CN101899490B

CN101899490B - 一种微生物发酵生产恩拉霉素的方法

Info

Publication number: CN101899490B
Application number: CN2010102265066A
Authority: CN
Inventors: 胡江林; 王永星; 景巍; 葛庆燕
Original assignee: SHANDONG SHENGLI BIOENGINEERING CO Ltd; SHENGLI CO Ltd SHANDONG
Current assignee: Shandong Shengli Bioengineering Co., Ltd.
Priority date: 2010-07-14
Filing date: 2010-07-14
Publication date: 2012-09-05
Anticipated expiration: 2030-07-14
Also published as: CN101899490A

Abstract

本发明公开了一种微生物发酵生产恩拉霉素的方法，包括以下步骤：制备杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidicus)SDSL1205CGMCC No.3933的孢子液，将孢子液在液氮环境下保存；将冻存孢子液接种到种子培养基中进行种子培养得种子液；按4-6wt％的接种量将种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养；发酵后的发酵液经进一步处理得恩拉霉素结晶。本方法简单易行，省去了繁琐的制种工艺，降低了染菌几率；接种量易控制，发酵结果稳定，重复性好；发酵结果比传统工艺有所提高，恩拉霉素最大产量达到8500μg/ml以上(HPLC)。

Description

一种微生物发酵生产恩拉霉素的方法

技术领域

本发明涉及一种微生物发酵生产恩拉霉素的方法，属于生物发酵技术领域。

背景技术

恩拉霉素(Enramycin)，又名安来霉素，是由土壤中分离出来的放线菌Streptomyces fungicidious NO.B5477发酵产生的一种多肽类抗生素。恩拉霉素因其强大的杀菌作用而被命名为Enduracidin，之后世界卫生组织(WHO)确定其通用名为恩拉霉素。恩拉霉素是一种有机碱，其盐酸盐为白色结晶性粉末，分子量约为2500，融点为238～245℃。本品易溶于稀盐酸和二甲亚砜，可溶于甲醇、含水乙醇，难溶于乙醇和丙酮，不溶于苯、氯仿等。恩拉霉素的化学结构可通过部分水解肽键的方法测定。现已证实，恩拉霉素是由包括13个不同种类的17个氨基酸分子和脂肪酸分子所组成，其中氨基酸分子构成环状多肽结构，脂肪酸位于多肽结构末端。据其末端脂肪酸种类不同，得到A、B两种组分，即A(C₁₀₇H₁₃₈C₁₂N₂₆O₃₁)和B(C₁₀₈H₁₄₀C₁₂N₂₆O₃₁)。恩拉霉素则是由这两种组分组成的混合物。作为一种全新的多肽类抗生素饲料添加剂，恩拉霉素被世界上许多国家推荐使用。

目前，恩拉霉素生产通常采用传统的斜面培养，接种环挖块接种摇瓶，摇瓶再接种子罐的工艺，制种工艺繁琐，染菌几率高，发酵结果不稳定，重复性差。

发明内容

本发明针对上述生产恩拉霉素工艺的不足，提供了一种工艺简单、发酵产量高的微生物发酵生产恩拉霉素的方法。

本发明是通过以下措施来实现的：

以往生产恩拉霉素的方法是通过斜面培养和摇瓶培养制备菌种的，但是斜面培养保藏时间短、不稳定，需要循环不断的制作筛选高产斜面。本发明对传统的工艺进行了改进，优化了制种过程，通过液氮环境冻存的方法使制得的菌种可以长期保存，这样可以一次性制备大量的菌种，省去了繁琐的重复制种步骤，缩短了生产时间；且本工艺发酵结果稳定，重复性好，恩拉霉素产量大，可达8500μg/ml以上(HPLC)。

本发明所用的菌株为杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidicus)SDSL1205，已于2010年6月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.3933。

该SDSL1205菌株是通过以下几个阶段选育出来的：

一、从野生菌Streptomyces fungicidicus SDSL1号菌出发，经连续紫外诱变得到比出发菌株产量提高203％的236号高产菌株。

二、将236号高产菌株经连续的链霉素抗性筛选，得到较236菌株产量提高191％的417菌株。

链霉素抗性筛选过程为：将链霉素按照30～200ug/ml的浓度添加至平板培养基中，制作成平板，121℃灭菌30分钟。利用该链霉素抗性筛选平板筛选抗链霉素的菌株，培养温度27～30℃，培养时间6～7天。平板培养基组分为：可溶性淀粉9-13g/L、酵母浸膏1.5-2.2g/L、琼脂18-20g/L，培养基pH6.8-7.0。

三、将417菌株经多轮亚硝基胍诱变，结合链霉素抗性筛选得到SDSL959菌株，较417菌株产量提高96％。

四、SDSL959菌株经多轮自然分纯，链霉素抗性筛选得到SDSL1205菌株，产量达到8500U/ml以上。

本发明的技术方案如下：

一种微生物发酵生产恩拉霉素的方法，包括以下步骤：

(1)制备冻存孢子液：

a.将杀真菌素链霉菌CGMCCNo.3933接种到多个平板培养基上进行扩大培养，得到大量杀真菌素链霉菌孢子；所得孢子具有灰色、圆形、中间有小突起特征；

b.将上述得到的孢子刮到甘油水溶液中，打散混匀制成孢子液，将孢子液分装在冻存管中在液氮环境中冷冻保存，待用；每毫升孢子液中含1.0×10⁸-1.0×10⁹个杀真菌素链霉菌孢子；

(2)种子培养：将冻存孢子液接种到种子培养基中，每30L培养基接种1-2ml冻存孢子液，培养得种子液，种子液中的固形物占种子液总量的20-30体积％；

(3)发酵培养：按4-6wt％的接种量将种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养；

发酵完毕，发酵液经过滤得菌丝体，菌丝体用甲醇浸提，再经离心分离得浸提液，浸提液经浓缩、结晶得到恩拉霉素结晶。

本发明第一步中制得的冻存孢子液可长期保存，可以一次性制备大量的孢子液供后期使用，省去了繁琐的重复制种步骤，缩短了生产时间。

上述的生产恩拉霉素的方法中，步骤(1)中冻存孢子液还可以用来制备新的冻存孢子液，其步骤为：

①用生理盐水梯度稀释冻存孢子液，将稀释的冻存孢子液接种到多个平板培养基上进行培养，得到大量孢子；

②将得到的孢子刮到甘油水溶液中，打散混匀制成孢子液，孢子液分装在冻存管中在液氮环境中进行冷冻保存，待用，每毫升孢子液中含1.0×10⁸-1.0×10⁹个杀真菌素链霉菌孢子。

上述步骤①的具体步骤为：将冻存孢子液梯度稀释至原先浓度的10^-8-10^-12倍，在此浓度范围内取5个梯度的稀释孢子液分别接种到5个平板培养基上进行平板培养，接种量均为0.1ml。

上述制备冻存孢子液的过程中，每个平板制得的孢子液装20-30支冻存管，每支冻存管装1ml孢子液。

上述生产恩拉霉素的方法中，平板培养的条件为：平板培养基成分：可溶性淀粉9-13g/L、酵母浸膏1.5-2.2g/L、琼脂18-20g/L，培养基pH6.8-7.0，27-28℃下培养6-7天。

上述生产恩拉霉素的方法中，种子培养基组分及各组分的浓度为：玉米粉3.0-3.5wt％、玉米浆2.8-3.0wt％、棉籽饼粉0.3-0.5wt％、玉米蛋白粉0.5-1wt％、硫酸铵0.25-0.75wt％、硫酸亚铁0.036-0.043wt％、磷酸二氢钾0.1-0.125wt％、碳酸钙1.5-2.0wt％、泡敌0.025-0.05wt％，水余量，培养基pH7.0-7.5。

上述生产恩拉霉素的方法中，种子培养条件为：在27.5-28.5℃，通气量1.0-1.1vvm，转速200-250rpm下培养46-50h。

上述生产恩拉霉素的方法中，发酵培养基的组分及各组分浓度为：葡萄糖3.6-4.0wt％、玉米淀粉1.8-2.0wt％、玉米浆2.0-2.2wt％、玉米蛋白粉2.8-3.0wt％、棉籽饼粉1.0-1.2wt％、氯化铵0.35-0.5wt％、氯化钠1.5-1.75wt％、碳酸钙1.2-1.5wt％、泡敌0.025-0.05wt％，水余量，培养基pH7.0-7.2。

上述的生产恩拉霉素的方法中，发酵培养条件为：在27.5-28.5℃，通气量0.6-1.3vvm，转速50-115rpm下发酵培养270-300h。

上述的生产恩拉霉素的方法中，所用甘油水溶液的质量分数为20％。

将按本发明方法制得的发酵液通过HPLC方法进行检测，检测结果显示发酵液中恩拉霉素的生物效价在8500U/ml以上，检测条件如下：

柱子：RP C18(4.6x250mm)

流动相：乙腈-35mmol/L磷酸二氢钾溶液，乙腈与磷酸二氢钾溶液的体积比为30∶70。

磷酸二氢钾(35mmol/L)配制方法：称取磷酸二氢钾4.76g溶于700ml纯水中，用磷酸调pH至4.5。

流速：1.0ml/min

波长：267nm

柱温：35℃

样品处理方法：称取2g发酵液加入到18ml丙酮浸提液中，室温下超声处理40min后过滤进样，超声频率100W。丙酮浸提液是丙酮、2mol/L盐酸溶液和水的混合液，其中，丙酮、2mol/L的盐酸溶液、水的体积比为20∶1∶21。

标准溶液配制：将恩拉霉素标准品配制成浓度为200μg/ml的标准溶液。

本发明与传统斜面培养，接种环挖块接种摇瓶，摇瓶再接种子罐的传统工艺相比，具有以下积极效果：

1、本方法简单易行，省去了繁琐的制种工艺，降低了染菌几率。

2、本方法大幅降低了工作量，一次制备菌种，可长期供应发酵。

3、本方法接种量易控制，发酵结果稳定，重复性好。

4、本方法将孢子液在液氮环境中冷冻保存，减少了菌种分纯复壮频率，降低菌种变异几率。

5、本方法发酵结果比传统工艺有所提高，恩拉霉素最大产量达到8500μg/ml以上(HPLC)。

微生物保藏信息：

杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidicus)SDSL1205，已于2010年6月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.3933。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作具体的说明，应该明白的是，下述说明仅是示例性的，并不对本发明进行限制。以下百分数如无特别说明，均为重量百分数。

菌株选育过程如下：

一、从野生菌Streptomyces fungicidicus SDSL1号菌出发，经连续紫外诱变得到比出发菌株产量提高203％的236号高产菌株，操作步骤如下：

将SDSL1号菌株接入平板培养基，培养6天后，选取一块生长良好的平板，将孢子刮到121℃，消毒30min的20wt％的甘油水溶液中，用玻璃珠打散混匀，得菌悬液，孢子在10⁸-10⁹个/ml左右。将菌悬液装在平皿中，暴露于30W紫外灯源下15厘米处，照射60秒。照射后将菌悬液梯度稀释10^-8-10^-12倍，涂平板。培养温度28℃，培养时间7天。选取长势良好的菌落，进行发酵验证。经HPLC检测发酵液中恩拉霉素含量，诱变菌株SDSL236号产量为1491U/ml，而野生菌SDSL1号产量为491U/ml。诱变菌株比野生菌株产量提高203％。

二、将SDSL236号高产菌株经连续的链霉素抗性筛选，得到SDSL417号菌株。操作步骤如下：

将链霉素按照30～200ug/ml的浓度添加至平板培养基中，制作成平板，121℃灭菌30分钟。将SDSL236号菌株接种到平板培养基中，利用该链霉素抗性筛选平板筛选抗链霉素的菌株，培养温度28℃，培养时间6-7天。选取长势良好的菌落，进行发酵验证。经HPLC检测发酵液中恩拉霉素含量，SDSL417号菌株产量为4339U/ml，比诱变菌株SDSL236号产量提高191％。

三、再利用亚硝基胍诱变SDSL417号菌株，结合链霉素抗性筛选得到SDSL959菌株，操作步骤如下：

将SDSL417号菌株接入平板培养基，培养7天后，选取一块生长良好的平板，将孢子刮到121℃，消毒30min的20wt％的甘油水溶液中，用玻璃珠打散混匀，得菌悬液，孢子控制在10⁸-10⁹个/ml左右。

在通风橱内，称取20mg亚硝基胍，按0.1ml/mg的比例先加丙酮使之溶解，再加4倍柠檬酸盐缓冲液稀释，这样制成的溶液浓度为2mg/ml。将孢子菌悬液与亚硝基胍溶液按1∶2混合，在26～28℃下作用30分钟。处理后，离心分离，并反复用生理盐水洗涤离心10次以上，最后用生理盐水恢复到原有体积。然后按照与上面相同的方法进行梯度稀释，稀释孢子液涂布到链霉素抗性筛选平板中，培养温度28℃，培养时间7天。选取长势良好的菌落，进行发酵验证。经HPLC检测发酵液中恩拉霉素含量，突变株SDSL959号产量超过亚硝基胍诱变前的SDSL417号96％，达到8505U/ml。

四、将已经得到的SDSL959号菌株，再经多轮自然分纯得SDSL1205号菌株。操作如下：按照前述方法制备孢子菌悬液，孢子浓度大约10⁸-10⁹个/ml。

选取8支粗试管，在1-8号中加入9毫升无菌水，吸取1ml孢子悬液入1号管，充分震动混匀，从1号管吸1ml到2号管，依次类推，制成梯度浓度。从6号管中吸取0.05ml于平板培养基内涂抹均匀。同理，从7、8号管分别吸取0.1和0.2ml稀释液于平板培养基中。培养温度28℃，培养时间8天。挑选具有灰色、圆形、中间有小突起特征的单菌落接入平板培养，通过种子培养，然后进行发酵验证。HPLC检测恩拉霉素含量达到了8515U/ml。

发酵过程如下：

(1)制备冻存孢子液：

a.将SDSL1205号菌株接种到多个平板培养基上，在28℃培养6天，得孢子，孢子具有灰色、圆形、中间有小突起特征；

b.将每个平板上培养的孢子分别刮到20wt％甘油水溶液中，用玻璃珠打散混匀制成孢子液，孢子液分装在30支冻存管中，每管装1ml孢子液，孢子浓度约为10⁸-10⁹个/ml，冻存管在液氮环境中进行冷冻保存；

(2)种子培养：将冻存孢子液接种到种子培养基中，每30升培养基接种2毫升冻存孢子液，在28℃，通气量1.1vvm，转速250rpm下无菌培养50h，得种子液；种子液中的固形物占种子液总量的20-30体积％；

(3)发酵培养：按5％的接种量将种子液接种到发酵培养基中，在28℃，通气量1.3vvm，转速100rpm下发酵培养280h；

发酵完毕，发酵液经过滤后，菌丝体用甲醇浸提，离心分离，浸提液经浓缩后，结晶得到恩拉霉素结晶。

培养基组成：

平板培养：可溶性淀粉10g，酵母浸提物2g，琼脂20g，1000ml蒸馏水溶解，调PH至7.0，121℃灭菌。

种子培养：玉米粉3.5％，玉米浆2.8％，棉籽饼粉0.5％，玉米蛋白粉0.5％，硫酸铵0.25％，硫酸亚铁0.036％，磷酸二氢钾0.125％，轻质碳酸钙2.0％，泡敌0.05％，30L蒸馏水，pH 7.5，121℃灭菌

发酵培养：葡萄糖4.0％，玉米淀粉2.0％，玉米浆2.0％，玉米蛋白粉3.0％，棉籽饼粉1.0％，氯化铵0.5％，氯化钠1.5％，碳酸钙1.5％，泡敌0.05％，800L蒸馏水，pH7.2，121℃灭菌。

发酵液通过HPLC方法进行检测，样品处理方法：称取2g发酵液加入18ml丙酮浸提液中(V_丙酮∶V_2mol/LHCl∶V_水＝20∶1∶21)，超声(100W)40min后过滤进样。将恩拉霉素标准品配制成200μg/ml进行检测，检测条件如下：

柱子：RP C18(4.6x250mm)

流动相∶V_乙腈∶V_{磷酸二氢钾}＝30∶70

流速：1.0ml/min

波长：267nm

柱温：35℃

实施例1

利用选育的SDSL1205号菌株进行发酵培养。

(1)制备冻存孢子液：

a.将菌株接种到多个平板培养基上，在27℃培养7天，所得孢子具有灰色、圆形、中间有小突起特征；

b.将每个平板上培养的孢子分别刮到20wt％甘油水溶液中，用玻璃珠打散混匀制成孢子液，孢子液分装在25支冻存管中，每管装1ml孢子液，冻存管在液氮环境中进行冷冻保存；孢子浓度在10⁸-10⁹个/ml左右；

(2)种子培养：将冻存孢子液接种到种子培养基中，每30升培养基接种1.5毫升冻存孢子液，在28.5℃，通气量1.0vvm，转速200rpm下无菌培养50h，得种子液；种子液中的固形物占种子液总量的20-30体积％；

(3)发酵培养：按4％的接种量将种子液接种到发酵培养基中，在27.5℃，通气量1.0vvm，转速70rpm下发酵培养270h；

培养基组成：

平板培养：可溶性淀粉9g，酵母浸提物2.2g，琼脂18g，1000ml蒸馏水溶解，调PH至6.8，121℃灭菌。

种子培养：玉米粉3.0％，玉米浆3.0％，棉籽饼粉0.3％，玉米蛋白粉1.0％，硫酸铵0.75％，硫酸亚铁0.043％，磷酸二氢钾0.1％，轻质碳酸钙1.5％，泡敌0.025％，30L蒸馏水，pH 7.2，121℃灭菌。

发酵培养：葡萄糖3.6％，玉米淀粉1.8％，玉米浆2.2％，玉米蛋白粉2.8％，棉籽饼粉1.2％，氯化铵0.35％，氯化钠1.75％，碳酸钙1.2％，泡敌0.025％，800L蒸馏水，pH 7.0，121℃灭菌。

发酵液通过HPLC方法进行检测，检测结果显示发酵液中恩拉霉素的生物效价为8512U/ml。

此外，冻存孢子液快用完时可以用现有的冻存孢子液再制备新的冻存孢子液，其过程如下：

取现有的冻存孢子液，用生理盐水进行梯度稀释，取浓度为原先10^-8、10^-9、10^-10、10^-11、10^-12倍的稀释孢子液涂在平皿上，每个浓度涂5个平皿，每个平皿接种0.1ml菌悬液，接种后的平皿在28℃培养箱中培养6-7天。

平皿在28℃培养箱中培养6-7天后，将单菌落划线扩种到另外的平板上，平板在28℃下培养6-7天。

用蒸馏水稀释20g甘油，定溶到100ml，搅拌均匀，121℃，消毒30min。将平板上的孢子刮到甘油水溶液中，用玻璃珠打散摇匀，将孢子液分装到冻存管(容积5ml)中，每个平板装20-30支冻存管，每管装1ml孢子液，孢子液中孢子浓度约为10⁸-10⁹个/ml。冻存管至于液氮中保存。

实施例2

(1)制备冻存孢子液：

a.将SDSL1205号菌株接种到多个平板培养基上，在28℃培养7天；

b.将每个平板上培养的孢子分别刮到20wt％甘油水溶液中，用玻璃珠打散混匀制成孢子液，孢子液分装在20支冻存管中，每管装1ml孢子液，冻存管在液氮环境中进行冷冻保存；孢子浓度在10⁸-10⁹个/ml左右；

(2)种子培养：将冻存孢子液接种到种子培养基中，每30升培养基接种1毫升冻存孢子液，在28℃，通气量1.1vvm，转速250rpm下无菌培养50h，得种子液；种子液中的固形物占种子液总量的20-30体积％；

(3)发酵培养：按5％的接种量将种子液接种到发酵培养基中，在28℃，通气量0.6vvm，转速50rpm下发酵培养300h；

培养基组成：

平板培养：可溶性淀粉13g，酵母浸提物1.5g，琼脂19g，1000ml蒸馏水溶解，调PH至7.0，121℃灭菌。

种子培养：玉米粉3.2％，玉米浆2.9％，棉籽饼粉0.4％，玉米蛋白粉0.75％，硫酸铵0.5％，硫酸亚铁0.040％，磷酸二氢钾0.110％，轻质碳酸钙1.8％，泡敌0.030％，30L蒸馏水，pH 7.0，121℃灭菌。

发酵培养：葡萄糖3.8％，玉米淀粉1.9％，玉米浆2.1％，玉米蛋白粉2.9％，棉籽饼粉1.1％，氯化铵0.4％，氯化钠1.6％，碳酸钙1.4％，泡敌0.04％，800L蒸馏水，pH 7.2，121℃灭菌。

冻存孢子液可以一次性制备很多待用，避免了每次都要配制孢子液的麻烦。在冻存液快用完时再用剩余的孢子液进行扩种培养再制备出一批冻存孢子液待用。制备方法如实施例1。

实施例3

(1)制备冻存孢子液：

a.将SDSL1205号菌株接种到多个平板培养基上，在28℃培养6天；

(3)发酵培养：按5％的接种量将种子液接种到发酵培养基中，在28℃，通气量1.3vvm，转速115rpm下发酵培养280h；

培养基组成：

平板培养：可溶性淀粉10g，酵母浸提物2.0g，琼脂20g，1000ml蒸馏水溶解，调PH至7.0，121℃灭菌。

种子培养：玉米粉3.5％，玉米浆2.8％，棉籽饼粉0.5％，玉米蛋白粉0.5％，硫酸铵0.25％，硫酸亚铁0.036％，磷酸二氢钾0.125％，轻质碳酸钙2.0％，泡敌0.05％，30L蒸馏水，pH 7.5，121℃灭菌。

发酵培养：葡萄糖4.0％，玉米淀粉2.0％，玉米浆2.0％，玉米蛋白粉3.0％，棉籽饼粉1.0％，氯化铵0.5％，氯化钠1.5％，碳酸钙1.5％，泡敌0.05％，800L蒸馏水，pH 7.2，121℃灭菌。

发酵液通过HPLC方法进行检测，检测结果显示发酵液中恩拉霉素的生物效价为8515U/ml。

由上述说明可以看出，本方法简单易行，省去了繁琐的制种工艺，因此降低了染菌几率；一次制备菌种，可长期供应发酵，减少了工作时间，此外，本方法还减少了菌种分纯复壮频率，降低菌种变异几率。

Claims

1.一种微生物发酵生产恩拉霉素的方法，其特征是包括以下步骤：

(1)制备冻存孢子液：

a.将杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidicus)SDSL1205 CGMCC NO.3933接种到多个平板培养基上进行培养，得杀真菌素链霉菌孢子；

b.将上述得到的孢子刮到甘油水溶液中，打散混匀制成孢子液，将孢子液分装在冻存管中在液氮环境中冷冻保存，待用；

发酵完毕，将发酵液过滤得菌丝体，菌丝体用甲醇浸提、离心分离得浸提液，浸提液经浓缩、结晶得到恩拉霉素结晶。

2.根据权利要求1所述的生产恩拉霉素的方法，其特征是采用步骤(1)中制得的冻存孢子液制备新的冻存孢子液，其步骤为：

①用生理盐水梯度稀释冻存孢子液，将稀释的冻存孢子液接种到多个平板培养基上进行培养，得杀真菌素链霉菌孢子；

②将得到的孢子刮到甘油水溶液中，打散混匀制成孢子液，孢子液分装在冻存管中在液氮环境中进行冷冻保存，待用。

3.根据权利要求2所述的生产恩拉霉素的方法，其特征是：步骤①中，将冻存孢子液梯度稀释至原先浓度的10^-8-10^-12倍，在此浓度范围内取5个梯度的稀释孢子液分别接种到5个平板培养基上进行培养，接种量均为0.1ml。

4.根据权利要求1、2或3所述的生产恩拉霉素的方法，其特征是：每毫升冻存孢子液中含1.0×10⁸-1.0×10⁹个杀真菌素链霉菌孢子。

5.根据权利要求4所述的生产恩拉霉素的方法，其特征是平板培养的条件为：平板培养基以水为溶剂，除水外，还含有以下成分：可溶性淀粉9-13g/L、酵母浸膏1.5-2.2g/L、琼脂18-20g/L，培养基pH6.8-7.0，27-28℃下培养6-7天。

6.根据权利要求4所述的生产恩拉霉素的方法，其特征是种子培养基组分及各组分的浓度为：玉米粉3.0-3.5wt％、玉米浆2.8-3.0wt％、棉籽饼粉0.3-0.5wt％、玉米蛋白粉0.5-1wt％、硫酸铵0.25-0.75wt％、硫酸亚铁0.036-0.043wt％、磷酸二氢钾0.1-0.125wt％、碳酸钙1.5-2.0wt％、泡敌0.025-0.05wt％，水余量，培养基pH7.0-7.5。

7.根据权利要求6所述的生产恩拉霉素的方法，其特征是种子培养条件为：在27.5-28.5℃，通气量1.0-1.1vvm，转速200-250rpm下培养46-50h。

8.根据权利要求4所述的生产恩拉霉素的方法，其特征是发酵培养基的组分及各组分浓度为：葡萄糖3.6-4.0wt％、玉米淀粉1.8-2.0wt％、玉米浆2.0-2.2wt％、玉米蛋白粉2.8-3.0wt％、棉籽饼粉1.0-1.2wt％、氯化铵0.35-0.5wt％、氯化钠1.5-1.75wt％、碳酸钙1.2-1.5wt％、泡敌0.025-0.05wt％，水余量，培养基pH7.0-7.2。

9.根据权利要求8所述的生产恩拉霉素的方法，其特征是发酵培养条件为：在27.5-28.5℃，通气量0.6-1.3vvm，转速50-115rpm下发酵培养270-300h。

10.根据权利要求1、2或3所述的生产恩拉霉素的方法，其特征是：所述甘油水溶液质量分数为20％。