CN105510459A - 一种非布索坦原料的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种非布索坦原料的检测方法，所述检测方法包括性状、鉴别、检查和含量测定项目；其中，鉴别是对非布索坦进行鉴别；检查是对干燥失重、炽灼残渣、重金属、有关物质和有机溶剂残留量进行检查；含量测定是对非布索坦含量进行测定。针对现有技术的不足，本发明建立了系统的、完整的、有效的成分鉴别和含量测定方法，可有效控制非布索坦原料的质量，从而确保其临床疗效。

Description

一种非布索坦原料的检测方法
本申请是申请日为2012年12月14日，申请号为2012105453507，名称为“一种非布索坦原料的制备方法和检测方法”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种非布索坦原料的制备方法和检测方法，属于药物化学技术领域。
背景技术
痛风为嘌呤代谢紊乱和(或)酸排泄障碍所致血尿酸增高的一组异质性疾病。痛风自古就是欧美等发达国家的常见病。近20年来，亚洲地区高尿酸血症和痛风的患病率有显著增多的趋势。
别嘌呤醇是临床上唯一一个用于抑制尿酸生成的药物，并作为痛风的黄金治疗药物广泛用于临床，但由于别嘌呤醇只对还原型的XOR有抑制作用，需要重复大剂量给药来维持较高的药物水平，不少患者对别嘌醇过敏、无效或不能耐受。
而非布索坦(febuxostat)则是一种特异性黄嘌呤氧化酶抑制剂，英文名：febuxostat，化学名：2-[3-氰基-4-(2-甲基丙氧基)苯基]-4-甲基噻唑-5-羧酸，分子式：C16H16N2O3S，分子量：316.37，化学结构式如下所示：
与别嘌醇相比，非布索坦阻止痛风发作的疗效及药物不良反应的发生率相似，但抑制尿酸生成强度更高。现欧盟与FDA均批准其上市申请，用于慢性尿酸过高症痛风症的治疗。临床研究结果表明：非布索坦的临床有效性和安全性均有满意结果。
查阅相关文献，总结出文献报道的非布索坦合成有以下几条路线：
路线一：
路线二：
路线三：
路线四：
路线五：
目标产物非布索坦的合成路线的关键点在于上氰基的方法不同及O-异丁基化的先后顺序。路线一通过将硝基氢化还原成氨基、然后氨基转化成氰基；路线二使用氰化钾直接上氰基；路线三和路线四都是先在HMT、PPA的作用下上醛基、然后羟胺加成转化成肟、最后脱水成氰基。路线一的合成路线长(7步反应)且收率低，并使用到剧毒品氰化亚铜和氰化钾；路线二虽然路线短但是同样使用到剧毒品氰化钾；路线三和路线四使用的起始原料工业中虽不易得但是可以自行制备；而路线五采用剧毒品硫化氢来制备中间体来合成目标化合物。
在分析上述路线的基础上，以路线三为基础，参考路线一、路线二和路线五的部分反应来合成制备路线三的起始原料2-(4-羟基苯基)-4-甲基噻唑-5-甲酸乙酯，并对最后一步水解反应加以改进，考虑到目标化合物合成中可能残留溶剂的毒性，去除四氢呋喃为溶剂，改用乙醇/水为反应溶剂；使用新的结晶方法来制备得到稳定的新晶型。
此外，目前对非布索坦原料还没有一套严格可靠的质量检测标准。如果没有严格的质量标准，得到的产品不能确保其质量，结果必将影响该药物的临床疗效；所以为提高以非布索坦为原料制成的药物制剂的治疗作用，确保用药的安全、有效及产品质量的稳定，制定一个严格可靠的质量标准成为保证药品质量的基本要求。随着现代仪器分析技术的发展，高效液相色谱法等分析方法在药品的质量控制中得到了越来越广泛的应用。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种非布索坦原料的制备方法和检测方法。本发明针对现有技术的不足，对非布索坦原料的制备工艺进行了优化，使用新的结晶方法来制备得到稳定的新晶型，使其对治疗尿酸沉积已经形成的慢性尿酸过高症(包括历史性和进行性痛风和/或痛风性关节炎)的疗效更为显著，并建立了系统的、完整的、有效的成分鉴别和含量测定方法，可有效控制该药品的质量，从而确保其临床疗效。
本发明的技术方案：一种非布索坦原料的制备方法，包括以下步骤：取对羟基苯甲腈Ⅱ、HCl饱和的DMF(二甲基甲酰胺)、硫代乙酰胺混合，发生反应得对羟基硫代苯甲酰胺Ⅲ；取中间体Ⅲ、无水乙醇、2-氯代乙酰乙酸乙酯混合，发生反应得2-(4-羟基苯基)-4-甲基噻唑-5-甲酸乙酯Ⅳ；取中间体Ⅳ、六亚甲基四胺、多聚磷酸混合，发生反应得2-(3-甲酰基-4-羟基苯基)-4-甲基噻唑-5-甲酸乙酯Ⅴ；取中间体Ⅴ、DMF、无水碳酸钾、溴代异丁烷混合，发生反应得2-(3-甲酰基-4-异丁氧基苯基)-4-甲基噻唑-5-甲酸乙酯Ⅵ；取中间体Ⅵ、无水甲酸、盐酸羟胺、甲酸钠混合，发生反应得2-(3-氰基-4-异丙氧基苯基)-4-甲基噻唑-5-甲酸乙酯Ⅶ；取中间体Ⅶ、无水乙醇、氢氧化钠混合，发生反应得非布索坦粗品Ⅰ，对非布索坦粗品Ⅰ进行精制、转晶即得；其反应路线如下：
前述非布索坦原料的制备方法中，由对羟基苯甲腈Ⅱ制备中间体Ⅲ的具体过程为：在反应瓶内依次加入500g、4.2mol的对羟基苯甲腈Ⅱ和2000mLHCl饱和的DMF，搅拌下加入565g、7.5mol的硫代乙酰胺，升温至100℃，搅拌反应5h；通过TLC监控反应，其中，RfⅡ＝0.7，RfⅢ＝0.5，展开剂：乙酸乙酯：石油醚＝1：1，GF254硅胶板；停止加热，减压回收DMF，残留物中加入1.5L水，乙酸乙酯提取两次，每次4500mL，合并有机相，减压至溶剂尽，得粘稠固体，加入二氯甲烷4000mL，搅拌分散30min，过滤，得棕褐色固体，60℃干燥，称重得421g中间体Ⅲ，其TLC检测为单一斑点。
前述非布索坦原料的制备方法中，由中间体Ⅲ制备中间体Ⅳ的具体过程为：在反应瓶中，依次加入420g、2.74mol的中间体Ⅲ、7.8L无水乙醇和546g、3.36mol的2-氯代乙酰乙酸乙酯，搅拌成悬浮液，加热回流反应5h；通过TLC监控反应，其中，RfⅢ＝0.5，RfⅣ＝0.8，展开剂：乙酸乙酯：石油醚＝1：1，GF254硅胶板；停止加热，稍冷后减压回收乙醇至尽，残留物中加入乙酸乙酯2500mL，搅拌20min，过滤，200mL乙酸乙酯洗涤，抽干，得黄褐色固体，50℃减压干燥过夜，称重得650g中间体Ⅳ，其TLC检测为单一斑点。
前述非布索坦原料的制备方法中，由中间体Ⅳ制备中间体Ⅴ的具体过程为：搅拌下将650g、2.46mol的中间体Ⅳ和357g、2.55mol的六亚甲基四胺加入到盛有3.57kg多聚磷酸的反应瓶中，加热至100℃，反应2h；通过TLC监控反应，其中，RfⅣ＝0.4，RfⅤ＝0.55，展开剂：乙酸乙酯：石油醚＝1：3，GF254硅胶板；停止加热，稍冷后加入冰水1100mL，搅拌，乙酸乙酯萃取3次，每次1200mL，合并有机相，饱和盐水洗涤2次，每次1000mL，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压回收乙酸乙酯至尽，得368g黄色固体，即中间体Ⅴ，其TLC检测基本为单一斑点。
前述非布索坦原料的制备方法中，由中间体Ⅴ制备中间体Ⅵ的具体过程为：将368g、1.26mol的中间体Ⅴ加入到反应瓶中，加入3500mLDMF，再加入260g、1.9mol的无水碳酸钾，搅拌15分钟后加入260g、1.9mol的溴代异丁烷，升温至70℃反应10小时；通过TLC监控反应，其中，RfⅤ＝0.55，RfⅥ＝0.7，展开剂：乙酸乙酯：石油醚＝1：3，GF254硅胶板；停止加热，将反应混合物转移到20L反应器中，冷却后加入水8500mL，搅拌析出固体，继续搅拌30分钟，过滤，水洗涤4次，每次800mL，60℃减压干燥过夜，得黄色固体300g，即中间体Ⅵ，其TLC检测为单一斑点。
前述非布索坦原料的制备方法中，由中间体Ⅵ制备中间体Ⅶ的具体过程为：将300g、0.86mol的中间体Ⅵ加入反应瓶中，加入1800mL无水甲酸，搅拌下加入68g、0.99mol的盐酸羟胺和71g、1.05mol的甲酸钠，加热至100℃反应10小时；通过TLC监控反应，其中，RfⅥ＝0.7,RfⅦ＝0.75，展开剂：乙酸乙酯：石油醚＝1：3，GF254硅胶板；停止加热，冷却，依次加入水4000mL和乙酸乙酯400mL，搅拌30分钟，过滤，水洗涤3次，每次1000mL，60℃减压干燥过夜，将所得固体用8.5L无水乙醇加热溶解，趁热过滤，冷却析晶，过滤，500mL无水乙醇，60℃减压干燥4h，称重得270g中间体Ⅶ。
前述非布索坦原料的制备方法中，由中间体Ⅶ制备非布索坦粗品Ⅰ的具体过程为：将270g、0.78mol的中间体Ⅶ加入反应瓶中，再加入2750mL无水乙醇和2750mL、0.3M的氢氧化钠溶液，加热回流反应1.5小时；通过TLC监控反应，其中，RfⅦ＝0.8，RfⅠ＝0，展开剂：乙酸乙酯：石油醚＝1：3，GF254硅胶板；停止加热，冰水冷却至室温，搅拌下滴加盐酸至PH3，析出固体，继续搅拌30分钟，过滤，水洗涤3次，每次100mL，80℃减压干燥4小时，得非布索坦粗品225g。
前述非布索坦原料的制备方法中，对非布索坦粗品Ⅰ进行精制、转晶的具体过程为：称取非布索坦粗品225g，加入反应瓶中，加入无水乙醇4500mL，加热回流溶解，稍冷却，加入活性炭10g，继续回流30分钟，趁热过滤，滤液室温放置冷却析晶，冰水浴冷却至0℃保温30min，过滤，滤饼用少量冷乙醇洗涤，80℃减压干燥过夜，称重195g；将上述所得固体加入12L二氯甲烷，加热至产品全溶，室温冷却析晶，降至接近室温后0℃析晶30min，过滤，1L冷的二氯甲烷洗涤，抽干，60℃减压干燥3h，称重180g即得。
前述非布索坦原料的检测方法包括：性状、鉴别、检查和含量测定项目；其中，鉴别是对非布索坦进行鉴别；检查是对干燥失重、炽灼残渣、重金属、有关物质和有机溶剂残留量进行检查；含量测定是对非布索坦含量进行测定。
对非布索坦含量进行测定的方法为：
参照《中国药典》2010年版二部附录VD的高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为甲醇－三乙胺调pH为5.0的0.3％乙酸＝70：30，检测波长为317nm；理论板数按非布索坦峰计算，应不低于2000；
测定法：取本原料药10mg，精密称定，置50mL量瓶中，加甲醇适量，超声使溶解，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取5mL置25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取10μL注入液相色谱仪；另取非布索坦对照品，同法测定；按外标法以峰面积计算，即得。
前述的非布索坦原料的检测方法中，对非布索坦的具体鉴别方法为：
(1)在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致；
(2)本原料药的红外吸收图谱与对照品的图谱一致；
(3)本原料药的X射线粉末衍射图谱在2θ为5.7、8.6、12.1、13.2、14.4处有特征吸收峰。
前述的非布索坦原料的检测方法中，对非布索坦的具体检查方法为：
(1)有关物质：取本原料药10mg，精密称定，置50mL量瓶中，加甲醇适量，超声使溶解，加甲醇至刻度，作为供试品溶液；精密量取1mL，用甲醇稀释成每1mL含2μg的溶液，作为对照品溶液Ⅰ；另取杂质A适量，用甲醇稀释成每1mL含杂质A2μg的溶液，作为对照品溶液Ⅱ；参照含量测定项下的色谱条件，取10μL对照品溶液Ⅰ注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的10％～20％；再精密量取供试品溶液和对照品溶液Ⅰ、Ⅱ各10μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍；供试品溶液的色谱图中如有与对照品溶液Ⅱ主峰相对应的峰，则按外标法计算，应不得大于0.5％；除杂质A外，最大单一杂质峰面积不得大于对照品溶液Ⅰ峰面积的0.2倍，即0.2％；所有杂质峰面积的和不得大于对照品溶液Ⅰ峰面积的1.0倍，即1.0％；
(2)有机溶剂残留量：
①乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷：取本原料药0.4g置2mL量瓶中，加入二甲基亚砜微热溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另精密称取乙醇125mg、二氯甲烷15mg、乙酸乙酯125mg置于25mL量瓶中，加二甲基亚砜溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，从中精密量取5mL置25mL量瓶中，加二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；参照《中国药典》2010年版二部附录ⅧP的残留溶剂测定法进行测定，色谱柱为14％氰丙基苯基-甲基聚硅氧烷，30m×0.32mm×0.25μm毛细管柱，柱温起始温度为33℃，保持3分钟，然后以20℃/分钟的速率升至80℃，保持2分钟，再以60℃/分钟的速率升至200℃,保持3分钟；检测器为氢火焰离子化检测器，检测器温度为220℃；气化室温度为220℃；载气为氮气；精密量取供试品溶液和对照品溶液各1μL，分别注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，含二氯甲烷的量不得超过0.06％，含乙酸乙酯的量不得超过0.5％，乙醇的量不得超过0.5％；
②N,N-二甲基甲酰胺：取本原料药0.4g置2mL量瓶中，加入二甲基亚砜微热溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另精密称取N,N-二甲基甲酰胺22mg，置于25mL量瓶中，加二甲基亚砜溶解并稀释至刻度，摇匀,作为对照品储备液，从中精密量取5mL置25mL量瓶中,加二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；参照《中国药典》2010年版二部附录ⅧP的残留溶剂测定法进行测定，色谱柱为DM-WAX，30m×0.32mm×0.25μm毛细管柱；柱温起始温度为170℃，保持3分钟，然后以20℃/分钟的速率升至200℃，保持2分钟；检测器为氢火焰离子化检测器，检测器温度为220℃；气化室温度为220℃；载气为氮气；精密量取供试品溶液和对照品溶液各1μL，分别注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，含N,N-二甲基甲酰胺的量不得超过0.088％；
(3)干燥失重：取本原料药，参照《中国药典》2010年版二部附录ⅧL进行检查，在105℃干燥至恒重，减失重量应不得超过1.0％；
(4)炽灼残渣：取本原料药0.5g，参照《中国药典》2010年版二部附录ⅧN进行检查，遗留残渣不得超过0.2％；
(5)重金属：取炽灼残渣项下残留的残渣，参照《中国药典》2010年版二部附录ⅧH第二法进行检查，含重应不得超过10％。
前述的非布索坦原料的检测方法包括：
(1)性状：本原料药为白色至类白色粉末；
(2)含量测定：参照《中国药典》2010年版二部附录VD的高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为甲醇－三乙胺调pH为5.0的0.3％乙酸＝70：30，检测波长为317nm；理论板数按非布索坦峰计算，应不低于2000；
测定法：取本原料药10mg，精密称定，置50mL量瓶中，加甲醇适量，超声使溶解，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取5mL置25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取10μL注入液相色谱仪；另取非布索坦对照品，同法测定；按外标法以峰面积计算，即得；
(3)鉴别：
①在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致；
②本原料药的红外吸收图谱与对照品的图谱一致；
③本原料药的X射线粉末衍射图谱在2θ为5.7、8.6、12.1、13.2、14.4处有特征吸收峰；
(4)检查：
①有关物质：取本原料药10mg，精密称定，置50mL量瓶中，加甲醇适量，超声使溶解，加甲醇至刻度，作为供试品溶液；精密量取1mL，用甲醇稀释成每1mL含2μg的溶液，作为对照品溶液Ⅰ；另取杂质A适量，用甲醇稀释成每1mL含杂质A2μg的溶液，作为对照品溶液Ⅱ；参照含量测定项下的色谱条件，取10μL对照品溶液Ⅰ注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的10％～20％；再精密量取供试品溶液和对照品溶液Ⅰ、Ⅱ各10μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍；供试品溶液的色谱图中如有与对照品溶液Ⅱ主峰相对应的峰，则按外标法计算，应不得大于0.5％；除杂质A外，最大单一杂质峰面积不得大于对照品溶液Ⅰ峰面积的0.2倍，即0.2％；所有杂质峰面积的和不得大于对照品溶液Ⅰ峰面积的1.0倍，即1.0％；
②有机溶剂残留量：
乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷：取本原料药0.4g置2mL量瓶中，加入二甲基亚砜微热溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另精密称取乙醇125mg、二氯甲烷15mg、乙酸乙酯125mg置于25mL量瓶中，加二甲基亚砜溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，从中精密量取5mL置25mL量瓶中，加二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；参照《中国药典》2010年版二部附录ⅧP的残留溶剂测定法进行测定，色谱柱为14％氰丙基苯基-甲基聚硅氧烷，30m×0.32mm×0.25μm毛细管柱，柱温起始温度为33℃，保持3分钟，然后以20℃/分钟的速率升至80℃，保持2分钟，再以60℃/分钟的速率升至200℃,保持3分钟；检测器为氢火焰离子化检测器，检测器温度为220℃；气化室温度为220℃；载气为氮气；精密量取供试品溶液和对照品溶液各1μL，分别注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，含二氯甲烷的量不得超过0.06％，含乙酸乙酯的量不得超过0.5％，乙醇的量不得超过0.5％；
N,N-二甲基甲酰胺：取本原料药0.4g置2mL量瓶中，加入二甲基亚砜微热溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另精密称取N,N-二甲基甲酰胺22mg，置于25mL量瓶中，加二甲基亚砜溶解并稀释至刻度，摇匀,作为对照品储备液，从中精密量取5mL置25mL量瓶中,加二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；参照《中国药典》2010年版二部附录ⅧP的残留溶剂测定法进行测定，色谱柱为DM-WAX，30m×0.32mm×0.25μm毛细管柱；柱温起始温度为170℃，保持3分钟，然后以20℃/分钟的速率升至200℃，保持2分钟；检测器为氢火焰离子化检测器，检测器温度为220℃；气化室温度为220℃；载气为氮气；精密量取供试品溶液和对照品溶液各1μL，分别注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，含N,N-二甲基甲酰胺的量不得超过0.088％；
③干燥失重：取本原料药，参照《中国药典》2010年版二部附录ⅧL进行检查，在105℃干燥至恒重，减失重量应不得超过1.0％；
④炽灼残渣：取本原料药0.5g，参照《中国药典》2010年版二部附录ⅧN进行检查，遗留残渣不得超过0.2％；
⑤重金属：取炽灼残渣项下残留的残渣，参照《中国药典》2010年版二部附录ⅧH第二法进行检查，含重应不得超过10％。
为了确保本发明所述的非布索坦原料的制备工艺科学、合理、可行，申请人进行了一系列试验研究和考察。
一、确证化学结构的方法
1、元素分析
测试单位：北京大学分析测试中心；
仪器型号：德国ElementarVarioEL型元素分析仪；
测定结果见表1。
表1非布索坦样品元素分析测定结果
非布索坦样品元素分析结果显示，实验测定值与按非布索坦分子式计算的元素分析理论值一致(误差小于0.3％)，因此，本原料药的元素分析结果符合非布索坦的化学组成。
2、红外吸收光谱(IR)
测试单位：北京微量化学研究所分析测试中心；
测试方法：KBr压片法；
仪器型号：BIO-RADWin-IR；
分辨率：4cm-1；
扫描次数：32次；
取非布索坦样品适量，测定红外吸收光谱，图谱解析结果见表2。
表2非布索坦样品红外吸收光谱数据解析表
吸收峰(cm-1) 强度 振动类型 基团
2960、2875 m υC-H 甲基、亚甲基
2229 m υCΝ 氰基
1694 s υC＝O 羧基(二缔合体)
1659 s υC＝O 羧基(分子内氢键)
1608，1513 s υC＝C 苯环骨架
1430，1449 m δC-H 甲基、亚甲基
1389，1372 m δC-H 偕二甲基CH(CH3)2
1286 s υC-O-C C-O-C
数据解析：2960、2875cm-1处的吸收峰为-CH3、-CH2的C-H伸缩振动吸收峰。2229cm-1处的吸收峰为氰基伸缩振动吸收峰。1694cm-1、1659cm-1处的吸收峰为分别为二缔合体、分子内氢键状态的羧基的伸缩振动吸收峰。1608cm-1、1513cm-1处的吸收峰为苯环骨架的C＝C伸缩振动吸收峰。1430cm-1、1449cm-1处的吸收峰为-CH3、-CH2的C-H弯曲振动吸收峰。1389cm-1、1372cm-1处的吸收峰为偕二甲基CH(CH3)2的C-H弯曲振动吸收峰，同一个C原子上的两个甲基的C-H健的两种不同相位的振动偶合使其裂分为强度相当的双峰。1286cm-1处的强宽吸收峰为C-O-C反对称伸缩振动吸收峰，这是由于O原子的未共用P电子对与苯环发生P-π共轭，使C-O键具有一定程度的双键性，C-O-C的反对称伸缩振动引起分子偶极矩的较大变化，使吸收带宽而强。以上这些特征官能团与非布索坦的分子结构相符。
3、紫外吸收光谱
仪器型号：安捷仑上分6010；
样品制备：称取16.6mg样品，适量甲醇溶解，稀释到50mL，再取2mL，稀释到100mL，配制成6.64μg/mL的样品溶液；
其紫外吸收光谱解析结果见表3。
表3紫外吸收光谱数据解析表
溶剂 λmax(nm) εmax
甲醇 314.8 2.3x 104
图谱解析：样品的最大摩尔吸光系数为2.3x104，表明样品非布索坦分子结构中含共轭结构，与理论相符。
4、核磁共振谱(NMR)
测试单位：北京微量化学研究所分析测试中心；
仪器型号：BRUKERARX-500；
溶剂：DMSO-d6；
谱图数据解析结果见表4。
表41H-NMR、H-Hcosy谱图数据解析表
化学位移(ppm) 质子数 多重性 归属 J值 相关质子
2.663 3 s H-12
13.421 1 s 13位羧基
8.298～8.303 1 d H-7 2.5Hz H-11
8.223～8.245 1 dd H-11 2.0,9.0Hz H-7、H-10
7.373～7.391 1 d H-10 9.0Hz H-11
4.005～4.018 2 d H-15 6.5Hz H-16
2.067～2.119 1 m H-16 6.5Hz H-15、H17、H18
1.013～1.027 6 d H17、H18 7.0Hz H-16
图谱解析：
1H-NMR给出8组峰，积分比(由低场至高场)为1：1：1：1：2：3：1：6，共有16个氢质子，与非布索坦的分子式相符。根据化学位移、偶合常数值及1H-1HCOSY谱，氢质子归属如下：
δ13.421是一包峰，相当于1个质子，为13位羧基质子；
δ8.298～8.303为双峰，相当于1个质子，δ8.223～8.245为四重峰，相当于1个质子，δ7.373～7.391为双峰，相当于1个质子，三组峰氢氢相关，根据化学位移分别归属为苯环上的7位和10,11位质子；
δ4.005～4.018为双峰，相当于2个质子，可推测是15位亚甲基的2个质子，这是由于受与其直接相连的电负性较大的氧原子的影响，化学位移相对较高；
δ2.663是单峰，相当于3个质子，根据化学位移归属为噻唑环上的12位甲基质子；
δ1.013～1.027为双峰，相当于6个质子，δ2.067～2.119是一组多重峰，相当于1个质子，1H-1HCOSY显示两组质子存在相关性，可推测分别是17位、18位甲基质子和16位的次甲基质子。
谱图数据解析结果见表5。
表513C-NMR、HMQC图谱数据解析表
化学位移(ppm) 碳类型 C数 归属 HMQC 备注
16.966 伯 1 C12 H12
18.652 伯 2 C17、C18 H17、H18
27.542 叔 1 C16 H16
75.069 仲 1 C15 H15
101.497 季 1 C8 /
113.767 叔 1 C11 H11
115.295 季 1 C14 /
122.834 季 1 C6 /
125.294 季 1 C5 /
131.411 叔 1 C7 H7
132.929 叔 1 C10 H10
159.447 季 1 C9 /
161.970 季 1 C4 /
162.761 季 1 C13 /
166.095 季 1 C2 /
谱图解析：
13C-NMR谱图中除溶剂峰外有15个碳峰，考虑到C17和C18的等同性，与非布索坦分子式相符。根据化学位移、HMQC，各碳原子归属如下：
δ16.966处有甲基碳原子信号，与H12相关，归属为C12；
δ18.652处有甲基碳原子信号，与H17、H18相关，归属为C17和C18；
δ27.542ppm处有叔C碳原子信号，与H16相关，归属为C16；
δ75.069ppm处有连氧仲C碳原子信号，与H15相关，归属为C15；
δ101.497ppm处有1个季C碳原子信号，归属为C8；
δ113.767、131.411、132.929ppm处各有1个苯环叔C碳原子信号，根据化学位移和δ113.767、131.411、132.929ppm分别相关H11、H7、H10，归属为分子中的三个苯环叔碳C11，C7,C10；
δ115.295ppm处有一个季C碳原子信号，为氰基碳信号，归属为C14；
δ122.834ppm处有一个苯环季C碳原子信号，归属为C6；
δ125.294ppm处有一个苯环季C碳原子信号，归属为C5；
δ159.447ppm处有一个苯环季C碳原子信号，归属为C9；
δ162.761ppm处有一个羰基季C碳原子信号，为羧基碳原子，归属为C13；
δ161.970ppm处有一个芳环季C碳原子信号，归属为C4；
δ166.095ppm处有一个芳环季C碳原子信号，归属为C2；
综上所述，所有C、H存在合理，与非布索坦的分子结构相符合。
5、质谱(MS)
测试单位：北京大学分析测试中心；
仪器：BrukerApexⅣFTMS质谱仪；
离子化方式：ESI；
BrukerDaltonicsDataAnalysis3.4分析结果显示，质荷比为317.09498的分子离子峰的分子组成为C16H17N2O3S，与非布索坦的分子式C16H16N2O3S一致，可解释为(M+H)+离子峰。
6、热分析
(1)差式扫描量热分析(DSC)
测试单位：北京大学分析测试中心；
仪器：UniversalV4.1DTAInstruments；
温度范围：30-250℃；
升温速率：10℃/min；
样品在201℃有一吸热峰，与熔点相一致。
(2)热重分析(TGA)
测试单位：北京大学分析测试中心；
仪器：UniversalV4.4ATAInstruments；
温度范围：20-500℃；
升温速率：10℃/min；
结果表明：测试样品不含结晶水、结晶溶剂和吸附水。
7、粉末X-射线衍射
测试单位：北京大学化学与分子工程学院；
仪器型号：D/max-RC型X-射线粉末衍射仪；
扫描速度：4°/min；
管流管压：40kv，100mA；
从样品的X-射线粉末衍射图谱可以判断出其为晶态化合物。
8、综合结论
通过本原料药的元素分析的结果，综合红外光谱、核磁共振谱、质谱和紫外光谱的数据，结合X—射线粉末衍射和热分析的测定结果，可得出如下结论：本原料药的化学结构与已知的非布索坦的结构一致。
二、非布索坦新晶型研究
2、试验方案(见表6)：
表6
2、粉末X射线衍射测试结果
对上述各个试验方案得到的晶型样品进行X射线粉末衍射，结果见下表：
表7
样品序号 X射线粉末衍射特征峰(以2θ表示) 结论
1# 6.5、7.1、11.5、12.7、17.2、25.7 与专利晶型B不一致
2# 7.3、14.7、16.7、26.0 与专利晶型B不一致13 -->
3# 5.7、8.6、12.1、13.2、14.4 与专利晶型B不一致
7# 4.8、6.8、11.6、12.1、15.8 与专利晶型B一致
8# 5.6、7.8、11.5、12.6、25.8 与专利晶型B不一致
9# 4.7、6.7、11.4、12.0、15.7、17.3 与专利晶型B一致
11# 4.7、6.8、11.6、15.8、17.5 与专利晶型B一致
注：专利晶型B是指帝人株式会社申请的专利，其专利公开号CN1275126。
3、结论
考虑到新晶型的流动性、适宜制剂等各方面的因素，选择样品3#作为开发的新晶型。
另外，为了确保本发明的检测方法科学、合理、可行，申请人进行了一系列试验研究和考察。
一、理化常数
1、性状：根据多批样品实际情况将性状制定为：本原料药为白色至类白色粉末。测定四批，见表8。
表8性状测定结果
批号 080825 080915 080920 080925
性状 类白色粉末 类白色粉末 类白色粉末 类白色粉末
2、溶解度：根据合成与分析测试时需要使用的溶剂，测试了非布索坦在以下几种溶剂中的溶解情况。
表9溶解度测定结果
结论：当T＝25℃时，本原料药几乎不溶于水，微溶于甲醇和乙腈，略溶于乙酸乙酯，易溶于二甲基甲酰胺。
3、熔点：本原料药为非布索坦新晶型，因此参考中国药典2010年版二部附录ⅥC对本原料药进行了测定，结果见表10。
表10测定结果
批号 080825 080915 080920 080925
熔点(℃) 202.8-203.6 202.2-203.3 204.0-204.8 203.5-204.7
二、含量测定
采用HPLC法进行含量测定的方法学研究，并测定了样品的含量。
1、标准曲线的制备
取非布索坦对照品10mg，精密称定，置50mL量瓶中，加甲醇适量，超声使溶解，加甲醇至刻度，分别精密量取1、3、5、7、10mL置25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别取上述溶液各10μL进样，记录谱图。结果见图1和表11。
表11非布索坦线性测定结果
浓度(μg/mL) 8.176 24.528 40.880 57.232 81.760
峰面积A 276397 802833 1343758 1899259 2697396
线性方程为Y＝33009X+534.34，R2＝0.9999,表明浓度在8.176～81.760μg/mL范围内呈良好线性。
2、精密度试验
取线性中间浓度的溶液，分别取10μL进样六次，记录谱图。结果见表12。
表12精密度试验结果
序号 1 2 3 4 5 6 平均值 RSD％
峰面积 1352997 1348004 1351334 1354380 1353633 1347994 1351357 0.21
3、重复性试验
取同一批样品10mg，分别六份，精密称定，置50mL量瓶中，加甲醇适量，超声使溶解，加甲醇至刻度，分别精密量取5mL置25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另精密称取非布索坦对照品10mg置50mL量瓶中，加甲醇适量，超声使溶解，加甲醇至刻度，分别精密量取5mL置25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。计算测定样品的含量，结果见表13。
表13重复性试验结果
序号 1 2 3 4 5 6 平均值 RSD％
含量％ 99.3 100.2 99.3 98.3 99.9 98.4 99.2 0.79
4、稳定性试验
取重复性项下第一份供试品溶液，分别于0、2、4、6、8小时10μL注入色谱仪，记录谱图，结果见表14。
表14稳定性试验结果
序号 0 2 4 6 8 平均值 RSD％
峰面积A×103 1690 1692 1666 1676 1685 1681.8 0.64
5、含量测定
取各批样品各10mg，精密称定，置50mL量瓶中，加甲醇适量，超声使溶解，加甲醇至刻度，分别精密量取5mL置25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另精密称取非布索坦对照品10mg置50mL量瓶中，加甲醇适量，超声使溶解，加甲醇至刻度，分别精密量取5mL置25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。计算即得含量。结果见表15。
表15含量测定结果
批号 080825 080915 080920 080925
含量(％) 99.2 100.2 100.1 100.3
三、鉴别
1、在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。
2、本原料药的红外吸收图谱与对照的图谱一致。
3、本原料药的X射线粉末衍射图谱在2θ为5.7、8.6、12.1、13.2、14.4处有特征吸收峰。见表16。
表16非布索坦鉴别结果
四、检查
1、溶液的澄清度与颜色：取本原料药0.1g,加甲醇50mL，超声使溶解，考察溶液的澄清度与颜色，溶液应澄清无色；若有颜色，应浅于黄色2号。结果见表17。
2、干燥失重：取本原料药0.2g，在105℃干燥至恒重，减失重量不得过1.0％，参照《中国药典》2010年版二部附录ⅧL进行检查，测定四批，结果见表17。
3、氯化物：取本原料药0.40g，加水50mL，振摇，玻璃棒搅拌使之振摇溶解充分，再加稀硝酸20mL，摇匀，滤过，取续滤液35mL,置50mL纳氏比色管中，加水至约40mL，参照《中国药典》2010年版二部附录ⅧA进行检查，与标准氯化钠溶液2.0mL制成的对照品溶液比较，不得更深(0.01％)。测定四批，结果见表17。
4、硫酸盐：取本原料药1.0g，加水50mL，充分振摇，取续滤液25mL置50mL纳氏比色管中，加稀盐酸2mL，摇匀，加水至约40mL，参照《中国药典》2010年版二部附录ⅧB依法检查，与标准硫酸钾溶液2.0mL制成的对照品溶液比较，不得更深(0.04％)。测定四批，结果见表17。
5、炽灼残渣：取本原料药0.5g，参照《中国药典》2010年版二部附录ⅧN依法检查，不得过0.2％。测定四批，结果见表17。
6、重金属：取炽灼残渣项下残留物，参照《中国药典》2010年版二部附录ⅧH第二法依法检查，含重金属不得过百万分之十。测定四批，结果见表17。
7、砷盐检查：取本原料药2.0g，置加热套中炭化，待炭化完全后置600℃下灰化至完全，加盐酸5mL和水21mL，摇匀，转移至测砷瓶中，加碘化钾试液5mL与酸性氯化亚锡试液5滴，在室温放置10分钟后，加锌粒2g，立即将装妥的导气管密塞于测砷瓶上，置40℃水浴中反应45分钟，取出溴化汞试纸，得供试品砷斑，参照《中国药典》2010年版二部附录ⅧJ，依法检查，与标准砷斑比较，结果见表17。
表17非布索坦检查结果
批号 080825 080915 080920 080925
溶液的澄清度与颜色 澄清无色 澄清无色 澄清无色 澄清无色
干燥失重％ 0.687％ 0.508％ 0.489％ 0.496％17 -->
氯化物 ≤0.01％ ≤0.01％ ≤0.01％ ≤0.01％
硫酸盐 ≤0.04％ ≤0.04％ ≤0.04％ ≤0.04％
炽灼残渣 0.0182％ 0.0386％ 0.0196％ 0.0394％
重金属 ≤10ppm ≤10ppm ≤10ppm ≤10ppm
砷盐 ≤1ppm ≤1ppm ≤1ppm ≤1ppm
8.有关物质
8.1色谱条件的选择
8.1.1由非布索坦甲醇溶液的紫外扫描图可知，非布索坦在217nm及316nm附近均有最大吸收。同时参考文献CN1785182中测定方法拟定如下色谱条件：
(1)色谱条件：采用迪马C18色谱柱，以甲醇－0.3％乙酸(60：40)为流动相。检测波长为317nm.
(2)供试品溶液的制备：取本原料药适量，用甲醇溶解并稀释成每1mL含非布索坦0.2mg的溶液，即得。
(3)流动相选择：以甲醇－0.3％乙酸(60：40)、甲醇－0.3％乙酸(70：30)及甲醇－0.3％乙酸(90：10)为流动相，分别进样，记录谱图，结果对本原料药的洗脱效果不理想。因本原料药为弱酸性物质，故考虑调节0.3％乙酸的pH值为5.0做如下试验：
ⅰ甲醇－0.3％乙酸(三乙胺调节pH值为5.0)(90：10)；
ⅱ甲醇－0.3％乙酸(三乙胺调节pH值为5.0)(65：35)；
ⅲ甲醇－0.3％乙酸(三乙胺调节pH值为5.0)(70：30)；
取上述供试品溶液10μL，注入色谱仪，记录色谱图。结果谱图显示，在条件ⅰ下，本原料药的主峰出峰过快，且峰形不好，在条件ⅱ和ⅲ下，主峰的对称因子良好。结合主峰的保留时间，选择出峰稍快的，故暂定此条件ⅲ。
8.1.2取非布索坦合成粗品，采用8.1.1中拟定条件在DAD检测器上进行测定，从3D图谱中可知，非布索坦及其主要杂质非布索坦水解产物在217nm及317nm附近均有最大吸收。因此主要对217nm及317nm波长下的有关物质进行考察。具体数据见表18及图2、图3。
表18217nm及317nm波长下的有关物质比较
从以上图谱与数据可知，在217nm及317nm时测定杂质时，所经检测出来的杂质个数与位置及大小基本一致。其中非布索坦水解产物在217nm的吸收要强于317nm，但由于该杂质为非布索坦的主要杂质，拟采用杂质对照品法进行定量。从以上图谱可知在217nm测定时基线极其不平稳，对于3min到5min杂质峰峰面积的积分的准确性影响很大，但这个区域为非布索坦主要杂质集中区域，另外在6.9min左右的色谱峰由于基线波动仅能从色谱图中看出而无法积分。因此决定采用317nm作为非布索坦有关物质测定的检测波长，对于非布索坦水解产物(杂质A)采用杂质对照品法进行定量。
8.2考察破坏试验
供试品溶液的制备：取本原料药，用甲醇制成每1mL含非布索坦0.2mg的溶液。
酸降解产物：取供试品溶液2mL，加1mol/L盐酸1mL，摇匀，放置半小时，用1mol/L氢氧化钠调至中性，即得。
碱降解产物：取供试品溶液2mL，加1mol/L氢氧化钠1mL，摇匀，放置半小时，用1mol/L盐酸调至中性，即得。
氧化降解产物：取供试品溶液2mL，加双氧水2mL，摇匀，放置半小时，立即进样。
高温降解产物：取供试品溶液5mL，在80℃烘箱中加热3小时，放冷后加甲醇至5mL，即得。
光降解产物：取供试品溶液5mL，在4500±500LX强光下放置3小时后加甲醇至5mL，即得。
分别取上述溶液各10μL进样，记录谱图。
结果表明：本原料药对酸、高温、光和双氧水较为稳定，对碱较不稳定。
结论：经破坏试验，证明本原料药主峰与各降解产物的分离良好。
8.3样品与中间体的分离
取非布索坦合成工艺中的各中间体适量，加甲醇稀释成一定浓度，作为中间体溶液；分别取中间体溶液、供试品和中间体的混合液(体积比1：1)各10μL进样，记录谱图结果表明：中间体和供试品的主峰分离良好，且本法适于中间体Ⅵ的质量控制。
8.4杂质A(非布索坦水解产物)的测定方法研究
在合成小试得样品中，保留时间约为4分钟左右杂质超过杂质研究指导原则中鉴定限度0.1％，且经合成部门多次处理后仍未除去，因此对该杂质进行研究。具体情况如下：
8.4.1杂质结构的确定
在非布索坦产品的HPLC图谱中，保留时间在4.6min左右存在一个较大杂质峰(约0.3％)，但在中间体VII中没有该杂质。通过对非布索坦化学结构的分析，可能是在乙酯水解的同时氰基也发生了部分水解，生成酰胺或羧酸。为此，设计以下实验，延长反应时间，使氰基充分水解。
取非布索坦1g，加入15mL0.3M氢氧化钠溶液、15mL乙醇，加热回流5h。停止反应，降温至室温后搅拌下用稀盐酸调PH为3，析出沉淀，继续搅拌10min。过滤，抽干，得类白色固体，将其用30mL无水乙醇加热溶解，趁热过滤，冷却析晶。过滤，少量乙醇洗，抽干，80℃减压干燥过夜。得白色固体0.8g。
经HPLC测定结果比较，可以初步判断是该杂质，面积归一化法显示其纯度为94.66％。送样做1H-NMR、LC-MS。
相关图谱解析结果表明该杂质是酰胺，化学名为：2-[3-氨基甲酰基-4-(2-甲基丙氧基)苯基]-4-甲基噻唑-5-羧酸，分子式：C16H18N2O4S，分子量：334.4。
1H-NMR图谱解析(见表19)：
表19
化学位移(ppm) 质子数 峰形 归属 备注
0.99～1.00 6 d H17、H18
2.09～2.15 1 m H-16
2.66 3 s H-6
3.97～3.98 2 d H-15
7.25～7.278.02～8.04 2 d,d H-11、H-12
8.34 1 s H-8
7.58,7.74 2 s,s H-14
13.31 1 s H-7 重水交换，该吸收峰消失
HPLC-MS图谱解析(见表20)：
表20
荷质比 归属 备注
335.1 M+H 基峰
357.1 M+Na
669.2 2M+H
691.2 2M+Na
1025.2 M+Na
8.4.2杂质测定方法学研究
对杂质A(非布索坦水解产物)采用杂质对照品法进行定量，方法学研究情况如下：
(1)线性研究
精密称取杂质A对照品约10mg，置50mL量瓶中，加甲醇适量超声溶解，并稀释至刻度，摇匀，分别移取1mL、2mL、3mL各置100mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为线性溶液①、②和③。再精密移取线性溶液①2mL、5mL各置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为线性溶液④、⑤。分别取上述溶液各10μL，注入色谱仪中，记录谱图，结果见表21。
表21杂质A线性测定结果
线性方程为Y＝26473X+406.05，R2＝0.9994,表明杂质A浓度在0.4024～6.036μg/mL范围内呈良好线性。
(2)精密度考察
取线性中间浓度的溶液，分别六次量取10μL，注入色谱仪，记录谱图，结果见表22。
表22杂质A精密度考察
次数 1 2 3 4 5 6 平均 RSD％
峰面积A 53022 52315 52965 52185 52836 51991 52552 0.84
结果表明：本原料药在此仪器此方法下测定的精密度良好。
(3)杂质A回收率测定
取杂质A对照品10mg，置50mL量瓶中加甲醇适量，超声使溶解，加甲醇至刻度，摇匀，在分别四次量取1mL，置100mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，备用。另精密称取本原料药粉末(面积归一测定杂质A含量)六份，各置50mL量瓶中，加对照品储备液适量，超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照加样溶液。再另精密称取杂质A对照品适量，加甲醇溶解并稀释成2μg/mL的溶液，作为对照品溶液。分别量取上述溶液10μL注入色谱仪，记录谱图，并计算其回收率，结果见表23。
表23杂质A的回收率测定结果
结果表明：平均回收率99％以上，RSD％小于2，本原料药采用此法测定，回收良好。
(4)杂质A的最小检出量
取加样回收率项下的对照储备液，用甲醇分别稀释成1％、2％和3％溶液，精密量取10μL注入色谱仪，记录谱图，结果3％溶液所出的峰的峰高为基线噪音的3倍，计算得本原料药的最小检出量为0.67ng。
8.5最小检出
取本原料药样品粉末16mg置50mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，再精密吸取1mL置100mL容量瓶中作为1％溶液，再分别取1％溶液用甲醇稀释成0.01％溶液，再取1％溶液2mL置100mL容量瓶中做0.02％溶液。
分别取上述的0.01％、0.02％溶液10μL进样，记录谱图，结果表明本原料药的最小检出量为0.30ng，最小检出限度为0.02％。
8.6限度的制定
在原料药杂质中，单个最大杂质为杂质A，制备结构确证后证实为非布索坦水解产物，该产物口服给药后亦会产生。同时由于本原料药种现在处于申报临床阶段，积累数据亦有限，因此将非布索坦水解产物的限度暂时制定为0.5％。
其他未知杂质虽经过加速6个月与长期6个月稳定性考察，均未有超过0.1％的单个杂质产生，但基于目前所处临床申报阶段积累数据有限考虑，暂时制定其他单个未知杂质限度为0.2％，等以后申报生产时，积累了生产规模的数据后依照具体情况再做调整。
8.7测定方法
取本原料药适量，用甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取1mL,用甲醇稀释成每1mL含2μg的溶液，作为对照品溶液Ⅰ；另取杂质A适量，用甲醇稀释成每1mL含杂质A2μg的溶液，作为对照品溶液Ⅱ；照含量测定项下的色谱条件，取对照品溶液Ⅰ10μL注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的10％～20％；再精密量取供试品溶液和对照品溶液Ⅰ、Ⅱ各10μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。供试品溶液的色谱图中如有与对照品溶液Ⅱ主峰相对应的峰，则按外标法计算，应不得大于0.5％；其他杂质(除溶剂峰外)峰面积的和不得大于对照品溶液Ⅰ主峰面积。
分别取上述溶液各10μL进样，记录谱图。测定结果见表24。
表24非布索坦有关物质检查结果
9、有机溶剂残留量
本原料药合成过程中引入的有机溶剂有乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯及N,N-二甲基甲酰胺。故对乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯及N,N-二甲基甲酰胺的残留量进行测定。
9.1色谱条件的选择：分别用HP-5、DB-1701和DM-WAX测定本原料药的有机残留，经多种条件试验证明用这三种色谱柱同时测定乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯及N,N-二甲基甲酰胺的残留量均不合适，但试验中发现在DB-1701色谱柱下乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯分离较好，N,N-二甲基甲酰胺和溶剂二甲基亚砜分离不是很好。而在DM-WAX色谱柱下N,N-二甲基甲酰胺和溶剂二甲基亚砜分离较好。故采用DB-1701和DM-WAX分别测定本原料药的有机残留。
9.2有机溶剂残留量乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯的测定
9.2.1色谱条件及系统适用性试验：色谱柱为DB-1701(30m×0.32mm×0.25μm)石英毛细管柱；柱温起始温度为33℃，保持3分钟，然后以20℃/分钟的速率升至80℃，保持2分钟，然后以60℃/分钟的速率升至200℃,保持3分钟，气化室温度为220℃，FID检测器温度为220℃；载气为氮气，柱前压为25Kpa，氢气流速为30mL/min，空气流速为300mL/min。理论板数按乙醇峰计应大于2500，分离度应符合要求。
9.2.2对照品溶液的配制：精密称取乙醇125mg，二氯甲烷15mg，乙酸乙酯125mg置于25mL量瓶中，加二甲基亚砜溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，从中精密量取5mL置25mL量瓶中，加二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
9.2.3标准曲线的制备：精密量取乙醇125mg，二氯甲烷15mg，乙酸乙酯125mg置于25mL量瓶中，加二甲基亚砜溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，从中精密量取3、4、5、6、7mL置25mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液各1μL，注入气相色谱仪，记录色谱图，以各对照品浓度C(mg/mL)为横坐标，峰面积A为纵坐标进行线性回归,结果见表25。
表25标准曲线的回归方程
溶剂 回归方程 R2
乙醇 y＝278540x+127362 R2＝0.9993
二氯甲烷 y＝164.3x+1469.1 R2＝0.9991
乙酸乙酯 y＝264055x+99956 R2＝0.9997
9.2.4精密度试验：精密量取乙醇125mg，二氯甲烷15mg，乙酸乙酯15mg置于25mL量瓶中，加二甲基亚砜溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，从中精密量取5mL置25mL量瓶中,加二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。将对照品溶液连续重复进样6次，计算各峰面积的RSD(％)乙醇为4.31％，二氯甲烷为1.83％，乙酸乙酯为3.51％。
9.2.5回收率试验：精密量取乙醇125mg，二氯甲烷15mg，乙酸乙酯125mg置于25mL量瓶中，加二甲基亚砜溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，从中精密量取5mL置25mL量瓶中，加二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密量取本原料药粉末三份(批号080825)各0.4g置2mL量瓶中，加入对照品溶液微热溶解并稀释至刻度，摇匀，取上述溶液1μL进样进行测定；精密量取本原料药粉末(批号080825)0.4g置2mL量瓶中，加二甲基亚砜超声溶解并稀释至刻度,摇匀,取上述溶液1μL进样。记录谱图，测定有机溶剂残留量；计算出回收率结果见表26。
表26回收率实验结果
回收率％ 1 2 3 平均
乙醇 100.2％ 98.4％ 98.5％ 99.0％
二氯甲烷 100.4％ 101.9％ 98.1％ 100.1％
乙酸乙酯 101.5％ 101.3％ 98.5％ 100.4％
9.2.6最低检测限试验：将对照品溶液用二甲基亚砜溶解逐步稀释,直到检测峰高为基线噪声的3-4倍为止,结果乙醇的最低检测限为(ng)2.02，二氯甲烷的最低检测限(ng)为1.25，乙酸乙酯的最低检测限(ng)为1.007。
9.2.7样品测定：精密称取4批样品(批号080825、080915、080920、080925)各0.4g置2mL量瓶中，加入二甲基亚砜微热溶解并稀释至刻度，摇匀，取上述溶液进样1μL测定有机溶剂残留量，结果见表27。
表27样品的测定结果(％)
残留量％ 080825批 080915批 080920批 080925批
乙醇 0.010 未检出 未检出 0.008
二氯甲烷 未检出 未检出 未检出 未检出
乙酸乙酯 未检出 未检出 未检出 未检出
结果表明：样品中含含乙醇残留量未过0.5％，含二氯甲烷残留量未过0.06％，含乙酸乙酯残留量未过0.5％。
9.3有机溶剂残留量N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的测定
9.3.1色谱条件及系统适用性试验：色谱柱为DM-WAX(30m×0.32mm×0.25μm)石英毛细管柱；柱温温度为170℃，保持3分钟，然后以20℃/分钟的速率升至200℃，保持2分钟，气化室温度为220℃，FID检测器温度为220℃；载气为氮气，柱前压为25Kpa，氢气流速为30mL/min，空气流速为300mL/min。理论板数按DMF峰计应大于2500，分离度应符合要求。
9.3.2对照品溶液的配制：精密量取DMF22mg置于25mL量瓶中，加二甲基亚砜溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，从中精密量取5mL置25mL量瓶中,加二甲基亚砜稀释至刻度,摇匀,即得。
9.3.3标准曲线的制备：分别精密量取对照品储备液各3、4、5、6、7mL于25mL量瓶中，加二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1μL，注入气相色谱仪，记录色谱图，以各对照品溶剂浓度C(mg/mL)为横坐标,峰面积A为纵坐标进行线性回归，结果见表28。
表28标准曲线的回归方程
溶剂 回归方程 R224 -->
DMF y＝322.06x–1792.3 R2＝0.9991
9.3.4精密度试验：将对照品溶液连续重复进样，计算各峰面积的RSD(％)为4.28％。
9.3.5最低检测限试验：将对照品贮备液用二甲基亚砜溶解逐步稀释，直到检测峰高为基线噪声的3-4倍为止，结果DMF的最低检测限(ng)为1.78。
9.3.6回收率试验：精密量取本原料药粉末三份(批号080825)各0.4g置2mL量瓶中，加入对照品溶液并稀释至刻度，摇匀，取上述溶液1μL进样进行测定；精密量取本原料药粉末(批号080825)0.4g置2mL量瓶中，加二甲基亚砜微热溶解并稀释至刻度，摇匀，取上述溶液1μL进样，记录谱图，测定有机溶剂残留量，计算出回收率结果见表29。
表29回收率实验结果
回收率％ 1 2 3 平均
DMF 101.9％ 98.13％ 98.6％ 99.5％
9.3.7样品测定：精密称取4批样品(批号080825、080915、080920、080925)各0.4g置2mL量瓶中，加入二甲基亚砜微热溶解并稀释至刻度，摇匀，取样1μL进样测定有机溶剂残留量，结果见表30。
表30样品的测定结果
批号 080825 080915 080920 080925
DMF残留量％ 未检出 未检出 0.021 未检出
结果表明：样品中DMF小于0.088％。
四、主要原料及中间体内控质量标准(见表31)
表31
五、稳定性研究
选取四批样品模拟上市包装，按照药物稳定性指导原则，考察了本原料药的初步稳定性。本原料药选用药用复合膜包装，同时经考察本原料药在该包装条件下进行影响因素试验、加速试验6个月、长期试验6个月。试验表明非布索坦在各试验条件下均稳定，长期放置未见含量明显减小有关物质明显增大，样品较稳定，各项质量指标均能满足自拟临床用药质量标准。
与现有技术相比，本发明针对现有技术的不足，对非布索坦原料的制备工艺进行了优化，选取路线短，条件要求低，产品的纯度高的工艺路线，制备非布索坦原料药，成本低，可操作性强。包装材料选择得当，长期放置样品稳定性良好，可保证样品品质，满足生产临床样品的要求。
非布索坦合成工艺过程中可能引入的有机杂质：乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺，通过气相色谱进行严格控制。在非布索坦合成工艺过程中最后一步反应中产生的杂质非布索坦氰基水解产物，采用杂质对照品法进行了严格控制。非布索坦质量标准采用残留溶剂等检查控制外源性杂质，通过X射线粉末衍射和红外鉴别作定性检查，含量测定作定量检查。
所采用的合成路线及工艺经验证表明合理稳定可行、质量可控，制定的各项技术标准和管理文件合理可行，可以很好的控制生产全过程，保证生产出的样品质量均一，适宜于工业化生产。本发明建立了系统的、完整的、有效的成分鉴别和含量测定方法，可有效控制该药品的质量，从而确保其临床疗效。
附图说明
图1是非布索坦线性测定曲线图；
图2、图3分别是217nm、317nm波长下的有关物质图谱。
具体实施方式
下面所给出的优选实施例，旨在进一步阐明本发明所述化合物的合成方法及其应用，而并非局限于所列举的实例范畴，也并非限定本发明权利要求中提出的技术方案，即是说通过这些实施例所述的方法可很容易地制得非布索坦原料及其药物制剂。
实施例1：中间体Ⅲ的合成
在反应瓶内依次加入500g、4.2mol的对羟基苯甲腈Ⅱ和2000mLHCl饱和的DMF，搅拌下加入565g、7.5mol的硫代乙酰胺，升温至100℃，搅拌反应5h；通过TLC监控反应，其中，RfII＝0.7，RfIII＝0.5，展开剂：乙酸乙酯：石油醚＝1：1，GF254硅胶板；停止加热，减压回收DMF，残留物中加入1.5L水，乙酸乙酯提取两次，每次4500mL，合并有机相，减压至溶剂尽，得粘稠固体，加入二氯甲烷4000mL，搅拌分散30min，过滤，得棕褐色固体，60℃干燥，称重得421g中间体Ⅲ，收率为65.5％，其TLC检测为单一斑点。
实施例2：中间体Ⅳ的合成
在反应瓶中，依次加入420g、2.74mol的中间体Ⅲ、7.8L无水乙醇和546g、3.36mol的2-氯代乙酰乙酸乙酯，搅拌成悬浮液，加热回流反应5h；通过TLC监控反应，其中，RfⅢ＝0.5，RfⅣ＝0.8，展开剂：乙酸乙酯：石油醚＝1：1，GF254硅胶板；停止加热，稍冷后减压回收乙醇至尽，残留物中加入乙酸乙酯2500mL，搅拌20min，过滤，200mL乙酸乙酯洗涤，抽干，得黄褐色固体，50℃减压干燥过夜，称重得650g中间体Ⅳ，收率为90.0％，其TLC检测为单一斑点。
实施例3：中间体Ⅴ的合成
搅拌下将650g、2.46mol的中间体Ⅳ和357g、2.55mol的六亚甲基四胺加入到盛有3.57kg多聚磷酸的反应瓶中，加热至100℃，反应2h；通过TLC监控反应，其中，RfⅣ＝0.4，RfⅤ＝0.55，展开剂：乙酸乙酯：石油醚＝1：3，GF254硅胶板；停止加热，稍冷后加入冰水1100mL，搅拌，乙酸乙酯萃取3次，每次1200mL，合并有机相，饱和盐水洗涤2次，每次1000mL，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压回收乙酸乙酯至尽，得368g黄色固体，即中间体Ⅴ，收率为51.2％，其TLC检测基本为单一斑点。
实施例4：中间体Ⅵ的合成
将368g、1.26mol的中间体Ⅴ加入到反应瓶中，加入3500mLDMF，再加入260g、1.9mol的无水碳酸钾，搅拌15分钟后加入260g、1.9mol的溴代异丁烷，升温至70℃反应10小时；通过TLC监控反应，其中，RfⅤ＝0.55，RfⅥ＝0.7，展开剂：乙酸乙酯：石油醚＝1：3，GF254硅胶板)；停止加热，将反应混合物转移到20L反应器中，冷却后加入水8500mL，搅拌析出固体，继续搅拌30分钟，过滤，水洗涤4次，每次800mL，60℃减压干燥过夜，得黄色固体300g，即中间体Ⅵ，收率为68.5％，其TLC检测为单一斑点。
实施例5：中间体Ⅶ的合成
将300g、0.86mol的中间体Ⅵ加入反应瓶中，加入1800mL无水甲酸，搅拌下加入68g、0.99mol的盐酸羟胺和71g、1.05mol的甲酸钠，加热至100℃反应10小时；通过TLC监控反应，其中，RfⅥ＝0.7,RfⅦ＝0.75，展开剂：乙酸乙酯：石油醚＝1：3，GF254硅胶板；停止加热，冷却，依次加入水4000mL和乙酸乙酯400mL，搅拌30分钟，过滤，水洗涤3次，每次1000mL，60℃减压干燥过夜，将所得固体用8.5L无水乙醇加热溶解，趁热过滤，冷却析晶，过滤，500mL无水乙醇，60℃减压干燥4h，称重得270g中间体Ⅶ，收率为91.0％。
实施例6：非布索坦粗品Ⅰ的合成
将270g、0.78mol的中间体Ⅶ加入反应瓶中，再加入2750mL无水乙醇和2750mL、0.3M的氢氧化钠溶液，加热回流反应1.5小时；通过TLC监控反应，其中，RfⅦ＝0.8，RfⅠ＝0，展开剂：乙酸乙酯：石油醚＝1：3，GF254硅胶板；停止加热，冰水冷却至室温，搅拌下滴加盐酸至PH3，析出固体，继续搅拌30分钟，过滤，水洗涤3次，每次100mL，80℃减压干燥4小时，得非布索坦粗品225g，收率为91.0％。
实施例7：非布索坦精品的制备
称取非布索坦粗品225g，加入反应瓶中，加入无水乙醇4500mL，加热回流溶解，稍冷却，加入活性炭10g，继续回流30分钟，趁热过滤，滤液室温放置冷却析晶，冰水浴冷却至0℃保温30min，过滤，滤饼用少量冷乙醇洗涤，80℃减压干燥过夜，称重195g；将上述所得固体加入12L二氯甲烷，加热至产品全溶，室温冷却析晶，降至接近室温后0℃析晶30min，过滤，1L冷的二氯甲烷洗涤，抽干，60℃减压干燥3h，称重180g即得，收率为92.0％。
实施例8：本发明所述非布索坦原料的完整检测方法为：
(1)性状：本原料药为白色至类白色粉末；
(2)含量测定：参照《中国药典》2010年版二部附录VD的高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为甲醇－三乙胺调pH为5.0的0.3％乙酸＝70：30，检测波长为317nm；理论板数按非布索坦峰计算，应不低于2000；
测定法：取本原料药10mg，精密称定，置50mL量瓶中，加甲醇适量，超声使溶解，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取5mL置25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取10μL注入液相色谱仪；另取非布索坦对照品，同法测定；按外标法以峰面积计算，即得；
(3)鉴别：
①在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致；
②本原料药的红外吸收图谱与对照品的图谱一致；
③本原料药的X射线粉末衍射图谱在2θ为5.7、8.6、12.1、13.2、14.4处有特征吸收峰；
(4)检查：
①有关物质：取本原料药10mg，精密称定，置50mL量瓶中，加甲醇适量，超声使溶解，加甲醇至刻度，作为供试品溶液；精密量取1mL，用甲醇稀释成每1mL含2μg的溶液，作为对照品溶液Ⅰ；另取杂质A适量，用甲醇稀释成每1mL含杂质A2μg的溶液，作为对照品溶液Ⅱ；参照含量测定项下的色谱条件，取10μL对照品溶液Ⅰ注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的10％～20％；再精密量取供试品溶液和对照品溶液Ⅰ、Ⅱ各10μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍；供试品溶液的色谱图中如有与对照品溶液Ⅱ主峰相对应的峰，则按外标法计算，应不得大于0.5％；除杂质A外，最大单一杂质峰面积不得大于对照品溶液Ⅰ峰面积的0.2倍，即0.2％；所有杂质峰面积的和不得大于对照品溶液Ⅰ峰面积的1.0倍，即1.0％；
②有机溶剂残留量：
乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷：取本原料药0.4g置2mL量瓶中，加入二甲基亚砜微热溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另精密称取乙醇125mg、二氯甲烷15mg、乙酸乙酯125mg置于25mL量瓶中，加二甲基亚砜溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，从中精密量取5mL置25mL量瓶中，加二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；参照《中国药典》2010年版二部附录ⅧP的残留溶剂测定法进行测定，色谱柱为14％氰丙基苯基-甲基聚硅氧烷，30m×0.32mm×0.25μm毛细管柱，柱温起始温度为33℃，保持3分钟，然后以20℃/分钟的速率升至80℃，保持2分钟，再以60℃/分钟的速率升至200℃,保持3分钟；检测器为氢火焰离子化检测器，检测器温度为220℃；气化室温度为220℃；载气为氮气；精密量取供试品溶液和对照品溶液各1μL，分别注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，含二氯甲烷的量不得超过0.06％，含乙酸乙酯的量不得超过0.5％，乙醇的量不得超过0.5％；
N,N-二甲基甲酰胺：取本原料药0.4g置2mL量瓶中，加入二甲基亚砜微热溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另精密称取N,N-二甲基甲酰胺22mg，置于25mL量瓶中，加二甲基亚砜溶解并稀释至刻度，摇匀,作为对照品储备液，从中精密量取5mL置25mL量瓶中,加二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；参照《中国药典》2010年版二部附录ⅧP的残留溶剂测定法进行测定，色谱柱为DM-WAX，30m×0.32mm×0.25μm毛细管柱；柱温起始温度为170℃，保持3分钟，然后以20℃/分钟的速率升至200℃，保持2分钟；检测器为氢火焰离子化检测器，检测器温度为220℃；气化室温度为220℃；载气为氮气；精密量取供试品溶液和对照品溶液各1μL，分别注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，含N,N-二甲基甲酰胺的量不得超过0.088％；
③干燥失重：取本原料药，参照《中国药典》2010年版二部附录ⅧL进行检查，在105℃干燥至恒重，减失重量应不得超过1.0％；
④炽灼残渣：取本原料药0.5g，参照《中国药典》2010年版二部附录ⅧN进行检查，遗留残渣不得超过0.2％；
⑤重金属：取炽灼残渣项下残留的残渣，参照《中国药典》2010年版二部附录ⅧH第二法进行检查，含重应不得超过10％。

Claims (4)

1.一种非布索坦原料的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括性状、鉴别、检查和含量测定项目；其中，鉴别是对非布索坦进行鉴别；检查是对干燥失重、炽灼残渣、重金属、有关物质和有机溶剂残留量进行检查；含量测定是对非布索坦含量进行测定，对非布索坦含量进行测定的方法为：
参照《中国药典》2010年版二部附录ⅤD的高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为甲醇－三乙胺调pH为5.0的0.3％乙酸＝70：30，检测波长为317nm；理论板数按非布索坦峰计算，应不低于2000；
测定法：取本原料药10mg，精密称定，置50mL量瓶中，加甲醇适量，超声使溶解，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取5mL置25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取10μL注入液相色谱仪；另取非布索坦对照品，同法测定；按外标法以峰面积计算，即得。
2.根据权利要求1所述的非布索坦原料的检测方法，其特征在于，对非布索坦的具体鉴别方法为：
(1)在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致；
(2)本原料药的红外吸收图谱与对照品的图谱一致；
(3)本原料药的X射线粉末衍射图谱在2θ为5.7、8.6、12.1、13.2、14.4处有特征吸收峰。
3.根据权利要求1或2所述的非布索坦原料的检测方法，其特征在于，对非布索坦的具体检查方法为：
(1)有关物质：取本原料药10mg，精密称定，置50mL量瓶中，加甲醇适量，超声使溶解，加甲醇至刻度，作为供试品溶液；精密量取1mL，用甲醇稀释成每1mL含2μg的溶液，作为对照品溶液Ⅰ；另取杂质A适量，用甲醇稀释成每1mL含杂质A2μg的溶液，作为对照品溶液Ⅱ；参照含量测定项下的色谱条件，取10μL对照品溶液Ⅰ注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的10％～20％；再精密量取供试品溶液和对照品溶液Ⅰ、Ⅱ各10μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍；供试品溶液的色谱图中如有与对照品溶液Ⅱ主峰相对应的峰，则按外标法计算，应不得大于0.5％；除杂质A外，最大单一杂质峰面积不得大于对照品溶液Ⅰ峰面积的0.2倍，即0.2％；所有杂质峰面积的和不得大于对照品溶液Ⅰ峰面积的1.0倍，即1.0％；
(2)有机溶剂残留量：
①乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷：取本原料药0.4g置2mL量瓶中，加入二甲基亚砜微热溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另精密称取乙醇125mg、二氯甲烷15mg、乙酸乙酯125mg置于25mL量瓶中，加二甲基亚砜溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，从中精密量取5mL置25mL量瓶中，加二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；参照《中国药典》2010年版二部附录ⅧP的残留溶剂测定法进行测定，色谱柱为14％氰丙基苯基-甲基聚硅氧烷，30m×0.32mm×0.25μm毛细管柱，柱温起始温度为33℃，保持3分钟，然后以20℃/分钟的速率升至80℃，保持2分钟，再以60℃/分钟的速率升至200℃,保持3分钟；检测器为氢火焰离子化检测器，检测器温度为220℃；气化室温度为220℃；载气为氮气；精密量取供试品溶液和对照品溶液各1μL，分别注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，含二氯甲烷的量不得超过0.06％，含乙酸乙酯的量不得超过0.5％，乙醇的量不得超过0.5％；
②N,N-二甲基甲酰胺：取本原料药0.4g置2mL量瓶中，加入二甲基亚砜微热溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另精密称取N,N-二甲基甲酰胺22mg，置于25mL量瓶中，加二甲基亚砜溶解并稀释至刻度，摇匀,作为对照品储备液，从中精密量取5mL置25mL量瓶中,加二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；参照《中国药典》2010年版二部附录ⅧP的残留溶剂测定法进行测定，色谱柱为DM-WAX，30m×0.32mm×0.25μm毛细管柱；柱温起始温度为1700C，保持3分钟，然后以20℃/分钟的速率升至200℃，保持2分钟；检测器为氢火焰离子化检测器，检测器温度为220℃；气化室温度为220℃；载气为氮气；精密量取供试品溶液和对照品溶液各1μL，分别注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，含N,N-二甲基甲酰胺的量不得超过0.088％；
(3)干燥失重：取本原料药，参照《中国药典》2010年版二部附录ⅧL进行检查，在105℃干燥至恒重，减失重量应不得超过1.0％；
(4)炽灼残渣：取本原料药0.5g，参照《中国药典》2010年版二部附录ⅧN进行检查，遗留残渣不得超过0.2％；
(5)重金属：取炽灼残渣项下残留的残渣，参照《中国药典》2010年版二部附录ⅧH第二法进行检查，含重应不得超过10％。
4.根据权利要求1所述的非布索坦原料的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括：
(1)性状：本原料药为白色至类白色粉末；
(2)含量测定：参照《中国药典》2010年版二部附录VD的高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为甲醇－三乙胺调pH为5.0的0.3％乙酸＝70：30，检测波长为317nm；理论板数按非布索坦峰计算，应不低于2000；
测定法：取本原料药10mg，精密称定，置50mL量瓶中，加甲醇适量，超声使溶解，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取5mL置25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取10μL注入液相色谱仪；另取非布索坦对照品，同法测定；按外标法以峰面积计算，即得；
(3)鉴别：
①在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致；
②本原料药的红外吸收图谱与对照品的图谱一致；
③本原料药的X射线粉末衍射图谱在2θ为5.7、8.6、12.1、13.2、14.4处有特征吸收峰；
(4)检查：
①有关物质：取本原料药10mg，精密称定，置50mL量瓶中，加甲醇适量，超声使溶解，加甲醇至刻度，作为供试品溶液；精密量取1mL，用甲醇稀释成每1mL含2μg的溶液，作为对照品溶液Ⅰ；另取杂质A适量，用甲醇稀释成每1mL含杂质A2μg的溶液，作为对照品溶液Ⅱ；参照含量测定项下的色谱条件，取10μL对照品溶液Ⅰ注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的10％～20％；再精密量取供试品溶液和对照品溶液Ⅰ、Ⅱ各10μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍；供试品溶液的色谱图中如有与对照品溶液Ⅱ主峰相对应的峰，则按外标法计算，应不得大于0.5％；除杂质A外，最大单一杂质峰面积不得大于对照品溶液Ⅰ峰面积的0.2倍，即0.2％；所有杂质峰面积的和不得大于对照品溶液Ⅰ峰面积的1.0倍，即1.0％；
②有机溶剂残留量：
乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷：取本原料药0.4g置2mL量瓶中，加入二甲基亚砜微热溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另精密称取乙醇125mg、二氯甲烷15mg、乙酸乙酯125mg置于25mL量瓶中，加二甲基亚砜溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，从中精密量取5mL置25mL量瓶中，加二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；参照《中国药典》2010年版二部附录ⅧP的残留溶剂测定法进行测定，色谱柱为14％氰丙基苯基-甲基聚硅氧烷，30m×0.32mm×0.25μm毛细管柱，柱温起始温度为33℃，保持3分钟，然后以20℃/分钟的速率升至80℃，保持2分钟，再以60℃/分钟的速率升至200℃,保持3分钟；检测器为氢火焰离子化检测器，检测器温度为220℃；气化室温度为220℃；载气为氮气；精密量取供试品溶液和对照品溶液各1μL，分别注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，含二氯甲烷的量不得超过0.06％，含乙酸乙酯的量不得超过0.5％，乙醇的量不得超过0.5％；
N,N-二甲基甲酰胺：取本原料药0.4g置2mL量瓶中，加入二甲基亚砜微热溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另精密称取N,N-二甲基甲酰胺22mg，置于25mL量瓶中，加二甲基亚砜溶解并稀释至刻度，摇匀,作为对照品储备液，从中精密量取5mL置25mL量瓶中,加二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；参照《中国药典》2010年版二部附录ⅧP的残留溶剂测定法进行测定，色谱柱为DM-WAX，30m×0.32mm×0.25μm毛细管柱；柱温起始温度为1700C，保持3分钟，然后以20℃/分钟的速率升至200℃，保持2分钟；检测器为氢火焰离子化检测器，检测器温度为220℃；气化室温度为220℃；载气为氮气；精密量取供试品溶液和对照品溶液各1μL，分别注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，含N,N-二甲基甲酰胺的量不得超过0.088％；
③干燥失重：取本原料药，参照《中国药典》2010年版二部附录ⅧL进行检查，在105℃干燥至恒重，减失重量应不得超过1.0％；
④炽灼残渣：取本原料药0.5g，参照《中国药典》2010年版二部附录ⅧN进行检查，遗留残渣不得超过0.2％；
⑤重金属：取炽灼残渣项下残留的残渣，参照《中国药典》2010年版二部附录ⅧH第二法进行检查，含重应不得超过10％。
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