发明内容
为了更好地控制醋酸乌利司他原料药及其制剂的药物质量,本发明对原料药中的杂质进行研究,获得了相关杂质化合物,并提供其制备方法和检测方法。本发明所制备的杂质化合物,作为杂质对照品,可用于该醋酸乌利司他原料药及其制剂的质量分析,同时也可以为工艺条件的选择提供参考,有利于生产过程中药品质量的控制。
本发明技术方案如下:
本发明提供一种化合物或其盐,所述化合物的结构如下式化合物B或者化合物C所示:
化合物B:
化合物C:
上述所述的化合物或其盐,其中所述盐为无机酸盐或有机酸盐。
作为本发明另一目的,还提供一种上述所述化合物或其盐的制备方法,其包括3,20-双缩酮(中间体VI)在双氧水氧化反应将5(11)位的双键环氧化后通过后续的水解反应生成其水解产物,通过互变发生双键移位,再通过乙酰化反应步骤而制得,其反应式如下:
上述所述的制备方法,其中:
所述的双氧水氧化反应为:
例如,化合物VI溶于二氯甲烷中,碱性条件下,加入氧化剂和全卤代丙酮室温下反应。碱选自吡啶,磷酸氢二钾,磷酸二氢钾,磷酸氢二钠,磷酸二氢钠等;氧化剂选自双氧水,间氯过氧苯甲酸等,优选双氧水;反应温度-10-10℃。
所述的水解反应为:
例如,在二氯甲烷和稀酸中搅拌下进行水解反应,酸选自盐酸、硫酸、硫酸氢钠等无机酸,优选为0.2-4N HCl溶液,反应温度-10-50℃,反应时间1-5h。
所述的乙酰化反应为:
例如,用冰醋酸、高氯酸或醋酐酰化反应,优选高氯酸和醋酐中加入冰醋酸;反应温度-40-25℃,优选-10-25℃;冰醋酸的量占冰醋酸、高氯酸、醋酐构成的乙酰化试剂体积的1-50%V/V,优选10-15%V/V。
作为本发明另一目的,还提供另一种上述所述化合物或其盐的制备方法,其包括从由3,20-双缩酮(中间体VI)制备得到醋酸乌利司他的反应产物中经分离制备得到所述化合物B、化合物C的步骤。优选地,所述的由3,20-双缩酮(中间体VI)制备得到醋酸乌利司他的反应过程如下:
上述所述的制备方法,其中:
所述环氧化反应为:
例如,化合物VI溶于二氯甲烷中,碱性条件下,加入氧化剂和全卤代丙酮室温下反应。碱选自吡啶,磷酸氢二钾,磷酸二氢钾,磷酸氢二钠,磷酸二氢钠等;氧化剂选自双氧水,间氯过氧苯甲酸等,优选双氧水;反应温度-10-10℃。
所述的格氏试剂反应为:
例如,在THF,氯化亚铜催化下与4-(N,N一二甲基氨基)苯基溴化镁格氏试剂进行加成;优选地,反应原料与格氏试剂摩尔比1:1.5-5,反应温度-10-40℃,反应时间2-8h。
所述的水解反应为:
例如,在二氯甲烷和稀酸中搅拌下进行水解反应;优选地,所述的酸选自盐酸、硫酸、硫酸氢钠等无机酸,优选为0.2-4N HCl溶液;优选地,反应温度-10-50℃,反应时间1-5h。
所述的乙酰化反应为:
例如,用冰醋酸、高氯酸或醋酐中任一种或者两种以上的酰化剂下酰化反应;优选高氯酸和醋酐中加入冰醋酸;优选地,反应温度-40-25℃,优选-10-25℃;优选地,冰醋酸的量占冰醋酸、高氯酸、醋酐构成的乙酰化试剂体积的1-50%V/V,优选10-15%V/V。
作为本发明另一实施方式,还提供另一种上述所述化合物或其盐的制备方法,其包括从由3,20-双缩酮(中间体VI)制备得到醋酸乌利司他的反应产物中经分离制备得到所述化合物B或化合物C的步骤。3,20-双缩酮(中间体VI)制备得到醋酸乌利司他的反应,例如可以参见现有技术CN102516345B公开的可工业化生产醋酸乌利司他的方法。
上述所述的制备方法,其中所述的分离制备为制备高压液相色谱分离;优选地,所述的制备高压液相色谱条件为:固定相为C18反相填料,流动相为三乙胺磷酸溶液-乙腈梯度洗脱,检测波长为237nm。
优选地,上述所述的制备方法,优选从醋酸乌利司他重结晶所得到的重结晶母液中分离制备得到所述的化合物B或化合物C。
优选地,上述所述化合物或其盐的检测方法,其中所述方法为HPLC法或者HPLC-MS法;
优选地,所述的HPLC法的检测条件为:固定相以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,流动相为三乙胺磷酸溶液-乙腈梯度洗脱,检测波长为237nm;优选地,流动相为pH2.5~3.5的三乙胺磷酸溶液-乙腈,体积比为30∶70~50∶50;更优选地,流动相为pH3.0的三乙胺磷酸溶液-乙腈,体积比为40∶60;优选地,检测波长为237nm;
优选地,所述的HPLC-MS法的检测条件为:HPLC的色谱条件为固定相以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,流动相为乙腈:0.1%甲酸水=50:50,MS的条件为采用选择性离子检测法,检测化合物B母离子[M+H]+m/z 415.1,或者化合物C母离子[M+H]+m/z 373.1。
作为本发明另一目的,还提供上述所述化合物或其盐在醋酸乌利司他原料药或者制剂的有关物质检测中作为杂质对照品的用途。
上述所述的用途,其中所述的检测采用HPLC法或者HPLC-MS法检测;优选地,所述的检测采用HPLC法检测;更优选地,所述的HPLC法检测条件为:固定相为十八烷基硅烷键合硅胶,流动相为体积比为30∶70~50∶50的pH2.5~3.5的三乙胺磷酸溶液-乙腈,更优选流动相为0.2%三乙胺(磷酸调pH 3.0)缓冲液:乙腈=40:60,检测波长为DAD(二极管阵列检测器)237nm,理论板数按醋酸乌利司他峰计算应不小于2000;更优选地,所述的有关物质检测中,供试品溶液的色谱图中如有杂质峰,以峰面积计算,与各杂质相对应的峰各不得大于杂质对照品溶液的0.15倍(即杂质含量不超过0.15%)。总杂质含量不得超过1.0%。
作为本发明一个具体实施方式,上述所述的杂质化合物B或杂质化合物C具体可通过以下方法制备得到。
1、醋酸乌利司他的制备过程
将3,20-双缩酮(1mo1),二氯甲烷,吡啶、三水六氟丙酮,冷却至-10-0℃,滴加50%双氧水,于-5-5℃反应2-3h,分出有机相,水相用二氯甲烷萃取两次合并,用10%硫代硫酸钠水溶液洗涤,有机相水洗两次,无水硫酸镁干燥,过滤,减压浓缩至恒重。
将Mg(1.6mo1),1,2一二溴乙烷和THF加入三口烧瓶,滴加4-溴-N,N-二甲基苯胺和THF,加热引发反应后回流滴加,加毕,于50-60℃搅拌反应3h得到格氏试剂,冷却至25℃,加入氯化亚铜,25℃搅拌30分钟后,冷却下滴加上述环氧化物的二氯甲烷溶液,保持温度10-20℃,加毕保温搅拌2h,倒入冰的饱和NH4Cl水溶液中,搅拌10分钟,分出有机相,水相用二氯甲烷萃取,有机相合并,加入2N HCl溶液。于25℃下搅拌2h,分出有机相,水相用二氯甲烷萃取,合并,依次用饱和碳酸氢钠水溶液,水各洗一次,无水硫酸镁干燥,过滤,滤液转入反应瓶中,加入冰醋酸(1.25mol),冷却至-10-0℃,加入70%高氯酸(1.18mo1),然后搅拌下于-10-0℃滴加醋酐(5.96mo1),保温搅拌30分钟后,水相用二氯甲烷萃取,合并,依次用饱和碳酸氢钠水溶液,水各洗一次,无水硫酸镁干燥,过滤,减压浓缩至干约110g,经用10倍量异丙醇:乙醇(95:5)重结晶得到浅黄色结晶244.8g,重结晶母液浓缩干得固体,待用。产物再次用异丙醇:乙醇(95:5)重结晶,60℃烘干得到浅黄色结晶的产物,重结晶母液浓缩干得固体,待用。
上述所得的醋酸乌利司他经LC-MS分析,含有多个杂质,其中包括杂质B(即化合物B)和杂质C(即化合物C)的MS检测结果为:杂质A:[M+H]+397.16,杂质B:[M+H]+415.1,杂质C:[M+H]+373.1,杂质D:[M+H]+462.2,杂质E:[M+H]+434.0,杂质F:[M+H]+518.2,杂质G:[M+H]+476.2,杂质H:[M+H]+441.2,杂质I:[M+H]+516.2,杂质J:[M+H]+474.2,杂质K:[M+H]+492.3。
所用的LC-MS条件为:
HPLC:流动相为乙腈︰0.1%甲酸水=50︰50
柱温25~35℃
流速0.3ml/min
检测波长237nm
色谱柱:Agilent Poroshe11120EC-C18 2.7u m 4.6X 50mm
MS:条件
ESI,fg=25,MS2scan。
2、杂质B、C的制备过程
经HPLC分析,醋酸乌利司他成品中杂质的含量低于0.1%,但经对合成过程中的母液进行分析,其中杂质的含量较高,故采用从合成过程中处理过的母液中制备分离杂质。
将醋酸乌利司他的制备过程中所得重结晶母液浓缩至干得到固体,此固体中含较高比例杂质,将此固体经高压制备液相纯化、处理可得到高纯的的杂质对照品,具体操作如下:
纯化条件:
梯度洗脱比例:
时间(分) |
A% |
B% |
0 |
90 |
10 |
30 |
40 |
60 |
60 |
40 |
60 |
具体操作步骤:
将母液浓缩至干得到固体,取约1g,用40%乙腈/水溶解,上柱,梯度洗脱,根据出峰情况,分段收集洗脱液,每次纯化完成后,纯化柱用5%乙腈水溶液重新平衡后,可重复进样纯化。将多批次纯化得到的含各组份纯度>98%的洗脱液分别合并。浓缩除去大部分乙腈,水层用乙酸乙酯提取,浓缩乙酸乙酯至干,分别得到杂质固体。每批次纯化可得杂质A约为5mg,杂质B约为10mg,杂质C约为5mg,杂质D约为15mg,杂质E约为5mg,杂质F约为5mg,杂质G约为5mg,杂质H约为15mg,杂质I约为5mg,杂质J约为10mg,杂质K约为5mg。
上述纯化过程中的分析检测条件为:
流动相为pH3.0三乙胺磷酸缓冲液∶乙腈=40∶60
检测波长237nm
柱温:30℃
流速1.0mL/min
作为本发明一个具体实施方式,还提供了杂质B、C在醋酸乌利司他原料及其制剂产品质量检测方法中的用途。优选用HPLC和/或HPLC-MS检测杂质B或C及其含量。
更优选地,所述HPLC所采用的条件为,
流动相:pH2.5~3.5的三乙胺磷酸溶液-乙腈,体积比为30∶70~50∶50;其中pH2.5~3.5的三乙胺磷酸溶液是由三乙胺-磷酸缓冲对组成,1000份水加1~3份三乙胺得到三乙胺溶液,以磷酸调节pH为2.5~3.5;
流速:0.8~1.2mL/min(优选流速1.0mL/min);
柱温:25~35摄氏度,优选30℃;
检测波长:采用多波长检测,分别选择各杂质的最大吸收波长进行有关物质检测、验证。醋酸乌利司他:303nm;杂质A:259nm;杂质B:234nm;杂质C:241nm;杂质D:303nm;杂质E:304nm;杂质F:328nm;杂质G:253nm;杂质H:262nm;杂质I:256nm;杂质J:261nm;杂质K:299nm。
固定相:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂
更一步优选的,所述HPLC-MS所采用的条件为:
色谱条件为:流动相:0.05%~0.5%HAc/水:乙腈=(75~80):(25~20);优选0.1%HAc/水,与乙腈比例优选78:22
流速:0.1~0.5ml/min,优选0.3ml/min;柱温:20~40℃,优选30℃
质谱条件为:采用选择性离子监测((SIM)法
干燥气温度:300~400℃,优选350℃
载气流速:8~12L/min,优选10L/min
雾化气压力:30~50psi,优选40psi
毛细管电压:4000V
作为本发明一个优选实施方式,提供了上述杂质B或C作为杂质对照品在醋酸乌利司他及其制剂的有关物质检查的质量分析中的应用,其中所述的醋酸乌利司他及其杂质的检测方法优选为HPLC法,HPLC检测条件如下:
固定相:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂
流动相:pH3.0的三乙胺磷酸溶液-乙腈,体积比为40∶60;其中pH3.0的三乙胺磷酸溶液是由三乙胺-磷酸缓冲对组成,1000份水加2份三乙胺,以磷酸调节pH为3.0;
流速:0.8~1.2mL/min(优选流速1.0mL/min);
柱温:25~35摄氏度,优选30℃;
检测波长:250~270nm,优选237nm。
理论板数按醋酸乌利司他峰计算应不小于2000
检测波长:紫外扫描显示,各杂质及主成分最大吸收波长如下:
醋酸乌利司他:303nm;杂质A:259nm;杂质B:234nm;杂质C:241nm;杂质D:303nm;杂质E:304nm;杂质F:328nm;杂质G:253nm;杂质H:262nm;杂质I:256nm;杂质J:261nm;杂质K:299nm,综合考虑,采用多波长检测,分别选择各杂质的最大吸收波长进行有关物质检测、验证。
实验操作:
分别称取醋酸乌利司他对照品及杂质A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K对照品各适量,加流动相溶解并稀释制成每1ml中分别含醋酸乌利司他、杂质A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K各约20u g的混合溶液,作为系统适用性试验溶液。精密量取系统适用性试验溶液10ul注入液相色谱仪,记录色谱图,醋酸乌利司他及各杂质峰相互间的分离度应符合要求,理论板数按醋酸乌利司他峰计算应不小于2000。
测定法
精密称取本品10mg,置20ml量瓶中,用流动相溶解,并稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1ml置100ml量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,作为对照溶液。量取对照溶液10μl,注入液相色谱仪,调节检测灵敏度使主成分色谱峰的峰高为满量程的10-20%。再精密量取供试品溶液10μl,注入液相色谱仪,记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。
各杂质重点研究检测波长:
波长 |
杂质 |
302nm |
杂质D、E、F、K |
237nm |
杂质B、C |
258nm |
杂质A、G、H、I、J |
供试品溶液的色谱图中如有杂质峰,以峰面积计算,与各杂质相对应的峰各不得大于对照溶液的0.15倍(即杂质含量不超过0.15%);其他任一单个杂质峰均不得大于对照溶液的0.15倍(即杂质含量不超过0.15%),总杂质不得超过1.0(即总杂质含量不得超过1.0%),小于对照溶液主峰面积0.05倍(即含量小于0.05%)的峰忽略不计。
本发明提供的上述醋酸乌利司他有关物质的检测的方法的优点是测定结果准确可靠,专属性强,实用性强,各杂质能有效检出,且醋酸乌利司他及各杂质间均达到良好分离,采用该系统可检测多种杂质。
上述方法同样适用醋酸乌利司他制剂的有关物质分析。