CN109055502A

CN109055502A - 一种侵袭性真菌感染的检测方法、检测试剂盒、及应用

Info

Publication number: CN109055502A
Application number: CN201810899103.4A
Authority: CN
Inventors: 王荣芳; 陈昊; 钱震斌
Original assignee: DiaSys Diagnostic Systems (Shanghai) Co Ltd
Current assignee: DiaSys Diagnostic Systems (Shanghai) Co Ltd
Priority date: 2018-08-08
Filing date: 2018-08-08
Publication date: 2018-12-21
Anticipated expiration: 2038-08-08
Also published as: CN109055502B

Abstract

本发明提出了一种基于真菌游离DNA(cell free DNA,cfDNA)的侵袭性真菌感染快速多重PCR鉴定诊断检测方法，本发明可鉴定由临床常见和高发的白色念珠菌(Candida albicans)，热带假丝酵母(Candida tropicalis)，近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)，克柔念珠菌(Candida krusei)，光滑念珠菌(Candida glabrata)及烟曲霉(Aspergillus fumigtus)造成的侵袭性感染。本发明根据各真菌属、种的特征基因组区段设计扩增引物，依据所述扩增片段设计可区分菌种的检测荧光探针，对待测样品进行实时荧光PCR(real time PCR)，综合了巢式PCR的高灵敏性和多重荧光杂交探针PCR的高特异性和多靶标性的优势鉴定真菌菌种。本发明还提出了用于侵袭性真菌感染PCR诊断试剂盒及其应用。

Description

一种侵袭性真菌感染的检测方法、检测试剂盒、及应用

技术领域

本发明属于生物医学检测技术领域，涉及一种侵袭性真菌感染快速检测方法，具体涉及一种基于真菌游离DNA(cfDNA)的对临床常见和高发真菌引起的侵袭性感染、采用多重PCR技术进行鉴定诊断的方法及应用、以及检测试剂盒。

背景技术

近年来，随着人口老龄化加速，肿瘤和免疫缺陷等疾病发病率上升，实体器官和造血干细胞移植快速发展，以及抗生素和免疫抑制剂的大规模使用，侵袭性真菌病发病率逐年升高。但目前诊断方法有限，无法早期准确诊断，容易贻误最佳治疗时机，导致临床预后差、死亡率高。

侵袭性真菌病的病原学诊断方法包括传统方法和非培养方法。传统方法包括真菌镜检、培养和组织病理学检查。真菌镜检和组织病理学检查虽可反映真菌在组织中的寄生形态，但无法确定病原菌种类；真菌培养是金标准，并依据药物敏感性选择药物，但耗时长、敏感性低，可能需要多次培养，也可能根本无法培养，极易丧失最佳治疗时间。非培养方法即血清学检测，包括GM试验和G试验。GM试验虽可作为诊断侵袭性曲霉病的依据，但灵敏度有时可低至50％，且影响因素多，假阳性率高达18％。G试验虽被列入侵袭性真菌病的诊断标准，但无法鉴别致病菌种，不能用于接合菌和隐球菌感染的检测，且具有较高的假阳性。因此，目前临床的真菌感染检测技术存在耗时长、重复性差、假阳性率较高以及不能准确区分菌种等问题，不能满足临床的需求。发展快速准确的病原真菌检测方法对于临床早期诊断和精准治疗具有重要意义。

分子生物学方法主要通过检测病原真菌的特定基因序列而达到检测和鉴定的双重目的。早在2006年Florent等的前瞻性研究证实了PCR-ELISA技术在侵袭性曲霉病早期诊断中的价值，PCR阳性可早于临床体征、影像学改变或培养阳性5～19.5天，早于GM试验17天。荧光定量PCR技术可以鉴别组织病理学检查难以区分的接合菌和其他丝状真菌,且敏感性和特异性均可达到100％。由此可见，相比其他技术，基于PCR技术的分子生物学方法具有简便、快速、灵敏等优势。相较于其它病原微生物的检测，真菌核酸检测主要有下述技术难点:(1)在实验操作中极易被在环境中广泛存在的真菌孢子污染，由于PCR检测灵敏度高，导致误诊；(2)真菌细胞壁较坚固，难于被常规技术手段裂解，造成实验繁复、出错率上升及检测成本提高；(3)由于侵袭性真菌感染早期病原菌数量少不易被检测。因此，研发能够克服这些技术难点的适用于临床的诊断试剂盒是真菌分子诊断发展的必然趋势。

胞外游离DNA(cell free DNA，cfDNA)检测是当前无创体外诊断的热点领域，主要集中应用于产前遗传筛查和肿瘤等遗传疾病的早期诊断，已有较多的方法学研究报道，但迄今尚无应用真菌cfDNA进行检测的报道。

发明内容

本发明创新性地利用真菌cfDNA结合PCR技术实现对真菌感染的诊断及耐药菌种的鉴定。本发明提出的一种侵袭性真菌感染的检测方法，包括：富集纯化待测样本(如外周血血清等)中真菌游离DNA(cell free DNA,cfDNA)片段，然后直接进行种特异性基因组片段的一步法巢式+荧光杂交探针多重PCR检测鉴定，即，依据真菌rDNA保守区(5.8S，18S，28S)设计真菌属特异性引物，依据所述扩增片段中的ITS区设计真菌种特异检测荧光探针，对所述待测样品进行实时荧光定量PCR，通过PCR多重反应对所述待测样品中可能存在的真菌菌种进行区分和鉴定。本发明是一种基于真菌细胞游离DNA(cell free DNA,cfDNA)的侵袭性真菌感染的快速、多重一步法巢式PCR鉴定诊断方法。

本发明中，所述方法的检测靶标为临床样本中的真菌游离DNA片段(cell freeDNA,cfDNA)。

本发明所述方法在利用巢式PCR的较高灵敏度的特性前提下，利用经优化的通用巢式引物及特异探针组合及反应条件设置，将常规的需分步骤多次多管完成的巢式PCR反应合并为一步单管完成，实现检测灵敏性及操作简化的结合。

其中，所述真菌包括白色念珠菌(Candida albicans)，热带假丝酵母(Candidatropicalis)，近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)，克柔念珠菌(Candida krusei)，光滑念珠菌(Candida glabrata)，烟曲霉(Aspergillus fumigtus)中任意的一种或几种的组合。

本发明创新性地利用真菌cfDNA结合PCR技术实现对真菌感染的诊断检测，创新点包括：首先，本发明将胞外游离DNA(cfDNA)检测方法应用于真菌感染检测领域，在富集样本中真菌cfDNA片段后，直接进行种特异性基因组片段检测，因而避免了外源的真菌(孢子)的干扰，杜绝了因此而导致的误诊。其次，因无需细胞裂解，简化了操作流程并降低了技术要求，进一步避免了外源真菌等污染的可能性，提高检测的特异性和可靠性；同时节约了人力，降低了检测费用。并且，本发明还采用巢式+多重荧光杂交探针PCR(Nest-PCR+Multiplex-PCR)的策略进行，其特点是将具有较高灵敏度的巢式扩增PCR技术(Nest-RCR)与较高特异性和多靶标性的荧光杂交探针技术相结合；通过优化的巢式PCR(Nest-PCR)和多重荧光杂交探针PCR的联合应用，针对性地克服了样本中真菌cfDNA含量相对较少的问题，提高了检测的灵敏度又保证了结果的特异性。进一步的是，本发明优化改进巢式+多重荧光杂交探针PCR反应条件，将全部反应一步完成，避免了中途加样引入操作错误及外部污染的可能，进而提高结果的可信度。

本发明提出了基于真菌游离DNA的，依据真菌rDNA保守区(5.8S，18S，28S)以及ITS区，对存在于血清、血浆及组织灌洗液等临床样本中的由临床上最常见的侵袭性感染真菌：白色念珠菌(Candida albicans)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、克柔念珠菌(Candida krusei)、光滑念珠菌(Candidaglabrata)、烟曲霉(Aspergillus fumigtus)进行多重PCR鉴定诊断检测方法。

本发明依据真菌白色念珠菌(Candida albicans)，热带假丝酵母(Candidatropicalis)，近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)rDNA保守区(5.8S，18S，28S)以及ITS区设置特异性扩增引物和特异检测荧光探针。所述真菌属特异性巢式PCR引物包括如下序列的引物组合，即，rDNA保守区(5.8S，18S，28S)扩增引物的引物组合为：

上游引物1，5’-3’序列：TGAAGAACGCAGCGAAAT(SEQ ID NO.1)；

下游引物1，5’-3’序列：ATATGCTTAAGTTCAGCG(SEQ ID NO.2)；

上游引物1-1，5’-3’序列：CATGCCTGTTTGAGCG(SEQ ID NO.3)；

下游引物1-2，5’-3’序列：GTCCTACCTGATTTGAGG(SEQ ID NO.4)。

与前述引物组合对应的，当含有如下对应于白色念珠菌(Candida albicans)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)的真菌种特异检测荧光探针时，则本发明所述方法能准确地检测和区分待测样本中特定具体菌种。即，真菌种特异检测荧光探针为如下序列之任意的一种或几种的组合：

白色念珠菌(Candida albicans)5’-3’序列：TACCGCCGCAAGCAAT(SEQ ID NO.5)；

热带假丝酵母(Candida tropicalis)5’-3’序列：TGAAATAAATTGTGGTGGCC(SEQ IDNO.6)；和/或，

近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)5’-3’序列：TGGAGTTTGTACCAATGAGT(SEQ ID NO.7)。

采用本发明所述方法，能准确地从临床样本中检测并确定由白色念珠菌(Candidaalbicans)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)和近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)中的一种、两种或三种之任意组合所导致的真菌感染，并检测确定所感染的具体菌种。

本发明方法中，依据真菌克柔念珠菌(Candida krusei)、光滑念珠菌(Candidaglabrata)、烟曲霉(Aspergillus fumigtus)rDNA保守区(5.8S，18S，28S)以及ITS区设置特异性扩增引物和特异检测荧光探针。真菌属特异性巢式PCR引物包括如下序列的引物组合，即，rDNA保守区(5.8S，18S，28S)扩增引物的组合为：

上游引物1，5’-3’序列：TGAAGAACGCAGCGAAAT(SEQ ID NO.1)；

下游引物1，5’-3’序列：ATATGCTTAAGTTCAGCG(SEQ ID NO.2)；

上游引物1-1，5’-3’序列：CATGCCTGTTTGAGCG(SEQ ID NO.3)；

下游引物2-2，5’-3’序列：TTCCTACCTGATTTGAGG(SEQ ID NO.8)；

下游引物2-3，5’-3’序列：CCCTACCTGATTTGAGG(SEQ ID NO.9)；

上游引物2-4，5’-3’序列：TCCCTACCTGATCCGAGG(SEQ ID NO.10)；

下游引物2-5，5’-3’序列：CATGCCTGTCCGAGCGT(SEQ ID NO.11)。

与前述引物组合对应的，当含有如下的对应于克柔念珠菌(Candida krusei)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、烟曲霉(Aspergillus fumigtus)的真菌种特异检测荧光探针时，采用本发明所述方法能准确地检测和区分待测样本中是否感染了特定具体菌种；即，真菌种特异检测荧光探针为如下序列之任意的一种或几种的组合：

克柔念珠菌(Candida krusei)5’-3’序列：CGTGCGCAGAGTTGGG(SEQ ID NO.12)；

光滑念珠菌(Candida glabrata)5’-3’序列：TGTCTGCCCAGCACGCA(SEQ IDNO.13)；

烟曲霉(Aspergillus fumigtus)5’-3’序列：CCTACAGAGCAGGTGACAAAG(SEQ IDNO.14)。

通过本发明所述方法，能准确地从临床样本中检测并确定该样本中是否感染由克柔念珠菌(Candida krusei)、光滑念珠菌(Candida glabrata)和烟曲霉(Aspergillusfumigtus)之任意一种、两种和/或三种任一组合所导致的感染，并检测确定所感染的具体菌种。

具体地，本发明提出了一种基于真菌游离DNA的临床最常见侵袭性感染的真菌菌种的巢式+多重荧光杂交探针PCR检测，具体地检测存在于血清、血浆及组织灌洗液等临床样本中的由白色念珠菌(Candida albicans)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)，克柔念珠菌(Candida krusei)，光滑念珠菌(Candida glabrata)和烟曲霉(Aspergillus fumigtus)。通过在rDNA保守区(5.8S，18S，28S)设置特异性扩增引物，根据ITS区设计菌种特异检测荧光探针，对待测样品进行实时荧光PCR(real-time PCR)检测。通过两个单管多重反应鉴定区分白色念珠菌(Candidaalbicans)，热带假丝酵母(Candida tropicalis)，近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)，克柔念珠菌(Candida krusei)，光滑念珠菌(Candida glabrata)，烟曲霉(Aspergillus fumigtus)。

其中，所述用于鉴定白色念珠菌(Candida albicans)，热带假丝酵母(Candidatropicalis)，近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)引物为：

上游引物1，5’-3’序列：TGAAGAACGCAGCGAAAT(SEQ ID NO.1)；

下游引物1，5’-3’序列：ATATGCTTAAGTTCAGCG(SEQ ID NO.2)；

上游引物1-1，5’-3’序列：CATGCCTGTTTGAGCG(SEQ ID NO.3)；

下游引物1-2，5’-3’序列：GTCCTACCTGATTTGAGG(SEQ ID NO.4)的组合。

所述特异检测荧光探针(5'标记荧光基团，3'标记淬灭基团)为：

热带假丝酵母(Candida tropicalis)5’-3’序列：TGAAATAAATTGTGGTGGCC(SEQ IDNO.6)；和

近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)5’-3’序列：TGGAGTTTGTACCAATGAGT(SEQ ID NO.7)中任意的一种或几种。

进一步地，所述探针序列上的两端化学修饰为：

5'端：FAM、HEX、VIC、JOE、TAMRA、Cy3、NED、ROX、TEXAS-Red、Cy5以上荧光染料基团中任意三种染料的组合；和，

3'端：BHQ1或BHQ2或3IABkFQ或3IAbRQSp淬灭基团，与上述挑选的三种5'端荧光基团的任意组合；

优选地，3’端使用MGB修饰。

其中，所述用于克柔念珠菌(Candida krusei)，光滑念珠菌(Candida glabrata)，烟曲霉(Aspergillus fumigtus)引物为：

上游引物1，5’-3’序列：TGAAGAACGCAGCGAAAT(SEQ ID NO.1)；

下游引物1，5’-3’序列：ATATGCTTAAGTTCAGCG(SEQ ID NO.2)；

上游引物1-1，5’-3’序列：CATGCCTGTTTGAGCG(SEQ ID NO.3)；

下游引物2-2，5’-3’序列：TTCCTACCTGATTTGAGG(SEQ ID NO.8)；

下游引物2-3，5’-3’序列：CCCTACCTGATTTGAGG(SEQ ID NO.9)；

上游引物2-4，5’-3’序列：TCCCTACCTGATCCGAGG(SEQ ID NO.10)；和

下游引物2-5，5’-3’序列：CATGCCTGTCCGAGCGT(SEQ ID NO.11)；的组合。

其中，所述特异检测荧光探针(5'标记荧光基团，3'标记淬灭基团)为：

烟曲霉(Aspergillus fumigtus)5’-3’序列：CCTACAGAGCAGGTGACAAAG(SEQ IDNO.14)中任意的一种或几种组合。

进一步地，所述探针序列上的两端化学修饰为：

优选地，3’端使用MGB修饰。

本发明提出的侵袭性真菌感染的多重PCR检测方法，包括如下步骤：

1)样本cfDNA富集纯化：可使用磁珠法、或选用本公司(Diasys)及现售的QIAGEN等公司的全血小片段DNA抽提试剂盒。

2)荧光PCR扩增：按照PCR操作流程配制PCR反应体系，在具有与探针匹配检测通道上的荧光PCR仪器上按照总变性、循环(含变性、退火、延伸步骤或含变性、退火延伸步骤)扩增并检测。

优选地，所述荧光PCR扩增为三色荧光PCR扩增：按照PCR操作流程配制PCR反应体系，在具有与探针匹配检测通道上的荧光PCR仪器上按照总变性、循环(含变性、退火、延伸步骤或含变性、退火延伸步骤)扩增并三色同步检测。

其中，所述实时荧光定量PCR中，退火温度在55-67℃之间，PCR扩增片段长度为50-500bp；引物终浓度范围为0.5-0.05uM之间。各条探针的终浓度范围为：1nM-15nM。

优选地，所述实时荧光定量PCR中，退火温度设置为两个阶段，一阶段退火温度为65℃-61℃之间，循环数为3-10个循环，二阶段退火温度为63℃-57℃之间，循环数为38-45个循环。

优选地，所述实时荧光定量PCR中，PCR扩增片段长度为100-350bp。

优选地，所述实时荧光定量PCR中，扩增基因组DNA浓度范围为0.08-0.02uM之间。

优选地，所述实时荧光定量PCR中，各条探针的终浓度范围为：2nM-10nM。

3)结果分析与判断：根据每份样本在各通道检测到的Ct值，通过具体探针标记基团判定其具体真菌菌种类型。

本发明还提出了一种用于检测侵袭性真菌感染的检测试剂盒。所述试剂盒包括前述的真菌属特异性引物以及真菌种特异检测荧光探针。

进一步地，所述试剂盒包括PCR扩增反应试剂；其中，所述RCR扩增反应试剂包含PCR反应试剂mix(混合液)、PCR引物探针mix-1(引物及探针混合液1)、PCR引物探针mix-2(引物及探针混合液2)。

进一步地，所述试剂盒包括：含有位于rDNA各真菌菌种种特异区段的阳性质粒标准品。

进一步地，所述试剂盒包括：PCR反应缓冲体系、Hot-start Taq酶。

本发明还提出了所述检测侵袭性真菌感染的检测试剂盒的应用，提出了一种基于真菌游离DNA(cell free DNA,cfDNA)的侵袭性真菌感染快速检测方法的试剂中的应用。所述应用中包括前述的真菌属特异性引物以及真菌种特异检测荧光探针，所述试剂盒可用于对侵袭性真菌进行区分和鉴定。

所述试剂盒及其应用中，进一步地，还包括所述探针序列的两端化学修饰，包括：5'端：FAM、HEX、VIC、JOE、TAMRA、Cy3、NED、ROX、TEXAS-Red、Cy5以上荧光染料基团中任意三种染料的组合；3'端：BHQ1或BHQ2或3IABkFQ或3IAbRQSp淬灭基团，与上述挑选的三种5'端荧光基团的任意组合。

具体地，本发明提出的包括针对临床相关标本的试剂盒体系。例如，试剂盒(48人份)主要组成如下表-1所示：

表-1侵袭性真菌检测试剂盒主要组成

PCR反应试剂mix主要成分包括：2X缓冲液+dNTPs+Mg⁺⁺+hot-start Taq；

PCR引物探针mix主要成分包括：上下游引物+TaqMan探针；

阳性对照1：含混合了白色念珠菌，热带假丝酵母及近平滑假丝酵母片段的质粒；

阳性对照2：含混合了克柔念珠菌，光滑念珠菌及烟曲霉片段的质粒；

阴性对照：空载质粒。

适用的Real Time PCR扩增仪：

Applied Biosystems 7900HT/7300/7500 Real-Time PCR System、7500 FastReal-Time PCR System、StepOnePlus^TM Real-Time PCR System(Applied Biosystems)、(Roche Diagnostics)、CFXTouch^TM(Bio-Rad)。

试剂运输及储存条件：

本试剂盒运输可在2～8℃环境下进行。储存时，须置-20℃保存。

有效期：本试剂盒有效期为12个月，在有效期内使用。

试剂盒原理：

试剂盒使用了Hot-start Taq酶进行PCR扩增，通过反应液中Taq酶水解TaqMan探针释放的荧光强度变化，达到检测PCR产物扩增的目的。以真菌rDNA的含有保守区(5.8S，18S，28S)及ITS区的真菌基因组序列进行PCR扩增，使用TaqMan探针实现对各菌种的鉴定区分。试剂盒中的DNA聚合酶由于使用了Hot-start Taq酶，从而抑制常温下的非特异性扩增，大大提高PCR扩增的准确率。

TaqMan多重荧光检测法:

被FAM，VIC/ROX和CY5标记的TaqMan探针与目的片段杂交后被Taq酶水解后发出荧光，通过检测反应体系中的特异荧光，达到检测、鉴定、区分具体真菌菌种(白色念珠菌，热带假丝酵母，平滑假丝酵母，克柔念珠菌，光滑念珠菌，烟曲霉)的目的。

试剂盒特点:

适用于多种常规Real-Time PCR反应平台，可以快速、准确地对人类血清、血浆、灌洗液中的由白色念珠菌、热带假丝酵母、平滑假丝酵母、克柔念珠菌、光滑念珠菌和烟曲霉引起的侵袭性感染进行检测、分析，确定具体感染菌种。PCR反应液配制时，在反应体系中混入引物探针，再加入模板便可进行Real-Time PCR反应，操作简单方便。DNA聚合酶使用了Hot-start DNA聚合酶，与公司独自开发的Buffer系统相结合，具有高扩增效率、高扩增灵敏度和高扩增特异性的特点。

本发明有益效果还包括：在方法学上，应用一步法巢式+多重荧光杂交探针PCR检测，可实现即时观察检测结果。检测时间短为1.5～3小时，操作简便，有利于实践中的广泛推广及应用。本发明的试剂盒首次把胞外游离DNA(cfDNA)检测方法应用于真菌感染检测领域，在富集样本中真菌cfDNA片段后直接进行种特异性基因组片段检测,开发一种无需细胞裂解及核酸提取的病原真菌核酸检测试剂盒。其优势为：1.环境中的真菌(孢子)对检测结果没有影响，有效降低了误诊率，提高检测可靠性；2.简化了检测步骤，操作更加简单快速；3.降低检测费用。本发明的试剂盒采用巢式+多重荧光杂交探针PCR(Nest-PCR+Mutiplex-PCR)的策略进行。其特点是将具有较高灵敏度的巢式扩增PCR技术(Nest-RCR)与较高特异度的荧光杂交探针技术相结合。首先，利用巢式PCR高灵敏度的特点，针对性克服了cfDNA含量相对较少的问题。其次，优化改进巢式+多重荧光杂交探针PCR反应条件，将全部反应合为一步完成，既兼顾了巢式PCR的高灵敏度，又避免了中途加样引入错误的可能，提高结果的可信度。

附图说明

图1为表示本发明中探针、引物各自的设计目标区段的示意图。

图2为表示本发明中鉴定的真菌菌种多重PCR引物探针具体实现方式示意图，用实线标示的特异多重检测TaqMan探针位置(ITS区)，巢式PCR引物(箭头标注)扩增区域位置(5.8s,28s,18s)。巢式PCR扩增通过一次反应中两个阶段的不同的退火温度实现。

图3为表示本发明中不同浓度(弱阳，中弱阳，中强阳，强阳)阳性克隆质粒扩增曲线(TaqMan探针)。其中，图3A表示白色念珠菌阳性质粒扩增曲线(其中，横坐标反应循环数为5、10、15、20、25、30、35；纵坐标相对荧光值为：0.099、0.899、1.699、2.499、3.299、4.099、4.899、5.699、6.499、7.299、8.099)；图3B表示热带假丝酵母阳性质粒扩增曲线(其中，横坐标反应循环数为5、10、15、20、25、30、35；纵坐标相对荧光值为：0.242、0.942、1.642、2.342、3.042、3.742、4.442、5.142、5.842、6.542、7.242)；图3C表示近平滑假丝酵母阳性质粒扩增曲线(其中，横坐标反应循环数为5、10、15、20、25、30、35；纵坐标相对荧光值为：-0.118、0.582、1.282、1.982、2.682、3.382、4.082、4.782、5.482、6.182、6.882、7.582)。

图4为表示本发明中不同浓度(弱阳，中弱阳，中强阳，强阳)阳性克隆质粒扩增曲线(TaqMan探针)。其中，图4A表示克柔念珠菌阳性质粒扩增曲线(其中，横坐标反应循环数为5、10、15、20、25、30、35；纵坐标相对荧光值为：0.394、1.194、1.994、2.794、3.594、4.394、5.194、5.994、6.794、7.594、8.394)；图4B表示光滑念珠菌阳性质粒扩增曲线(其中，横坐标反应循环数为5、10、15、20、25、30、35；纵坐标相对荧光值为：0.216、0.916、1.616、2.316、3.016、3.716、4.416、5.116、5.816、6.516、7.216)；图4C表示烟曲霉阳性质粒扩增曲线(其中，横坐标反应循环数为5、10、15、20、25、30、35；纵坐标相对荧光值为：-0.151、0.549、1.249、1.949、2.649、3.349、4.049、4.749、5.449、6.149、6.849、7.549)。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图/表，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1：

用阳性质粒样本对本发明方法的进行验证

本实施例中，用本发明方法对各阳性菌种质粒进行PCR检测，验证本发明方法反应体系可通过单管多重反应，分别一次性特异鉴定出白色念珠菌，热带假丝酵母，平滑假丝酵母或克柔念珠菌，光滑念珠菌，烟曲霉而无相互交叉反应。各次反应中包含了上述各菌种的阳性质粒，将各菌种阳性质粒单独或组合后配制成待检测样本(质粒浓度为10²拷贝/μL)。

一、实施方法：

1.准备菌种的阳性质粒

1.1.引物设计：分别参照已报道的各菌种rDNA序列(包含5.8s,18s,28s及ITS区)设计构建各菌种阳性质粒的引物序列：

白色念珠菌：

上游引物5’-3’序列：GGTGTTGAGCAATACGACTTGG(SEQ ID NO.15)

下游引物5’-3’序列：AGACCTAAGCCATTGTCAAAGC(SEQ ID NO.16)

热带假丝酵母：

上游引物5’-3’序列：TGGTATTCCAAAGGGCATGC(SEQ ID NO.17)

下游引物5’-3’序列：CCACGTTAAATTCTTTCAAACAAA(SEQ ID NO.18)

平滑假丝酵母：

上游引物5’-3’序列：ATTGCGCCCTTAGGGCATG(SEQ ID NO.19)

下游引物5’-3’序列：TCCATTAGTTTATACTCCGCCTT(SEQ ID NO.20)

克柔念珠菌：

上游引物5’-3’序列：CTGTTTGAGCGTCGTTTCCA(SEQ ID NO.21)

下游引物5’-3’序列：TCCTACCTGATTTGAGGTCGAG(SEQ ID NO.22)

光滑念珠菌：

上游引物5’-3’序列：CCATATCAGTATGTGGGACACGA(SEQ ID NO.23)

下游引物5’-3’序列：ATCCCTCCCTAGATCAACACC(SEQ ID NO.24)

烟曲霉：

上游引物5’-3’序列：ATTGCGCCCTTAGGGCATG(SEQ ID NO.25)

下游引物5’-3’序列：TCCATTAGTTTATACTCCGCCTT(SEQ ID NO.26)。

1.2.采用以下PCR反应体系克隆各菌种rDNA序列(包含5.8s,18s,28s及ITS区)：

在200μL微量PCR反应管内加入PCR反应体系：

反应条件为总变性94℃8分钟，35个循环(94℃25秒，62℃20秒，72℃35秒)。

1.3.PCR产物克隆：扩增出的PCR片段，经PCR产物回收试剂盒回收后,用T4DNA聚合酶(T4DNA polymerase,NEB BioLabs公司)补平末端，再经琼脂糖凝胶电泳，将目标片段用胶回收试剂盒回收纯化，然后插入到pBluesecriptII SK(+)载体上的EcoRV位点中，详细方法见文献(Sambrooks,《分子克隆手册》)，最后将连接产物转化到DH5α菌株中，用PCR方法来筛选阳性克隆。

1.4.对阳性克隆进行DNA序列测定，其测序结果与基因库序列或公开报导序列一致。

1.Real-time PCR反应体系为：

2.反应条件设定(标准两步法)

总变性95℃5分钟，5个循环(94℃15秒，63℃15秒，72℃25秒)，38个循环(94℃15秒，60℃15秒，72℃25秒)。

二、检测结果：

PCR反应结束后依据各通道荧光信号Ct值判定是否与加入的阳性样本菌种相符合，当扩增检测信号(Ct≤35)时，则判定为阳性信号，以此证明本发明体系对检测各菌种的有效性。各实验结果如表-2所示：

表-2反应管加入以C.albicans,C.tropicalis,C.parapsilosis为靶标的探针后对各阳性质粒(“+”含有阳性质粒，“-”无阳性质粒)的检测判定结果

表-3反应管加入以C.krusei(FAM)、C.glabrata(ROX)、A.fumigatus为靶标的探针后对各阳性质粒(“+”含有阳性质粒，“-”无阳性质粒)的检测判定

上述表-2，表-3中，当扩增检测信号(Ct≤35)时，则判定为阳性信号：各菌种对应信号通道为：C.albicans(FAM),C.tropicalis(Cy5),C.parapsilosis(ROX/VIC),以及C.krusei(FAM),C.glabrata(ROX),A.fumigatus(Cy5)。表中“+”示意加入相应菌种的阳性质粒，“-”示意无相应菌种的阳性质粒。各反应中仅当且当有探针对应阳性质粒加入后才能检测到对应的信号通道为阳性，说明本发明体系特异性良好，可特异鉴定各真菌菌种，且无交叉反应。本发明的多重检测系统可在较低目标浓度下一次性同时准确分辨和检测任意的各菌种组合，而未出现任何错误，如假阳性和假阴性。综上，本实施例说明，本发明检测体系的特异性和灵敏度达到设计要求，可作为快速，便捷诊断侵袭性真菌感染因型的有效工具。

实施例2：

用被已知的菌种感染的体外培养模型进行菌种鉴定测试

本实施例中，用确定真菌菌种体外模拟(PBMC)培养上清液样本，测试本发明PCR系统是否能利用游离真菌DNA区分菌种，且不被非检测靶标菌种影响。通过此实施例，进一步证实本发明试剂盒适用于基于真菌游离DNA片段对真菌菌种进行区分鉴定检测，且在对体外模拟感染样本的检测中表现出系统特异性和重复性均良好，而不受其他干扰因子影响。

一、实施方法：

1.对于已知菌种的培养液，离心后取上清，用Qiagen或德赛诊断系统(上海)有限公司血液DNA抽提试剂盒抽提DNA。

2.real-time PCR反应体系为：

3.反应条件设定

二、检测结果：

当扩增检测信号(Ct≤35)时，则判定为阳性信号：各菌种对应信号通道为：C.albicans(FAM),C.tropicalis(Cy5),C.parapsilosis(ROX/VIC),以及C.krusei(FAM),C.glabrata(ROX),A.fumigatus(Cy5)。PCR反应结束后依据各通道荧光信号Ct值判定筛查样本中的具体菌种。

表-4对体外培养模型进行菌种鉴定检测结果

本次实施例样品共30例，经单盲实验，含白色念珠菌孢子培养液上清样本2次2人独立分别实验检出率为100％；且其他干扰因子无影响。本系统体外模拟感染样本中系统特异性，重复性良好。

如表-4中所示，表中“-”示意无扩增信号或Ct＞35。本实施例共计30个确定菌种的体外培养模拟样本，用本发明的试剂盒及方法所得到的结果与已知的测序结果经比对后符合率达到了100％。由此可知，本发明基于裂解真菌使用真菌游离DNA片段检测的多重PCR鉴定方法，可用于真实样本中的真菌鉴定。

实施例3：

用被已知的菌种感染的动物真菌侵袭感染模型血清进行菌种鉴定测试

本实施例中，使用确定真菌菌种感染的动物感染模型血清样本来确定是否可通过本发明的方法学鉴定体内感染模型的感染菌种。通过该实施例进一步证实本发明试剂盒适用于基因游离真菌DNA片段对真菌菌种进行区分鉴定检测，且在对体内模拟感染样本的检测中表现出系统特异性和重复性均良好，而不受其他干扰因子无影响。

一、实施方法：

1.对于不同处理(免疫抑制剂处理或无免疫抑制处理)的小鼠，通过尾静脉注射白色念珠菌菌种的真菌培养液，在一定间隔天数后取血，制备血清样本，然后用Qiagen或德赛诊断系统(上海)有限公司血液DNA抽提试剂盒抽提DNA。

2.real-time PCR反应体系为：

3.反应条件设定

二、检测结果：

当扩增检测信号(Ct≤35)时，则判定为阳性信号：各菌种对应信号通道为：C.albicans(FAM)、C.tropicalis(Cy5)、C.parapsilosis(ROX/VIC)、以及C.krusei(FAM)、C.glabrata(ROX)、A.fumigatus(Cy5)，PCR反应结束后依据各通道荧光信号Ct值判定筛查样本中的具体菌种。

表-5以已知真菌菌种感染动物模型进行菌种鉴定测试结果

上述表-5中，“+”示意表中左侧列条件项为“是”/“加入”，“-”示意表中左侧列条件项为“否”/“不加入”。小鼠感染模型测试显示系统可检测接种后有患病体征小鼠的白色念珠菌感染。阴性小鼠无假阳性信号。且感染但体质健康小鼠也无阳性信号。体系两次独立重复试验结果一致。说明本系统可用于临床侵袭性真菌感染样本的菌种鉴定检测。

实施例4：

用随机挑选的医院各科室未知真菌菌种感染的、且经G试验检测为阳性的真菌疑似感染病人的血清样本，对本发明方法进行验证，并与G试验检测的方法学进行比较

本实施例中，使用医院各科室疑似真菌感染的病人血清样本，所有样本G试验检测已确定为阳性。通过此实施例，进一步证实本发明基于游离的真菌DNA片段的多重PCR菌种区分鉴定检测方法可适用于对人侵袭性真菌感染检测的诊断和感染菌种的确认。并与G试检测进行临床相关性比较。

一、实施方法：

1.使用医院不同科室收集的血清样本，并记录样本G检测的测定值，用Qiagen或德赛(诊断)上海有限公司的血液DNA抽提试剂盒抽提DNA。

2.real-time PCR反应体系为：

3.反应条件设定

二、检测结果：

当扩增检测信号(Ct≤35)时，则判定为阳性信号：各菌种对应信号通道为：C.albicans(FAM),C.tropicalis(Cy5),C.parapsilosis(ROX/VIC),以及C.krusei(FAM),C.glabrata(ROX),A.fumigatus(Cy5)。PCR反应结束后，依据各通道荧光信号Ct值判定筛查样本中的具体菌种。

表-6对随机挑选的医院各科室样本检测结果

小批量临床样本(N＝7)测试显示，本发明方法可在人类血清样本中利用真菌游离DNA片段对侵袭性真菌感染病人进行菌种鉴定诊断测试。与G试验检测结果相比较具有一定的相关性(70％)，相比G试验检测方法，本发明方法的检测时间更短，且能确认具体感染菌种，可以对后期针对菌种合理用药提供治疗指导。

实施例5：

用随机挑选的医院住院病人未知真菌菌种感染的且经过G或GM实验测试的真菌疑似感染病人血清样本对本发明方法的验证性检测和与G，及GM检测的方法学比较

本实施例中，使用随机挑选的住院病人血清样本，所述血清样本是疑似真菌感染(菌种未知)，并对所述血清样本采用G或GM试验进行测试。通过此实施例，进一步证实本发明基于游离的真菌DNA片段的多重PCR菌种区分鉴定检测方法可适用于对人侵袭性真菌感染的检测、诊断和感染菌种的确认。并与G和GM检测进行临床相关性比较。

一、实施方法：

1.使用医院随机挑选的住院病人的血清样本，所述血清样本是疑似真菌感染(菌种未知)，并对所述血清样本采用G或GM试验进行测试，记录样本G或GM试验检测的测定值；然后，采用Qiagen或德赛诊断(上海)有限公司的血液DNA抽提试剂盒抽提DNA。

2.real-time PCR反应体系为：

3.反应条件设定

二、检测结果：

表-7对随机挑选的医院住院病人样本检测结果各菌种占比

	测试样本各菌种占比％(样本数＝45)
		C.albicans	87.2
C.tropicalis	2.1
		C.parapsilosis	2.1
C.krusei	2.1
		C.glabrata	2.1
Aspergillus fumigatus	38.3

表-8对随机挑选的医院住院病人样本PCR检测与G或GM测试符合率

	样本数	PCR测试符合率％
			GM阳性	20	75(15/20)
GM阴性	5	80(4/5)
			G阳性	14	92.9(13/14)
G阴性	6	33.3(2/6)

由上述表-7统计得出，在未考虑临床结果参照前，仅使用PCR方法，判定超过80％样本中菌种检测为白色念珠菌(C.albicans)，这一结果符合公开文献中所记载的侵袭性感染真菌菌种的分布特点。表-8中，GM试验阴性、阳性均符合率>70％，与GM试验特异性高有关。G试验部分阳性率较高(与实际临床病历信息比对)，具体原因可解释为PCR本身方法学的高灵敏度。上述结果表明，本发明方法与现有G，GM检测方法有一定的相关性，但灵敏度更高，且可确认感染的具体菌种，从而根据菌种针对性用药，对真菌感染的早期和针对性治疗指导意义重大。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 德赛诊断系统（上海）有限公司

<120> 一种侵袭性真菌感染的检测方法、检测试剂盒、及应用

<160> 26

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgaagaacgc agcgaaat 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atatgcttaa gttcagcg 18

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

catgcctgtt tgagcg 16

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtcctacctg atttgagg 18

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

taccgccgca agcaat 16

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgaaataaat tgtggtggcc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tggagtttgt accaatgagt 20

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttcctacctg atttgagg 18

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ccctacctga tttgagg 17

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tccctacctg atccgagg 18

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

catgcctgtc cgagcgt 17

<210> 12

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cgtgcgcaga gttggg 16

<210> 13

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tgtctgccca gcacgca 17

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cctacagagc aggtgacaaa g 21

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ggtgttgagc aatacgactt gg 22

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

agacctaagc cattgtcaaa gc 22

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tggtattcca aagggcatgc 20

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ccacgttaaa ttctttcaaa caaa 24

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

attgcgccct tagggcatg 19

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tccattagtt tatactccgc ctt 23

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ctgtttgagc gtcgtttcca 20

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

tcctacctga tttgaggtcg ag 22

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

ccatatcagt atgtgggaca cga 23

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

atccctccct agatcaacac c 21

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

attgcgccct tagggcatg 19

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

tccattagtt tatactccgc ctt 23

Claims

1.一种侵袭性真菌感染的检测方法，其特征在于，所述方法为，富集纯化待测样本中真菌游离DNA片段，然后直接进行种特异性基因组片段的一步法巢式+多重荧光杂交探针PCR(Nest-PCR+Multiplex-PCR)检测，即，依据真菌rDNA保守区5.8S，18S，28S设计真菌属特异性巢式PCR引物，依据所述扩增片段中的ITS区设计真菌种特异性检测荧光探针，通过PCR多重反应对所述待测样品真菌菌种进行区分和鉴定。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述真菌为白色念珠菌Candida albicans，热带假丝酵母Candida tropicalis，近平滑假丝酵母Candida parapsilosis，克柔念珠菌Candida krusei，光滑念珠菌Candida glabrata，烟曲霉Aspergillus fumigtus中任意的一种或几种的组合。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的检测靶标为临床样本中的真菌游离DNA片段。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在利用巢式PCR的较高灵敏度的特性前提下，将常规的需分步骤多次多管完成的巢式PCR反应合并为一步单管完成。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述真菌属特异性巢式PCR引物包括如下序列的引物组合：

上游引物1，5’-3’序列：TGAAGAACGCAGCGAAAT(SEQ ID NO.1)；

下游引物1，5’-3’序列：ATATGCTTAAGTTCAGCG(SEQ ID NO.2)；

上游引物1-1，5’-3’序列：CATGCCTGTTTGAGCG(SEQ ID NO.3)；

下游引物1-2，5’-3’序列：GTCCTACCTGATTTGAGG(SEQ ID NO.4)；

与所述引物组合对应的，所述真菌种特异检测荧光探针为如下序列之任意的一种或几种的组合：

白色念珠菌(Candida albicans)的菌种特异检测荧光探针5’-3’序列为：TACCGCCGCAAGCAAT(SEQ ID NO.5)；

热带假丝酵母(Candida tropicalis)的菌种特异检测荧光探针5’-3’序列为：TGAAATAAATTGTGGTGGCC(SEQ ID NO.6)；

近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)的菌种特异检测荧光探针5’-3’序列为：TGGAGTTTGTACCAATGAGT(SEQ ID NO.7)。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述真菌属特异性巢式PCR引物包括如下序列的引物组合：

上游引物1，5’-3’序列：TGAAGAACGCAGCGAAAT(SEQ ID NO.1)；

下游引物1，5’-3’序列：ATATGCTTAAGTTCAGCG(SEQ ID NO.2)；

上游引物1-1，5’-3’序列：CATGCCTGTTTGAGCG(SEQ ID NO.3)；

下游引物2-2，5’-3’序列：TTCCTACCTGATTTGAGG(SEQ ID NO.8)；

下游引物2-3，5’-3’序列：CCCTACCTGATTTGAGG(SEQ ID NO.9)；

上游引物2-4，5’-3’序列：TCCCTACCTGATCCGAGG(SEQ ID NO.10)；

下游引物2-5，5’-3’序列：CATGCCTGTCCGAGCGT(SEQ ID NO.11)；

克柔念珠菌(Candida krusei)的菌种特异检测荧光探针5’-3’序列为：CGTGCGCAGAGTTGGG(SEQ ID NO.12)；

光滑念珠菌(Candida glabrata)的菌种特异检测荧光探针5’-3’序列为：TGTCTGCCCAGCACGCA(SEQ ID NO.13)；

烟曲霉(Aspergillus fumigtus)的菌种特异检测荧光探针5’-3’序列为：CCTACAGAGCAGGTGACAAAG(SEQ ID NO.14)。

7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述真菌种特异检测荧光探针序列上的两端化学修饰包括：

5'端：采用FAM、HEX、VIC、JOE、TAMRA、Cy3、NED、ROX、TEXAS-Red、Cy5荧光染料基团中任意三种染料的组合的化学修饰；和，

3'端：采用BHQ1或BHQ2或3IABkFQ或3IAbRQSp淬灭基团的化学修饰。

8.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述真菌种特异检测荧光探针序列为3’MGB修饰。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)对临床样本中的游离DNA进行抽取和富集；

2)对所抽取和富集的游离DNA进行荧光多重PCR扩增；

3)结果分析与判断：根据每份临床样本在各通道检测到的Ct值，通过具体探针标记基团判定其所属的具体真菌菌种类型。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述多重PCR中，退火温度在55-67℃之间，PCR扩增片段长度为50bp-500bp；引物终浓度范围为0.5-0.05uM之间；各个探针的终浓度范围为：1nM-15nM。

11.一种用于检测侵袭性真菌感染的真菌属特异性引物以及真菌种特异检测荧光探针，其特征在于，所述真菌为真菌白色念珠菌(Candida albicans)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)之任意一种或几种组合；其中，所述真菌属特异性巢式PCR引物包括如下序列的引物组合：

上游引物1，5’-3’序列：TGAAGAACGCAGCGAAAT(SEQ ID NO.1)；

下游引物1，5’-3’序列：ATATGCTTAAGTTCAGCG(SEQ ID NO.2)；

上游引物1-1，5’-3’序列：CATGCCTGTTTGAGCG(SEQ ID NO.3)；

下游引物1-2，5’-3’序列：GTCCTACCTGATTTGAGG(SEQ ID NO.4)；

相对应地，所述真菌种特异检测荧光探针为如下序列之任意的一种或几种的组合：

热带假丝酵母(Candida tropicalis)5’-3’序列：TGAAATAAATTGTGGTGGCC(SEQ IDNO.6)；

近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)5’-3’序列：TGGAGTTTGTACCAATGAGT(SEQ IDNO.7)；

和/或，

所述真菌为克柔念珠菌(Candida krusei)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、烟曲霉(Aspergillus fumigtus)之任意一种或几种组合；其中，所述真菌属巢式PCR特异性引物包括如下序列的引物组合；

上游引物1，5’-3’序列：TGAAGAACGCAGCGAAAT(SEQ ID NO.1)；

下游引物1，5’-3’序列：ATATGCTTAAGTTCAGCG(SEQ ID NO.2)；

上游引物1-1，5’-3’序列：CATGCCTGTTTGAGCG(SEQ ID NO.3)；

下游引物2-2，5’-3’序列：TTCCTACCTGATTTGAGG(SEQ ID NO.8)；

下游引物2-3，5’-3’序列：CCCTACCTGATTTGAGG(SEQ ID NO.9)；

上游引物2-4，5’-3’序列：TCCCTACCTGATCCGAGG(SEQ ID NO.10)；

下游引物2-5，5’-3’序列：CATGCCTGTCCGAGCGT(SEQ ID NO.11)；

光滑念珠菌(Candida glabrata)5’-3’序列：TGTCTGCCCAGCACGCA(SEQ ID NO.13)；

12.如权利要求11所述用于检测侵袭性真菌感染的真菌属特异性引物以及真菌种特异检测荧光探针，其特征在于，进一步包括两端经化学修饰的真菌种特异检测荧光探针；所述化学修饰包括：5'端：采用FAM、HEX、VIC、JOE、TAMRA、Cy3、NED、ROX、TEXAS-Red、Cy5荧光染料基团中任意三种染料的组合的化学修饰；和，3'端：采用BHQ1或BHQ2或3IABkFQ或3IAbRQSp淬灭基团的化学修饰。

13.一种用于检测侵袭性真菌感染的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求8所述的真菌属特异性引物以及真菌种特异检测荧光探针。

14.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：含有位于rDNA各真菌菌种种特异区段的阳性质粒标准品。

15.一种如权利要求13或14所述的试剂盒在对侵袭性真菌进行区分和鉴定中的应用。