CN117551191A - 针对SARS-CoV-2的单克隆抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了针对SARS‑CoV‑2的单克隆抗体,本发明提供的单克隆抗体对SARS‑CoV‑2病毒具有中和抑制作用,不仅有开发用于SARS‑CoV‑2的诊断试剂盒的价值,还有开发预防或治疗SARS‑CoV‑2相关疾病的药物的潜在价值,应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体涉及针对SARS-CoV-2的单克隆抗体。
背景技术
COVID-19传播迅速,人感染了SARS-CoV-2,亦无特效药用于临床,主要以对症治疗为主。而作为疫苗和化学治疗的补充,由抗体介导的预防和治疗病毒感染的措施已显现良好的效果,其应用前景得到专家的认同。
因此,制备针对SARS-CoV-2的抗体,是本领域亟需解决的问题。
发明内容
为弥补现有技术的不足,本发明提供了针对SARS-CoV-2的单克隆抗体。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
本发明的第一方面提供了针对SARS-CoV-2的单克隆抗体,所述单克隆抗体包括重链可变区互补决定区VH CDR和轻链可变区互补决定区VL CDR,
其中,VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列分别具有与SEQ ID NO:1、2、3所示的氨基酸序列至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同性,
VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列分别具有与SEQ ID NO:9、10、11所示的氨基酸序列至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同性。
进一步,VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、2、3所示,
VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:9、10、11所示。
进一步,所述单克隆抗体还包括重链可变区框架区VH FR和轻链可变区框架区VLFR,
其中,VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4的氨基酸序列分别具有与SEQ ID NO:4、5、6、7所示的氨基酸序列至少90%、至少92%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同性,
VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4的氨基酸序列分别具有与SEQ ID NO:12、13、14、15所示的氨基酸序列至少90%、至少92%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同性。
进一步,VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、5、6、7所示,
VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:12、13、14、15所示。
进一步,所述单克隆抗体的重链可变区VH的氨基酸序列具有与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同性,
轻链可变区VL的氨基酸序列具有与SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同性。
进一步,所述单克隆抗体的重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示,轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
进一步,所述单克隆抗体连接可检测标签。
进一步,所述检测标签包括荧光标签、酶底物标签、放射性同位素。
进一步,所述CDR是根据Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact编号系统定义的。
进一步,所述CDR是根据IMGT编号系统定义的。
进一步,所述单克隆抗体是无岩藻糖基化的。
进一步,所述SARS-CoV-2包括SARS-CoV-2-S蛋白、SARS-CoV-2-N蛋白、SARS-CoV-2-M蛋白、SARS-CoV-2-E蛋白。
进一步,所述SARS-CoV-2选自SARS-CoV-2-S蛋白。
本发明的第二方面提供了如下任一种产品:
(1)分离的核酸分子,所述核酸分子编码本发明第一方面所述的单克隆抗体;
(2)包括(1)中所述的分离的核酸分子的载体;
(3)包括(1)中所述的分离的核酸分子或(2)中所述的载体的宿主细胞;
(4)检测SARS-CoV-2的产品,所述产品包括本发明第一方面所述的单克隆抗体;
(5)药物组合物,所述药物组合物包括本发明第一方面所述的单克隆抗体、(1)中所述的分离的核酸分子、(2)中所述的载体、(3)中所述的宿主细胞。
进一步,(1)中编码VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3的核酸分子的核苷酸序列分别具有与SEQ ID NO:17、18、19所示的核苷酸序列至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同性,
编码VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3的核酸分子的核苷酸序列分别具有与SEQ ID NO:25、26、27所示的核苷酸序列至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同性。
进一步,(1)中编码VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3的核酸分子的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:17、18、19所示,
编码VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3的核酸分子的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:25、26、27所示。
进一步,(1)中编码VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4的核酸分子的核苷酸序列分别具有与SEQ ID NO:20、21、22、23所示的核苷酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同性,
编码VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4的核酸分子的核苷酸序列分别具有与SEQID NO:28、29、30、31所示的核苷酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同性。
进一步,编码VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4的核酸分子的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:20、21、22、23所示,
编码VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4的核酸分子的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:28、29、30、31所示。
进一步,编码重链可变区的核酸分子的核苷酸序列分别具有与SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同性,
编码轻链可变区的核酸分子的核苷酸序列分别具有与SEQ ID NO:32所示的核苷酸序列至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同性。
进一步,编码重链可变区的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示,编码轻链可变区的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:32所示。
进一步,(2)中所述的载体包括病毒载体、质粒、噬菌体。
进一步,(3)中所述的宿主细胞包括原核细胞、真核细胞。
进一步,(6)中所述的药物组合物还包括药学上可接受的载体。
本发明的第三方面提供了一种制备本发明第一方面所述的单克隆抗体的方法,所述方法包括培养本发明第二方面中(3)所述的宿主细胞,回收抗体。
本发明的第四方面提供了一种检测SARS-CoV-2在样品中的存在或其量的方法,所述方法包括:
(1)将所述样品与本发明第一方面所述的单克隆抗体接触;
(2)检测所述单克隆抗体与SARS-CoV-2之间复合物的形成或检测所述复合物的量。
进一步,所述方法为非诊断目的的方法。
本发明的第五方面提供了本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的产品在检测SARS-CoV-2或制备检测SARS-CoV-2的产品中的应用。
本发明的第六方面提供了本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的产品在制备预防/治疗SARS-CoV-2相关疾病的产品中的应用。
进一步,SARS-CoV-2相关疾病包括呼吸道传染疾病。
本发明的优点和有益效果:
本发明提供的单克隆抗体对SARS-CoV-2病毒具有中和抑制作用,不仅有开发用于SARS-CoV-2的诊断试剂盒的价值,还有开发预防或治疗SARS-CoV-2相关疾病的药物的潜在价值,应用前景广阔。
附图说明
图1是微量中和实验结果图。
具体实施方式
下文提供了本说明书中使用的一些术语的定义。除非另有说明,本文中使用的所有技术和科学用语通常具有和本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同的意思。
本发明提供了针对SARS-CoV-2的单克隆抗体,所述单克隆抗体包括重链可变区互补决定区VH CDR和轻链可变区互补决定区VL CDR。
在本发明中,天然的完整抗体包括两个重(H)链和两个轻(L)链。哺乳动物的重链分为α、δ、ε、γ和μ,每个重链由一个可变区(VH)和一个第一、第二、第三和任选的第四恒定区(分别为CH1、CH2、CH3、CH4)组成;哺乳动物的轻链分为λ或κ,而每个轻链由一个可变区(VL)和一个恒定区组成。该抗体呈Y形,Y的茎部由两条重链的第二和第三恒定区组成,通过二硫键结合在一起。Y的每个臂包括与单个轻链的可变区和恒定区结合的单个重链的可变区和第一恒定区。轻链和重链的可变区负责与抗原结合。两条链的可变区一般包含三个高度可变的环,其被称为互补性决定区(CDRs)(轻链CDR包括LCDR1、LCDR2和LCDR3,重链CDR包括HCDR1、HCDR2、HCDR3)。
在本发明中,单克隆抗体的CDR的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义,例如可按照Kabat编号系统(Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.,1991)、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917;Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)、AbM、Contact或IMGT编号系统(Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的抗体,本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且,不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如,可参见Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)。
本发明的单克隆抗体含有的CDR可根据本领域已知的各种编号系统确定。在本发明的具体实施方案中,本发明的单克隆抗体含有的CDR通过IMGT编号系统确定。
所述单克隆抗体连接检测标签。
在本发明中,可检测标签的例子包括但不限于荧光标签(如荧光素、罗丹明、丹宁、藻红素或德克萨斯红)、酶底物标签(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、葡聚糖酶、溶菌酶、糖氧化酶或-D-半乳糖苷酶)、放射性同位素(如123I、124I、125I、131I、35S、3H、111In、112In、14C、64Cu、67Cu、86Y、88Y、90Y、177Lu、211At、186Re、188Re、153Sm、212Bi和32P,其他镧系元素)、发光标签、色素基团、地高辛、生物素/阿维丁、DNA分子或黄金进行检测。
所述单克隆抗体是无岩藻糖基化的。
在本发明中,无岩藻糖基化抗体指在Fc区中在Asn297处具有改变的糖基化样式且具有降低的岩藻糖残基水平的IgG1或IgG3同种型的抗体。在Asn297处发生人IgG1或IgG3的糖基化,作为以多至两个Gal残基为末端的核心岩藻糖化双触角复合寡糖糖基化。根据末端Gal残基的量,这些结构称为G0、G1(α1,6或α1,3)或G2聚糖残基(Raju,T.S.,BioProcessInt.1(2003)44-53)。抗体Fc部分的CHO型糖基化例如由Routier,F.H.,GlycoconjugateJ.14(1997)201-207描述。应当理解,如本发明中所使用的,术语无岩藻糖基化抗体包括在其糖基化样式中没有岩藻糖的抗体。通常已知的是,抗体中典型的糖基化残基位置是依照EU编号系统的第297位的天冬酰胺(Asn297)。EU编号系统或EU索引一般在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用(例如Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991)中报告的EU索引,通过提及而将其明确收入本发明)。
本发明提供了如下任一种产品:
(1)分离的核酸分子,所述核酸分子编码上述单克隆抗体;
(2)包括(1)中所述的分离的核酸分子的载体;
(3)包括(1)中所述的分离的核酸分子或(2)中所述的载体的宿主细胞;
(4)检测SARS-CoV-2的产品,所述产品包括上述单克隆抗体;
(5)药物组合物,所述药物组合物包括上述单克隆抗体、(1)中所述的分离的核酸分子、(2)中所述的载体、(3)中所述的宿主细胞。
在本发明中,载体的例子包括但不限于病毒载体(逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头病毒(如SV40))、噬菌体(如λ噬菌体和M13噬菌体)、质粒pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-Seu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pCMV-SCRIPT.RTM、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR 2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等等。
在本发明中,宿主细胞实际上可以是表达载体可用的任何细胞。包括原核细胞、真核细胞,所述原核细胞包括但不限于真细菌,如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体,例如肠内菌科(Enterobacteriaceae),如埃希氏菌属(Escherichia),例如大肠杆菌;肠杆菌属(Enterobacter);欧文氏菌属(Erwinia);克雷伯氏菌属(Klebsiella);变形杆菌属(Proteus);沙门氏菌属(Salmonella),例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium);沙雷氏菌属(Serratia),例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans);和志贺杆菌属(Shigella),以及芽孢杆菌属(Bacilli),如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis);假单胞菌属(Pseudomonas),如绿脓杆菌(P.aeruginosa);和链霉菌属(Streptomyces)。
真核细胞包括但不限于原生生物细胞、动物细胞、植物细胞或真菌细胞,所述动物细胞包括哺乳动物细胞、鸟类细胞、昆虫细胞;其中,哺乳动物细胞包括但不限于中国仓鼠卵巢细胞、SP2/0细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、癌细胞。
所述的药物组合物还包括药学上可接受的载体。
在本发明中,药学上可接受的载体通常将是任何类型的无毒的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、封装材料或制剂助剂。
在本发明中,药学上可接受的载体是指与治疗剂一起施用的稀释剂、辅助剂、辅料或赋形剂。这样的载体可以是无菌液体,比如水和油,包括石油、动物、植物或合成来源的那些,比如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物静脉内给药时,水是优选的载体。盐溶液以及葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体载体,特别是用于注射溶液。合适的药物辅料包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要,该组合物还可以含有少量的湿润剂或乳化剂,或pH缓冲剂,比如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐。还设想了抗菌剂,比如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯;抗氧化剂,比如抗坏血酸或亚硫酸氢钠;螯合剂,比如乙二胺四乙酸;以及用于调节张度(tonicity)的试剂,比如氯化钠或右旋糖(dextrose)。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释制剂等形式。该组合物可以与传统的粘合剂和载体(例如甘油三酯)一起配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体,比如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例在E.W.Martin的《Remington'sPharmaceutical Sciences》中描述,其通过引用并入本发明。这样的组合物将包含治疗有效量的抗原结合多肽,优选地以纯化形式,与适量的载体一起,以提供用于向患者适当施用的形式。该制剂应适合于给药方式。可以将肠胃外制剂封装在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
本发明提供了上述单克隆抗体、上述产品在制备预防/治疗SARS-CoV-2相关疾病的产品中的应用。
在本发明中,SARS-CoV-2相关疾病包括但不限于呼吸道传染病,SARS-CoV-2相关疾病的症状包括发烧、干咳、呼吸困难、疲劳、身体疼痛、头痛、味觉或嗅觉的新丧失、喉咙痛、鼻塞或流鼻涕、恶心或呕吐、腹泻、胸部持续压迫或疼痛、新的意识模糊、无法醒来或保持清醒以及嘴唇或面部发青。
下面结合具体实施例进一步阐述此发明。应理解的是,在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示,并不作为对本发明的限制。在不偏离本发明范围的情况下,本发明的主要特征可以用于各种实施方式。
实施例
1病毒培养(所有操作均在BSL-3实验室中进行)
BetaCoV/JS03/human/2020毒株为专利申请者于2020年在一名江苏病人急性期外周血中分离获得。该病毒接种Vero E6细胞后,于37℃、5%CO2的条件下培养5天,收集上清液并测定50%组织感染量(50%tissue culture infective dose,TCID50)。
2重组S蛋白,商业购买
3ScFv人源抗体文库构建和抗SARS-CoV-2-S蛋白单链抗体的筛选
3.1材料
引物:根据《Phage Display》一书设计家族特异性轻链(Vκ和Vλ)、IgG重链(VH)和overlap-PCR引物(表1),其中Vκ12对、Vλ24对、VH 6对、overlap-PCR 1对。
表1构建人源性单链抗体文库的引物
3.2方法
3.2.1外周血淋巴细胞的分离及总RNA提取
将2名COVID-19患者恢复期外周血分别与等量的生理盐水混合后按照淋巴细胞分离液说明书吸取单个核细胞,生理盐水洗涤三次后参照总RNA抽提试剂盒说明抽提RNA。
3.2.2抗体可变区基因的PCR扩增
将抽提的2份总RNA混合后反转录出cDNA第一链,反转录条件如下:55℃30min,85℃5min,4℃30min。再以cDNA为模板PCR扩增人源性抗体Vκ、Vλ和VH基因,PCR反应条件为:94℃预变性10min,然后94℃20s,57℃45s,72℃1min,25个循环,最后72℃延伸20min,凝胶电泳并切胶纯化回收。
3.2.3ScFv基因的拼接
将纯化的Vκ基因片段与Vλ基因片段等摩尔混合后再与VH基因片段等量混合,利用overlap-PCR拼接scFv基因,overlap-PCR反应条件为:94℃预变性10min,然后94℃20s,57℃45s,72℃1min,25个循环,最后72℃延伸20min,凝胶电泳并切胶纯化回收。
3.2.4噬菌体单链抗体文库的构建及质量鉴定
纯化后的scFv基因与pComb3XSS质粒分别经sfiI酶切,连接胶纯化回收后的目的片段,转入感受态大肠杆菌XL1-Blue,加入20mL 2YT培养液中37℃培养45min后离心,沉淀涂于2YT平板30℃过夜培养。次日将平板上生长的菌苔全部收集于2YT培养基中,37℃培养至OD600为0.8。加入终浓度为1×109PFU/mL的辅助噬菌体VCSM13 37℃培养1h。加入终浓度为50μg/mL的卡纳霉素,37℃继续培养8h,900g离心20min弃沉淀,于上清中加入5×PEG/NaCl,混匀后置于冰上6h,900g离心45min,把沉淀重悬于3mL的PBS中,过0.22μm的滤膜,滤液即为人源性噬菌体单链抗体文库,同时计算文库库容和多样性。
3.2.5抗SARS-CoV-2-S蛋白特异性单链抗体的筛选
取200μL扩增后的噬菌体文库与固相化包被的SARS-CoV-2-S蛋白共同孵育,进行4轮“吸附-洗脱-扩增”亲和筛选,取第4轮洗脱液感染对数生长期的大肠杆菌XL1-Blue后,涂布2×YT培养板,37℃培养过夜,随机挑取100个单菌落分别接种96孔深孔板(含100μg/mL氨苄青霉素、12.5μg/mL四环素和1g/mL葡萄糖),37℃过夜振摇培养,次日1:10分别接种到新96孔深孔板(含100μg/mL氨苄青霉素和30μg/mL四环素)中37℃振摇培养6h,加入辅助噬菌体VCSM13(终浓度为1×109PFU/mL),37℃孵育1h,加入卡纳霉素(终浓度为50μg/mL)30℃过夜振摇培养制备成噬菌体单链抗体,用0.1μg/孔SARS-CoV-2-S蛋白包被酶标板,二抗是用PBS缓冲液(含5g/mL脱脂奶粉)按1:2000稀释的HRP标记抗M13抗体,进行Phage-ELISA鉴定并测定OD450值,当Positive/Negative≥2.1时定为阳性,阳性克隆的菌液送商业公司测序。
3.3结果
抗SARS-CoV-2-S蛋白单链抗体的筛选
以SARS-CoV-2-S蛋白为抗原对人源化SARS-CoV-2病毒单链抗体文库进行了4轮亲和筛选,抗SARS-CoV-2-S蛋白特异性单链抗体得到了选择性富集,产出/投入比值提高了近40倍。随机挑取100个噬菌体单克隆进行Phage-ELISA试验并测定OD450值,结果显示有9个单链抗体与SARS-CoV-2-S蛋白能特异性结合。经测序分析,获得7种不同氨基酸序列的scFv抗体,分别命名为A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10。
4 7个scFv单抗克隆微量中和实验(所有操作均在BSL-3实验室中进行)
4.1噬菌体抗体的制备
分别挑取Phage-ELISA实验阳性的7种单菌落至2ml 2×YT培养基(含100μg/mL氨苄青霉素、12.5μg/mL四环素和1g/mL葡萄糖)中,37℃过夜振摇培养,次日1:10分别接种到10ml 2×YT培养基(含100μg/mL氨苄青霉素和30μg/mL四环素)中37℃振摇培养6h,加入辅助噬菌体VCSM13(终浓度为1×109PFU/mL),37℃孵育1h,加入卡纳霉素(终浓度为50μg/mL)30℃过夜振摇培养后900g离心30分钟,弃沉淀,于上清中加入5×PEG/NaCl,混匀后置于冰上6小时,900g离心30min,弃上清,用1mlPBS重悬沉淀后900g离心30min,将上清加入透析袋中在PBS缓冲液中透析3天过0.22μm的滤膜后4℃保存。
4.2微量中和实验操作
(1)Vero细胞接种于96孔板,培养至对数生长期。
(2)将50TCID50病毒(共50μl)与等体积噬菌体抗体混匀,37°孵育1h。
(3)把抗原抗体复合物100μl加入细胞培养孔中,设置复孔,同时设置阳性对照组(康复期病人血清)、阴性对照组(2×YT培养基)和空白对照组(只有细胞,没有病毒)。
(4)细胞培养物置于37℃、5%CO2的培养箱中培养5天,每天观察细胞病变(Cytopathic effect,CPE)。对于能抑制大于50%CPE出现的单抗被认为具有中和抑制作用。
4.3结果
实验结果显示,7种ScFv单抗中只有A10对SARS-CoV-2病毒具有中和抑制作用(图1),其序列如表2所示。
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上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.针对SARS-CoV-2的单克隆抗体,其特征在于,所述单克隆抗体包括重链可变区互补决定区VH CDR和轻链可变区互补决定区VL CDR,
其中,VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列分别具有与SEQ ID NO:1、2、3所示的氨基酸序列至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同性,
VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列分别具有与SEQ ID NO:9、10、11所示的氨基酸序列至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同性;
优选地,VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、2、3所示,
VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:9、10、11所示。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体,其特征在于,所述单克隆抗体还包括重链可变区框架区VH FR和轻链可变区框架区VL FR,
其中,VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4的氨基酸序列分别具有与SEQ ID NO:4、5、6、7所示的氨基酸序列至少90%、至少92%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同性,
VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4的氨基酸序列分别具有与SEQ ID NO:12、13、14、15所示的氨基酸序列至少90%、至少92%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同性;
优选地,VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、5、6、7所示,
VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:12、13、14、15所示。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体,其特征在于,所述单克隆抗体的重链可变区VH的氨基酸序列具有与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同性,
轻链可变区VL的氨基酸序列具有与SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同性;
优选地,所述单克隆抗体的重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示,轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
4.根据权利要求3所述的单克隆抗体,其特征在于,所述单克隆抗体连接可检测标签;
优选地,所述检测标签包括荧光标签、酶底物标签、放射性同位素;
优选地,所述CDR是根据Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact编号系统定义的;
优选地,所述CDR是根据IMGT编号系统定义的;
优选地,所述单克隆抗体是无岩藻糖基化的;
优选地,所述SARS-CoV-2包括SARS-CoV-2-S蛋白、SARS-CoV-2-N蛋白、SARS-CoV-2-M蛋白、SARS-CoV-2-E蛋白;
优选地,所述SARS-CoV-2选自SARS-CoV-2-S蛋白。
5.如下任一种产品:
(1)分离的核酸分子,其特征在于,所述核酸分子编码权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体;
(2)包括(1)中所述的分离的核酸分子的载体;
(3)包括(1)中所述的分离的核酸分子或(2)中所述的载体的宿主细胞;
(4)检测SARS-CoV-2的产品,其特征在于,所述产品包括权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体;
(5)药物组合物,其特征在于,所述药物组合物包括权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体、(1)中所述的分离的核酸分子、(2)中所述的载体、(3)中所述的宿主细胞。
6.根据权利要求5所述的产品,其特征在于,(1)中编码VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3的核酸分子的核苷酸序列分别具有与SEQ ID NO:17、18、19所示的核苷酸序列至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同性,
编码VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3的核酸分子的核苷酸序列分别具有与SEQ ID NO:25、26、27所示的核苷酸序列至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同性;
优选地,(1)中编码VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3的核酸分子的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:17、18、19所示,
编码VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3的核酸分子的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:25、26、27所示;
优选地,(1)中编码VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4的核酸分子的核苷酸序列分别具有与SEQ ID NO:20、21、22、23所示的核苷酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同性,
编码VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4的核酸分子的核苷酸序列分别具有与SEQ IDNO:28、29、30、31所示的核苷酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同性;
优选地,编码VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4的核酸分子的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:20、21、22、23所示,
编码VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4的核酸分子的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:28、29、30、31所示;
优选地,编码重链可变区的核酸分子的核苷酸序列分别具有与SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同性,
编码轻链可变区的核酸分子的核苷酸序列分别具有与SEQ ID NO:32所示的核苷酸序列至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同性;
优选地,编码重链可变区的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示,编码轻链可变区的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:32所示;
优选地,(2)中所述的载体包括病毒载体、质粒、噬菌体;
优选地,(3)中所述的宿主细胞包括原核细胞、真核细胞;
优选地,(6)中所述的药物组合物还包括药学上可接受的载体。
7.一种制备权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体的方法,其特征在于,所述方法包括培养权利要求5中(3)所述的宿主细胞,回收抗体。
8.一种检测SARS-CoV-2在样品中的存在或其量的方法,其特征在于,所述方法包括:
(1)将所述样品与权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体接触;
(2)检测所述单克隆抗体与SARS-CoV-2之间复合物的形成或检测所述复合物的量。
9.权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体、权利要求5或6所述的产品在检测SARS-CoV-2或制备检测SARS-CoV-2的产品中的应用。
10.权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体、权利要求5或6所述的产品在制备预防/治疗SARS-CoV-2相关疾病的产品中的应用;
优选地,SARS-CoV-2相关疾病包括呼吸道传染疾病。
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