/水＝8/2)，得到生物活性物质TCI-CFG-02，经1H-NMR与ESIMS分析其化学结构后，确认其为齐墩果酸 (Oleanolic acid)。
可知，台湾藜汁液的包含有鸟苷(TCI-CFG-21)、反式-3-吲哚丙烯酸 (TCI-CFG-16)、4-葡萄糖基香草酸(TCI-CFG-20)、淫羊藿次甙B1 (TCI-CFG-03)、原儿茶酸(TCI-CFG-17)、龙胆酸(TCI-CFG-19)、咖啡酸(TCI-CFG-14)、香草酸(TCI-CFG-18)、芦丁(TCI-CFG-11)、槲皮素-3- 芦丁糖苷-7-鼠李糖苷(TCI-CFG-12)、香豆酸(TCI-CFG-13)、阿魏酸 (TCI-CFG-15)、20-羟基蜕皮酮(TCI-CFG-01)、槲皮苷(TCI-CFG-06)、黄芪苷(TCI-CFG-08)、山奈酚-3-鼠李糖苷(TCI-CFG-20)、山奈酚-7-鼠李糖苷(TCI-CFG-10)、槲皮素(TCI-CFG-04)、山奈酚(TCI-CFG-05)、齐墩果酸(TCI-CFG-02)、白前苷B(TCI-CFG-07)等生物活性物质。
范例九：台湾藜汁液的生物活性物质分别测试抑制脂肪堆积功效试验
脂肪细胞内以油滴(Lipid droplet)的形式贮存脂肪。基此，本次试验分析染色后的油滴，以直接观察细胞内油滴的数量以确认脂肪堆积的状态。后续，再将染剂溶出并分析以作为量化的数值指标。
本次试验采用小鼠骨髓基质细胞(后续简称OP9细胞)，购自美国典型培养物保存中心(American Type Culture Collection，
)的OP9细胞株 (ATCC CRL-2749)。
首先，取24孔培养盘将每孔接种8×104个OP9细胞及500μL培养基 (Medium)，培养基其中包含90％的MEMAM(Minimum Essential Medium Alpha Medium，购自Gibco，美国)细胞培养液、20％的胎牛血清(Fetal Bovine Serum，购自Gibco，美国，Cat#10437-028)，且加入0.1％的青霉素/链霉素 (Penicillin-streptomycin，购自Gibco，美国)，在37℃下培养7天。此7天的细胞培养期间每隔3天更换培养基。7天后，以显微镜(ZEISS；放大倍率400x) 观察细胞内油滴形成，借以确认细胞已完全分化为脂肪细胞，然后将完全分化后的脂肪细胞分为以下13组。
TCI-CFG-02实验组：依照每1毫升(mL)培养基添加10微克(μg)提取物的比例(即，浓度为10ppm)将齐墩果酸添加至含分化后的脂肪细胞培养基中，在37℃下培养7天。此7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。
TCI-CFG-04实验组：依照每1毫升(mL)培养基添加10微克(μg)提取物的比例(即，浓度为10ppm)将槲皮素添加至含分化后的脂肪细胞培养基中，在37℃下培养7天。此7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。
TCI-CFG-05实验组：依照每1毫升(mL)培养基添加10微克(μg)提取物的比例(即，浓度为10ppm)将山奈酚添加至含分化后的脂肪细胞培养基中，在37℃下培养7天。此7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。
TCI-CFG-06实验组：依照每1毫升(mL)培养基添加10微克(μg)提取物的比例(即，浓度为10ppm)将槲皮苷添加至含分化后的脂肪细胞培养基中，在37℃下培养7天。此7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。
TCI-CFG-07实验组：依照每1毫升(mL)培养基添加10微克(μg)提取物的比例(即，浓度为10ppm)将白前苷B添加至含分化后的脂肪细胞培养基中，在37℃下培养7天。此7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。
TCI-CFG-08实验组：依照每1毫升(mL)培养基添加10微克(μg)提取物的比例(即，浓度为10ppm)将黄芪苷添加至含分化后的脂肪细胞培养基中，在37℃下培养7天。此7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。
TCI-CFG-09实验组：依照每1毫升(mL)培养基添加10微克(μg)提取物的比例(即，浓度为10ppm)将山奈酚-3-鼠李糖苷添加至含分化后的脂肪细胞培养基中，在37℃下培养7天。此7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。
TCI-CFG-10实验组：依照每1毫升(mL)培养基添加10微克(μg)提取物的比例(即，浓度为10ppm)将山奈酚-7-鼠李糖苷添加至含分化后的脂肪细胞培养基中，在37℃下培养7天。此7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。
TCI-CFG-11实验组：依照每1毫升(mL)培养基添加10微克(μg)提取物的比例(即，浓度为10ppm)将芦丁添加至含分化后的脂肪细胞培养基中，在37℃下培养7天。此7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。
TCI-CFG-12实验组：依照每1毫升(mL)培养基添加10微克(μg)提取物的比例(即，浓度为10ppm)将槲皮素-3-芦丁糖苷-7-鼠李糖苷添加至含分化后的脂肪细胞培养基中，在37℃下培养7天。此7天的细胞处理期间每隔3 天更换培养基。
TCI-CFG-13实验组：依照每1毫升(mL)培养基添加10微克(μg)提取物的比例(即，浓度为10ppm)将香豆酸添加至含分化后的脂肪细胞培养基中，在37℃下培养7天。此7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。
TCI-CFG-14实验组：依照每1毫升(mL)培养基添加10微克(μg)提取物的比例(即，浓度为10ppm)将咖啡酸添加至含分化后的脂肪细胞培养基中，在37℃下培养7天。此7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。
控制组：不作任何处理，即不额外添加其他化合物至含分化后的脂肪细胞培养基中，在37℃下培养7天。此7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。
于7天的细胞处理后，各组别依据下列步骤进行红油O的染色。首先将培养基移除，以1mL的磷酸盐缓冲溶液(Phosphate buffered saline,PBS)清洗脂肪细胞两次，再加入1mL的10％甲醛并于室温下反应30分钟以固定脂肪细胞。接着移除甲醛后以1mL的PBS轻轻地清洗脂肪细胞两次，接着于每孔细胞内加入1mL的60％异丙醇，反应1分钟后，移除异丙醇并加入1mL的油红O作用溶液与脂肪细胞反应，于室温下反应1小时，接着移除与脂肪细胞作用的油红O作用溶液并迅速地以1mL的60％异丙醇进将脂肪细胞行脱色5秒钟，再使用显微镜观察并拍摄细胞。
参考图11。TCI-CFG-02实验组到TCI-CFG-14实验组经由台湾藜汁液内所分离而得的不同生物活性物质处理之后可见红色油滴数量皆少于控制组。
后续，将染色后的各组再依下列步骤进行红油O的定量。加入100％异丙醇于染色的细胞中，并置于振荡器上反应10分钟以溶解油滴，接着取100μL 至96孔培养盘中，以测量ELISA读取仪(BioTek)读取各组的OD510nm读值。其中，利用Excel软件进行student t-test以决定两个样本群体之间是否在统计上具有显著差异(图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著)。
参考图12。将控制组的脂肪油滴含量视为1(即100％)的情况下。 TCI-CFG-02实验组的脂肪油滴含量为75.7％，意即经由齐墩果酸处理之后能显著地减少24.3％的脂肪堆积量。TCI-CFG-04实验组的脂肪油滴含量为73.9％，意即经由槲皮素处理之后能显著地减少26.1％的脂肪堆积量。TCI-CFG-05实验组的脂肪油滴含量为67％，意即经由山奈酚处理之后能显著地减少33％的脂肪堆积量。TCI-CFG-06实验组的脂肪油滴含量为73.6％，意即经由槲皮苷处理之后能显著地减少26.4％的脂肪堆积量。TCI-CFG-07实验组的脂肪油滴含量为 69.2％，意即经由白前苷B处理之后能显著地减少30.8％的脂肪堆积量。 TCI-CFG-08实验组的脂肪油滴含量为82.2％，意即经由黄芪苷处理之后能显著地减少17.8％的脂肪堆积量。TCI-CFG-09实验组的脂肪油滴含量为83.3％，意即经由山奈酚-3-鼠李糖苷处理之后能显著地减少16.7％的脂肪堆积量。 TCI-CFG-10实验组的脂肪油滴含量为68.8％，意即经由山奈酚-7-鼠李糖苷处理之后能显著地减少31.2％的脂肪堆积量。TCI-CFG-11实验组的脂肪油滴含量为 79％，意即经由芦丁处理之后能显著地减少21％的脂肪堆积量。TCI-CFG-12实验组的脂肪油滴含量为72.1％，意即经由槲皮素-3-芦丁糖苷-7-鼠李糖苷处理之后能显著地减少27.9％的脂肪堆积量。TCI-CFG-13实验组的脂肪油滴含量为 76.1％，意即经由香豆酸处理之后能显著地减少23.9％的脂肪堆积量。 TCI-CFG-14实验组的脂肪油滴含量为68.5％，意即经由咖啡酸处理之后能显著地减少31.5％的脂肪堆积量。
其中，尤其以山奈酚、白前苷B、山奈酚-7-鼠李糖苷及咖啡酸等四个生物活性物质其能有效减少30％以上的脂肪堆积量。而齐墩果酸、槲皮素、槲皮苷、芦丁、槲皮素-3-芦丁糖苷-7-鼠李糖苷及香豆酸等六个生物活性物质能有效减少 20％以上的脂肪堆积量。
范例十：台湾藜汁液的减脂功效试验
减脂是指脂肪被分解，而脂肪分解(Lipolysis)作用是指脂肪细胞内所贮存的三酸甘油酯(triglyceride,TG)被逐步降解为脂肪酸(fatty acid,FA)与甘油(Glycerol)的过程。基此，本次试验分析脂肪细胞中甘油的含量作为量化指标，以观察是否有产生脂肪分解作用。
本次试验采用小鼠骨髓基质细胞(后续简称OP9细胞)，购自美国典型培养物保存中心(American Type Culture Collection，
)的OP9细胞株 (ATCC CRL-2749)。
首先，取24孔培养盘将每孔接种8×104个OP9细胞及500μL培养基 (Pre-adipocyte Expansion Medium)，培养基其中包含90％的MEMAM (Minimum EssentialMedium Alpha Medium，购自Gibco，美国)细胞培养液、 20％的胎牛血清(Fetal BovineSerum，购自Gibco，美国，Cat#10437-028)，且加入0.1％的青霉素/链霉素(Penicillin-streptomycin，购自Gibco，美国)，在37℃下培养7天。此7天的细胞培养期间每隔3天更换培养()。7天后，以显微镜(ZEISS；放大倍率400x)观察细胞内油滴形成，借以确认细胞已完全分化为脂肪细胞。
TCI-CFG-16实验组：依照每1毫升(mL)培养基添加10微克(μg)提取物的比例(即，浓度为10ppm)将反式-3-吲哚丙烯酸添加至含分化后的脂肪细胞培养基中，在37℃下培养7天。此7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。
TCI-CFG-20实验组：依照每1毫升(mL)培养基添加10微克(μg)提取物的比例(即，浓度为10ppm)将4-葡萄糖基香草酸添加至含分化后的脂肪细胞培养基中，在37℃下培养7天。此7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基
控制组：不作任何处理，即不额外添加其他化合物至含分化后的脂肪细胞培养基中，在37℃下培养7天。此7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。
接下来，使用细胞甘油基检测试剂套组(Glycerol cell-based assay kit，购自Cayman，美国，产品编号10011725)依据下列步骤测量甘油含量。收集各组细胞液的上清液，并各取其中的25μL转移到新的96孔培养盘中，并于各孔中加入100μL的重构游离甘油测定试剂(Reconstituted free glycerol assay reagent)，再于室温下作用15分钟后，将培养盘以ELISA读数器读取各组的 OD540nm的吸亮度，以量化各组脂肪细胞分解并释放至细胞培养液中的甘油量，并代表脂肪的分解量。其中，利用Excel软件进行student t-test以决定两个样本群体之间是否在统计上具有显著差异(图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著)。
参考图13。将控制组的脂肪分解量视为100％时，TCI-CFG-16实验组的脂肪分解量为102.5％，意即经由反式-3-吲哚丙烯酸处理之后能显著地提升20.5％的脂肪分解量。TCI-CFG-20实验组的脂肪分解量为118.9％，意即经由4-葡萄糖基香草酸处理之后能显著地提升18.9％的脂肪分解量。此结果显示，本发明的台湾藜汁液内所提取得的反式-3-吲哚丙烯酸及4-葡萄糖基香草酸能直接且有效促进脂肪细胞中脂肪的分解，以减少脂肪细胞中脂肪的含量，而达到燃脂减肥的功效。
范例十一：台湾藜汁液的指纹图谱HPLC试验
于此，利用高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography， HPLC)来对B组台湾藜汁液中的生物活性物质进行定量与定性的分析。
本次试验中所使用的溶剂为甲醇与水，并在甲醇与水各自添加0.1％甲酸，设定流速为1ml/min，设定冲提条件为0分钟时甲醇：水为2：98，10分钟时甲醇：水为2：98，40分钟时甲醇：水为70：30，50分钟时甲醇：水为100：0，60分钟时甲醇：水为100：0。
参考图14。在时间为20分附近解析出TCI-CFG-20生物活性物质的波峰，在时间为28分附近解析出TCI-CFG-13生物活性物质的波峰，在时间为31分附近解析出TCI-CFG-11生物活性物质的波峰，在时间为32.5分附近解析出 TCI-CFG-12生物活性物质的波峰。
换言之，台湾藜汁液中芦丁、槲皮素-3-芦丁糖苷-7-鼠李糖苷、香豆酸及 4-葡萄糖基香草酸含量较多。意即芦丁、槲皮素-3-芦丁糖苷-7-鼠李糖苷、香豆酸及4-葡萄糖基香草酸为台湾藜汁液中有效生物活性物质的主要成分。
虽然本发明的技术内容已经以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神所作些许的更动与润饰，皆应涵盖于本发明的范畴内，因此本发明的保护范围当视后附的专利范围所界定者为准。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。
序列表
<110> 百岳特生物技术（上海）有限公司
<120> 台湾藜汁液及其用途以及减脂组合物
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<170> PatentIn version 3.5
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Claims (19)
1.一种台湾藜汁液，其特征在于，该台湾藜汁液以一含水的溶剂进行浸提，其中该台湾藜汁液包含以下至少一成分：鸟苷、反式-3-吲哚丙烯酸、4-葡萄糖基香草酸、淫羊藿次甙B1、原儿茶酸、龙胆酸、咖啡酸、香草酸、芦丁、槲皮素-3-芦丁糖苷-7-鼠李糖苷、香豆酸、阿魏酸、20-羟基蜕皮酮、槲皮苷、黄芪苷、山奈酚-3-鼠李糖苷、山奈酚-7-鼠李糖苷、槲皮素、山奈酚、齐墩果酸、白前苷B。
2.根据权利要求1所述的台湾藜汁液，其特征在于，该台湾藜汁液包含以下至少一成分：该齐墩果酸、该槲皮素、该山奈酚、该槲皮苷、该白前苷B、该黄芪苷、该山奈酚-3-鼠李糖苷、该山奈酚-7-鼠李糖苷、该芦丁、该槲皮素-3-芦丁糖苷-7-鼠李糖苷、该香豆酸、该阿魏酸、该反式-3-吲哚丙烯酸、该4-葡萄糖基香草酸。
3.根据权利要求2所述的台湾藜汁液，其特征在于，该台湾藜汁液包含以下至少一成分：该芦丁、该槲皮素-3-芦丁糖苷-7-鼠李糖苷、该香豆酸、该4-葡萄糖基香草酸。
4.一种台湾藜浸提物用于制备抵抗自然衰老的组合物的用途，其特征在于，该台湾藜汁液通过提高细胞中抗老回春相关基因表现量达到该抵抗自然衰老，且其中该台湾藜汁液是以一含水的溶剂进行浸提。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，该台湾藜汁液能够延缓细胞老化。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，该抗老回春相关基因包括CCT8基因、Pink1基因、Atg1基因、Atg8基因、FOXO3基因、PARP1基因、UBL5基因、NADSYN1基因及MRPS5基因其中至少一项。
7.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，该台湾藜汁液的浓度为0.5％以上。
8.一种台湾藜浸提物用于制备促进脂肪分解的组合物的用途，其特征在于，该台湾藜汁液是以一含水的溶剂进行浸提。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，该台湾藜汁液包含以下至少一成分：反式-3-吲哚丙烯酸、4-葡萄糖基香草酸。
10.一种台湾藜浸提物用于制备减少脂肪堆积的组合物的用途，其特征在于，该台湾藜汁液是以一含水的溶剂进行浸提。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，该台湾藜汁液包含以下至少一成分：齐墩果酸、槲皮素、山奈酚、槲皮苷、白前苷B、黄芪苷、山奈酚-3-鼠李糖苷、山奈酚-7-鼠李糖苷、芦丁、槲皮素-3-芦丁糖苷-7-鼠李糖苷、香豆酸、阿魏酸。
12.根据权利要求8或10所述的用途，其特征在于，该台湾藜汁液的浓度为0.125％以上。
13.根据权利要求4、8或10其中任一项所述的用途，其特征在于，该含水的溶剂为一纯水或一含有一有机酸的水溶剂。
14.根据权利要求13的用途，其特征在于，该有机酸的浓度为0.05％-1.00％。
15.根据权利要求4、8或10其中任一项所述的用途，其特征在于，该台湾藜汁液是以该含水的溶剂形成一初萃液，该初萃液经糖化酵素酵解而形成该台湾藜汁液。
16.一种用于减脂的组合物，其特征在于，其包括选自下列成分：鸟苷、反式-3-吲哚丙烯酸、4-葡萄糖基香草酸、淫羊藿次甙B1、原儿茶酸、龙胆酸、咖啡酸、香草酸、芦丁、槲皮素-3-芦丁糖苷-7-鼠李糖苷、香豆酸、阿魏酸、20-羟基蜕皮酮、槲皮苷、黄芪苷、山奈酚-3-鼠李糖苷、山奈酚-7-鼠李糖苷、槲皮素、山奈酚、齐墩果酸、白前苷B其中至少一种或其组合。
17.根据权利要求16所述的组合物，其特征在于，其包括选自下列成分：该齐墩果酸、该槲皮素、该山奈酚、该槲皮苷、该白前苷B、该黄芪苷、该山奈酚-3-鼠李糖苷、该山奈酚-7-鼠李糖苷、该芦丁、该槲皮素-3-芦丁糖苷-7-鼠李糖苷、该香豆酸、该阿魏酸其中至少一种或其组合，其中该减脂组合物用以抑制脂肪生成。
18.根据权利要求16所述的组合物，其特征在于，其包括选自下列成分：该反式-3-吲哚丙烯酸、该4-葡萄糖基香草酸其中至少一种或其组合，其中该组合物用以促进脂肪分解。
19.根据权利要求16所述的组合物，其特征在于，该鸟苷、该反式-3-吲哚丙烯酸、该4-葡萄糖基香草酸、该淫羊藿次甙B1、该原儿茶酸、该龙胆酸、该咖啡酸、该香草酸、该芦丁、该槲皮素-3-芦丁糖苷-7-鼠李糖苷、该香豆酸、该阿魏酸、该20-羟基蜕皮酮、该槲皮苷、该黄芪苷、该山奈酚-3-鼠李糖苷、该山奈酚-7-鼠李糖苷、该槲皮素、该山奈酚、该齐墩果酸、该白前苷B是分离自一台湾藜浸提物。
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