CN107557303A - 一种高产胞外多糖的海洋破囊壶菌菌株分离筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种高产胞外多糖(EPS)的海洋破囊壶菌菌株分离筛选方法,主要步骤包括制备分离培养基，分离纯化，制备液体培养基，摇瓶发酵培养初筛菌液，制备初筛胞外液，培养复筛菌液，制备二次筛选的胞外液，以及微量苯酚硫酸法测定EPS含量。本发明为分离红树林潮间带来源的破囊壶菌及筛选高产胞外多糖的破囊壶菌菌株提供了技术支持，其次，本发明采用初筛、纯化和复筛结合的方法高效快速的分离高产EPS的菌株，且确定了所筛选菌株EPS产量最高的发酵培养时间。

Description

一种高产胞外多糖的海洋破囊壶菌菌株分离筛选方法

技术领域

本发明属于分离海洋真菌菌株技术领域，尤其涉及一种高产胞外多糖的海洋破囊壶菌菌株分离筛选方法。

背景技术

目前，很多的海洋微生物被发现都可以产生胞外多糖(EPS),这些EPS被发现可以应用在多种多样的生物技术上，从生物医药上的抗癌剂、抗凝血剂和眼睛及关节手术的创伤敷料；到食品工业上的乳化稳定剂、啤酒的泡沫稳定剂和冷冻食品的晶体形成的抑制剂；再到水处理和矿石提取的絮凝剂，以及化妆品行业的保湿剂胶凝剂；甚至是在细胞和酶技术上的凝胶剂。近几年，从红树林来源的破囊壶菌被发现可产EPS，并且具有一定的生物活性，如主导抗氧化的DDPH和羟基自由清除活性，对细菌和真菌的抑制性等。所以，开发高产EPS菌株和EPS新型功能的菌株尤为重要。

然而现阶段分离筛选高产EPS的破囊壶菌菌株方法，主要是对菌液的上清液进行醇沉透析，再经过醇沉冻干后利用苯酚硫酸法测定EPS含量。但该方法耗时长，且步骤繁琐。因此，有必要开发一种更加快速、准确高效的分离筛选高产EPS的破囊壶菌菌株的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术不足，提供一种高产胞外多糖的海洋破囊壶菌菌株分离筛选方法，能够获得更多红树林潮间带来源的破囊壶菌菌株资源，通过优化测定EPS的苯酚硫酸法，并利用破囊壶菌在48小时左右可完全消耗培养基中葡萄糖特点，简化提取胞外多糖液步骤，结合初筛和复筛的方法建立更快速准确的筛选高产EPS菌株的方法。

本发明的技术方案是一种高产胞外多糖的海洋破囊壶菌菌株分离筛选方法，包括以下步骤：

步骤(1)、制备分离培养基：先称取葡萄糖20g、蛋白胨1.5g、酵母提取物1g、磷酸二氢钾0.25g、琼脂20g、人工海盐33g于锥形瓶中，再加入1L超纯水，然后玻璃棒搅拌并超声10-20分钟至完全溶解，115℃灭菌21分钟，待温度降至55±5℃，取至超净台内，加入10ml现配制的经0.22um滤膜过滤的抗生素混合液，摇匀，倒平板；

上述抗生素混合液制备方法是：称取氨苄西林0.5-1g，链霉素林0.5-1.5g，制霉菌素5-20mg，加超纯水10ml溶解，震荡超声10-20分钟至溶液澄清完全溶解；

步骤(2)、分离纯化：先用灭过菌的剪刀将采集的潮间带红树植物腐败落叶剪成直径0.5-1.5cm碎片,再用灭菌海冲水洗一遍,贴于上述步骤(1)制备分离培养基上,于28±1℃培养,培养3-5天后,显微观察菌株形态,将显微观察其形态为破囊壶菌的单菌落，用接种环将其挑至新的分离培养基上划线纯化，培养长出单菌落后显微观察其形态，划线纯化培养2-4次，得到纯培养的破囊壶菌单菌落；

建立苯酚硫酸法测多糖含量的标准曲线：

配制80％苯酚作为苯酚母液：80g苯酚于20g水，60℃溶解，4℃保存备用；

配制6％苯酚：取3g，80％苯酚，加超纯水至溶液质量为40g；

称取甘露糖10mg，用100ml容量瓶配制为0.1mg/ml的甘露糖标准溶液，取0.0，0.02，0.04，0.08，0.12，0.16，0.18ml于干燥具塞管中，补水至0.2ml，各管先加入0.12ml，6％苯酚，再加入0.6ml浓硫酸，摇匀震荡，100℃水浴20min，(冰浴)冷却室温后，将样品加入96孔板，用酶标仪测定490nm的吸光值，得到甘露糖浓度与吸光值的标准曲线；

步骤(3)、制备液体培养基：先称取葡萄糖20g，蛋白胨1.5g，酵母提取物1.0g，磷酸二氢钾0.25g，人工海盐33g于锥形瓶中，再加入1L超纯水，然后用玻璃棒搅拌并超声5-10分钟至完全溶解，分装至100ml的锥形瓶中，每瓶20ml，作为初筛液体培养基ML1或50ml，作为复筛液体培养基ML2的液体培养基，115℃灭菌21分钟；

步骤(4)、摇瓶发酵培养初筛菌液：在超净台内，用灭菌的接种环从上述步骤(1)中制备的分离培养基上挑取一环破囊壶菌至装有上述步骤(3)中制备的初筛液体培养基ML1中，再将其放入条件为150-200rpm，28±1℃的摇床中培养2天作为种子液，用移液枪从锥形瓶中取1ml种子液转至新的ML1中，培养至4天；

步骤(5)、制备初步筛选的胞外液：在超净台内，用移液枪取1ml培养的菌液至无菌的1.5ml离心管中，两个平行，8000-12000rpm，5-10min离心菌液，取其上清液作为胞外液；

步骤(6)、摇瓶发酵培养复筛菌液：在超净台内，用灭菌的接种环从上述步骤(1)中制备的分离培养基上挑取一环破囊壶菌至装有上述步骤(3)中制备的复筛液体培养基ML2中，再将其放入条件为150-200rpm，28±1℃的摇床中培养2天作为种子液，用移液枪从锥形瓶中取2.5ml种子液转至新的ML2中培养7天；

步骤(7)、制备二次筛选的胞外液：对初筛产量较高的菌株进行复筛，在超净台内，用移液枪取1ml培养到第4，5，6，7天的菌液至无菌的1.5ml离心管中，三个平行，8000-12000rpm，5-10min离心菌液，取其上清液，用孔径为0.45um，直径为13mm的无菌滤头过滤至新的1.5ml离心管中；用3500Da，10MD透析袋透析此过滤液48小时，此透析液即胞外液。

有益效果

与现有的筛选高产胞外多糖的破囊壶菌菌株方法相比，该方法有以下优点：

本发明为分离红树林潮间带来源的破囊壶菌及筛选高产胞外多糖的破囊壶菌菌株提供了技术支持。

本发明采用初筛、纯化和复筛结合的方法高效快速的分离菌株，且产量最高：

首先，在第四天时摇瓶中的葡萄糖会被破囊壶菌全部利用掉，所以液体培养基中的葡萄糖将不会影响测定。

初筛对多糖含量的准确度要求不高，可以直接取第四天的上清液作为胞外测定液，省去了醇沉透析等步骤；复筛时，取培养到第4,5,6,7天的上清液，在初筛处理上加了过滤和透析的处理，这样高效率的去除了上清液中的蛋白和DNA等杂质；且测定了四个时间的产量，基本确定了菌株在此培养条件下的最高产量；也免去了常用的醇沉后冻干的处理，节省时间和成本。

其次，缩小了苯酚硫酸法的反应体系，由常用的2.3ml体系缩小为0.92ml体系。

附图说明

图1是显微镜下观察的破囊壶菌图：

(a)、K52；(b)、K46；(c)、K4；(d)、K31。

图2是苯酚硫酸法显色反应示意图:

(a)、标准曲线；(b)、K52；(c)、K46；(d)、K4；(e)K31。

图3是初筛的15株破囊壶菌菌株在第4天的EPS产量。

图4是复筛的4株破囊壶菌菌株在第4,5,6,7天的EPS产量。

具体实施方式

下面通过具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。本发明的实施例是为了使本领域的技术人员更好地理解本发明，并不对本发明作任何的限制。

于2015年8,9月份分别采集浙江温州，海南海口和福建厦门的红树林地区采集的潮间带红树植物腐败落叶，运用本方法分离得到15株破囊壶菌，并筛选了4株高产胞外多糖的菌株。

实施例1：

(1)、配制分离培养基：葡萄糖20g，蛋白胨1.5g，酵母提取物1g，磷酸二氢钾0.25g，琼脂20g，人工海盐33g于锥形瓶中；加入1L超纯水，玻璃棒搅拌并超声20分钟至完全溶解，115℃灭菌21分钟；待温度降至55℃，取至超净台内，加入10ml现配制的经0.22um滤膜过滤的抗生素混合液，摇匀，倒平板，即得破囊壶菌的分离培养基。抗生素混合液配制方法：称取氨苄西林0.7g，链霉素林0.75g，制霉菌素10mg，加超纯水10ml溶解，震荡超声20分钟至溶液澄清完全溶解。

(2)、破囊壶菌的分离纯化：用灭菌剪刀将采集的潮间带红树植物腐败落叶剪成直径1.0cm碎片，用灭菌海水冲洗一遍，贴于上述的分离培养基上，于28℃培养，培养4天后，显微观察菌株形态，将显微观察其形态为破囊壶菌的单菌落，用接种环将其挑至新的分离培养基上划线纯化，培养长出单菌落后显微观察其形态；划线纯化培养3次，得到纯培养的破囊壶菌单菌落。共分离得到6个平板上长出破囊壶菌形态的白色或浅黄色的单菌落，经18SrRNA鉴定为破囊壶菌，包括Aurantiochytrium属，Botryochytrium属和Parietichytrium属。其中的一个平板上划线得到26个单菌落，经18S rRNA鉴定分别为破囊壶菌Aurantiochytrium属。显微形态见分别见图1(a)。

建立苯酚硫酸法测多糖含量的标准曲线：

配制80％苯酚作为苯酚母液：80g苯酚于20g水，60℃溶解，4℃保存备用；

配制6％苯酚：取3g，80％苯酚，加超纯水至溶液质量为40g；

称取甘露糖10mg，用100ml容量瓶配制为0.1mg/ml的甘露糖标准溶液，取0.0，0.02，0.04，0.08，0.12，0.16，0.18ml于干燥具塞管中，补水至0.2ml，各管先加入0.12ml，6％苯酚，再加入0.6ml浓硫酸，摇匀震荡，100℃水浴20min，(冰浴)冷却室温后(显色见图2(a))，将样品加入96孔板，用酶标仪测定490nm的吸光值，得到甘露糖浓度与吸光值的标准曲线。

(3)、初筛的液体培养基配制：葡萄糖20g，蛋白胨1.5g，酵母提取物1.0g，磷酸二氢钾0.25g，人工海盐33g于锥形瓶中，加入1L超纯水，玻璃棒搅拌并超声10分钟至完全溶解，分装至100ml锥形瓶中，每瓶20ml液体培养基，115℃灭菌21分钟，即得初筛高产EPS破囊壶菌的液体培养基ML1。

(4)、初筛摇瓶发酵培养菌液：在超净台内，分别用灭菌的接种环从6个平板上挑取一环破囊壶菌至已编号的6瓶ML1中，将其放入条件为170rpm，28℃的摇床中培养2天作为种子液，分别用移液枪从锥形瓶中取1ml种子液转至新的6瓶ML1中，初筛培养至第4天。

(5)、初步筛选高产胞外多糖菌株：在超净台内，用移液枪取1ml培养到第4天的菌液至无菌的1.5ml离心管中，两个平行，8000rpm，5min离心菌液，取其上清液作为胞外液。

取胞外液0.2ml至10ml干燥具塞管中，加入0.12ml，6％苯酚，再加入0.6ml浓硫酸，摇匀震荡，100℃水浴20min，(冰浴)冷却室温后，将样品加入96孔板(显色见图2(b))，用酶标仪测定490nm的吸光值，再根据标准曲线计算出每株菌的胞外多糖含量，得到1株胞外多糖含量大于0.1mg/ml的破囊壶菌菌株，6株破囊壶菌菌株的EPS产量如图3。

(6)、复筛的液体培养基配制：葡萄糖10g，蛋白胨0.75g，酵母提取物0.5g，磷酸二氢钾0.125g，人工海盐16.5g于锥形瓶中，加入500ml超纯水，玻璃棒搅拌并超声10分钟至完全溶解，分装至100ml锥形瓶中，每瓶50ml液体培养基，115℃灭菌21分钟，即得复筛高产胞外多糖的破囊壶菌的液体培养基ML2。

(7)、复筛的摇瓶发酵培养菌液：在超净台内，分别用灭菌的接种环从4个平板上挑取一环破囊壶菌至已编号的4个ML2中，将其放入条件为170rpm，28℃的摇床中培养2天作为种子液，分别用移液枪从锥形瓶中取2.5ml种子液转至新的4个ML2中，培养7天。

(8)、对初筛的胞外多糖产量较高破囊壶菌菌株进行复筛：在超净台内，用移液枪从1瓶培养了4天的发酵液中取1ml至1个无菌的1.5ml离心管中，三个平行，取样后将摇瓶放回摇床继续培养，8000rpm，5min离心菌液，取其上清液，用孔径为0.45um，直径为13mm的无菌滤头过滤至新的1.5ml离心管中存于4℃，待处理。在培养的第5，6，7天重复第四天的取样过程，用3500Da，10MD透析袋去透析这株菌在4个时间的过滤液48小时，此透析液即胞外液，取胞外液0.2ml至10ml干燥具塞中，加入0.12ml，6％苯酚，再加入0.6ml浓硫酸，摇匀震荡，100℃水浴20min，(冰浴)冷却室温后，将样品加入96孔板，用酶标仪测定490nm的吸光值，再根据标准曲线计算出每株菌的胞外多糖含量，K52菌株在第6天产量最高，见图4。

实施例2：

(1)、配制分离培养基：葡萄糖20g，蛋白胨1.5g，酵母提取物1g，磷酸二氢钾0.25g，琼脂20g，人工海盐33g于锥形瓶中；加入1L超纯水，玻璃棒搅拌并超声10分钟至完全溶解，115℃灭菌21分钟；待温度降至50℃，取至超净台内，加入10ml现配制的经0.22um滤膜过滤的抗生素混合液，摇匀，倒平板，即得破囊壶菌的分离培养基。抗生素混合液配制方法：称取氨苄西林0.5g，链霉素林0.5g，制霉菌素5mg，加超纯水10ml溶解，震荡超声10分钟至溶液澄清完全溶解。

(2)、破囊壶菌的分离纯化：用灭菌剪刀将采集的潮间带红树植物腐败落叶剪成直径0.5cm碎片，用灭菌海水冲洗一遍，贴于上述的分离培养基上，于27℃培养，培养3天后，显微观察菌株形态，将显微观察其形态为破囊壶菌的单菌落，用接种环将其挑至新的分离培养基上划线纯化，培养长出单菌落后显微观察其形态；划线纯化培养3-4次，得到纯培养的破囊壶菌单菌落。共分离得到2个平板上长出破囊壶菌形态的白色的单菌落，经18S rRNA鉴定为破囊壶菌，包括Schizochytrium属，Thraustochytrium属。其中的一个平板上划线得到42个单菌落，经18S rRNA鉴定分别为破囊壶菌Schizochytrium属，显微形态见图1(b)。

建立苯酚硫酸法测多糖含量的标准曲线：

配制80％苯酚作为苯酚母液：80g苯酚于20g水，60℃溶解，4℃保存备用；

配制6％苯酚：取3g，80％苯酚，加超纯水至溶液质量为40g；

称取甘露糖10mg，用100ml容量瓶配制为0.1mg/ml的甘露糖标准溶液，取0.0，0.02，0.04，0.08，0.12，0.16，0.18ml于干燥具塞管中，补水至0.2ml，各管先加入0.12ml，6％苯酚，再加入0.6ml浓硫酸，摇匀震荡，100℃水浴20min，(冰浴)冷却室温后，将样品加入96孔板，用酶标仪测定490nm的吸光值，得到甘露糖浓度与吸光值的标准曲线。

(3)、初筛的液体培养基配制：葡萄糖20g，蛋白胨1.5g，酵母提取物1.0g，磷酸二氢钾0.25g，人工海盐33g于锥形瓶中，加入1L超纯水，玻璃棒搅拌并超声5分钟至完全溶解，分装至100ml锥形瓶中，每瓶20ml液体培养基，115℃灭菌21分钟，即得初筛高产EPS破囊壶菌的液体培养基ML1。

(4)、初筛摇瓶发酵培养菌液：在超净台内，分别用灭菌的接种环从2个平板上挑取一环破囊壶菌至已编号的2个ML1中，将其放入条件为150rpm，27℃的摇床中培养2天作为种子液，分别用移液枪从锥形瓶中取1ml种子液转至新的2个ML1中，初筛培养至第4天。

(5)、初步筛选高产胞外多糖菌株：在超净台内，用移液枪取1ml培养到第4天的菌液至无菌的1.5ml离心管中，两个平行，10000rpm，8min离心菌液，取其上清液作为胞外液。

取胞外液0.2ml至10ml干燥具塞管中，加入0.12ml，6％苯酚，再加入0.6ml浓硫酸，摇匀震荡，100℃水浴20min，(冰浴)冷却室温后，将样品加入96孔板(显色见图2(c))，用酶标仪测定490nm的吸光值，再根据标准曲线计算出每株菌的胞外多糖含量，得到1株胞外多糖含量大于0.1mg/ml的破囊壶菌菌株，2株破囊壶菌菌株的EPS产量见图3。

(6)、复筛的液体培养基配制：葡萄糖10g，蛋白胨0.75g，酵母提取物0.5g，磷酸二氢钾0.125g，人工海盐16.5g于锥形瓶中，加入500ml超纯水，玻璃棒搅拌并超声10分钟至完全溶解，分装至100ml锥形瓶中，每瓶50ml液体培养基，115℃灭菌21分钟，即得复筛高产胞外多糖的破囊壶菌的液体培养基ML2。

(7)、复筛的摇瓶发酵培养菌液：在超净台内，用灭菌的接种环从平板上挑取一环破囊壶菌至已编号的1瓶ML2中，将其放入条件为150rpm，27℃的摇床中培养2天作为种子液，分别用移液枪从锥形瓶中取2.5ml种子液转至新的1瓶ML2中，培养7天。

(8)、对初筛的胞外多糖产量较高破囊壶菌菌株进行复筛：在超净台内，分别用移液枪从1瓶培养了4天的发酵液中取1ml至1个无菌的1.5ml离心管中，三个平行，取样后将摇瓶放回摇床继续培养，10000rpm，5min离心菌液，取其上清液，用孔径为0.45um，直径为13mm的无菌滤头过滤至新的1.5ml离心管中存于4℃，待处理。在培养的第5，6，7天重复第四天的取样过程，用3500Da，10MD透析袋去透析这株菌在4个时间的过滤液48小时，此透析液即胞外液，取胞外液0.2ml至10ml干燥具塞中，加入0.12ml，6％苯酚，再加入0.6ml浓硫酸，摇匀震荡，100℃水浴20min，(冰浴)冷却室温后，将样品加入96孔板，用酶标仪测定490nm的吸光值，再根据标准曲线计算出每株菌的胞外多糖含量，K46菌株在第6，7天的EPS产量是第4天的3倍左右，达0.45mg/ml。

实施例3：

(1)、配制分离培养基：葡萄糖20g，蛋白胨1.5g，酵母提取物1g，磷酸二氢钾0.25g，琼脂20g，人工海盐33g于锥形瓶中；加入1L超纯水，玻璃棒搅拌并超声15分钟至完全溶解，115℃灭菌21分钟；待温度降至60℃，取至超净台内，加入10ml现配制的经0.22um滤膜过滤的抗生素混合液，摇匀，倒平板，即得破囊壶菌的分离培养基。抗生素混合液配制方法：称取氨苄西林1g，链霉素林1.5g，制霉菌素20mg，加超纯水10ml溶解，震荡超声15分钟至溶液澄清完全溶解。

(2)、破囊壶菌的分离纯化：用灭菌剪刀将采集的潮间带红树植物腐败落叶剪成直径1.5cm碎片，用灭菌海水冲洗一遍，贴于上述的分离培养基上，于29℃培养，培养5天后，显微观察菌株形态，将显微观察其形态为破囊壶菌的单菌落，用接种环将其挑至新的分离培养基上划线纯化，培养长出单菌落后显微观察其形态；划线纯化培养3次，得到纯培养的破囊壶菌单菌落。共分离得到3个平板上长出破囊壶菌形态的白色或浅黄色的单菌落，经18SrRNA鉴定为破囊壶菌，包括Schizochytrium属，Aurantiochytrium属。其中的一个平板上划线得到18个单菌落，经18S rRNA鉴定分别为破囊壶菌Schizochytrium属，显微形态见图1(c)。

建立苯酚硫酸法测多糖含量的标准曲线：

配制80％苯酚作为苯酚母液：80g苯酚于20g水，60℃溶解，4℃保存备用；

配制6％苯酚：取3g，80％苯酚，加超纯水至溶液质量为40g；

称取甘露糖10mg，用100ml容量瓶配制为0.1mg/ml的甘露糖标准溶液，取0.0，0.02，0.04，0.08，0.12，0.16，0.18ml于干燥具塞管中，补水至0.2ml，各管先加入0.12ml，6％苯酚，再加入0.6ml浓硫酸，摇匀震荡，100℃水浴20min，(冰浴)冷却室温后，将样品加入96孔板，用酶标仪测定490nm的吸光值，得到甘露糖浓度与吸光值的标准曲线。

(3)、初筛的液体培养基配制：葡萄糖20g，蛋白胨1.5g，酵母提取物1.0g，磷酸二氢钾0.25g，人工海盐33g于锥形瓶中，加入1L超纯水，玻璃棒搅拌并超声7分钟至完全溶解，分装至100ml锥形瓶中，每瓶20ml液体培养基，115℃灭菌21分钟，即得初筛高产EPS破囊壶菌的液体培养基ML1。

(4)、初筛摇瓶发酵培养菌液：在超净台内，分别用灭菌的接种环从3个平板上挑取一环破囊壶菌至已编号的3瓶ML1中，将其放入条件为200rpm，29℃的摇床中培养2天作为种子液，分别用移液枪从锥形瓶中取1ml种子液转至新的3瓶ML1中，初筛培养至第4天。

(5)、初步筛选高产胞外多糖菌株：在超净台内，用移液枪取1ml培养到第4天的菌液至无菌的1.5ml离心管中，两个平行，12000rpm，10min离心菌液，取其上清液作为胞外液。

取胞外液0.2ml至10ml干燥具塞管中，加入0.12ml，6％苯酚，再加入0.6ml浓硫酸，摇匀震荡，100℃水浴20min，(冰浴)冷却室温后，将样品加入96孔板(显色见图2(d))，用酶标仪测定490nm的吸光值，再根据标准曲线计算出每株菌的胞外多糖含量，得到4株胞外多糖含量大于0.1mg/ml的破囊壶菌菌株，3株破囊壶菌菌株的EPS产量见图3。

(6)、复筛的液体培养基配制：葡萄糖10g，蛋白胨0.75g，酵母提取物0.5g，磷酸二氢钾0.125g，人工海盐16.5g于锥形瓶中，加入500ml超纯水，玻璃棒搅拌并超声10分钟至完全溶解，分装至100ml锥形瓶中，每瓶50ml液体培养基，115℃灭菌21分钟，即得复筛高产胞外多糖的破囊壶菌的液体培养基ML2。

(7)、复筛的摇瓶发酵培养菌液：在超净台内，分别用灭菌的接种环从1平板上挑取一环破囊壶菌至已编号的1瓶ML2中，将其放入条件为200rpm，29℃的摇床中培养2天作为种子液，分别用移液枪从锥形瓶中取2.5ml种子液转至新的1瓶ML2中，培养7天。

(8)、对初筛的胞外多糖产量较高破囊壶菌菌株进行复筛：在超净台内，用移液枪从1瓶培养了4天的发酵液中取1ml至4个无菌的1.5ml离心管中，三个平行，取样后将摇瓶放回摇床继续培养，12000rpm，5min离心菌液，取其上清液，用孔径为0.45um，直径为13mm的无菌滤头过滤至新的1.5ml离心管中存于4℃，待处理。在培养的第5，6，7天重复第四天的取样过程，用3500Da，10MD透析袋去透析这株菌在4个时间的过滤液48小时，此透析液即胞外液，取胞外液0.2ml至10ml干燥具塞中，加入0.12ml，6％苯酚，再加入0.6ml浓硫酸，摇匀震荡，100℃水浴20min，(冰浴)冷却室温后，将样品加入96孔板，用酶标仪测定490nm的吸光值，再根据标准曲线计算出每株菌的胞外多糖含量，K4菌株在第4天与第7天的EPS产量接近，约0.15mg/ml。

实施例4：

(1)、配制分离培养基：葡萄糖20g，蛋白胨1.5g，酵母提取物1g，磷酸二氢钾0.25g，琼脂20g，人工海盐33g于锥形瓶中；加入1L超纯水，玻璃棒搅拌并超声15分钟至完全溶解，115℃灭菌21分钟；待温度降至60℃，取至超净台内，加入10ml现配制的经0.22um滤膜过滤的抗生素混合液，摇匀，倒平板，即得破囊壶菌的分离培养基。抗生素混合液配制方法：称取氨苄西林1g，链霉素林1.5g，制霉菌素20mg，加超纯水10ml溶解，震荡超声15分钟至溶液澄清完全溶解。

(2)、破囊壶菌的分离纯化：用灭菌剪刀将采集的潮间带红树植物腐败落叶剪成直径1.0cm碎片，用灭菌海水冲洗一遍，贴于上述的分离培养基上，于29℃培养，培养5天后，显微观察菌株形态，将显微观察其形态为破囊壶菌的单菌落，用接种环将其挑至新的分离培养基上划线纯化，培养长出单菌落后显微观察其形态；划线纯化培养3次，得到纯培养的破囊壶菌单菌落。共分离得到4平板上长出破囊壶菌形态的白色或浅黄色的单菌落，经18SrRNA鉴定为破囊壶菌，包括Schizochytrium属，Aurantiochytrium属。其中的一个平板上划线得到37个单菌落，经18S rRNA鉴定分别为破囊壶菌Aurantiochytrium属，显微形态见图1(d)。

建立苯酚硫酸法测多糖含量的标准曲线：

配制80％苯酚作为苯酚母液：80g苯酚于20g水，60℃溶解，4℃保存备用；

配制6％苯酚：取3g，80％苯酚，加超纯水至溶液质量为40g；

称取甘露糖10mg，用100ml容量瓶配制为0.1mg/ml的甘露糖标准溶液，取0.0，0.02，0.04，0.08，0.12，0.16，0.18ml于干燥具塞管中，补水至0.2ml，各管先加入0.12ml，6％苯酚，再加入0.6ml浓硫酸，摇匀震荡，100℃水浴20min，(冰浴)冷却室温后，将样品加入96孔板，用酶标仪测定490nm的吸光值，得到甘露糖浓度与吸光值的标准曲线。

(3)、初筛的液体培养基配制：葡萄糖20g，蛋白胨1.5g，酵母提取物1.0g，磷酸二氢钾0.25g，人工海盐33g于锥形瓶中，加入1L超纯水，玻璃棒搅拌并超声7分钟至完全溶解，分装至100ml锥形瓶中，每瓶20ml液体培养基，115℃灭菌21分钟，即得初筛高产EPS破囊壶菌的液体培养基ML1。

(4)、初筛摇瓶发酵培养菌液：在超净台内，分别用灭菌的接种环从4个平板上挑取一环破囊壶菌至已编号的4瓶ML1中，将其放入条件为200rpm，29℃的摇床中培养2天作为种子液，分别用移液枪从锥形瓶中取1ml种子液转至新的4瓶ML1中，初筛培养至第4天。

(5)、初步筛选高产胞外多糖菌株：在超净台内，用移液枪取1ml培养到第4天的菌液至无菌的1.5ml离心管中，两个平行，9000rpm，10min离心菌液，取其上清液作为胞外液。

取胞外液0.2ml至10ml干燥具塞管中，加入0.12ml，6％苯酚，再加入0.6ml浓硫酸，摇匀震荡，100℃水浴20min，(冰浴)冷却室温后(显色见图2)，将样品加入96孔板，用酶标仪测定490nm的吸光值，再根据标准曲线计算出每株菌的胞外多糖含量，得到1株胞外多糖含量大于0.1mg/ml的破囊壶菌菌株，4株破囊壶菌菌株的EPS产量见图3。

(6)、复筛的液体培养基配制：葡萄糖10g，蛋白胨0.75g，酵母提取物0.5g，磷酸二氢钾0.125g，人工海盐16.5g于锥形瓶中，加入500ml超纯水，玻璃棒搅拌并超声10分钟至完全溶解，分装至100ml锥形瓶中，每瓶50ml液体培养基，115℃灭菌21分钟，即得复筛高产胞外多糖的破囊壶菌的液体培养基ML2。

(7)、复筛的摇瓶发酵培养菌液：在超净台内，分别用灭菌的接种环从1个平板上挑取一环破囊壶菌至已编号的1瓶ML2中，将其放入条件为200rpm，29℃的摇床中培养2天作为种子液，分别用移液枪从锥形瓶中取2.5ml种子液转至新的1瓶ML2中，培养7天。

(8)、对初筛的胞外多糖产量较高破囊壶菌菌株进行复筛：在超净台内，用移液枪从1瓶培养了4天的发酵液中取1ml至4个无菌的1.5ml离心管中，三个平行，取样后将摇瓶放回摇床继续培养，9000rpm，5min离心菌液，取其上清液，用孔径为0.45um，直径为13mm的无菌滤头过滤至新的1.5ml离心管中存于4℃，待处理。在培养的第5，6，7天重复第四天的取样过程，用3500Da，10MD透析袋去透析这4株菌在4个时间的过滤液48小时，此透析液即胞外液，取胞外液0.2ml至10ml干燥具塞中，加入0.12ml，6％苯酚，再加入0.6ml浓硫酸，摇匀震荡，100℃水浴20min，(冰浴)冷却室温后，将样品加入96孔板(显色见图2(e)),用酶标仪测定490nm的吸光值，再根据标准曲线计算出每株菌的胞外多糖含量，K31菌株在第7天EPS产量最高0.18mg/ml，约为第4,5天产量的2倍。

应当理解的是，这里所讨论的实施方案及实例只是为了说明，对本领域技术人员来说，可以加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (1)

1.一种高产胞外多糖的海洋破囊壶菌菌株分离筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤(1)、制备分离培养基：先称取葡萄糖20g、蛋白胨1.5g、酵母提取物1g、磷酸二氢钾0.25g、琼脂20g、人工海盐33g于锥形瓶中，再加入1L超纯水，然后玻璃棒搅拌并超声10-20分钟至完全溶解，115℃灭菌21分钟，待温度降至55±5℃，取至超净台内，加入10ml现配制的经0.22um滤膜过滤的抗生素混合液，摇匀，倒平板；

上述抗生素混合液制备方法是：称取氨苄西林0.5-1g，链霉素林0.5-1.5g，制霉菌素5-20mg，加超纯水10ml溶解，震荡超声10-20分钟至溶液澄清完全溶解；

步骤(2)、分离纯化：先用灭过菌的剪刀将采集的潮间带红树植物腐败落叶剪成直径0.5-1.5cm碎片,再用灭菌海冲水洗一遍,贴于上述步骤(1)制备分离培养基上,于28±1℃培养,培养3-5天后,显微观察菌株形态,将显微观察其形态为破囊壶菌的单菌落，用接种环将其挑至新的分离培养基上划线纯化，培养长出单菌落后显微观察其形态，划线纯化培养2-4次，得到纯培养的破囊壶菌单菌落；

建立苯酚硫酸法测多糖含量的标准曲线：

配制80％苯酚作为苯酚母液：80g苯酚于20g水，60℃溶解，4℃保存备用；

配制6％苯酚：取3g，80％苯酚，加超纯水至溶液质量为40g；

称取甘露糖10mg，用100ml容量瓶配制为0.1mg/ml的甘露糖标准溶液，取0.0，0.02，0.04，0.08，0.12，0.16，0.18ml于干燥具塞管中，补水至0.2ml，各管先加入0.12ml，6％苯酚，再加入0.6ml浓硫酸，摇匀震荡，100℃水浴20min，(冰浴)冷却室温后，将样品加入96孔板，用酶标仪测定490nm的吸光值，得到甘露糖浓度与吸光值的标准曲线；

步骤(3)、制备液体培养基：先称取葡萄糖20g，蛋白胨1.5g，酵母提取物1.0g，磷酸二氢钾0.25g，人工海盐33g于锥形瓶中，再加入1L超纯水，然后用玻璃棒搅拌并超声5-10分钟至完全溶解，分装至100ml的锥形瓶中，每瓶20ml，作为初筛液体培养基ML1或50ml，作为复筛液体培养基ML2的液体培养基，115℃灭菌21分钟；

步骤(4)、摇瓶发酵培养初筛菌液：在超净台内，用灭菌的接种环从上述步骤(1)中制备的分离培养基上挑取一环破囊壶菌至装有上述步骤(3)中制备的初筛液体培养基ML1中，再将其放入条件为150-200rpm，28±1℃的摇床中培养2天作为种子液，用移液枪从锥形瓶中取1ml种子液转至新的ML1中，培养至4天；

步骤(5)、制备初步筛选的胞外液：在超净台内，用移液枪取1ml培养的菌液至无菌的1.5ml离心管中，两个平行，8000-12000rpm，5-10min离心菌液，取其上清液作为胞外液；

步骤(6)、摇瓶发酵培养复筛菌液：在超净台内，用灭菌的接种环从上述步骤(1)中制备的分离培养基上挑取一环破囊壶菌至装有上述步骤(3)中制备的复筛液体培养基ML2中，再将其放入条件为150-200rpm，28±1℃的摇床中培养2天作为种子液，用移液枪从锥形瓶中取2.5ml种子液转至新的ML2中培养7天；

步骤(7)、制备二次筛选的胞外液：对初筛产量较高的菌株进行复筛，在超净台内，用移液枪取1ml培养到第4，5，6，7天的菌液至无菌的1.5ml离心管中，三个平行，8000-12000rpm，5-10min离心菌液，取其上清液，用孔径为0.45um，直径为13mm的无菌滤头过滤至新的1.5ml离心管中；用3500Da，10MD透析袋透析此过滤液48小时，此透析液即胞外液。