CN111961133A - 一种针对新冠病毒SARS-CoV-2棘突蛋白非RBD区的单克隆抗体及其应用 - Google Patents
一种针对新冠病毒SARS-CoV-2棘突蛋白非RBD区的单克隆抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种针对新冠病毒SARS‑CoV‑2棘突蛋白非RBD区的单克隆抗体及其应用，该单克隆抗体与新冠病毒SARS‑CoV‑2刺突糖蛋白RBD区特异性结合，包括重链可变区的互补性决定区CDRH1、CDRH2、CDRH3和轻链可变区的互补性决定区CDRL1、CDRL2、CDRL3；本发明的针对新冠病毒SARS‑CoV‑2棘突蛋白非RBD区的单克隆抗体，效价高、特异性强，可以高效表达，能与新冠病毒SARS‑CoV‑2表面的刺突蛋白RBD区以外的区域特异性结合，用于新冠病毒SARS‑CoV‑2的定性或定量检测，并且能够中和一定的新冠病毒毒性，减弱病毒毒性，起到预防或/和治疗新冠病毒肺炎的作用。
Description
技术领域
本发明涉及细胞免疫学、分子生物学技术领域，具体来说是一种针对新冠病毒SARS-CoV-2棘突蛋白非RBD区的单克隆抗体及其应用。
背景技术
新冠病毒SARS-CoV-2，属于冠状病毒科(Coronaviridae)，正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinae)的β冠状病毒属(Coronavirus)，与严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV)近缘，都会导致严重肺炎症状。人感染新冠病毒后常见的临床症状主要有发热、乏力，呼吸道症状以干咳为主，并逐渐呼吸困难，严重者急性呼吸窘迫症、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍等。
SARS-CoV-2病毒是一种单股正链RNA病毒，是已知基因组最大的RNA病毒之一，大约包含2.6～3.2万碱基，其基因组依次编码核蛋白(Nucleoprotein)、包膜蛋白(Envelopeprotein)、膜蛋白(Membrane protein)及棘突蛋白(Spike protein，又称S-protein或S蛋白)，其中棘突蛋白是其表面最重要的蛋白，其主要功能为决定病毒的宿主范围和特异性，与宿主细胞细胞膜受体结合并融合，实现对细胞的感染。棘突蛋白具有两个亚基S1和S2，S1中的受体结合区(Receptor binding domain，RBD)，与人类SARS-CoV受体血管紧张素转化酶II(ACE2)分子互作，而S2则含有膜融合过程所需要的基本元件，实现病毒与细胞的融合。因此S蛋白的人源单克隆抗体理论上可以阻断病毒跟细胞的结合，具有减弱病毒传染的能力，可以作为抗体药物用于治疗新冠病毒肺炎患者。
抗体是哺乳动物免疫系统中的一个重要糖蛋白分子。抗体分子由两条重链(Heavychain)和两条轻链(Light chain)组成，其中重链由分为可变区(Variable region ofheavy chain，VH)和三个恒定区(Constant region of heavy chain；CH1，CH2，CH3)，轻链则由一个可变区(VL)和一个恒定区(CL)组成。可变区具有跟抗原结合的功能，因抗体个体不同而不同，而抗体的恒定区则因抗体的种属及亚型不同而不同。抗体重链可变区包含三个互补决定区(Complementarity-determining regions；CDRH1，CDRH2，CDRH3)，轻链可变区也包含三个互补决定区，即CDRL1，CDRL2，和CDRL3，互补决定区又称为高变区，直接与抗原的表位结合。
目前针对新冠肺炎的治疗有多种方案，但并没有针对新冠病毒的特异性的治疗药物和疫苗上市，由于抗体药物在传染病、自身免疫等疾病的治疗上发挥了重要作用，也给我们研究针对病毒的抗体提供了理论支持，因此开发针对新冠病毒SARS-CoV-2棘突蛋白非RBD区的单克隆抗体具有非常重要的意义。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种针对新冠病毒SARS-CoV-2棘突蛋白非RBD区的单克隆抗体及其应用。
本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：
本发明公开了一种针对新冠病毒SARS-CoV-2棘突蛋白非RBD区的单克隆抗体，该单克隆抗体与新冠病毒SARS-CoV-2棘突糖蛋白非RBD区特异性结合，包括重链可变区的互补性决定区CDRH1、CDRH2、CDRH3和轻链可变区的互补性决定区CDRL1、CDRL2、CDRL3；重链可变区的互补性决定区CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列依次为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；轻链可变区的互补性决定区CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列依次为SEQID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。
优选的，一种针对新冠病毒SARS-CoV-2棘突蛋白非RBD区的单克隆抗体，命名为A3，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：5。
本发明还包括一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码上述任一项所述的单克隆抗体。
本发明还包括一种包含上述核酸分子的表达载体，除了前面所述的核酸分子之外，表达载体还包括与所述核酸分子序列操作性相连的表达调控序列。
表达载体是指可将编码A3抗体的多聚核苷酸插入其中并使A3抗体得到表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。载体的种类包括本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。原则上，只要能在宿主体内复制和稳定，任何载体都可以用。在表达载体中，除了含有复制起点外，还可含有标记基因和其他翻译控制元件。
本发明还包括一种包含上述核酸分子或上述表达载体的宿主细胞。
表达A3抗体的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞：真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO，COS，293细胞或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
本发明还包括一种非诊断目的的检测新冠病毒SARS-CoV-2水平的方法，包括以下步骤：
①提取含有新冠病毒SARS-CoV-2的样品；
②将步骤①得到的样品与上述的单克隆抗体A3接触；
③检测样品与单克隆抗体的免疫反应。
本发明还包括上述任一项所述的针对新冠病毒SARS-CoV-2棘突蛋白非RBD区的单克隆抗体在制备新冠病毒SARS-CoV-2检测产品中的应用。
所述检测产品包括但不限于检测试剂、试剂盒、芯片或试纸。凡是包括前面所述结合分子的能够检测出SARS-CoV-2的检测产品均包括在本发明的范围之内。
本发明还包括上述任一项所述的针对新冠病毒SARS-CoV-2棘突蛋白非RBD区的单克隆抗体在制备抑制新冠病毒SARS-CoV-2药物中的应用。
本发明还包括上述任一项所述的针对新冠病毒SARS-CoV-2棘突蛋白非RBD区的单克隆抗体在制备预防或治疗由新冠病毒SARS-CoV-2引起的肺炎药物制剂中的应用。
本发明所用的术语“新冠病毒SARS-CoV-2”与“SARS-CoV-2病毒”、“新冠病毒”“SARS-CoV-2”“新型冠状病毒SARS-CoV-2”可以互换使用。
本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明的针对新冠病毒SARS-CoV-2棘突蛋白非RBD区的单克隆抗体，效价高、特异性强，可以高效表达，能与新冠病毒SARS-CoV-2表面的棘突蛋白RBD区以外的区域特异性结合，用于新冠病毒SARS-CoV-2的定性或定量检测，并且能够中和一定的新冠病毒毒性，减弱病毒毒性，起到预防或/和治疗新冠病毒的作用。
本发明的噬菌体展示技术把外源DNA插入噬菌体编码外壳蛋白的基因中，使外源DNA片断对应的表达产物融合在噬菌体的外壳蛋白中形成融合蛋白，呈现在噬菌体表面。具有如下显著的优点：建立了基因型和表型之间直接的物理联系，从而使筛选简便高效。本发明从Tomlinson I+J噬菌体展示合成抗体库中筛选到了能够跟新冠病毒SARS-CoV-2的S蛋白结合的抗体，这些抗体在新冠病毒的检测及减弱病毒毒性方面具有重要的应用价值。
附图说明
图1为淘筛抗体库所得噬菌体的抗原结合性能的酶联免疫分析结果；
图2为单克隆抗体A3抗原特异性的酶联免疫试验结果；
图3为单克隆抗体A2抗原特异性的酶联免疫试验结果；
图4为利用淘筛的抗体检测新冠病毒原理示意图；
图5为利用A2抗体的Fab片段与A3组合检测病毒S蛋白的酶联免疫吸附试验结果；
图6为利用A2抗体的Fab片段与A3组合检测病毒S蛋白的酶联免疫吸附试验的标准曲线图。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种针对新冠病毒SARS-CoV-2棘突蛋白非RBD区的单克隆抗体及其应用，通过以下实施例进一步说明本发明，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制，根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
以下结合具体实施例来对本发明作进一步的描述。
实施例1
一、噬菌体展示抗体文库的扩增：
将500μL含有Tomlinson I+J噬菌体展示抗体库的大肠杆菌TG-1(英国MRC HGMP资源中心)接种到25mL含有100μg/mL氨苄青霉素及1％葡萄糖的2YT培养基(1.6％Tryptone，1％Yeast Extract，0.5％NaCl)中，37℃培养至OD600为0.4，加入109cfu(Colony FormationUnit)KM13辅助噬菌体(英国MRC HGMP资源中心)，37℃感染1小时后，3000g离心30分钟，弃上清，使用含有100μg/mL氨苄青霉素、50μg/ml卡那霉素及0.1％葡萄糖的2YT培养基50mL(1.6％Tryptone，1％Yeast Extract，0.5％NaCl)悬浮菌体，30℃，250rpm的速度摇菌16小时，次日5000g，30分钟离心培养液，分离回收上清40mL，在上清液中加入10mL的PEG/NaCl溶液，混合均匀后在冰上放置30分钟，5000g、30分钟离心，弃上清，加入2mL的灭菌PBS溶液将沉淀溶解，作为噬菌体展示抗体库溶液，利用大肠杆菌对噬菌体展示抗体库进行滴定，所制备抗体库的浓度为1012cfu/mL。
二、噬菌体展示抗体文库的淘筛
在96孔微孔板的10个孔内各加入100μL的含有10μg/mLSARS-CoV-2病毒S蛋白(南京金斯瑞生物科技有限公司)的PBS溶液，4℃过夜孵育，次日弃抗原溶液，每孔加入200μL含有2％脱脂奶粉的PBS溶液，25℃孵育2小时进行封闭，用PBST洗涤3次后，每孔加入100μL的噬菌体溶液(R0；每孔含有109cfu的噬菌体)，室温下孵育2小时，用PBST洗涤后，每孔加入100μL的胰蛋白酶将结合到病毒S蛋白的噬菌体洗脱。
培养TG-1大肠杆菌至OD600为0.4，取4mL菌液，将500μL溶出的噬菌体溶液加入到菌液中，37℃感染30分钟，5000g离心20分钟，弃上清，用含有100μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL卡那霉素及0.1％葡萄糖的2YT培养基悬浮菌体，30℃，250rpm摇菌16小时；次日以5000g、30分钟离心培养液，分离回收上清，在上清溶液中加入1/5容积的PEG/NaCl溶液，混合均匀后在冰上放置30分钟，5000g、30分钟离心，弃上清，加入200μL的灭菌PBS溶液，作为第一次富集后的噬菌体溶液(R1)；重复以上步骤，分别获得噬菌体溶液R2和R3；执行酶联免疫吸附试验，验证淘筛过程中获得的噬菌体展示抗体库跟S蛋白的结合特异性及结合性能。
酶联免疫吸附试验的操作如下：在96孔酶标板内加入100μL含有新冠病毒S蛋白溶液(2μg/mL)或牛血清白蛋白BSA(2μg/mL)的PBS溶液，4℃过夜，次日弃抗原溶液，加入200μL含有2％脱脂奶粉的溶液，在25℃下孵育2小时，对酶标板进行封闭。用含有0.1％吐温20的PBS溶液洗涤酶标板3次，加入稀释后的R0、R2及R3噬菌体溶液(109cfu/well)，25℃孵育1小时，用PBST溶液洗涤酶标板，加入HRP标记的小鼠抗M13抗体，孵育1小时后，用PBST洗板，加入HRP底物TMBZ(用pH6.0的乙酸钠溶液配制，含1/10000稀释的30％H2O2)，显色后用酶标仪测在450nm处的吸光度，绘制柱状图，比较各轮获得的噬菌体抗体跟S蛋白及BSA的结合性能。
酶联免疫吸附试验的结果如图1所示，比较噬菌体淘筛过程中获得的噬菌体库R0、R2及R3跟S蛋白的结合能力时发现，第二轮淘筛时所得噬菌体溶液R2与S蛋白的结合能力显著增加，而对BSA的结合性能非常微弱且没有变化，说明构建的噬菌体展示抗体库中抗新冠病毒S蛋白的抗体得以富集。
三、单克隆抗体筛选
培养TG-1大肠杆菌至OD600为0.4，取100μL淘筛R2噬菌体抗体库溶出的噬菌体溶液，用于感染200μL的大肠杆菌菌液，37℃孵育30分钟后，将菌液涂布到含有100μg/mL氨卞青霉素、50μg/mL卡那霉素及1％葡萄糖的2YT培养基平板上，37℃过夜培养；次日挑96个菌落接种到96孔的培养板上，37℃培养至OD600为0.4，每个孔内加入M13噬菌体，感染后以5000g离心20分钟，去除上清，每孔加入200μL含有100μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL卡那霉素及0.1％葡萄糖的2YT培养基，悬浮菌体，30℃下以250rpm的速度培养16小时；次日以5000g离心培养液30分钟，分离回收上清，执行酶联免疫吸附试验，验证各单克隆抗体跟S蛋白的结合特异性及结合性能。
酶联免疫吸附试验的操作如下：在96孔酶标板内加入100μL含有病毒S蛋白(1μg/mL)的PBS溶液，4℃过夜，次日弃抗原溶液，加入200μL含有2％脱脂奶粉的PBS溶液，在25℃下孵育2小时，对酶标板进行封闭。用含有0.1％吐温20的PBS溶液洗涤酶标板3次，加入噬菌体溶液，25℃孵育1小时，用PBST溶液洗涤酶标板，加入HRP标记的小鼠抗M13抗体，孵育1小时后，用PBST洗板，加入HRP底物TMBZ(用pH6.0的乙酸钠溶液配制，含1/10000稀释的30％H2O2)，显色后用酶标仪检测450nm和630nm的吸光度，绘制柱状图，比较利用各克隆制作的噬菌体抗体跟S蛋白及牛血清蛋白的结合性能。
根据实验结果，有6个包被了S蛋白的微孔颜色较深，其吸光度分别为1.40，1.30，1.35，1.05，1.10和0.80，培养这些微孔对应的细菌，并对吸光度1.30的微孔内的抗体抽取质粒并进行基因测序，抗体根据其在微孔板的位置(A行3列)命名为单克隆抗体A3，对吸光度1.40的微孔内的抗体抽取质粒并进行基因测序，抗体根据其在微孔板的位置(A行2列)命名为单克隆抗体A2，通过与抗体基因库中登录抗体序列进行比对，没有发现与本发明所述抗体基因相同的序列，因此这些抗体为新型抗体。抗体的氨基酸序列详细情况如下所述。
A3抗体重链可变区序列为SEQ ID NO：1，CDRH1序列为SEQ ID NO：2；CDRH2序列为SEQ ID NO：3；CDRH3序列为SEQ ID NO：4；
A3抗体轻链可变区序列为SEQ ID NO：5，CDRL1序列为SEQ ID NO：6；CDRL2序列为SEQ ID NO：7；CDRL3序列为SEQ ID NO：8。
A2抗体重链可变区序列为SEQ ID NO：9，CDRH1序列为SEQ ID NO：10；CDRH2序列为SEQ ID NO：11；CDRH3序列为SEQ ID NO：12；
A2抗体轻链可变区序列为SEQ ID NO：13，CDRL1序列为SEQ ID NO：14；CDRL2序列为SEQ ID NO：15；CDRL3序列为SEQ ID NO：16。
本发明A3涉及的序列具体信息如下：
SEQ ID NO：1：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSYITDDGANTSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYATFDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO：2：
GFTFSSYA；
SEQ ID NO：3：
ITDDGANT；
SEQ ID NO：4：
AKSYATFDY；
SEQ ID NO：5：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYNASGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAAYYPTTFGQGTKVEIKR；
SEQ ID NO：6：
QSISSY；
SEQ ID NO：7：
NAS；
SEQ ID NO：8：
QQAAYYPTT。
A2涉及的的序列具体信息如下：
SEQ ID NO：9：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIDASGYYTSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDAYTFDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO：10：
GFTFSSYA；
SEQ ID NO：11：
IDASGYYT；
SEQ ID NO：12：
AKDAYTFDY；
SEQ ID NO：13：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYSASYLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQASADPDTFGQGTKVEIKR；
SEQ ID NO：14：
QSISSY；
SEQ ID NO：15：
SAS；
SEQ ID NO：16：
QQASADPDT。
四、单克隆抗体的抗原特异性
在96孔酶标板内加入100μL浓度各为1μg/mL的新冠病毒S蛋白，S-RBD蛋白及BSA蛋白溶液，4℃过夜，次日弃蛋白溶液，加入200μL 2％脱脂奶粉-PBS溶液，在25℃下孵育2小时，对酶标板进行封闭；用含有0.1％吐温20的PBS溶液洗涤酶标板3次后，每孔加入100μL稀释的噬菌体展示抗体溶液，25℃孵育1小时，用PBST溶液洗涤酶标板，加入HRP标记的小鼠抗M13抗体，孵育1小时后，用PBST洗板，加入HRP底物TMBZ(用pH6.0的乙酸钠溶液配制，含1/10000稀释的30％H2O2)，显色后用酶标仪测450nm的吸光度，绘制柱状图，比较各克隆的噬菌体抗体与包被蛋白的结合性能。
单克隆抗体A3酶联免疫吸附试验结果如图2所示，A3可以与S蛋白结合，但是与S-RBD蛋白结合能力弱，说明A3主要与S蛋白RBD区以外的区域结合，单克隆抗体A3与包被的BSA不结合，说明抗体与S蛋白的结合具有特异性。
单克隆抗体A2的酶联免疫吸附试验的结果如图3所示，A2与S蛋白与S-RBD蛋白都结合，为识别S蛋白RBD区的抗体，A2抗体与包被的BSA不结合，说明单克隆抗体A2与S蛋白的结合具有特异性。
五、使用A2抗体Fab片段与噬菌体展示的A3抗体对新冠病毒S蛋白进行检测
检测原理如图4所示，利用A2蛋白及噬菌体展示的单克隆抗体A3，对新冠病毒的S蛋白进行检测，在96孔微孔板的孔内包被A2抗体的Fab片段(将A2抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因克隆到pDong1噬菌体展示载体，转化大肠杆菌HB2151，将转化后的大肠杆菌培养后取上清液，利用组氨酸标签进行纯化得到A2抗体的Fab片段)，封闭微孔板后，添加S蛋白或BSA蛋白，洗板后加入噬菌体展示A3抗体，之后加入标记辣根过氧化物酶的抗噬菌体抗体，洗板后加入底物显色，当样品没有新冠病毒S蛋白或为BSA蛋白时，反应体系不显色，有病毒S蛋白时体系显色，且样品中的病毒S蛋白越多，则通过病毒S蛋白捕获到酶标板的A3噬菌体就越多，相应的捕获的抗噬菌体抗体也就越多，加入酶的底物显色后颜色越深，用此方法可以判断样品中是否含有病毒S1蛋白，该方法可以用于检测样品中存在的SARS-CoV-2病毒，并可用于SARS-CoV-2病毒的定量检测。
具体操作如下：在96孔酶标板的孔内加入A2抗体Fab片段，4℃过夜，次日弃孔内液体，加入200μL 2％脱脂奶粉溶液，室温放置两个小时，对酶标板进行封闭。洗板后在微孔内加入100μL含有新冠病毒S蛋白的溶液或牛血清蛋白(BSA)溶液，25℃孵育1小时，去除孔内溶液，用含有0.1％吐温的PBS溶液(PBST溶液)洗涤酶标板，加入噬菌体展示的A3抗体溶液(109cfu/mL)，25℃孵育1小时，洗板后加入标记有辣根过氧化物酶(HRP)的抗噬菌体抗体溶液(1μg/mL)，25℃孵育1小时，去除孔内溶液后用PBST洗板3次，最后加入HRP底物3，3，5，5-四甲基联苯胺盐酸盐(TMBZ)溶液显色，测定孔内溶液在450nm和630nm处的吸收度，制作柱状图，比较抗体跟新冠病毒S蛋白及牛血清蛋白的结合能力。
如图5所示，A2抗体与噬菌体展示的A3组合检测病毒S蛋白的结果，横轴为检测蛋白的名称，纵轴为对应酶标孔内溶液的吸光度。A2与A3组合的溶液中含有病毒S蛋白的酶标孔板的吸光度为0.46，而添加BSA的孔的吸光度为0.04，说明A2与A3的组合可用于定性检测溶液中的新冠病毒S蛋白。
六、基于A2和A3抗体的新冠病毒S蛋白定量检测
基于A2 Fab抗体片段与噬菌体展示A3抗体，利用图4所示方法对新冠病毒S蛋白进行了定量检测。在96孔微孔板的孔内包被A2 Fab抗体片段，封闭微孔板后，添加灭活的新冠病毒S蛋白，洗板后加入噬菌体展示A3抗体，之后加入标记辣根过氧化物酶的抗噬菌体抗体，洗板后加入底物显色。当样品中没有病毒蛋白时，反应体系不显色；有病毒蛋白时体系显色且样品中的病毒蛋白越多，则通过病毒捕获到酶标板的A3噬菌体就越多，相应的捕获的抗噬菌体抗体也就越多，加入酶的底物显色后颜色越深。通过绘制病毒浓度与吸光度的标准曲线，可以测定溶液中病毒的含量。
具体操作如下：在96孔酶标板的孔内加入A2 Fab抗体片段，4℃过夜，次日弃孔内液体，加入200μL 2％脱脂奶粉-PBS溶液，室温放置两个小时，对酶标板进行封闭。洗板后在微孔内加入100μL含有不同浓度(0、1.2、6、30、1500ng/mL)新冠病毒S蛋白溶液或牛血清蛋白(BSA)溶液，25℃孵育1小时，去除孔内溶液，用含有0.1％吐温20的PBS溶液(PBST溶液)洗涤酶标板，加入噬菌体展示的A3抗体溶液，25℃孵育1小时，洗板后加入标记有辣根过氧化酶(HRP)的抗噬菌体抗体溶液(1μg/mL)，25℃孵育1小时，去除孔内溶液后用PBST洗板3次，最后加入HRP底物3，3，5，5-四甲基联苯胺盐酸盐(TMBZ)溶液显色，测定孔内溶液在450nm和630nm处的吸收度，制作标准曲线。
结果如图6所示。横轴代表新冠病毒S蛋白或BSA溶液的浓度，病毒溶液浓度由0到1500ng/mL，纵轴为每个浓度对应酶标孔内溶液的吸光度。随着溶液中病毒浓度的逐渐增加，溶液的吸光度也逐渐增加，呈线性对应关系，而作为阴性对照添加BSA的孔内，其吸光度没有因为BSA浓度的增加而变化，说明A2，A3抗体具有病毒S蛋白特异性，可根据此曲线来测定样品中新冠病毒S蛋白的含量，即本申请的抗体可用于检测新冠病毒S蛋白及新冠病毒颗粒在样品中的含量，使用该方法能够检测到的新冠病毒S蛋白的最低浓度为10ng/mL。
序列表
<110> 潍坊医学院
<120> 一种针对新冠病毒SARS-CoV-2 棘突蛋白非RBD 区的单克隆抗体及其应用
<130> 20200904A-3
<141> 2020-09-04
<150> 2020104148681
<151> 2020-05-15
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Thr Asp Asp Gly Ala Asn Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Tyr Ala Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ala Lys Ser Tyr Ala Thr Phe Asp Tyr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Ala Ser Gly Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Ala Tyr Tyr Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
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<400> 6
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1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Asn Ala Ser
1
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Gln Gln Ala Ala Tyr Tyr Pro Thr Thr
1 5
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Gly Ile Asp Ala Ser Gly Tyr Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Lys Asp Ala Tyr Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
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Thr Val Ser Ser
115
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Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Gln Gln Ala Ser Ala Asp Pro Asp Thr
1 5
Claims (9)
1.一种针对新冠病毒SARS-CoV-2棘突蛋白非RBD区的单克隆抗体，其特征在于：该单克隆抗体与新冠病毒SARS-CoV-2棘突糖蛋白非RBD区特异性结合，包括重链可变区的互补性决定区CDRH1、CDRH2、CDRH3和轻链可变区的互补性决定区CDRL1、CDRL2、CDRL3；重链可变区的互补性决定区CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列依次为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQID NO：4；轻链可变区的互补性决定区CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列依次为SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。
2.根据权利要求1所述的一种针对新冠病毒SARS-CoV-2棘突蛋白非RBD区的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：5。
3.一种分离的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子编码权利要求1～2中任一项所述的单克隆抗体。
4.一种包含权利要求3所述的核酸分子的表达载体。
5.一种包含权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的表达载体的宿主细胞。
6.一种非诊断目的的检测新冠病毒SARS-CoV-2水平的方法，其特征在于：包括以下步骤：
①提取含有新冠病毒SARS-CoV-2的样品；
②将步骤①得到的样品与权利要求1～2中任一项所述的单克隆抗体接触；
③检测样品与单克隆抗体的免疫反应。
7.权利要求1～2中任一项所述的针对新冠病毒SARS-CoV-2棘突蛋白非RBD区的单克隆抗体在制备新冠病毒SARS-CoV-2检测产品中的应用。
8.权利要求1～2中任一项所述的针对新冠病毒SARS-CoV-2棘突蛋白非RBD区的单克隆抗体在制备抑制新冠病毒SARS-CoV-2药物中的应用。
9.权利要求1～2中任一项所述的针对新冠病毒SARS-CoV-2棘突蛋白非RBD区的单克隆抗体在制备预防或治疗由新冠病毒SARS-CoV-2引起的肺炎药物制剂中的应用。
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