CN111057653A - 一种高产二十二碳六烯酸破囊壶菌菌株的育种方法 - Google Patents

一种高产二十二碳六烯酸破囊壶菌菌株的育种方法 Download PDF

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    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone

Abstract

本发明公开了一种高产二十二碳六烯酸破囊壶菌菌株的育种方法，包括如下步骤：制备破囊壶菌菌悬液；(2)在黑暗环境中，选择紫外光，取菌悬液均匀平铺在培养皿底部，加入灭菌后的磁子，搅拌，紫外照射，将紫外照射后的菌液再用无菌生理盐水稀释，均匀涂布在新鲜的M4平板培养基上，用锡箔纸包住，避光培养；(3)观察M4平板培养基上菌落大小及长势情况，挑选出形态大，表面光滑的单菌落为初筛，将初筛获得的单菌落发酵培养，检测其生物量及DHA产量，筛选出能够稳定遗传的高产二十二碳六烯酸的破囊壶菌菌株。本发明的方法操作简单，成本低，且时间短。经过本发明的方法获得的菌株，较野生株DHA产量提高最多可达32％，经济效益显著。

Description

一种高产二十二碳六烯酸破囊壶菌菌株的育种方法
技术领域
本发明属于工业发酵生产用产二十二碳六烯酸(DHA)的高产菌株的选育，特别涉及的一种海洋破囊壶菌进行紫外诱变进行选育，从而获得高产菌株的方法。
背景技术
二十二碳六烯酸(DHA)俗称脑黄金，是一种对人体非常重要的多不饱和脂肪酸，因其含有6个不饱和烯键的特有结构，使它具有独特的生理功能和经济价值，对人类健康有着特殊的作用和影响，但人体和动物不能合成，因此必须从食物中获取足够的DHA，并且随着生活水平的提高，人们也越来越重视DHA的补充。
破囊壶菌(Thraustochytrids)是一类异养的专性海生真菌类原生生物，近年来由于其富含多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFAs)，尤其是二十二碳六烯酸(Docosahexanoic acid，DHA)而备受关注。
在微生物菌种选育过程中，诱变育种是主要方法之一。利用简便高效的诱变方法处理微生物，使其在非自然条件下大幅度提高随机突变频率，然后从中挑选符合要求的高产突变株。提高DHA的产量势在必行，而在众多技术中，优良菌株的选育工作是其中的重要组成部分，一个高产菌株可以直接提高发酵效率，带来巨大的经济效益。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的存在的所诱变的菌株DHA产量较低的不足，提供一种操作简单、高效廉价的高产二十二碳六烯酸破囊壶菌菌株的育种方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种高产二十二碳六烯酸破囊壶菌菌株的育种方法，包括如下步骤：
(1)将经过菌种活化、种子培养、摇瓶发酵培养至对数期的破囊壶菌菌液，离心去除上清液，用无菌生理盐水将菌体悬浮，获得细胞浓度在107～109CFU/mL的菌悬液；
(2)在黑暗环境中，选择254nm紫外光，预先将紫外灯预热25-35min，稳定光源，在无菌条件下，取步骤(1)获得的菌悬液15-20mL均匀平铺在培养皿底部，加入2-3粒灭菌后的磁子，随后将培养皿置于磁力搅拌器之上，搅拌，照射垂直距离为15cm，紫外照射10-20s，设3个平行，将紫外照射后的菌液再用无菌生理盐水稀释100倍，取50-100μL均匀涂布在新鲜的M4平板培养基上，用锡箔纸包住，在15-30℃恒温培养箱中避光培养24-48h；
(3)观察M4平板培养基上菌落大小及长势情况，挑选出形态大，表面光滑的单菌落为初筛，将初筛获得的单菌落在发酵培养基中进行发酵培养，在15-30℃、150-200r/min培养3-5d，检测其生物量及DHA产量，筛选出能够稳定遗传的高产二十二碳六烯酸的破囊壶菌菌株。
本发明的优点：
本发明的方法操作程序简单，成本低，且时间短，突变效果明显，易于推广。
经过本发明的方法获得的菌株，较野生株DHA产量提高最多可达32％，经济效益显著。
附图说明
图1是野生株和突变株的生物量及DHA产量对比图。
图2是突变株的稳定性考察。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
本申请各实施例以破囊壶菌Aurantiochytrium sp.ZJWZ-7菌为例，但并不对本发明作任何限制，其它的野生破囊壶菌也可以用于本发明。
实施例1
一种高产二十二碳六烯酸破囊壶菌菌株的育种方法，包括如下步骤：
(1)将经过菌种活化、种子培养、摇瓶发酵培养至对数期的破囊壶菌菌液，离心去除上清液，用无菌生理盐水将菌体悬浮，获得细胞浓度在107～109CFU/mL的菌悬液；
(2)在黑暗环境中，选择254nm紫外光，预先将紫外灯预热30min，稳定光源，在无菌条件下，取步骤(1)获得的菌悬液18mL均匀平铺在培养皿底部，加入2粒灭菌后的磁子，随后将培养皿置于磁力搅拌器之上，搅拌，照射垂直距离为15cm，紫外照射15s，设3个平行，将紫外照射后的菌液再用无菌生理盐水稀释100倍，取80μL均匀涂布在新鲜的M4平板培养基上，用锡箔纸包住，在20℃恒温培养箱中避光培养36h；
(3)观察M4平板培养基上菌落大小及长势情况，挑选出形态大，表面光滑的单菌落为初筛，将初筛获得的单菌落在发酵培养基中进行发酵培养，在20℃、180r/min培养4d，检测其生物量及DHA产量，筛选出能够稳定遗传的高产二十二碳六烯酸的破囊壶菌菌株。
测定生物量
收集15mL步骤(3)获得的培养液，于已称重的离心管中，8000r/min离心10min，，倒掉上清液，离心管中剩余沉淀用无菌水清洗2次，-80℃冷冻2h，置于冷冻干燥机中48h后取出，称量冻干后离心管重量。培养液中的生物量即为冻干后离心管重量减去空离心管重量，见图1。
测定DHA产量。
取冻干称重后的菌体加入2ml的质量浓度4％的硫酸甲醇溶液中，加入100μl内标(1g/L十九烷酸)，80℃水浴1h后取出冷却，加入1ml灭菌水，1ml正己烷，充分混匀后离心，取上层有机相，过0.45μm膜后气相测样，根据内标的量来计算出DHA的含量，见图1。
突变株遗传稳定性测试
将步骤(3)获得的菌连续传至10代，再对其隔代进行摇瓶发酵培养，测定生物量和DHA产量并与初代进行比较，观察其遗产稳定性见图2。
实施例2
一种高产二十二碳六烯酸破囊壶菌菌株的育种方法，包括如下步骤：
(1)将经过菌种活化、种子培养、摇瓶发酵培养至对数期的破囊壶菌菌液，离心去除上清液，用无菌生理盐水将菌体悬浮，获得细胞浓度在107～109CFU/mL的菌悬液；
(2)在黑暗环境中，选择254nm紫外光，预先将紫外灯预热25min，稳定光源，在无菌条件下，取步骤(1)获得的菌悬液15mL均匀平铺在培养皿底部，加入3粒灭菌后的磁子，随后将培养皿置于磁力搅拌器之上，搅拌，照射垂直距离为15cm，紫外照射10s，设3个平行，将紫外照射后的菌液再用无菌生理盐水稀释100倍，取50μL均匀涂布在新鲜的M4平板培养基上，用锡箔纸包住，在15℃恒温培养箱中避光培养48h；
(3)观察M4平板培养基上菌落大小及长势情况，挑选出形态大，表面光滑的单菌落为初筛，将初筛获得的单菌落在发酵培养基中进行发酵培养，在15℃、150r/min培养3d，检测其生物量及DHA产量，筛选出能够稳定遗传的高产二十二碳六烯酸的破囊壶菌菌株。
实验证明，本实施例获得高产DHA的菌株。
实施例3
一种高产二十二碳六烯酸破囊壶菌菌株的育种方法，包括如下步骤：
(1)将经过菌种活化、种子培养、摇瓶发酵培养至对数期的破囊壶菌菌液，离心去除上清液，用无菌生理盐水将菌体悬浮，获得细胞浓度在107～109CFU/mL的菌悬液；
(2)在黑暗环境中，选择254nm紫外光，预先将紫外灯预热35min，稳定光源，在无菌条件下，取步骤(1)获得的菌悬液20mL均匀平铺在培养皿底部，加入2粒灭菌后的磁子，随后将培养皿置于磁力搅拌器之上，搅拌，照射垂直距离为15cm，紫外照射20s，设3个平行，将紫外照射后的菌液再用无菌生理盐水稀释100倍，取100μL均匀涂布在新鲜的M4平板培养基上，用锡箔纸包住，在30℃恒温培养箱中避光培养24h；
(3)观察M4平板培养基上菌落大小及长势情况，挑选出形态大，表面光滑的单菌落为初筛，将初筛获得的单菌落在发酵培养基中进行发酵培养，在30℃、200r/min培养5d，检测其生物量及DHA产量，筛选出能够稳定遗传的高产二十二碳六烯酸的破囊壶菌菌株。
实验证明，本实施例获得高产DHA的菌株。
M4培养基组成：葡萄糖20g/L、蛋白胨1.5g/L、酵母提取物1g/L、磷酸二氢钾0.25g/L、海盐33g/L。
M4平板培养基:葡萄糖20g/L、蛋白胨1.5g/L、酵母提取物1g/L、磷酸二氢钾0.25g/L、海盐33g/L；琼脂20g/L。

Claims (1)

1.一种高产二十二碳六烯酸破囊壶菌菌株的育种方法，其特征是包括如下步骤：
(1)将经过菌种活化、种子培养、摇瓶发酵培养至对数期的破囊壶菌菌液，离心去除上清液，用无菌生理盐水将菌体悬浮，获得细胞浓度在107～109CFU/mL的菌悬液；
(2)在黑暗环境中，选择254nm紫外光，预先将紫外灯预热25-35min，稳定光源，在无菌条件下，取步骤(1)获得的菌悬液15-20mL均匀平铺在培养皿底部，加入2-3粒灭菌后的磁子，随后将培养皿置于磁力搅拌器之上，搅拌，照射垂直距离为15cm，紫外照射10-20s，设3个平行，将紫外照射后的菌液再用无菌生理盐水稀释100倍，取50-100μL均匀涂布在新鲜的M4平板培养基上，用锡箔纸包住，在15-30℃恒温培养箱中避光培养24-48h；
(3)观察M4平板培养基上菌落大小及长势情况，挑选出形态大，表面光滑的单菌落为初筛，将初筛获得的单菌落在发酵培养基中进行发酵培养，在15-30℃、150-200r/min培养3-5d，检测其生物量及DHA产量，筛选出能够稳定遗传的高产二十二碳六烯酸的破囊壶菌菌株。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114672422A (zh) * 2022-03-08 2022-06-28 南京工业大学 一种产顺-11-十六碳烯醛破囊壶菌菌株的培育方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040161831A1 (en) * 2002-12-27 2004-08-19 Fuji Photo Film Co., Ltd. Microorganism having an ability of producing docosahexaenoic acid and use thereof
CN102391955A (zh) * 2011-11-30 2012-03-28 厦门金达威集团股份有限公司 一种dha产生菌双鞭甲藻的诱变筛选方法
CN107557303A (zh) * 2017-09-08 2018-01-09 天津大学 一种高产胞外多糖的海洋破囊壶菌菌株分离筛选方法
CN107574191A (zh) * 2017-09-11 2018-01-12 天津大学 一种高产dha的破囊壶菌发酵培养基及其培养方法
CN112481348A (zh) * 2019-09-11 2021-03-12 天津大学青岛海洋技术研究院 一种高产dha裂殖壶菌突变菌株的筛选方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040161831A1 (en) * 2002-12-27 2004-08-19 Fuji Photo Film Co., Ltd. Microorganism having an ability of producing docosahexaenoic acid and use thereof
US20080009045A1 (en) * 2002-12-27 2008-01-10 Fujifilm Corporation Microorganism having an ability of producing docosahexaenoic acid and use thereof
CN102391955A (zh) * 2011-11-30 2012-03-28 厦门金达威集团股份有限公司 一种dha产生菌双鞭甲藻的诱变筛选方法
CN107557303A (zh) * 2017-09-08 2018-01-09 天津大学 一种高产胞外多糖的海洋破囊壶菌菌株分离筛选方法
CN107574191A (zh) * 2017-09-11 2018-01-12 天津大学 一种高产dha的破囊壶菌发酵培养基及其培养方法
CN112481348A (zh) * 2019-09-11 2021-03-12 天津大学青岛海洋技术研究院 一种高产dha裂殖壶菌突变菌株的筛选方法

Non-Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIANG, YL等: "The Delta 5,7-Sterols and Astaxanthin in the Marine Microheterotroph Schizochytrium sp. S31", 《JOURNAL OF THE AMERICAN OIL CHEMISTS SOCIETY》 *
LIU, LX等: "Comparative Transcriptomic Analysis Uncovers Genes Responsible for the DHA Enhancement in the Mutant Aurantiochytrium sp", 《MICROORGANISMS》 *
OCLARIT, JM等: "QUANTITATIVE ANALYSIS OF OMEGA-3 ALIPHATIC ACID FROM SCHIZOCHYTRIUM SP. DZAM (ORDER THRAUSTOCHYTRIALES DIVISION CHROMISTA) UNDER DIFFERENT SPECTRAL PHOTO-EMISSIONS", 《OCEANS 2009 - EUROPE, VOLS 1 AND 2》 *
佘隽等: "高产DHA寇氏隐甲藻突变株的筛选", 《食品科学》 *
吴清平: "一株具有工业化生产DHA前景的破囊壶菌", 《微生物学通报》 *
姚力芬: "破囊壶菌的诱变筛选及发酵条件优化", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）工程科技I辑》 *
庄莹等: "1,3-丙二醇高产变异菌株的紫外诱变选育", 《山地农业生物学报》 *
李建涛等: "诱变育种在产油微生物生产DHA中的研究进展", 《生物技术通报》 *
李慧玲等: "诱变选育高产DHA裂殖壶菌突变株", 《食品科技》 *
李晶晶等: "破囊壶菌生产DHA的应用前景", 《食品工业科技》 *
梁园梅等: "高产DHA破囊壶菌Aurantiochytrium sp.PKU#SW7诱变株的筛选", 《微生物学通报》 *
许永: "海洋真菌裂殖壶菌诱变筛选及不同生态条件对突变菌株生长和DHA含量的影响", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）工程科技I辑》 *
许永等: "裂殖壶菌诱变筛选的研究", 《中国海洋大学学报（自然科学版）》 *
许石雄等: "二十二碳六烯酸生产菌的硫酸二乙酯-紫外线复合诱变育种", 《工业微生物》 *
赵玉巧等: "产DHA菌株的诱变育种", 《微生物学杂志》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114672422A (zh) * 2022-03-08 2022-06-28 南京工业大学 一种产顺-11-十六碳烯醛破囊壶菌菌株的培育方法

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