CN107072248A - 用于制备具有高胞外多糖含量的生物质的方法 - Google Patents

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Abstract

根据本发明，发现在高含量的硫酸盐中培养分类单元网粘菌纲的细胞使得可以获得具有高EPS含量的生物质，该生物质还可以有利地进一步加工成饲料。

Description

用于制备具有高胞外多糖含量的生物质的方法
本发明涉及用于制备生物质的方法，所述生物质含有分类单元网粘菌纲(Labyrinthulomycetes)的细胞的并且具有高EPS含量。
现有技术中已经描述了用于制备含有分类单元网粘菌纲细胞的生物质的方法。
Jain等人提到了所述细胞能够产生所谓的表多糖(Exopolysaccharide,EPS)并且能够将其分泌至周围的介质(Jain等人,Marine Biotechnology 7,184–192(2005))。
WO 2007/074479描述了展现出提高的EPS生产的Schizochytrium limacinum株。
表多糖(EPS；也称作“胞外多糖”或“胞外多聚物”)代表了具有其各种可能的医疗用途的物质，如例如抗肿瘤作用、或作为抗凝血剂的作用或者作为创伤愈合促进剂的作用。在医疗领域的用途之外，也已知可能的非医疗用途，如例如作为乳剂稳定剂或泡沫稳定剂的用途。另外，推断EPS在用作动物饲养中的饲料添加剂时，还具有促进健康的作用。
因而本发明的目的是提供用于对使用分类单元网粘菌纲细胞的EPS生产进行提高的方法，或者提供具有提高的EPS含量的含网粘菌生物质。
根据本发明，出乎意料地发现，可以通过将硫酸盐添加至发酵培养基来具体提高所制备的EPS的量(甚至是在最终发酵液中获得高生物质密度的时候)。
就此而言，这表明了可以通过添加一定量的硫酸盐(从而在所得的生物质中产生25-60g/kg的硫酸盐浓度)来获得最佳的EPS产量。
由此获得的含EPS生物质的特定的优势在于，所述由此获得的生物质不仅含有EPS，还含有多不饱和脂肪酸(PUFA)作为另外的有价值的促进健康的组分。
另外，高EPS含量带来高细胞稳定性，防止PUFA过早释放至发酵液。
还有，这表明了所获得的生物质(具有25-60g/kg的硫酸盐浓度)可以很低的能量输入来进一步加工成具有高抗磨损性和高水稳定性的饲料。
本发明的另一方面因此可以认为是提供生物质，所述生物质(由于其性质)在特别好的程度上能够适宜于进一步加工成饲料。
因此本发明首先提供了用于制备含表多糖(EPS)以及优选含多不饱和脂肪酸(PUFA)的生物质的方法，特征在于生物质的制备包括在发酵培养基中培养分类单元网粘菌纲的微生物，所述发酵培养基含有一定量的硫酸盐从而在所得的生物质中产生25-60g/kg的硫酸盐浓度(基于干物质)。就此而言，所得的生物质中的硫酸盐浓度优选为25-50g/kg、特别是25-40g/kg、特别优选25-35g/kg(每种情形都基于干物质)。
根据本发明，特别有利的是即使在很高的生物质密度，都可以实现EPS生产的显著提高。因此，在本发明一个优选的实施方案中，实现了所得的发酵液每升超过50、60、或70g(特别优选超过80或90g、尤其是超过100g)的生物质密度。
由于同时可实现的高生物质产量，对于绝对的EPS产量会有进一步的提高。
本发明类似地还提供了含EPS以及优选含PUFA的生物质，其含有分类单元网粘菌纲的细胞并且可以使用本发明的方法获得。
本发明类似地提供了含EPS以及优选含PUFA的生物质，其含有分类单元网粘菌纲的细胞并具有25-60g/kg的硫酸盐含量(基于干物质)，并且优选可以通过上文所述的方法获得。所述硫酸盐含量优选为25-50g/kg、特别是25-40g/kg、特别优选25-35g/kg(每种情形都基于干物质)。
根据本发明，"硫酸盐含量"理解为是指硫酸盐的总含量，也即游离的或结合的(特别是有机结合的)硫酸盐的含量。可以认为生物质中存在硫酸盐大部分是作为表多糖的组分存在的，其参与微生物细胞壁的形成。所掺入的硫酸盐的量因此代表了所合成的EPS的量的直接指标。
根据本发明，所述硫酸盐含量优选是通过查明所获得生物质的硫含量来确定的，因为生物质中存在的大部分的硫都可归因于存在的硫酸盐。归因于其它来源的硫由于存在的硫酸盐的量而可以忽略。因而，所存在的硫酸盐的量(因而还有所形成的EPS的量)可以容易的从查明的硫的量来确定。
就此而言，生物质的硫含量优选通过依照DIN EN ISO 11885的元素分析来确定。为了对生物质的硫含量进行分析，在分析前优选用硝酸和过氧化氢在240℃压力下来破坏样品的适宜等分试样，以便确保存在的硫的自由可接近性.
本发明因此还进一步提供了用于制备含EPS以及优选含PUFA的生物质的方法，特征在于生物质的制备包括在发酵培养基中培养微生物，所述发酵培养基含有一定量的硫酸盐从而在所得的生物质中通过依照DIN EN ISO 11885的元素分析可以检测到8-20g/kg的硫含量(基于干物质)。就此而言，所得的生物质中的硫含量优选为8-17g/kg、特别是8-14g/kg、尤其优选8-12g/kg(每种情形都基于干物质)。
本发明因此还进一步提供了含EPS以及优选含PUFA的生物质，特征在于通过依照DIN EN ISO 11885的元素分析可以检测到8-20g/kg的硫含量(基于干物质)。就此而言，所得的生物质中的硫含量优选为8-17g/kg、特别是8-14g/kg、特别优选8-12g/kg(每种情形都基于干物质)。
根据本发明，本发明生物质的磷含量就干物质而言优选为1-6g/kg、特别是2-5g/kg。所述磷含量同样优选通过依照DIN EN ISO 11885的元素分析来查明。
本发明的生物质优选包含细胞，并且优选基本上由以下分类单元的那些细胞组成：网粘菌纲(Labyrinthulea，网粘菌(slime nets))，特别是破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)的那些。破囊壶菌科包括以下属：Althomia属、不动茶菌属(Aplanochytrium)、Elnia属、日本壶菌属(Japonochytrium)、裂殖壶菌属(Schizochytrium)、破囊壶菌属(Thraustochytrium)、Aurantiochytrium属、Oblongichytrium属、和吾肯氏壶菌属(Ulkenia)。特别优选以下属的细胞：破囊壶菌属、裂殖壶菌属、Aurantiochytrium属或Oblongichytrium属，特别是Aurantiochytrium属。特别优选的株是Aurantiochytrium limacinum SR21(IFO 32693)株。
本发明的生物质优选采用发酵培养过程的产物的形式。因此，所述生物质可不仅含有要进行破碎的细胞还可含有发酵培养基的组分。这些组分可以采用特别是盐、消泡剂和未反应的碳源和/或氮源的形式。此生物质中的细胞含量优选为至少70％的重量、优选至少75％的重量。任选地，所述生物质中的细胞含量可以通过适宜的洗涤步骤来提升至，例如至少80％或至少90％的重量。
生物质中的细胞优选区别在于，其在每种情形中基于细胞干物质计含有至少20％重量的、优选至少30％重量的、特别是至少35％重量的PUFA。
在优选的实施方案中，脂质的大部分以甘油三酯的形式存在，且优选至少50％重量的、特别是至少75％重量的、以及在特别优选的实施方案中至少90％重量的细胞中存在的脂质是以甘油三酯的形式存在。
优选地，至少10％重量的、特别是至少20％重量的、特别优选20-60％重量的、特别是20-40％重量的细胞中存在的脂肪酸是PUFA。
根据本发明，多不饱和脂肪酸(PUFA)理解为是指具有至少两个C-C双键的脂肪酸。根据本发明，在PUFA中优选高度不饱和的脂肪酸(HUFA)。根据本发明，HUFA理解为是指具有至少四个C-C双键的脂肪酸。
所述PUFA在细胞中可以游离的或者结合的形式存在。以结合的形式存在的实例为PUFA的磷脂和酯，特别是单酰基-、二酰基-、和三酰基-甘油酯。在优选的实施方案中，所述PUFA的大部分是以甘油三酯的形式存在的，且优选至少50％重量的、特别是至少75％重量的、在特别优选的实施方案中至少90％重量的细胞中存在的PUFA以甘油三酯的形式存在。
优选的PUFA为ω-3脂肪酸和ω-6脂肪酸，且特别优选ω-3脂肪酸。本文优选的ω-3脂肪酸为二十碳五烯酸(EPA,20:5ω-3)、特别是(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酸，以及二十二碳六烯酸(DHA,22:6ω-3)、特别是(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酸，且特别优选二十二碳六烯酸。
用于产生含PUFA细胞(特别是破囊壶菌目(Thraustochytriales)的细胞)的方法在现有技术中已有详细描述(参见，例如WO91/07498,WO94/08467,WO97/37032,WO97/36996,WO01/54510)。一般来说，通过在碳源和氮源的存在下在发酵罐中培养细胞来进行生产。在此背景下，可以获得超过每升100克的生物质密度以及超过每小时每升0.5克脂质的生产率。该方法优选以已知为分批补料的方法来进行，也即碳和氮源在发酵期间进行渐增补料。一旦已经获得期望的生物质，则可以通过各种手段来诱导脂质的产生，例如通过限制氮源、碳源或氧气含量或者这些的组合。
适宜的碳源有醇和非醇碳源。醇碳源的实例有甲醇、乙醇和异丙醇。非醇碳源的实例有果糖、葡萄糖、蔗糖、糖蜜、淀粉和玉米糖浆。
适宜的氮源有无机的和有机的氮源。无机氮源的实例有硝酸盐和铵盐，特别是硫酸铵和氢氧化铵。有机氮源地实例有氨基酸，特别是谷氨酸盐，以及尿素。
根据本发明，在所得的生物质中期望的硫酸盐含量可以不同的方式来实现。
例如，在已知为分批的方法中，所需要的硫酸盐的量在开始的时候可以起始进行完全的添加。所需的硫酸盐的量可以容易地进行计算，因为用于形成生物质的细胞几乎完全吸收硫酸盐。
当使用已知为分批补料的方法时，所需要的硫酸盐的量还可以在发酵的过程中进行计量，或者相应地，可以初始添加一些硫酸盐并在发酵过程中进行计量。
特别是在发酵过程中当显现出所产生的生物质的量超过了原本计算的值时，可以通过随后对硫酸盐的计量来确保所得的生物质具有充分的细胞稳定性。
根据本发明，所使用的硫酸盐优选为硫酸钠、硫酸铵或硫酸镁以及其混合物。
在发酵期间，就液体发酵培养基(包括存在的生物质)而言的氯化物含量，优选总是低于3g/kg、特别是低于1g/kg、特别优选低于400mg/kg发酵培养基。
在所使用的硫酸盐以及任何氯化物之外，还可以在发酵期间任选使用其它的盐，特别是选自碳酸钠、碳酸氢钠、苏打灰或无机磷化合物的那些。
如果使用了其它的盐，则优选以这样的量使用：每一种在发酵期间就液体发酵培养基(包括存在的生物质)而言，在每种情形发酵培养基中都总是低于10g/kg、特别是低于5g/kg、特别优选低于3g/kg的量。
根据本发明，在整个发酵过程期间，发酵培养基(包括存在的生物质)中总的盐含量优选总是低于35g/kg、特别是低于30g/kg。特别优选地，在整个发酵过程期间，就液体发酵培养基(包括存在的生物质)而言的总的盐含量，为10-35g/kg、特别是12-30g/kg。
根据本发明，在整个发酵过程中，发酵培养基(包括存在的生物质)中的硫酸盐含量优选总是在5-16g/kg。
另外，也可以将有机磷化合物和/或已知的生长刺激物质(如例如，酵母提取物或玉米浆)添加至发酵培养基，从而对发酵产生积极效果。
细胞优选在3-11(特别是4-10)的pH进行发酵，以及优选在至少20℃的温度(特别是20-40℃、特别优选至少30℃)。通常的发酵过程需要大约100小时。
根据本发明，优选将细胞发酵至至少50、60或70g/l(特别是至少80或90g/l、特别优选至少100g/l)的生物质密度。在此情形中，所述数据是基于发酵结束后相对于发酵液总体积的干生物质含量。干生物质的含量是通过如下来确定的：从发酵液中过滤掉生物质、随后用水洗涤、继而完全干燥(例如在微波炉中)、和最后确定干重。
在收获细胞之后(或者任选在收获细胞之前不久)，细胞优选经过巴氏消毒以便将细胞杀死并且使可促进脂质降解的酶失活。
在发酵已经结束之后，收获生物质。通过离心、过滤、倾倒或溶剂蒸发的手段，可以从生物质去除大部分的发酵培养基。溶剂蒸发优选使用鼓式干燥器、隧道式干燥器、通过喷雾干燥或真空蒸发的手段来实现。特别是，也可以使用旋转蒸发器、薄膜蒸发器或降膜蒸发器来实现溶剂蒸发。溶剂蒸发可用的替代例如有，用于浓缩发酵液的逆渗透。随后，所获得的生物质任选进一步干燥，优选通过流化床制粒的手段。优选地，通过干燥过程将水分含量减少至低于15％的重量、特别是减少至低于10％的重量、特别优选减少至低于5％的重量。
根据本发明，"干物质"因而优选理解为是指具有低于10％重量的、特别是低于5％重量的水分含量的生物质。
在本发明特别优选的实施方案中，所述生物质依照本发明是在流化床制粒过程或喷嘴喷雾干燥过程中进行干燥的，例如在EP13176661.0中描述的。
在干燥过程期间，可任选将硅石添加至生物质作为抗结块剂，从而可将生物质转化为更易于处理的状态。为此目的，优选将包含生物质以及还有硅石的发酵液喷雾至特定的干燥区。或者，优选仅在干燥过程后将所述生物质与硅石混合。就此而言，可以特别提及的还是专利申请EP13187631.0。
优选通过所述干燥过程获得自由流动的、细粒或粗粒的产物(优选为粒状)。可以任选从经筛分或粉尘分离所获得的粒状来得到具有期望颗粒大小的产物。
得到了提供自由流动的细粒粉末，这可以任选转化为粗粒的、自由流动的大部分无粉尘的产物，其可以通过适宜的压实或制粒过程来储存。
常规的有机或无机辅助物或支持物如淀粉、明胶、纤维素衍生物或类似物质(其通常用于食品加工或在食品加工中用作粘合剂、胶凝剂或增稠剂)，可任选用于此随后的制粒或压实过程。
根据本发明，“自由流动”理解为是指能够从一系列具有不同大小流出开口的玻璃外流容器(至少从具有5毫米开口的容器)不受阻滞地流出的粉末(Klein:Seifen,Fette,Wachse 94,12(1968))。
根据本发明，“细粒”理解为是指具有直径20-100微米颗粒大小的主要部分(>50％)的粉末。
根据本发明，“粗粒”理解为是指具有直径100-2500微米颗粒大小的主要部分(>50％)的粉末。
根据本发明，“无粉尘”理解为是指仅含有很少部分(<10％，优选<5％)小于100微米颗粒大小的粉末。
颗粒大小根据本发明优选通过激光衍射光谱测定方法来确定。可能的方法在R.H.Müller和R.Schuhmann的教科书"in der Laborpraxis"[实验室颗粒大小测量],Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart(1996)中以及在M.Rhodes的教科书"Introduction to Particle Technology",Wiley&Sons(1998)中有描述。由于可以使用各种方法，因此优选使用R.H.Müller和R.Schuhmann的教科书中所引用的用于测量颗粒大小的第一个可用的方法。
通过本发明干燥方法获得的产物优选具有至少80％重量的、特别是至少90％重量的、特别优选至少95％重量的颗粒部分，所述颗粒具有100-3500微米、优选100-3000微米、尤其是100-2500微米的颗粒大小。
根据本发明获得的流化床制粒方法产物在此情形中优选具有至少80％重量的、特别是至少90％重量的、特别优选至少95％重量的颗粒部分，所述颗粒具有200-3500微米、优选300-3000微米、尤其是500-2500微米的颗粒大小。
根据本发明获得的喷雾干燥方法的产物相反优选具有至少80％重量的、特别是至少90％重量的、特别优选至少95％重量的颗粒部分，所述颗粒具有100-500微米、优选100-400微米、尤其是100-300微米的颗粒大小。
根据本发明获得的喷雾干燥方法和随后的制粒方法的产物优选具有至少80％重量的、特别是至少90％重量的、特别优选至少95％重量的的颗粒部分，所述粒具有100-1000微米的颗粒大小。
粉尘的部分(也即具有小于100微米颗粒大小的颗粒)，优选最多为10％的重量、特别是最多8％的重量、特别优选最多5％的重量、尤其是最多3％的重量。
根据本发明的产物的堆积密度优选为400-800kg/m3，特别优选为450-700kg/m3。
根据本发明，特别表明了本发明的生物质可以低能量输入进一步加工成具有高油负载能力、高抗磨损性和高水稳定性的饲料。
本发明因此还进一步提供了包含本发明的生物质以及还有另外的饲料组分的饲料。
就此而言，所述另外的饲料组分优选选自含蛋白的、含碳水化合物的、含核酸的、和脂可溶的成分，以及适宜的情形下，还有含脂肪的成分以及另外的其它添加剂如矿物质、维生素、色素和氨基酸。此外，在营养物之外还可以存在结构剂(structurant)，例如以便改善饲料的质地和外观。另外，也可以使用例如粘合剂，以便影响饲料的一致性。优选使用的且构成营养物和结构剂的成分是淀粉。
根据本发明，本发明的饲料或用于产生本发明饲料的组合物优选区别在于，其含有2-24％重量的、优选4-22％重量的、特别是9-20％重量的、尤其是11-18％重量的量的本发明生物质。
所述饲料或用于产生饲料的组合物优选还具有至少一个、优选所有的以下性质：
a)33-67％重量的、优选39-61％重量的、特别是44-55％重量的总蛋白含量；
b)5-25％重量的、优选8-22％重量的、特别是10-20％重量的、尤其是12-18％重量的总脂肪含量；
c)最多25％重量的、特别是最多20％重量的、优选6-17％重量的、特别优选8-14％重量的总淀粉含量；
d)2-13％重量的、优选3-11％重量的、特别是4-10％重量的、尤其是5.5-9％重量的多不饱和脂肪酸(PUFA)含量；
e)1-7％重量的、优选1.5-5.5％重量的、特别是2-5％重量的、尤其是2.5-4.5％重量的ω-3脂肪酸含量；
f)0.5-3％重量的、优选0.8-2.8％重量的、特别是1-2.8％重量的、尤其是1.3-2.4％重量的、特别是1.3-2.2％重量的DHA含量。
本发明因此优选还提供了饲料或适宜用于产生饲料的组合物，其具有至少一种、优选所有的以下性质：
a)33-67％重量的、优选39-61％重量的、特别是44-55％重量的总蛋白含量；
b)5-25％重量的、优选8-22％重量的、特别是10-20％重量的、尤其是12-18％重量的总脂肪含量；
c)最多25％重量的、特别是最多20％重量的、优选6-17％重量的、特别优选8-14％重量的总淀粉含量；
d)2-13％重量的、优选3-11％重量的、特别是4-10％重量的、尤其是5.5-9％重量的多不饱和脂肪酸(PUFA)含量；
e)1-7％重量的、优选1.5-5.5％重量的、特别是2-5％重量的、尤其是2.5-4.5％重量的ω-3脂肪酸含量；
f)0.5-3％重量的、优选0.8-2.8％重量的、特别是1-2.8％重量的、尤其是1.3-2.4％重量的、特别是1.3-2.2％重量的DHA含量。
本发明因此优选还提供了饲料或适宜用于产生饲料的组合物，其具有至少一种、优选所有的以下性质：
a)33-67％重量的、优选39-61％重量的、特别是44-55％重量的总蛋白含量；
b)5-25％重量的、优选8-22％重量的、特别是10-20％重量的、尤其是12-18％重量的总脂肪含量；
c)最多25％重量的、特别是最多20％重量的、优选6-17％重量的、特别优选8-14％重量的总淀粉含量；
d)2-24％重量的、优选4-22％重量的、特别是9-20％重量的、尤其是11-18％重量的本发明生物质含量，特别是本发明网粘菌纲生物质，优选本发明破囊壶菌科生物质；
e)2-13％重量的、优选3-11％重量的、特别是4-10％重量的、尤其是5.5-9％重量的多不饱和脂肪酸(PUFA)含量；
f)1-7％重量的、优选1.5-5.5％重量的、特别是2-5％重量的、尤其是2.5-4.5％重量的ω-3脂肪酸含量；
g)0.5-3％重量的、优选0.8-2.8％重量的、特别是1-2.8％重量的、尤其是1.3-2.4％重量的、特别是1.3-2.2％重量的DHA含量。
本发明因此优选还提供了饲料或适宜用于产生饲料的组合物，其具有至少一种、优选所有的以下性质：
a)33-67％重量的、优选39-61％重量的、特别是40-50％重量的总蛋白含量；
b)5-25％重量的、优选8-22％重量的、特别是10-20％重量的、尤其是12-18％重量的总脂肪含量；
c)最多25％重量的、特别是最多20％重量的、优选6-17％重量的、特别优选8-14％重量的总淀粉含量；
d)2-24％重量的、优选4-22％重量的、特别是9-20％重量的、尤其是11-18％重量的本发明Aurantiochytrium生物质含量，优选本发明Aurantiochytrium limacinum生物质含量，尤其是本发明Aurantiochytrium limacinum SR21生物质含量；
e)2-13％重量的、优选3-11％重量的、特别是4-10％重量的、尤其是5.5-9％重量的多不饱和脂肪酸(PUFA)含量；
f)1-7％重量的、优选1.5-5.5％重量的、特别是2-5％重量的、尤其是2.5-4.5％重量的ω-3脂肪酸含量；
g)0.5-3％重量的、优选0.8-2.8％重量的、特别是1-2.8％重量的、尤其是1.3-2.4％重量的、特别是1.3-2.2％重量的DHA含量。
通过挤压上述组合物，可以获得具有至少91％(特别是至少92％、93％、或94％)的抗磨损性的挤出物。本发明优选提供所述挤出物。
根据本发明，抗磨损性如下确定：使用Holmen粒料(pellet)测试仪NHP100(Borregaard Lignotech,Hull,UK)将干燥的挤出物(具有4mm的直径和4mm的长度)暴露于机械负载。在进行该测试之前，对样品进行筛选以便去除任何附着的精细颗粒。随后使用2.5mm的过滤筛子将经加工的样品(100g)引入粒料测试仪。然后以高气流速度(约70mbar)使所述粒料经具有直角弯管的管道传送30秒。实验参数通过设备预先确定。随后，通过称重来确定磨损。抗磨损性以PDI(粒料耐久性指数)进行说明，其定义为已进行了所述测试之后样品留在过滤筛子中的百分比量。用三份样品进行所述测试并继而确定均值。
证明了当以12-28Wh/kg、特别是14-26Wh/kg、特别优选16-24Wh/kg、尤其是18-22Wh/kg的能量输入完成挤压时，根据本发明是特别有利的。
就此而言，在挤压过程中特别优选使用螺杆或双螺杆挤出机。挤压过程优选在80-220℃、特别是80-130℃、尤其是95-110℃的温度进行，10-40bar的气压，和100-1000rpm、特别是300-700rpm的轴转速。所引入的混合物的停留时间优选为5-30秒、特别是10-20秒。
挤压过程可任选包括压实步骤和/或压缩步骤。
优选在进行挤压过程之前将成分彼此密切混合。这优选在装配有风向标的鼓中进行。在优选的实施方案中，此混合步骤包括蒸汽的注入，特别是以便引起优选存在的淀粉的膨胀。在此情形中，蒸汽的注入优选以1-5bar的气压进行，特别优选2-4bar的气压。
在与藻类生物质混合前，另外的饲料或饲料组分优选经粉碎(若需要的话)，以便确保在混合步骤中获得均质的混合物。另外的饲料或饲料组分的粉碎可以例如使用锤式粉碎机来进行。
所产生的挤出物优选具有1-14mm、优选2-12mm、特别是2-6mm的直径，以及优选还具有1-14mm、优选2-12mm、特别是2-6mm的长度。挤出物的长度在挤压过程中通过使用切割工具来设定。挤出物的长度优选经过选择，从而其大约对应于挤出物的直径。挤出物的直径是通过选择筛子的直径来给定的。
在本发明优选的一个实施方案中，挤压过程随后是所得的负载油的挤出物。为此，初始优选将所述挤出物干燥至最多5％重量的水分含量。根据本发明，可以通过例如将挤出物置于油中或者将挤出物与油进行喷雾来使挤压产物负载油；然而，根据本发明，优选真空涂敷(vacuum coating)。
以此方式，获得了含有本发明生物质的饲料，所述生物质优选是2-22％重量的、特别是4-20％重量的、特别优选8-18％重量的、尤其是10-16％重量的量。
因此，所述饲料优选另外还具有至少一种、优选所有的以下性质：
a)30-60％重量的、优选35-55％重量的、特别是40-50％重量的总蛋白含量；
b)15-35％重量的、优选18-32％重量的、特别是20-30％重量的、尤其是22-28％重量的总脂肪含量；
c)最多25％重量的、特别是最多20％重量的、优选5-15％重量的、特别优选7-13％重量的总淀粉含量；
d)2-12％重量的、优选3-10％重量的、特别是4-9％重量的、尤其是5-8％重量的多不饱和脂肪酸(PUFA)含量；
e)1-6％重量的、优选1.5-5％重量的、特别是2-4.5％重量的、尤其是2.5-4％重量的ω-3脂肪酸含量；
f)0.5-3％重量的、优选0.8-2.5％重量的、特别是1-2.5％重量的、尤其是1.2-2.2％重量的、特别是1.2-2.0％重量的DHA含量。
本发明因此优选还提供了饲料(特别是挤出物)，其具有至少一种、优选所有的以下性质：
a)30-60％重量的、优选35-55％重量的、特别是40-50％重量的总蛋白含量；
b)15-35％重量的、优选18-32％重量的、特别是20-30％重量的、尤其是22-28％重量的总脂肪含量；
c)最多25％重量的、特别是最多20％重量的、优选5-15％重量的、特别优选7-13％重量的总淀粉含量；
d)2-12％重量的、优选3-10％重量的、特别是4-9％重量的、尤其是5-8％重量的多不饱和脂肪酸(PUFA)含量；
e)1-6％重量的、优选1.5-5％重量的、特别是2-4.5％重量的、尤其是2.5-4％重量的ω-3脂肪酸含量；
f)0.5-3％重量的、优选0.8-2.5％重量的、特别是1-2.5％重量的、尤其是1.2-2.2％重量的、特别是1.2-2.0％重量的DHA含量。
本发明因此优选还提供了饲料(特别是挤出物)，其具有至少一种、优选所有的以下性质：
a)30-60％重量的、优选35-55％重量的、特别是40-50％重量的总蛋白含量；
b)15-35％重量的、优选18-32％重量的、特别是20-30％重量的、尤其是22-28％重量的总脂肪含量；
c)最多25％重量的、特别是最多20％重量的、优选5-15％重量的、特别优选7-13％重量的总淀粉含量；
d)2-22％重量的、优选4-20％重量的、特别是8-18％重量的、尤其是10-16％重量的本发明生物质含量，特别是本发明的网粘菌纲生物质，优选本发明的破囊壶菌科生物质；
e)2-12％重量的、优选3-10％重量的、特别是4-9％重量的、尤其是5-8％重量的多不饱和脂肪酸(PUFA)含量；
f)1-6％重量的、优选1.5-5％重量的、特别是2-4.5％重量的、尤其是2.5-4％重量的ω-3脂肪酸含量；
g)0.5-3％重量的、优选0.8-2.5％重量的、特别是1-2.5％重量的、尤其是1.2-2.2％重量的、特别是1.2-2.0％重量的DHA含量。
本发明因此优选还提供了饲料(特别是挤出物)，其具有至少一种、优选所有的以下性质：
a)30-60％重量的、优选35-55％重量的、特别是40-50％重量的总蛋白含量；
b)15-35％重量的、优选18-32％重量的、特别是20-30％重量的、尤其是22-28％重量的总脂肪含量；
c)最多25％重量的、特别是最多20％重量的、优选5-15％重量的、特别优选7-13％重量的总淀粉含量；
h)2-22％重量的、优选4-20％重量的、特别是8-18％重量的、尤其是10-16％重量的本发明Aurantiochytrium生物质含量，优选本发明Aurantiochytrium limacinum生物质含量，尤其是本发明Aurantiochytrium limacinum SR21生物质含量；
d)2-12％重量的、优选3-10％重量的、特别是4-9％重量的、尤其是5-8％重量的多不饱和脂肪酸(PUFA)含量；
e)1-6％重量的、优选1.5-5％重量的、特别是2-4.5％重量的、尤其是2.5-4％重量的ω-3脂肪酸含量；
f)0.5-3％重量的、优选0.8-2.5％重量的、特别是1-2.5％重量的、尤其是1.2-2.2％重量的、特别是1.2-2.0％重量的DHA含量。
本发明优选还提供可通过油涂敷获得的上述挤出物(并且优选具有至少96％、特别是至少97或98％的水稳定性)。
水稳定性基本上如Baeverfjord等人(2006；Aquaculture 261,1335-1345)中所述进行，有少许改动。将10g挤出物的样品(在每种情形中具有4mm的长度和直径)引入至具有6.5mm直径和0.3mm网格大小的金属灌注框(Inox,Germany)中。随后将所述灌注框引入至含有水的塑料槽中，并且样品因而完全被水覆盖。随后使用Multiorbital摇动器PSU-20I(Biosan,Latvia)将所述槽暴露于每分钟30摇动单位的摇动搅拌30分钟。之后，使用印迹纸小心地将样品干燥，并继而在其以105℃烤箱烘干24小时之前和之后称重。水稳定性计算为样品在水中温育之前和之后干重的差异，并表示为所使用样品在与水温育之前干重的百分比。
根据本发明，在要根据本发明使用的生物质之外，所使用的含脂肪的成分还可以是，动物和植物来源的脂肪(特别是油)。根据本发明，适宜的含脂肪成分特别是植物油，例如大豆油、菜籽油、葵花籽油、亚麻籽油或棕榈油以及其混合物。另外，也可以任选以低量将鱼油用作含脂肪成分。
优选地，本发明具有至少96％、97％或98％抗磨损性的饲料，以3-18％重量的、特别是5-15％重量的、尤其是7-13％重量的量含有植物油。如上文所述，就此而言的所述植物油优选以随后进行的方式应用于挤出物，特别是通过真空涂敷。
根据本发明，所使用的含蛋白成分可以例如是，大豆蛋白、豌豆蛋白、小麦面筋或玉米面筋以及其混合物。
以下的实例可用作还另外含有脂肪的含蛋白成分：鱼粉、磷虾粉、双壳贝类粉、鱿鱼粉或虾粉。这在后文归入术语"海产粉"。在优选的实施方案中，本发明的饲料以3-18％重量的、特别是5-15％重量的、尤其是7-13％重量的量包含海产粉(优选鱼粉)。
所使用的含碳水化合物成分可以例如是，小麦粉、葵花粉、大豆粉以及其混合物。
当在动物养殖中使用本发明的饲料(特别是本发明油涂敷的挤出物)时，这表明了其特别促进动物的生长并且改善动物的应激水平。
本发明还进一步提供了用于养殖动物的方法，特征在于向它们施用本发明的饲料。
就此而言，本发明特别提供了用于提高动物生长的方法，特征在于向它们施用本发明的饲料。
本发明类似地还特别提供了用于在动物的肌肉组织中提高ω-3脂肪酸(特别是DHA)部分的方法，特征在于向它们施用本发明的饲料。
优选地在本发明的方法中，至少每两天施用饲料、优选每天施用一次。
本发明还类似地提供了本发明的饲料用于提高动物生长的用途。
本发明同样还提供了本发明的饲料用于在动物肌肉组织中提高ω-3脂肪酸部分的用途。
本发明同样还提供了本发明的饲料用于改善动物的身体状况、特别是用于改善动物的应激水平的用途。
本发明同样还提供了本发明的饲料用于使得可以对动物进行应激减少的(stress-reduced)养殖的用途。
用本发明的饲料喂养的养殖动物优选是家禽、猪或牛.
然而，养殖的动物特别优选是海产动物，特别优选有鳍鱼类或甲壳类。这些特别包括，鲤鱼(carp)、罗非鱼(tilapia)、鲶鱼(catfish)、金枪鱼、鲑鱼、鳟鱼(trout)、澳洲肺鱼(barramundi)、鲷鱼(bream)、鲈鱼(perch)、鳕鱼(cod)、虾、龙虾、蟹、对虾和鳌虾(crayfish)。养殖的动物特别优选鲑鱼。在此背景下鲑鱼的优选类型有大西洋鲑鱼(Atlantic salmon)、红鲑鱼(red salmon)、樱鲑鱼(masu salmon)、大鳞鲑鱼(kingsalmon)、大麻哈鱼(keta salmon)、银鲑鱼(coho salmon)、哲罗鲑鱼(Danube salmon)、太平洋鲑鱼(Pacific salmon)和细鳞鲑鱼(pink salmon)。
所养殖的动物也可以特别是随后加工成鱼粉或鱼油的鱼类。就此而言，所述鱼类优选是青鱼(herring)、青鳕鱼(pollack)、鲱鱼(menhaden)、凤尾鱼(anchovy)、香鱼(capelin)或鳕鱼。由此获得的鱼粉或鱼油继而可在水产中用于养殖食用鱼类或甲壳类。
然而，养殖的动物也可以是在水产中用作饲料的小生物体。这些小生物体可以采取例如，线虫类(nematodes)、甲壳类或轮虫类(rotifers)的形式。
海产动物的养殖可以在池塘、水箱、盆又或者在海洋或湖泊中隔离的区域中进行，特别是在此情形中于笼或网箱中进行。养殖可用于养殖最终食用的鱼类，也可以用于养殖鱼苗(其随后被释放从而补充野生鱼类的存量)。
在鲑鱼养殖中，优选首先将该鱼在清水箱或人工水道中培养成二龄鲑(smolt)，并继而在漂浮于海中的笼或网箱(其优选锚定在海湾和峡湾中)中培养。
因此，本发明的饲料优选是用于养殖上文提到的动物的饲料。
实施例
实施例1:通过Aurantiochytrium limacinum SR21在不同硫酸钠含量的培养基中的发酵来产生生物质
使用具有2升发酵体积的钢发酵罐在补料过程中将细胞培养大约75h，其中总的起始质量为712g并且获得的总最终质量为1.3-1.5kg。在该过程中，在(分批补料过程)中测量葡萄糖溶液(570g/kg的葡萄糖)。
起始培养基的组成如下：
培养基1:20g/kg的葡萄糖；4g/kg的酵母提取物；2g/kg的硫酸铵；2.46g/kg的硫酸镁(七水)；0.45g/kg的氯化钾；4.5g/kg的磷酸二氢钾；0.1g/kg的硫胺(HCl)；5g/kg的微量元素溶液。
培养基2:为每份培养基1外加8g/kg的硫酸钠
培养基3:为每份培养基1外加12g/kg的硫酸钠
培养基4:为每份培养基1外加16g/kg的硫酸钠
微量元素溶液的组成如下：35g/kg的盐酸(37％)；1.86g/kg的氯化锰(四水)；1.82g/kg的硫酸锌(七水)；0.818g/kg的EDTA钠；0.29g/kg的硼酸；0.24g/kg的钼酸钠(二水)；4.58g/kg的氯化钙(二水)；17.33g/kg的硫酸铁(七水)；0.15g/kg的氯化铜(二水)。
在以下的条件下进行培养：培养温度28℃；通气速率0.5vvm，搅拌器速度600-1950rpm，使用氨水(25％v/v)在生长期将pH控制在4.5。实现了以下的生物质密度：100g/l(培养基1)、111g/l(培养基2)、114g/l(培养基3)、116g/l(培养基4)。所得的发酵液的粘度随着硫酸盐含量的提高而明显提高，并且是特定的所得发酵液中EPS含量提高的证据。
在培养过程之后，将发酵液加热至60℃达20分钟以防止进一步的细胞活性。
实施例2:确定生物质的DHA含量
在失活之后，对所获得的生物质进行脂肪酸分析。为此，将0.2-0.5ml的每种发酵液与1ml的内部标准物混合并用9ml的甲醇/氯仿溶液(1:2；v/v)填满。将样品在超声浴中处理10分钟。随后，将该样品在氮气层下于50℃恒温仪(thermal block)中浓缩至干燥。将2ml的0.5N KOH添加至每种干燥残余中，并在100℃温育15分钟。随后，将样品冷却至室温，每种情况中与2ml的0.7N HCl和1ml的三氟化硼溶液(甲醇中14％的BF3)混合，并在100℃再温育15分钟。在冷却至室温后，用3ml的水和2ml的庚烷组成的混合物来萃取每种所述样品。在以2000rpm离心1分钟后，将1ml的每种上层相转移至GC小管并通过气相色谱进行分析。
该分析反映出所有的四种生物质都含有超过32％重量的DHA部分(相对于存在的脂肪酸总量)。
实施例3:将所获得的生物质干燥
将根据实施例1的冷却的含生物质发酵液(具有不同含量的Na2SO4)每种分别进行喷雾干燥。
在每种情形中使用Büchi微型喷雾干燥仪B-290来进行喷雾干燥(喷嘴口直径：0.7mm；喷气流速：742L/h；抽吸流速：35m3/h；入口空气温度：220℃；出口空气温度：80℃)。
实施例4:确定喷雾干燥的样品的硫酸盐和DHA含量
对通过喷雾干燥发酵液(具有不同含量的Na2SO4)所获得的样品进行硫酸盐或硫确定以及DHA浓度确定。DHA确定如实施例2所述进行。硫含量依照DIN EN ISO 11885确定。
表1:喷雾干燥的样品的分析
硫含量的确定确认了，随着发酵培养基中硫酸盐含量的提高，越来越多的硫酸盐也掺入至可获得的生物质中，并且这是大大增加的EPS形成的进一步的证据。
实施例4:确定结块倾向(caking tendency)
在具有不同含量的硫酸钠的培养基中发酵之后获得的发酵液在喷雾干燥过程中展现出明显差异，并且所获得的喷雾干燥的材料展现出不同的结块倾向，其基础为释放的油。通过在培养基3和4中发酵获得的生物质显示出明显较低的结块倾向(相较于通过在培养基1和2中发酵获得的生物质)。这是相关生物质中细胞的细胞稳定性(其由于EPS形成的增加而得以提高)的证明。
实施例5:将来自实施例1的富含硫酸盐的生物质干燥以用于生产饲料的目的
对富含硫酸盐的培养基4中获得的来自实施例1的生物质进行两阶段的干燥过程，以用于生产饲料的目的：首先，将发酵液通过干燥成大约20％重量的干物质来进行浓缩。在这之后使用Production MinorTM喷雾干燥器(GEA NIRO)以340℃的干燥空气入口温度来将浓缩的发酵液喷雾干燥。通过喷雾干燥的手段，由此获得了具有超过95％重量的干物质的粉末。
实施例6:通过挤压产生饲料
产生了表3中所示的饲料混合物。除了要根据本发明实施例5使用的生物质之外，还对另外两种可商业购买的网粘菌纲生物质以及还有鱼油(目前仍作为ω-3脂肪酸的常规来源)进行了测试，以做比较。
每种饲料混合物都是通过使用双螺旋混合器(型号500L,TGC Extrusion,France)将化合物(除了油例外)混合来产生的。继而使用锤式粉碎机(型号SH1,Hosokawa-Alpine,Germany)将由此获得的混合物粉碎成小于250μm的颗粒大小。
表2:挤压过程中所使用的饲料组成(数据为重量％)
对于挤压过程，在每个情况中对每份饲料使用了140kg。使用具有55.5mm的螺杆直径和90-100kg/h的最大流速的双螺杆挤出机(CLEXTRAL BC45)来进行所述挤压过程。挤压出大小4.0mm(直径和长度)的粒料(pellet)。为此，所述挤出机装配有高速切割器以便将产物转化为需要的粒料大小。
继而测试了各种挤压参数，以便找出在何种挤压条件下才可以获得所得挤出物的最佳油负载能力。就此而言，这出乎意料地表明，用很低的能量输入就能够实现最佳的油负载能力。就此而言，能量输入明显低于使用鱼油的时候。另外，对于本发明优选使用的藻类生物质的情况，最佳能量输入也明显低于商业可得藻类生物质的情况。结果在表3中示出。
表3:与产生具有期望油负载能力的粒料相关的能量输入
就此而言，变量"SME"是比机械能(specific mechanical energy)。其如下计算：
其中
U:马达的操作电压(此处为460V)
I:马达的电流(A)
cosΦ:挤出机马达的理论性能(此处为0.95)
测试SS:旋转螺杆的测试速度(rpm)
最大SS:旋转螺杆的最大速度(267rpm)
QS:糊状物(mash)的出口流速(kg/h)
挤压之后，在振动流化床干燥机(型号DR100,TGC Extrusion,France)中将挤出物干燥。
在挤出物已冷却后，随后是通过真空涂敷(真空涂层PG-10VCLAB,Dinnisen,theNetherlands)的手段进行的油涂敷过程。
实施例7:查明来自实施例6的饲料的抗磨损性和水稳定性
如下来查明抗磨损性：在负载油之前，使用Holmen粒料测试仪(BorregaardLignotech,Hull,UK)将干燥的挤压产物暴露于机械负载。在进行该测试之前，对样品进行筛选以便去除任何附着的精细颗粒。随后使用2.5mm的过滤筛子将经加工的样品(100g)引入粒料测试仪。然后以高气流速度使所述粒料经具有直角弯管的管道传送30秒。随后，通过称重来确定磨损。抗磨损性以PDI(粒料耐久性指数)进行说明，其定义为样品留在过滤筛子中的百分比量。用三份样品进行所述测试并继而确定均值。
使用负载油的样品来进行水稳定性。该方法基本上如Baeverfjord等人(2006；Aquaculture 261,1335-1345)中所述进行，有少许改动。将10g样品引入至具有0.3mm网格大小的金属灌注框(metallic infusion basket)中。随后将所述灌注框引入至含有水的塑料槽中，并且样品因而完全被水覆盖。随后将所述槽暴露于每分钟30摇动单位的摇动搅拌30分钟。之后，使用印迹纸小心地将样品干燥，并继而在其以105℃烤箱烘干24小时之前和之后称重。水稳定性计算为样品在水中温育之前和之后干重的差异，并表示为所使用样品在与水温育之前干重的百分比。
结果在下表4中示出。
样品 M1 M2 M3 M4
抗磨损性[％] 90.0 93.3 88.3 85.2
水稳定性[％] 95.7 98.5 93.8 90.2
可以发现，与含有商业可得的网粘菌纲生物质或鱼油作为ω-3脂肪酸来源的饲料相比，含有本发明生物质(具有高EPS含量)的本发明饲料具有明显更高的抗磨损性和水稳定性。

Claims (15)

1.用于制备具有高EPS含量的生物质的方法，特征在于，所述生物质的制备包括在发酵培养基中培养分类单元网粘菌纲(Labyrinthulomycetes)的微生物，所述发酵培养基含有一定量的硫酸盐从而在所得的生物质中产生基于干物质计25-60g/kg的硫酸盐含量。
2.权利要求1的方法，特征在于，所述发酵培养基含有一定量的硫酸盐从而在所得的生物质中产生基于干物质计25-50g/kg、优选25-40g/kg、特别优选25-35g/kg的硫酸盐含量。
3.前述任一项权利要求的方法，特征在于，所述分类单元网粘菌纲的微生物是破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)的那些微生物，优选是Althomia属、不动茶菌属(Aplanochytrium)、Elnia属、日本壶菌属(Japonochytrium)、裂殖壶菌属(Schizochytrium)、破囊壶菌属(Thraustochytrium)、Aurantiochytrium属、Oblongichytrium属或吾肯氏壶菌属(Ulkenia)的那些微生物。
4.前述权利要求的方法，特征在于，所述微生物是Aurantiochytrium属的细胞、尤其是Aurantiochytrium limacinum种的那些细胞、特别是Aurantiochytrium limacinum SR21株(IFO 32693)的那些细胞。
5.含EPS的生物质，其含有分类单元网粘菌纲的微生物，特征在于，其具有基于干物质计25-60g/kg的硫酸盐含量。
6.前述权利要求的含EPS的生物质，特征在于，其具有基于干物质计25-50g/kg、优选25-40g/kg、特别优选25-30g/kg的硫酸盐含量。
7.前述任一项权利要求的含EPS的生物质，特征在于，分类单元网粘菌纲的细胞是破囊壶菌科的细胞，优选是Althomia属、不动茶菌属、Elnia属、日本壶菌属、裂殖壶菌属、破囊壶菌属、Aurantiochytrium属、Oblongichytrium属或吾肯氏壶菌属的细胞。
8.前述权利要求的含EPS的生物质，特征在于，所述微生物是Aurantiochytrium属的细胞、尤其是Aurantiochytrium limacinum种的那些细胞、特别是Aurantiochytriumlimacinum SR21株(IFO 32693)的那些细胞。
9.用于制备饲料的方法，特征在于，将前述任一项权利要求的含EPS的生物质与另外的饲料成分混合，并继而挤压以形成饲料，并且任选地，用油涂敷由此获得的挤出物。
10.前述权利要求的方法，特征在于，用于挤压的组合物具有以下性质：
a)33-67％重量的、优选39-61％重量的、特别是44-55％重量的总蛋白含量；
b)5-25％重量的、优选8-22％重量的、特别是10-20％重量的、尤其是12-18％重量的总脂肪含量；
c)最多25％重量的、特别是最多20％重量的、优选6-17％重量的、特别优选8-14％重量的总淀粉含量；
d)2-24％重量的、优选4-22％重量的、特别是9-20％重量的、尤其是11-18％重量的生物质含量，特别是网粘菌纲生物质含量，优选破囊壶菌科生物质含量；
e)优选0.8-8％重量的、优选1.2-6％重量的、特别是1.4-5％重量的、尤其是1.5-4％重量的多不饱和脂肪酸(PUFA)含量；
f)优选0.8-8％重量的、优选1.2-6％重量的、特别是1.4-5％重量的、尤其是1.5-4％重量的ω-3脂肪酸含量；
g)优选0.1-4.0％重量的、优选0.25-3.0％重量的、特别是0.5-2.8％重量的、尤其是0.8-2.5％重量的、特别是1.0-2.0％重量的DHA含量。
11.前述任一项权利要求的方法，特征在于，所述挤压是以12-28Wh/kg、特别是14-26Wh/kg、特别优选16-24Wh/kg的能量输入来完成的。
12.前述任一项权利要求的方法，特征在于，在所述挤压以及任选在挤出物干燥后用优选相对于最终产物的量是3-17％重量、特别是5-15％重量的油、特别是植物油涂敷所述挤出物。
13.饲料，特征在于，其含有权利要求1-8任一项的含EPS的生物质。
14.权利要求13的饲料，特征在于，其具有以下性质：
a)30-60％重量的、优选35-55％重量的、特别是40-50％重量的总蛋白含量；
b)15-35％重量的、优选18-32％重量的、特别是20-30％重量的、尤其是22-28％重量的总脂肪含量；
c)最多25％重量的、特别是最多20％重量的、优选5-15％重量的、特别优选7-13％重量的总淀粉含量；
d)2-22％重量的、优选4-20％重量的、特别是8-18％重量的、尤其是10-16％重量的生物质含量，特别是网粘菌纲生物质含量，优选破囊壶菌科生物质含量；
e)优选2-12％重量的、优选3-10％重量的、特别是4-9％重量的、尤其是5-8％重量的多不饱和脂肪酸(PUFA)含量；
f)优选1-6％重量的、优选1.5-5％重量的、特别是2-4.5％重量的、尤其是2.5-4％重量的ω-3脂肪酸含量；
g)优选0.5-3％重量的、优选0.8-2.5％重量的、特别是1-2.5％重量的、尤其是1.2-2.2％重量的、特别是1.2-2.0％重量的DHA含量。
15.用于养殖动物、特别是鱼类的方法，其中使用前述任一项权利要求的饲料。
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