CN111995677B - 一种针对新冠病毒棘突蛋白非rbd区的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一种针对新冠病毒棘突蛋白非rbd区的单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

一种针对新冠病毒棘突蛋白非RBD区的单克隆抗体及其应用，该单克隆抗体与新冠病毒棘突糖蛋白RBD区特异性结合，包括重链可变区的互补性决定区CDRH1、CDRH2、CDRH3和轻链可变区的互补性决定区CDRL1、CDRL2、CDRL3；本发明的针对新冠病毒棘突蛋白非RBD区的单克隆抗体，效价高、特异性强，可以高效表达，能与新冠病毒SARS‑CoV‑2表面的棘突蛋白RBD区以外的区域特异性结合，用于新冠病毒的定性或定量检测，并且能够中和一定的新冠病毒毒性，减弱病毒毒性，起到预防或/和治疗新冠病毒肺炎的作用。

Description

一种针对新冠病毒棘突蛋白非RBD区的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体说是细胞免疫学和分子生物学技术领域，更具体说是一种针对新冠病毒棘突蛋白非RBD区的单克隆抗体及其应用。
背景技术
新冠病毒的膜蛋白主要有表面的棘突蛋白（Spike protein，S蛋白）和膜（Membrane protein，M蛋白），S蛋白是一种糖蛋白，主要作用于细胞粘附和细胞膜融合，在许多哺乳动物体内，S蛋白被弗林蛋白酶或其他酶分解为S1和S2，其中S1上有受体附着位点，S2主要体现融合活性。新型冠状病毒可以结合多种细胞受体，其中血管紧张素转换酶2（ACE2）作为一种肽酶是细胞表面冠状病毒的受体之一。S1内有一部分区域与ACE2紧密结合，我们称之为受体结合域（RBD），是病毒和受体相互作用的关键因素。研究表明RBD只需更改几个氨基酸，就可能出现跨物种感染，且RBD包含重要的病毒中和表位，对提高免于抗体应答十分关键。
冠状病毒可以利用许多不同的蛋白质来复制和入侵细胞，但棘突蛋白是其用来与受体结合的主要表面蛋白，承担病毒与宿主细胞膜受体结合及膜融合功能，而受体是另一种充当进入人类细胞门户的蛋白质。当棘突蛋白与人类细胞受体结合后，病毒膜与人类细胞膜融合，使得病毒基因组得以进入人类细胞并开始感染，从而导致新冠肺炎。由此可见，棘突蛋白是宿主中和抗体的重要作用位点以及疫苗设计的关键靶点，研究其性质有重要作用。
另一方面，抗体是哺乳动物免疫系统中的一个重要糖蛋白分子。抗体分子由两条重链(Heavy chain)和两条轻链(Light chain)组成，其中重链由分为可变区(Variableregion of heavy chain，VH)和三个恒定区(Constant region of heavy chain；CH1，CH2，CH3)，轻链则由一个可变区（VL）和一个恒定区（CL）组成。可变区具有跟抗原结合的功能，因抗体个体不同而不同，而抗体的恒定区则因抗体的种属及亚型不同而不同。抗体重链可变区包含三个互补决定区（Complementarity-determining regions；CDRH1，CDRH2，CDRH3），轻链可变区也包含三个互补决定区，即CDRL1，CDRL2，和CDRL3，互补决定区又称为高变区，可以直接与抗原的表位结合。
目前的新冠肺炎还没有研发出合适的疫苗，而治疗新冠肺炎也没有非常有效的药物，采用常规抗生素药物治疗时效果并不明显，有些还存在严重的毒副作用；此外，由于抗体药物在传染病、自身免疫疾病等治疗上发挥着重要作用，针对性更强，因此开发针对新冠病毒的单克隆抗体，用于预防和治疗新冠肺炎具有非常重要的意义。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种针对新冠病毒棘突蛋白非RBD区的单克隆抗体及其应用。
本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：
本发明公开了一种针对新冠病毒SARS-CoV-2棘突蛋白非RBD区的单克隆抗体，该单克隆抗体与新冠病毒SARS-CoV-2棘突糖蛋白非RBD区特异性结合，包括重链可变区的互补性决定区CDRH1、CDRH2、CDRH3和轻链可变区的互补性决定区CDRL1、CDRL2、CDRL3；重链可变区的互补性决定区CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列依次为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；轻链可变区的互补性决定区CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列依次为SEQID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。
优选的，一种针对新冠病毒SARS-CoV-2棘突蛋白非RBD区的单克隆抗体，命名为A6，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：5。
本发明还包括一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码上述任一项所述的单克隆抗体。
本发明还包括一种包括上述核酸分子的表达载体，除了前面所述的核酸分子之外，表达载体还包括与所述核酸分子序列操作性相连的表达调控序列。
表达载体是指可将编码A6抗体的多聚核苷酸插入其中并使A6抗体得到表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。载体的种类包括本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。原则上，只要能在宿主体内复制和稳定，任何载体都可以用。在表达载体中，除了含有复制起点外，还可含有标记基因和其他翻译控制元件。
本发明还包括一种包含上述的核酸分子或上述的表达载体的宿主细胞。
表达A6抗体的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞：真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO，COS，293细胞或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
本发明还包括一种非诊断目的的检测新冠病毒SARS-CoV-2水平的方法，包括以下步骤：
①提取含有新冠病毒SARS-CoV-2的样品；
②将步骤①得到的样品与上述的单克隆抗体A6接触；
③检测样品与单克隆抗体的免疫反应。
本发明还包括上述任一项所述的针对新冠病毒SARS-CoV-2棘突蛋白非RBD区的单克隆抗体在制备新冠病毒SARS-CoV-2检测产品中的应用。
所述检测产品包括但不限于检测试剂、试剂盒、芯片或试纸。凡是包括前面所述结合分子的能够检测出SARS-CoV-2的检测产品均包括在本发明的范围之内。
本发明还包括上述任一项所述的针对新冠病毒SARS-CoV-2棘突蛋白非RBD区的单克隆抗体在制备抑制新冠病毒SARS-CoV-2药物中的应用。
本发明还包括上述任一项所述的针对新冠病毒SARS-CoV-2棘突蛋白非RBD区的单克隆抗体在制备预防或治疗由新冠病毒SARS-CoV-2引起的肺炎药物制剂中的应用。
本发明所用的术语“新冠病毒SARS-CoV-2”与“SARS-CoV-2病毒”、“新冠病毒”“SARS-CoV-2”“新型冠状病毒SARS-CoV-2”可以互换使用。
本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明的针对新冠病毒棘突蛋白非RBD区的单克隆抗体，能与新冠病毒SARS-CoV-2表面的棘突蛋白RBD区以外的区域特异性结合，用于新冠病毒的定性或定量检测，特异性强，效价高，能够高效表达；本发明的针对新冠病毒棘突蛋白非RBD区的单克隆抗体，能够中和/减弱一定的新冠病毒毒性，在制备新冠病毒检测产品或制备抑制新冠病毒药物中发挥重要作用。
本发明的噬菌体展示技术把外源DNA插入噬菌体编码外壳蛋白的基因中，使外源DNA片断对应的表达产物融合在噬菌体的外壳蛋白中形成融合蛋白，呈现在噬菌体表面。具有如下显著的优点：建立了基因型和表型之间直接的物理联系，从而使筛选简便高效。本发明从Tomlinson I+J噬菌体展示合成抗体库中筛选到了能够跟新冠病毒SARS-CoV-2的S蛋白结合的抗体，这些抗体在新冠病毒的检测及降低病毒毒性方面具有重要的应用价值。
附图说明
图1为淘筛抗体库所得噬菌体的抗原结合性能的酶联免疫分析结果；
图2为单克隆抗体A6抗原特异性的酶联免疫试验结果；
图3为单克隆抗体A2抗原特异性的酶联免疫试验结果；
图4为单克隆抗体C3抗原特异性的酶联免疫试验结果；
图5为利用淘筛的抗体检测新冠病毒原理示意图；
图6为利用A6抗体的Fab片段与A2组合检测病毒S蛋白的酶联免疫吸附试验结果；
图7为利用A6抗体的Fab片段与C3组合检测病毒S蛋白的酶联免疫吸附试验结果。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种针对新冠病毒棘突蛋白非RBD区的单克隆抗体及其应用，通过以下实施例进一步说明，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制，根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
以下结合具体实施例来对本发明作进一步的描述。
实施例1
一、噬菌体展示抗体文库的扩增：
将500 μL含有Tomlinson I+J噬菌体展示抗体库的大肠杆菌TG-1（英国MRC HGMP资源中心）接种到25 mL含有100μg/mL氨苄青霉素及1%葡萄糖的2YT培养基（1.6%Tryptone，1% Yeast Extract，0.5% NaCl）中，37℃培养至OD600为0.4，加入109cfu(ColonyFormation Unit)KM13辅助噬菌体（英国MRC HGMP资源中心），37℃感染1小时后，3000g离心30分钟，弃上清，使用含有100μg/ml氨苄青霉素、50μg/ml卡那霉素及0.1%葡萄糖的2YT培养基50mL（1.6% Tryptone，1% Yeast Extract，0.5% NaCl）悬浮菌体，30℃下以250rpm的速度摇菌16小时，次日以5000g，离心培养液30分钟，分离回收上清40mL，在上清液中加入10mL的PEG/NaCl溶液，混合均匀后在冰上放置30分钟，以5000g，离心30分钟，弃上清，加入2mL的灭菌PBS溶液将沉淀溶解，作为噬菌体展示抗体库溶液，利用大肠杆菌对噬菌体展示抗体库进行滴定，所制备抗体库的浓度为1012cfu/mL。
二、噬菌体展示抗体文库的淘筛
在96孔微孔板的10个孔内各加入100μL的含有10μg/ml SARS-CoV-2病毒S蛋白（南京金斯瑞生物科技有限公司）的PBS溶液，4℃过夜孵育，次日弃抗原溶液，每孔加入200μL含有2%脱脂奶粉的PBS溶液，25℃孵育2小时进行封闭，用PBST洗涤3次后，每孔加入100μL的噬菌体溶液（R0；每孔含有109cfu的噬菌体），室温下孵育2小时，用PBST洗涤后，每孔加入100μL的胰蛋白酶将结合到病毒S蛋白的噬菌体洗脱。
培养TG-1大肠杆菌至OD600为0.4，取4 mL菌液，将500μL溶出的噬菌体溶液加入到菌液中，37℃感染30分钟，5000g离心20分钟，弃上清，用含有100 μg/mL氨苄青霉素、50 μg/mL卡那霉素及0.1%葡萄糖的2YT培养基悬浮菌体，30℃下以250rpm摇菌16小时；次日5000g，离心培养液30分钟，分离回收上清，在上清溶液中加入1/5容积的PEG/NaCl溶液，混合均匀后在冰上放置30分钟，以5000g离心30分钟，弃上清，加入200 μL的灭菌PBS溶液，作为第一次富集后的噬菌体溶液（R1）；重复以上步骤，分别获得噬菌体溶液R2和R3；执行酶联免疫吸附试验，验证淘筛过程中获得的噬菌体展示抗体库跟S蛋白的结合特异性及结合性能。
酶联免疫吸附试验的操作如下：在96孔酶标板内加入100μL含有新冠病毒S蛋白溶液（2μg/mL）或牛血清白蛋白BSA（2μg/mL）的PBS溶液，4℃过夜，次日弃抗原溶液，加入200μL含有2%脱脂奶粉的PBS溶液，在25℃下孵育2小时，对酶标板进行封闭。用含有0.1%吐温20的PBS溶液洗涤酶标板3次，加入稀释后的R0、R2及R3噬菌体溶液（109cfu/well），25℃孵育1小时，用PBST溶液洗涤酶标板，加入HRP标记的小鼠抗M13抗体，孵育1小时后，用PBST洗板，加入HRP底物TMBZ（用pH6.0的乙酸钠溶液配制，含1/10000稀释的30%H2O2），显色后用酶标仪检测在450 nm处的吸光度，绘制柱状图，比较各步获得噬菌体抗体跟S蛋白及BSA的结合性能。
酶联免疫吸附试验的结果如图1所示，比较噬菌体淘筛过程中获得的噬菌体库R0、R2及R3跟S蛋白的结合能力时发现，第二轮淘筛时所得噬菌体溶液R2与S蛋白的结合能力显著增加，而对BSA的结合性能非常微弱且没有变化，说明构建的噬菌体展示抗体库中抗新冠病毒S蛋白的抗体得以富集。
三、单克隆抗体筛选
培养TG-1大肠杆菌至OD600为0.4，取100 μL淘筛R2噬菌体抗体库溶出的噬菌体溶液，用于感染200 μL的大肠杆菌菌液，37℃孵育30分钟后，将菌液涂布到含有100 μg/mL氨卞青霉素、50 μg/mL卡那霉素及1%葡萄糖的2YT培养基平板上，37℃过夜培养；次日挑96个菌落接种到96孔培养板上，37℃培养至OD600为0.4，每个孔内加入M13噬菌体，感染后以5000g离心20分钟，去除上清，每孔加入200 μL含有100 μg/mL氨苄青霉素、50 μg/mL卡那霉素及0.1%葡萄糖的2YT培养基，悬浮菌体，30℃下以250rpm的速度培养16小时；次日以5000g离心培养液30分钟，分离回收上清，执行酶联免疫吸附试验，验证各单克隆抗体跟S蛋白的结合特异性及结合性能。
酶联免疫吸附试验的操作如下：在96孔酶标板内加入100 μL含有病毒S蛋白（1 μg/mL）的PBS溶液，4℃过夜，次日弃抗原溶液，加入200 μL含有2%脱脂奶粉的PBS溶液，在25℃下孵育2小时，对酶标板进行封闭。用含有0.1%吐温20的PBS溶液洗涤酶标板3次，加入噬菌体溶液，25℃孵育1小时，用PBST溶液洗涤酶标板，加入HRP标记的小鼠抗M13抗体，孵育1小时后，用PBST洗板，加入HRP底物TMBZ（用pH6.0的乙酸钠溶液配制，含1/10000稀释的30%H2O2），显色后用酶标仪测450nm的吸光度，绘制柱状图，比较各克隆的噬菌体抗体跟S蛋白及牛血清蛋白的结合性能。
根据实验结果，有6个包被了S蛋白的微孔颜色较深，其吸光度分别为1.40，1.30，1.35，1.05，1.10和0.80，培养这些微孔对应的细菌，并对吸光度1.05的微孔内的细菌抽取质粒并进行基因测序，抗体根据其在微孔板的位置（A行6列）命名为单克隆抗体A6；对吸光度1.4的微孔内的细菌抽取质粒并进行基因测序，抗体根据其在微孔板的位置（A行2列）命名为单克隆抗体A2；对吸光度1.1的微孔内的细菌抽取质粒并进行基因测序，抗体根据其在微孔板的位置（C行3列）命名为单克隆抗体C3；通过与抗体基因库中登录抗体序列进行比对，没有发现与本发明所述抗体基因相同的序列，说明这些抗体为新型抗体。抗体的氨基酸序列详细情况如下所述。
A6抗体重链可变区序列为SEQ ID NO：1，CDRH1序列为SEQ ID NO：2；CDRH2序列为SEQ ID NO：3；CDRH3序列为SEQ ID NO：4；
A6抗体轻链可变区序列为SEQ ID NO：5，CDRL1序列为SEQ ID NO：6；CDRL2序列为SEQ ID NO：7；CDRL3序列为SEQ ID NO：8。
A2抗体重链可变区序列为SEQ ID NO：9，CDRH1序列为SEQ ID NO：10；CDRH2序列为SEQ ID NO：11；CDRH3序列为SEQ ID NO：12；
A2抗体轻链可变区序列为SEQ ID NO：13，CDRL1序列为SEQ ID NO：14；CDRL2序列为SEQ ID NO：15；CDRL3序列为SEQ ID NO：16。
C3抗体重链可变区序列为SEQ ID NO：17，CDRH1序列为SEQ ID NO：18；CDRH2序列为SEQ ID NO：19；CDRH3序列为SEQ ID NO：20；
C3抗体轻链可变区序列为SEQ ID NO：21，CDRL1序列为SEQ ID NO：22；CDRL2序列为SEQ ID NO：23；CDRL3序列为SEQ ID NO：24。
本发明A6涉及的序列具体信息如下：
SEQ ID NO：1：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSYITTTGSDTGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNYAAFDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO：2：GFTFSSYA ；
SEQ ID NO：3：ITTTGSDT；
SEQ ID NO：4：AKNYAAFDY；
SEQ ID NO：5：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAAAYPTTFGQGTKVEIKR；
SEQ ID NO：6：QSISSY；
SEQ ID NO：7：TAS；
SEQ ID NO：8：QQAAAYPTT；
本发明A2涉及的的序列具体信息如下：
SEQ ID NO：9：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIDASGYYTSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDAYTFDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO：10：
GFTFSSYA；
SEQ ID NO：11：
IDASGYYT；
SEQ ID NO：12：
AKDAYTFDY；
SEQ ID NO：13：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYSASYLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQASADPDTFGQGTKVEIKR；
SEQ ID NO：14：
QSISSY；
SEQ ID NO：15：
SAS；
SEQ ID NO：16：
QQASADPDT。
本发明C3涉及的的序列具体信息如下：
SEQ ID NO：17：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIASSGYYTDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDADSFDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO：18：GFTFSSYA；
SEQ ID NO：19：IASSGYYT；
SEQ ID NO：20：AKDADSFDY；
SEQ ID NO：21：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASYLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAYSAPSTFGQGTKVEIKR；
SEQ ID NO：22：QSISSY；
SEQ ID NO：23：AAS；
SEQ ID NO：24：QQAYSAPST。
四、单克隆抗体的抗原特异性
在96孔酶标板内加入100μL，浓度各为1μg/mL的新冠病毒S蛋白、S-RBD蛋白及BSA蛋白溶液，4℃过夜，次日弃蛋白溶液，加入200μL 2%脱脂奶粉-PBS溶液，在25℃下孵育2小时，对酶标板进行封闭；用含有0.1%吐温20的PBS溶液洗涤酶标板3次后，每孔加入100μL稀释的噬菌体展示抗体溶液，25℃孵育1小时，用PBST溶液洗涤酶标板，加入HRP标记的小鼠抗M13抗体，孵育1小时后，用PBST洗板，加入HRP底物TMBZ（用pH6.0的乙酸钠溶液配制，含1/10000稀释的30%H2O2），显色后用酶标仪测450 nm的吸光度，绘制柱状图，比较各克隆的噬菌体抗体跟包被蛋白的结合性能。
单克隆抗体A6的酶联免疫吸附试验的结果如图2所示，A6与S蛋白结合，但是与S-RBD蛋白结合能力弱，说明A6主要与S蛋白RBD区以外的区域结合，单克隆抗体A4与包被的BSA不结合，说明抗体与S蛋白的结合具有特异性。
单克隆抗体A2的酶联免疫吸附试验的结果如图3所示，A2与S蛋白与S-RBD蛋白结合，为识别S蛋白RBD区的抗体，A2抗体与包被的BSA不结合，说明单克隆抗体A2与S蛋白的结合具有特异性。
单克隆抗体C3的酶联免疫吸附试验的结果如图4所示，C3与S蛋白与S-RBD蛋白结合，为识别S蛋白RBD区的抗体，C3抗体与包被的BSA不结合，说明单克隆抗体C3与S蛋白的结合具有特异性。
五、使用A2抗体Fab片段与噬菌体展示的A6抗体对新冠病毒S蛋白进行检测
检测原理如图5所示，利用A2蛋白及噬菌体展示的A6，对新冠病毒的S蛋白进行检测，在96孔微孔板的孔内包被A2抗体的Fab片段，封闭微孔板后，添加S蛋白或BSA蛋白，洗板后加入噬菌体展示A6抗体，之后加入标记辣根过氧化物酶的抗噬菌体抗体，洗板后加入底物显色，当样品中没有新冠病毒S蛋白或者包含BSA蛋白时，反应体系不显色，有病毒S蛋白时体系显色，且样品中的病毒S蛋白越多，则通过病毒S蛋白捕获到酶标板的A6噬菌体就越多，相应的捕获的抗噬菌体抗体也就越多，加入酶的底物显色后颜色越深，用此方法可以判断样品中是否含有病毒S1蛋白，该方法也可用于检测样品中是否存在SARS-CoV-2病毒。
具体操作如下：在96孔酶标板的孔内加入A2抗体Fab片段，4℃过夜，次日弃孔内液体，加入200μL 2%脱脂奶粉溶液，室温放置两个小时，对酶标板进行封闭。洗板后在微孔内加入100μL含有新冠病毒S蛋白的溶液或牛血清蛋白（BSA）溶液，25℃孵育1小时，去除孔内溶液，用含有0.1%吐温的PBS溶液（PBST溶液）洗涤酶标板，加入噬菌体展示的A6抗体溶液（109 cfu/mL），25℃孵育1小时，洗板后加入标记有辣根过氧化物酶（HRP）的抗噬菌体抗体溶液（1μg/mL），25℃孵育1小时，去除孔内溶液后用PBST洗板3次，最后加入HRP底物3,3,5,5-四甲基联苯胺盐酸盐（TMBZ）溶液显色，测定孔内溶液在450 nm和630nm处的吸收度，制作柱状图，比较抗体跟新冠病毒S蛋白及牛血清蛋白的结合能力。
如图6所示，A2抗体分别与噬菌体展示的A6组合检测病毒S蛋白的结果，横轴为检测蛋白的名称，纵轴为对应酶标孔内溶液的吸光度。A2与A6组合的溶液中含有病毒S蛋白的酶标板孔的吸光度为0.52，而添加BSA的孔的吸光度为0.04，说明A2与A6的组合可用于检测溶液中的新冠病毒S蛋白及新冠病毒。
六、使用C3抗体Fab片段与噬菌体展示的A6抗体对新冠病毒S蛋白进行检测
检测原理如图5所示，利用C3蛋白及噬菌体展示的 A4，对新冠病毒的S蛋白进行检测，在96孔微孔板的孔内包被C3抗体的Fab片段，封闭微孔板后，添加S蛋白或BSA蛋白，洗板后加入噬菌体展示A4抗体，之后加入标记辣根过氧化物酶的抗噬菌体抗体，洗板后加入底物显色，当样品中没有新冠病毒S蛋白或者为BSA蛋白时，反应体系不显色，有病毒S蛋白时体系显色，且样品中的病毒S蛋白越多，则通过病毒S蛋白捕获到酶标板的A4噬菌体就越多，相应的捕获的抗噬菌体抗体也就越多，加入酶的底物显色后颜色越深，用此方法可以判断样品中是否含有病毒S1蛋白，该方法也可用于检测样品中是否存在SARS-CoV-2病毒。
具体操作如下：在96孔酶标板的孔内加入C3抗体Fab片段，4℃过夜，次日弃孔内液体，加入200μL 2%脱脂奶粉溶液，室温放置两个小时，对酶标板进行封闭。洗板后在微孔内加入100μL含有新冠病毒S蛋白的溶液或牛血清蛋白（BSA）溶液，25℃孵育1小时，去除孔内溶液，用含有0.1%吐温的PBS溶液（PBST溶液）洗涤酶标板，加入噬菌体展示的A3抗体溶液（109 cfu/mL），25℃孵育1小时，洗板后加入标记有辣根过氧化物酶（HRP）的抗噬菌体抗体溶液（1μg/mL），25℃孵育1小时，去除孔内溶液后用PBST洗板3次，最后加入HRP底物3,3,5,5-四甲基联苯胺盐酸盐（TMBZ）溶液显色，测定孔内溶液在450 nm和630nm处的吸收度，制作柱状图，比较抗体跟新冠病毒S蛋白及牛血清蛋白的结合能力。
如图7所示，C3抗体分别与噬菌体展示的A4组合检测病毒S蛋白的结果，横轴为检测蛋白的名称，纵轴为对应酶标孔内溶液的吸光度。C3与A4组合的溶液中含有病毒S蛋白的酶标板孔的吸光度为0.59，而添加BSA的孔的吸光度为0.04，说明与A4的组合可用于检测溶液中的新冠病毒S蛋白及新冠病毒。
序列表
<110> 潍坊医学院
<120> 一种针对新冠病毒棘突蛋白非RBD 区的单克隆抗体及其应用
<130> 20200910A-2
<141> 2020-09-10
<150> 2020104148681
<151> 2020-05-15
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ser Tyr Ile Thr Thr Thr Gly Ser Asp Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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1
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Gln Gln Ala Tyr Ser Ala Pro Ser Thr
1 5

Claims (7)

1.一种针对新冠病毒棘突蛋白非RBD区的单克隆抗体，其特征在于：该单克隆抗体与新冠病毒棘突糖蛋白非RBD区特异性结合，包括重链可变区的互补性决定区CDRH1、CDRH2、CDRH3和轻链可变区的互补性决定区CDRL1、CDRL2、CDRL3；重链可变区的互补性决定区CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列依次为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；轻链可变区的互补性决定区CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列依次为SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。
2.根据权利要求1所述的一种针对新冠病毒棘突蛋白非RBD区的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：5。
3.一种分离的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子编码权利要求1~2中任一项所述的单克隆抗体。
4.一种包括权利要求3所述的核酸分子的表达载体。
5.一种包含权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的表达载体的宿主细胞。
6.一种非诊断目的的检测新冠病毒水平的方法，其特征在于：包括以下步骤：
①提取含有新冠病毒的样品；
②将步骤①得到的样品与权利要求1~2中任一项所述的单克隆抗体接触；
③检测样品与单克隆抗体的免疫反应。
7.权利要求1~2中任一项所述的针对新冠病毒棘突蛋白非RBD区的单克隆抗体在制备新冠病毒检测产品中的应用。
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