CN114672422A - 一种产顺-11-十六碳烯醛破囊壶菌菌株的培育方法 - Google Patents
一种产顺-11-十六碳烯醛破囊壶菌菌株的培育方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明一种产顺‑11‑十六碳烯醛破囊壶菌菌株的培育方法，具体步骤如下：(1)制备菌悬液；(2)在无菌条件下，取菌悬液均匀平铺在固体培养皿中，进行氮离子注入诱变；(3)将经过氮离子注入诱变的菌液进行稀释，均匀涂布在M4培养基上，恒温培养；(4)于M4平板上挑选出单菌落作为初筛菌；(5)经过发酵培养，得出能够稳定产顺‑11‑十六碳烯醛的破囊壶菌菌株。本发明方法操作简单、效率高、成本低，易于推广。经本发明方法获得的菌株，较野生型破囊壶菌顺‑11‑十六碳烯醛产量提高最多可达65.18％，远超同类方法，能够产生巨大的经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种产顺-11-十六碳烯醛破囊壶菌菌株的培育方法，特别涉及一种破囊壶菌进行氮离子诱变进行选育，从而获得高产菌株的方法。
技术背景
小菜蛾作为农业生产中最为常见的害虫之一，广泛分布在中国多个粮食产区。近年来，有许多学者鉴定出顺-11-十六碳烯醛是小菜蛾信息素的主要有效成分，利用小菜蛾信息素可以高效、精准的诱捕并杀死害虫，达到绿色防治的目的。然而，目前市场上多数使用化学合成法生产顺-11-十六碳烯醛，造成了不必要的环境污染和资源浪费。因此，筛选并培育高产顺-11-十六碳烯醛的破囊壶菌迫在眉睫。
在微生物菌种选育过程中，氮离子诱变是主要方法之一。利用简单高效的氮离子诱变技术，可以使菌株在非自然条件下大幅提高突变效率，进而挑选出所需的高产菌。提高破囊壶菌的顺-11-十六碳烯醛产量可以大幅提高发酵效率，带来巨大的经济效益。
关于培育破囊壶菌产脂肪酸的方法有很多，如专利(CN201811209492.X)采用紫外光诱变破囊壶菌使其高产二十二碳六烯酸，虽然操作简单、成本低，但是有利变异少，诱变的方向和性质不能控制；或如专利(CN201911192842.0)通过改良破囊壶菌液体MP培养基及破囊壶菌发酵培养基来达到高产脂肪酸的目的，虽然培养基配方简单，能源利用高，利于工业化生产，但是所产总脂肪酸含量不高，且棕榈酸和DHA的含量均低于0.6g/L；或如专利(201911104758.9)中采用化学合成法合成顺-11-十六碳烯醛，虽然操作简单，反应条件温和，但是所产生的副产物会造成污染，不如生物制备法绿色安全。
发明内容
本发明的目的是提供一种产顺-11-十六碳烯醛破囊壶菌菌株的培育方法，突破微生物法产顺-11-十六碳烯的产量瓶颈。
本发明的技术方案概述如下：一种产顺-11-十六碳烯醛破囊壶菌菌株的培育方法，其具体步骤如下：
(1)取破囊壶菌于活化培养基中得活化菌液，将活化后的菌液离心，去除上清液，用无菌生理盐水将菌体悬浮，获得细胞浓度在107～109CFU/mL的菌悬液；
(2)在无菌条件下，取步骤(1)获得的菌悬液均匀平铺在固体培养皿中，平铺量为1.5～2mL/cm2，进行氮离子注入诱变，注入能量为20～40keV，氮离子注入量为5～50×1014ions/cm2；
(3)将步骤(2)中经过氮离子注入诱变的菌液用无菌生理盐水稀释体积50～150倍，取稀释后的菌液均匀涂布在M4固体平板培养基上，涂布的量为50～100μL/cm2，放入培养箱中培养；
(4)于M4平板上挑选出单菌落作为初筛菌；
(5)将步骤(4)中获得的初筛菌进行发酵培养，得到能稳定产顺-11-十六碳烯醛的破囊壶菌菌株。
优选步骤(1)中所述的活化培养基的成分为：葡萄糖50～55g/L、无水乙醇5～8g/L，酵母提取物2～3g/L、K2HPO4 0.2～0.3g/L，人工海盐13～14g/L、蛋白胨0.1～0.2g/L。
优选步骤(1)中活化培养条件为：在温度28～30℃，转速160～180rpm，pH为6.5～7.5条件下培养3～6天。
优选步骤(3)中放入培养箱中培养条件为15～30℃中恒温培养24～48h。
优选步骤(3)中M4培养基成分为：葡萄糖20～22g/L，蛋白胨1.5～2g/L，酵母提取物1.0～2.0g/L，人工海盐33～36g/L，琼脂粉20～25g/L。
优选步骤(5)中发酵培养条件为：温度为15～30℃、转速为200～250r/min，培养时间为4～6天。
有益效果：
本发明所涉及的破囊壶菌培育方法操作简单、效率高、成本低，在实际中易于操作。经过本发明方法所获得的破囊壶菌菌株，较野生型破囊壶菌顺-11-十六碳烯醛产量提高最多可达65.18％，远超同类方法，能够产生巨大的经济效益。
具体实施方式
以下结合具体实例对本发明做进一步的说明，本发明以破囊壶菌(Aurantiochytrium sp.NJTU-63菌，购买自宁波明舟生物科技有限公司)为例，但并不对本发明做任何限制，其他野生型破囊壶菌也适用于本发明。
实施例1：
一种产顺-11-十六碳烯醛破囊壶菌菌株的培育方法，包括如下步骤：
(1)挑取破囊壶菌于活化培养基中，培养基成分为：葡萄糖50g/L、无水乙醇8g/L，酵母提取物3g/L、K2HPO4 0.2g/L，人工海盐14g/L、蛋白胨0.1g/L在温度28℃，转速160rpm，pH为6.5条件下培养3天，得活化菌液，将活化后的菌液离心，去除上清液，用无菌生理盐水将菌体悬浮，获得细胞浓度在107CFU/mL的菌悬液；
(2)在无菌条件下，取步骤(1)获得的菌悬液均匀平铺在固体培养皿中，平铺量为1.5mL/cm2，进行氮离子注入诱变，注入能量为20keV，氮离子注入量为5×1014ions/cm2；
(3)将步骤(2)中经过氮离子注入诱变的菌液用无菌生理盐水稀释体积50倍，取50μL/cm2均匀涂布在M4培养基上，M4培养基成分为：葡萄糖22g/L，蛋白胨1.5g/L，酵母提取物2.0g/L，人工海盐33g/L，琼脂粉25g/L，15℃中恒温培养48h；
(4)于M4平板上挑选出单菌落作为初筛菌；
(5)将步骤(4)中获得的初筛菌进行发酵培养，在15℃、200r/min培养6天，检测其生物量及顺-11-十六碳烯醛产量。
检测发酵后菌株生物量：收集10mL上述步骤(5)获得的菌液，于已称重的离心管内，12000r/min离心10min，去上清，离心管中剩余沉淀物用生理盐水清洗3次，置于冷冻干燥机中冻干，称量冻干后离心管重量，离心管冻干后的重量减去空离心管重量即为发酵液生物量。经过检测，筛选得到的菌株生物量较野生型破囊壶菌提高了26.78％。
顺-11-十六碳烯醛产量：取冻干称重后的菌体加入2ml的质量浓度4％的硫酸甲醇溶液中，加入100μl内标(1g/L十九烷酸)，80℃水浴1h后取出冷却，加入1ml灭菌水，1ml正己烷，充分混匀后离心，取上层有机相，过0.45μm膜后气相测样，根据内标的量来计算出顺-11-十六碳烯醛的含量。经过计算，筛选得到的菌株顺-11-十六碳烯醛产量较野生型破囊壶菌提高了57.62％。
实施例2：
一种高产顺-11-十六碳烯醛破囊壶菌菌株的培育方法，包括如下步骤：
(1)挑取破囊壶菌于活化培养基中，培养基成分为：葡萄糖52g/L、无水乙醇6g/L，酵母提取物2.5g/L、K2HPO4 0.25g/L，人工海盐13.5g/L、蛋白胨0.15g/L在温度29℃，转速170rpm，pH为7条件下培养4天，得活化菌液，将活化后的菌液离心，去除上清液，用无菌生理盐水将菌体悬浮，获得细胞浓度在108CFU/mL的菌悬液；
(2)在无菌条件下，取步骤(1)获得的菌悬液均匀平铺在固体培养皿中，平铺量为1.7mL/cm2，进行氮离子注入诱变，注入能量为30keV，氮离子注入量为30×1014ions/cm2；
(3)将步骤(2)中经过氮离子注入诱变的菌液用无菌生理盐水稀释体积90倍，取75μL/cm2均匀涂布在M4培养基上，M4培养基成分为：葡萄糖21g/L，蛋白胨1.7g/L，酵母提取物1.5g/L，人工海盐35g/L，琼脂粉23g/L，23℃中恒温培养24h；
(4)于M4平板上挑选出单菌落作为初筛菌；
(5)将步骤(4)中获得的初筛菌进行发酵培养，在23℃、225r/min培养5天，检测其生物量及顺-11-十六碳烯醛产量。
菌株生物量及顺-11-十六碳烯醛产量计算方法同实施例1。经过检测，筛选得到的菌株生物量较野生型破囊壶菌提高了27.46％，筛选得到的菌株顺-11-十六碳烯醛产量较野生型破囊壶菌提高了60.77％。
实施例3：
一种高产顺-11-十六碳烯醛破囊壶菌菌株的培育方法，包括如下步骤：
(1)挑取破囊壶菌于活化培养基中，培养基成分为：葡萄糖55g/L、无水乙醇5g/L，酵母提取物2g/L、K2HPO4 0.3g/L，人工海盐13g/L、蛋白胨0.2g/L在温度30℃，转速180rpm，pH为7.5条件下培养6天，得活化菌液，将活化后的菌液离心，去除上清液，用无菌生理盐水将菌体悬浮，获得细胞浓度在109CFU/mL的菌悬液；
(2)在无菌条件下，取步骤(1)获得的菌悬液均匀平铺在固体培养皿中，平铺量为2mL/cm2，进行氮离子注入诱变，注入能量为40keV，注入量为50×1014ions/cm2；
(3)将步骤(2)中经过氮离子注入诱变的菌液用无菌生理盐水稀释体积150倍，取100μL/cm2均匀涂布在M4培养基上，M4培养基成分为：葡萄糖20g/L，蛋白胨2g/L，酵母提取物1.0g/L，人工海盐36g/L，琼脂粉20g/L，30℃中恒温培养36h；
(4)于M4平板上挑选出单菌落作为初筛菌；
(5)将步骤(4)中获得的初筛菌进行发酵培养，在30℃、250r/min培养4天，检测其生物量及顺-11-十六碳烯醛产量。
菌株生物量及顺-11-十六碳烯醛产量计算方法同实施例1。经过检测，筛选得到的菌株生物量较野生型破囊壶菌提高了28.17％，筛选得到的菌株顺-11-十六碳烯醛产量较野生型破囊壶菌提高了65.18％。
Claims (6)
1.一种产顺-11-十六碳烯醛破囊壶菌菌株的培育方法，其具体步骤如下：
(1)取破囊壶菌于活化培养基中得活化菌液，将活化后的菌液离心，去除上清液，用无菌生理盐水将菌体悬浮，获得细胞浓度在107～109CFU/mL的菌悬液；
(2)在无菌条件下，取步骤(1)获得的菌悬液均匀平铺在固体培养皿中，平铺量为1.5～2mL/cm2，进行氮离子注入诱变，注入能量为20～40keV，氮离子注入量为5～50×1014ions/cm2；
(3)将步骤(2)中经过氮离子注入诱变的菌液用无菌生理盐水稀释体积50～150倍，取稀释后的菌液均匀涂布在M4培养基上，涂布的量为50～100μL/cm2，放入培养箱中培养；
(4)于M4平板上挑选出单菌落作为初筛菌；
(5)将步骤(4)中获得的初筛菌进行发酵培养，得到能稳定产顺-11-十六碳烯醛的破囊壶菌菌株。
2.如权利要求1所述的培育方法，其特征在于步骤(1)中所述的活化培养基的成分为：葡萄糖50～55g/L、无水乙醇5～8g/L，酵母提取物2～3g/L、K2HPO40.2～0.3g/L，人工海盐13～14g/L、蛋白胨0.1～0.2g/L。
3.如权利要求1所述的培育方法，其特征在于步骤(1)中活化培养条件为：在温度28～30℃，转速160～180rpm，pH为6.5～7.5条件下培养3～6天。
4.如权利要求1所述的培育方法，其特征在于步骤(3)中放入培养箱中培养条件为15～30℃中恒温培养24～48h。
5.如权利要求1所述的培育方法，其特征在于步骤(3)中M4培养基成分为：葡萄糖20～22g/L，蛋白胨1.5～2g/L，酵母提取物1.0～2.0g/L，人工海盐33～36g/L，琼脂粉20～25g/L。
6.如权利要求1所述的培育方法，其特征在于步骤(5)中发酵培养条件为：温度为15～30℃、转速为200～250r/min，培养时间为4～6天。
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2022
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Non-Patent Citations (1)
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